Système respiratoire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système urogénital
Impact du ciblage des cellules sénescentes sur la longévité et l’espérance de vie en bonne santé
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Laissées vieillir jusqu'à 18 à 24 mois, elles reçoivent un anticorps ou un composé sénolytique par injection ou gavage tous les quinze jours, avec prélèvements de sang et d'urine, pour étudier l'élimination des cellules sénescentes dans le vieillissement. Le porteur anticipe la mort d'environ 20 % des animaux avant la fin, et la mise à mort de ceux qui perdent 15 % de leur poids. Il justifie le recours à la souris par la nécessité d'étudier un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet fait partie d'une étude plus globale de caractérisation du rôle de la surveillance immunitaire des cellules sénescentes dans le vieillissement, les maladies liées à l’âge et le cancer. Ce projet est basé sur les résultats obtenus au sein du laboratoire qui démontrent un lien entre la surexpression d’un glycolipide à la surface des cellules pulmonaires sénescentes et leur échappement au système immunitaire. L’objectif du projet est de déterminer l’effet du blocage de glycolipide par un anticorps sur la réponse immunitaire et le développement de maladies liées à la senescence chez la souris âgée. L’interaction et la communication entre les cellules sénescentes et les cellules immunitaires seront étudiées pour établir le mécanisme par lequel ces cellules exercent des pressions d’adaptation mutuelles observée in vitro. Le développement et l’avancement de diverses maladies liés à l’âge (Fibrose pulmonaire, fibrose rénale, fibrose hépatique, arthrose, ostéoporose, cancer) seront également suivis afin d’évaluer l’effet thérapeutique de l’anticorps comparé à un sénolytique connu (une combinaison de molécules éliminant les cellules sénescentes). Nous voulons évaluer si cette approche immunothérapeutique pourrait augmenter la durée de vie des souris ainsi que diminuer leur état de fragilité générale. La finalité de ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre le vieillissement pathologique en ciblant spécifiquement des molécules de surfaces associées aux cellules sénescentes. Cette approche pourrait être utile pour les patients dans de nombreuses maladies liées à l’âges incluant le cancer. Les résultats de cette étude devraient nous permettre de mieux développer l’anticorps et d’envisager des essais cliniques de phase précoce chez l’homme.
Bénéfices attendus
Par cette étude on s’attend à avoir une meilleure compréhension mécanistique des interactions entre le système immunitaire et les cellules sénescentes au cours du vieillissement mais également de déterminer le rôle et l’importance des point de contrôles immunitaires associés à la sénescence dans l’élimination des cellules sénescentes. Nous nous attendons également à comprendre si une approche immunothérapeutique visant ce ganglioside pourrait être envisagée afin de traiter et prévenir les maladies liées à l’âge et la comparer à un traitement déjà connu.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Administration de l’anticorps ou le sénolytique de référence ou les solutions contrôles (PBS ou isotype contrôle) par injection intrapéritonéale ou par gavage, pour tous les animaux, une fois tous les 15 jours pour 6 injections/gavages; durée d'environ 3 minutes par animal par injection/gavage - Pesée (toutes les semaines pour tous les animaux; durée moins d'une minute par pesée - Prélèvement sanguin (200µl une fois par mois pour tous les animaux) ; durée d'environ 5 minutes de manipulation (dilatation de la queue puis incision etrécupération, coagulation par pensement coagulant) par animal par injection - Collecte d’urine (tous les mois pour tous les animaux) sur animal vigile; durée moins d'une minute par anaimal - Imagerie µCT sur animal anesthésié (5 par groupe), durée d'environ 7 minute par animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype âgé est un phénotype dommageable car il peut induire l’apparition de nombreuses maladies. Entre 18 et 24 mois nous nous attendons à avoir 20% de perte d’animaux par mort « naturelle ». Une feuille de score adaptée au vieillissement sera faite pour suivre le bien-être des animaux. On notera que les souris seront systématiquement pesées chaque semaine. Une baisse de 15% du poids de la souris par rapport à la précédente pesée conduira à sa mise à mort.
Devenir
Pour les 2 procédures, nous voulons déterminer l’état physiologique de l’animal et sa durée de vie. Pour cela, nous devons analyser sa survie globale sans souffrance et mettre à mort tous les animaux qui ne seraient pas décédés de causes naturelles pour pouvoir prélever les organes et les analyser en histologie, cytométrie et RNAseq mais aussi de tester les capacités fonctionnelles des cellules ex vivo. L’analyse concernant les tissus ne peut se faire autrement que ex vivo. La mise à mort de l’animal est donc nécessaire afin de pouvoir prélever les organes. Un maximum de tissus seront récupérés afin que de tirer le plus d’information possible de cette expérience. Ainsi, l’objectif scientifique de ce projet nécessite la mise à mort (ou la mort naturelle) de tous les animaux.
Remplacement
La sénescence et le système immunitaire étant un processus intégré impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, ce projet nécessite une étude à l’échelle de l’organisme entier. Notre projet vise à étudier les mécanismes biologiques à l’origine du vieillissement et en particulier à l’origine du vieillissement pathologique. Nous voulons comprendre comment un organisme peut vieillir et déterminer si de nouvelles stratégies thérapeutiques peut empêcher le vieillissement pathologique et l’incidence de nombreuses maladies liées à l’âge. Ces mécanismes reposent sur de nombreuses interactions entre différentes cellules telles que les cellules âgées dites « sénescentes » ou les cellules immunitaires mais également sur la communication entre différents organes. À la vue de la complexité des mécanismes étudiés aucun modèle in vitro ou synthétique ne peut mimer le niveau de complexité de ces interactions ni remplacer l’étude sur l’animal. Seul l’analyse au niveau d’un organisme vivant pourra nous permettre de déterminer si le ciblage des cellules sénescentes par notre anticorps permet de limiter la présence des cellules sénescentes dans les tissus, d’évaluer l’état d’activation du système immunitaire, les conséquences sur l’incidence de maladies liées à l’âge, l’effet sur la longévité et sur l’espérance de vie en bonne santé. En revanche, lorsque les mécanismes principaux seront identifiés, leur étude mécanistique sera réalisée le plus possible par des méthodes de remplacement en réalisant des expériences in vitro de coculture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre minimum de souris pour les 2 approches expérimentales (longévité globale et vieillissement en bonne santé). L’ensemble du projet a donc été conçu pour REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance statistique robuste. Pour cela nous avons utilisé 3 approches complémentaires. - Tout d’abord une analyse complète des données de la littérature sur les agents sénolytiques pour connaitre la taille des effets biologiques et connaitre les nombres d’animaux et les effets statistiques déjà observés. - Ensuite, nous avons choisi de coupler nos analyses avec un suivi longitudinal des animaux par utilisation de l’imagerie par scanner (microCT ; technique équivalente au PET-Scan utilisé en clinique pour l’évaluation de la fibrose chez l’homme mais adaptée au petit animal). Ceci a pour effet de réduire drastiquement le nombre d’animaux en procédant à un suivi individualisé de chaque souris. - Nous avons « croisés » les contrôles pour les 2 procédures. Ainsi, le groupe contrôle recevra 6 IP d’anticorps isotype contrôle et 6 gavages contrôles, le groupe expérimental D+Q recevra 6 gavages de D+Q et 6 IP d’isotype contrôle et enfin le groupe anti ganglioside recevra les 6 IP d’anticorps anti ganglioside et 6 gavages contrôles. Ceci est exactement identique pour les 2 procédures. Cette stratégie a permis de supprimer complètement un groupe contrôle et donc de réduire le nombre d’animaux utilisé. - Nous réaliserons les 2 procédures en parallèle puisque les animaux sont issus du même lot chez le fournisseur et seront stabulés initialement et traités exactement de façon identique. Ceci permettra de comparer les résultats entre les 2 procédures, d’utiliser les mêmes animaux contrôles de 18 mois (les 15 animaux t0) et donc de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés en évitant de reproduire des contrôles inutilement. - Enfin, nous avons calculé précisément la grandeur de l’effectif nécessaire pour notre étude grâce au logiciel Gpower avec un test ANOVA oneway de puissance statistique de 0.8 associé à un effet taille moyen calculé sur les données déjà publiées d’effet de sénolytique (0.5) pour p≤0.05.
Raffinement
Les procédures de ce projet comprennent les éléments de raffinement suivants : Suivi quotidien des animaux, à l’aide d’une fiche de suivi appuyée par une grille de score clinique comprenant des points limites précoces et adaptés. Les animaux sont hébergés dans des pièces spécifiquement dédiées aux expériences sur le vieillissement permettant d'exercer un suivi plus précis et de limiter le stress et les risques de contamination en réduisant le passage dans ces zones. La conservation d’une cohésion sociale durant la durée de vie de l’animal. L’ajout d’éléments supplémentaire d’enrichissements incluant des maisons à ronger et des twists pour modifier la nidification en complément de l’enrichissement standard incluant des maisons rouges solides et des cotons carrés. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs afin de les habituer et de limiter le stress lors des procédures. Les protocoles d’imagerie non invasive permettant un suivi longitudinal sont menés sous anesthésie gazeuse. L'ensemble de ces mesures de raffinement visent à assurer le bien-être des animaux et assurer des résultats scientifiques de qualité pour éviter toute reproduction expérimentale inutile.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix avec une physiologie proche de l’homme (squelette osseux, poumons) et un cycle de vie relativement court (animal âgé à 18 mois). Chez la souris, les mécanismes de réparation et de dérégulation de la physiologie des tissus sont très bien décrits. Ils permettent une analyse précise de l'ensemble des phases mises en jeu au cours de ces évènements biologiques. Le modèle murin choisi est le seul nous permettant une approche intégrative des processus impliqués dans les maladies liées à l’âge. En effet, il permet d’étudier de façon concomitante les cellules immunitaires, les cellules sénescentes, l’avancement des maladies et l’expression du ganglioside. La physiopathologie des tissus est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour en tirer des données exploitables. La souris est le seul modèle accessible pour ce genre d’étude afin de répondre au questionnement scientifique de ce projet. Des souris âgées de 18 mois au début des expérimentations seront utilisées. Voulant étudier un large panel de maladies liées à l’âge et à la sénescence, le modèle le plus pertinent est donc d’utiliser des souris en vieillissement, soit ici 18 mois d’âge équivalent à 60 ans chez l’Homme. Les deux procédures décrites ici utiliseront donc des animaux au même stade de développement. Les données de la littérature montrent que certains phénotypes liés à l’âge émergent à partir de 12 mois mais que leur incidence est significativement plus élevée à partir de 18 mois. Pour analyser les capacités thérapeutiques de l’anticorps anti ganglioside et les conséquences de celui-ci sur l’émergence de ces maladies liées à l’âge et la longévité des animaux, nous allons utiliser donc des souris adultes âgées de 18 mois. Ceci nous permettra d’étudier comment le traitement fonctionne dans un organisme déjà vieillissant. D’autre part, en démarrant l’étude avec des animaux issus des mêmes croisements et directement âgés, en provenance du même fournisseur et avec un statut sanitaire SOPF très contrôlé, nous limiterons les effets de variabilité expérimentale.
Etude pilote: implantation de cellules graisseuses dans le poumon présentant des lésions de fibrose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système respiratoire
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, après dissection de la peau, elles reçoivent dans la trachée une injection d'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, puis une greffe de cellules précurseurs de cellules graisseuses, avant mise à mort et prélèvement des poumons au 21e jour. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il présente le projet comme une étude de faisabilité et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un "organe entier".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie rare, chronique et progressive de cause inconnue. Elle est très sévère, avec une survie inférieure à 30% à 5 ans après le diagnostic. Cette maladie se caractérise par des dommages pulmonaires liés à une cicatrisation anormale et chronique, avec l'accumulation de tissu fibreux (fibrose) menant à la destruction des alvéoles pulmonaires. Ces alvéoles sont de minces sacs creux qui prolongent les voies respiratoires, où se déroulent les échanges gazeux avec le sang; elles sont essentielles à la respiration. L'accumulation de tissu fibreux dans le poumon est en grande partie due à l'accumulation de fibroblastes et à leur activité de sécrétion de différents facteurs. Ces fibroblastes sont des cellules d'aspects fusiformes, normalement présentes dans le tissu; ils sont parfois appelés "cellules de soutien". Dans la FPI, les processus menant à la fibrose sont encore mal connus. Or, des travaux récents ont mis en évidence la présence de cellulles graisseuses dans les poumons de patients atteint de FPI. De plus, des données ont montré que ces cellules graisseuses diminuaient in vitro l'activité des fibroblastes de fibrose. Dans d'autres organes, le tissu graisseux a une influence démontrée sur la fibrose (foie, rein, coeur). Nous souhaitons donc étudier son rôle potentiel dans la fibrose pulmonaire. Cependant, des travaux préliminaires n'ont pas permis de mettre en évidence de cellules graisseuses chez la souris dans les modèles de fibrose pulmonaire. Dans le cadre de ce protocole (étude de faisabilité d’une durée de 1 an), la greffe de cellules donnant naissance à des cellules graisseuses dans le poumon sera testée dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces expériences préliminaires de transplantation de précurseurs de cellules graisseuses permettront de démontrer la faisabilité de cette approche pour étudier le rôle des cellules graisseuses dans la fibrose pulmonaire. Il s'agit d'une première étape importante afin d’identifier le tissu graisseux pulmonaire associé à la fibrose pulmonaire comme potentielle cible thérapeutique dans cette maladie mortelle.
Procédures
En début de procédure (jour 1), les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répété. Cette intervention dure 5 à 10 minutes pour chaque souris. Cinq jours plus tard, les souris recevront une injection unique de cellules capables de donner naissance à des cellules graisseuses (cellules précurseurs), soit au travers de la paroi thoracique, sous anesthésie gazeuse brève (5 minutes), soit via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale, (10 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure (jour 21), les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons.
Impact sur les animaux
L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et de la motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et de la motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon leur état général et leur poids.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. Les prélèvements seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'un seul protocole complet au cours de leur vie.
Remplacement
Le modèle murin est pertinent de par son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.
Raffinement
Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement concomitament de l'anesthésie. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon une grille d'évaluation (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, douleur, etc.): en cas d'atteinte d'un ou plusieurs point limite, les animaux seront sortis de la procédure et euthanasiés. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront suivies de manière rapprochée. La douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle souris est pertinent car son système respiratoire est proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Role des cellules dendritiques dans les infections virales locales et systémiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5046 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 860 d'entre elles en gravité sévère. Elles sont infectées par trois virus, un cytomégalovirus, un virus de la chorioméningite et un virus de la grippe, administrés par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou nasale, pour étudier le rôle d'un type de cellule immunitaire dans la défense antivirale. Le porteur indique surveiller la perte de poids et euthanasier les souris atteignant un point limite. Il affirme que la mesure de la réponse immunitaire "nécessite" un organisme vivant et complet, et que la souris est le modèle "le mieux approprié" du fait de sa génétique.
Objectifs
Le système immunitaire protège l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules dendritiques (DC) appartiennent au système immunitaire et agissent comme sentinelles du système immunitaire Lorsqu’un pathogène est détecté, elles transmettent des signaux qui initient et orchestrent les réponses immunitaires. Les DC se divisent en conventionnelles (cDC) et plasmacytoïdes (pDC). Les cDC agissent principalement comme présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T, qui à leur tour contrôlent l’infection et génèrent des cellules ayant mémoire du pathogène. Les pDC sont la principale source de molécules, dites Interférons (IFN), produites au cours des infections virales. Presque toutes les cellules du corps répondent aux IFN en produisant des molécules capables de bloquer les différentes phases du cycle virale (immunité intrinsèque). De plus, la réponse aux IFN est indispensable pour activer les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. Les pDC sont ainsi considérées clef dans l’immunité antivirale. Notre hypothèse est que les pDC exercent des fonctions différentes selon le type de virus et/ou d’infection qu’il engendre. Après infection, la réplication du virus peut rester limitée à l’organe d’entrée (infection locale) ou s’étendre à tout l’organisme (infection systémique). Généralement, les virus sont éliminés par l’hôte, mais, parfois, ils persistent sous forme latente ou génèrent une infection chronique. Notre objectif principal est de déterminer quelles fonctions exercent les pDC dans ces différents types d’infection. Nous étudierons la localisation et l’état d’activation des pDC présentes dans les tissus infectés dans les souris pDC-Tomato, qui permettent d’identifier spécifiquement les pDC par fluorescence. Ensuite, nous évaluerons l’impact de la perte des pDC au cours de l’infection en utilisant les souris pDC-less, qui ont un déficit sélectif en pDC. Nous infecterons nos modèles murins avec les trois virus suivants: le cytomégalovirus murin (MCMV), le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) et la souche A du virus de la grippe (IAV). IAV induit une infection locale restreinte au système respiratoire, alors que MCMV et le LCMV induisent des infections systémiques. Le MCMV persiste dans l’hôte, mais sous forme latente. En revanche, LCMV est éliminé par l’hôte, sauf dans le cas de certaines souches qui établissent des infections chroniques.
Bénéfices attendus
Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les fonctions des pDC dans l’immunité anti-virale. L’identification des mécanismes moléculaires qui instruisent les différentes fonctions des pDC murines ouvriront des perspectives de nouveaux traitements pharmacologiques visant à inhiber ou promouvoir l’activation des pDC humaines selon les différents contextes pathologiques. Nous pourrons étendre nos études à l’homme car nous avons développé dans notre laboratoire des cultures de pDC humaines dérivées de précurseurs hématopoïétiques du sang de cordon. Nous pouvons ainsi étudier dans ces pDC les conséquences fonctionnelles de la perte d’expression d’un gène candidat grâce à des technologies d’ingénierie génétique. Nous déterminerons si les mécanismes moléculaires identifiés chez la souris sont conservés dans les pDC humaines et, si oui, quel est l’impact de leur inactivation.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. L'infection systémique par MCMV sera effectuée par voie intraperitoneales sur des souris vigiles. Cette infection dure une minute/souris. Les infections LCMV clone Armstrong et IAV seront effectuées par voie intranasale sur des animaux anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine/xylasine (injection intraperitonéale). L'infection par voie intranasale dure 1 minute/souris et les souris se réveillent 30 minutes après l'injection de l'anesthésie. L'infection LCMV clone 13 sera effectuée par voie intraveineuse sur des souris anesthésiées avec de l'isofluorane. L'infection par voie intraveineuse dure 1 minute/souris, le traitement par anesthesie dure 5 minutes/souris. Dans certaines expériences nous prélèverons le sérum des souris infectées. Cela sera effectué une seule fois par prélèvement retrorbitale et sur animaux anesthésiés avec isoflurane. L'anesthésie plus le prélèvement durent en totalité 5 minutes. Le volume de sang prélevé sera de maximum 200µl.
Impact sur les animaux
Nous surveillerons différents paramètres, comme la perte de poids, la douleur, le stress, l’inactivité, une mobilité réduite, ainsi que tout comportement anormal, induits dans toutes les procédures sévères de notre projet. Nous définirons une grille de score spécifique à chaque modèle d’infection et nous surveillerons quotidiennement les souris infectées. Lorsque les souris auront atteint un score correspondant à un point limite nous procéderons à l’euthanasie immédiate des souris souffrantes.
Devenir
Mise a mort de tous les animaux
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours des différents modèles d’infections virales in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Ainsi le modèle murin est un modèle de choix pour notre étude.
Réduction
Nous utiliserons 5046 souris pour mener à bien cette étude. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène C57BL/6J pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Ainsi, chaque expérience devrait pouvoir être répétée indépendamment deux fois, avec 4-5 animaux par groupe, minimum requis pour s’assurer de la bonne reproductibilité des résultats.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles exemptes d'organisme pathogène spécifique (EOPS). La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Un animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs, notamment pour les animaux placés en hauteur car trop exposés à la lumière. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans chaque procédure et des grilles de score spécifiques à chaque modèle d'infection seront utilisées pour le suivi des souris infectées. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes dont le système immunitaire est mature. Elles auront entre 6 et 12 semaines. Dans le cas spécifique de chimères de moelle osseuse appellées « shield » nous utiliserons des souris agées de 4 semaines au moment de la reconstitution (voir procédure 1).
Etude chez la souris de la toxicité pulmonaire de nouveaux conjugués Anticorps/Drogue
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps, trois expositions intranasales à la bléomycine et une trachéotomie sous anesthésie sans réveil, pour provoquer une fibrose pulmonaire et mesurer la toxicité de nouveaux conjugués anticorps-médicament anticancéreux. Le porteur indique que le modèle entraîne une perte de poids et des difficultés respiratoires liées à la fibrose induite. Il présente ces études comme "essentielles" pour sélectionner le candidat le moins toxique avant une première administration chez l'humain, les bénéfices annoncés pour la santé humaine restant à moyen terme.
Objectifs
Les modèles animaux permettent l’étude des effets positifs et négatifs de drogues anticancéreuses à l’échelle de l’organisme. Ces études précliniques sur l’animal permettent la validation de thérapies anticancéreuses plus efficaces et moins toxiques pour le traitement des patients. Les études proposées visent à évaluer l’induction d’une fibrose pulmonaire chez l’animal par de nouvelles molécules développées pour être des traitements anticancéreux. Connaître ce paramètre pour un composé permet de prédire l’apparition de toxicités pulmonaires observées chez l’Homme avec ce type de traitements. Les études proposées portent sur différents variants d’un anticancéreux en développement et visent à déterminer lequel des composés présente le profil de toxicité le plus favorable, afin de le qualifier pour un développement préclinique plus poussé
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra d’étudier l’impact du design du conjugué anticorps-médicament sur la toxicité pulmonaire. Ces études sont essentielles pour la sélection du ou des ADC (anticorps-drogue conjugué) induisant le moins de toxicité pulmonaire, et de sélectionner le candidat médicament pour les études précliniques réglementaires avant une première administration chez l’homme.
Procédures
Injection d'anticorps : nombre 1 durée : quelques secondes Exposition intra nasale a la bléomycine : nombre 3 durée : quelques secondes. Trachéotomie : nombre 1 : Durée 30 minutes sans réveil.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles inherentes au modèle telles qu'une perte de poids, une apprition d'une fibrose induisant des difficultées respiratoire
Devenir
Toutes les souris seront mise a mort en fin de procédure pour analyses. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes. De ce fait nous utiliserons les tests de Mann-Whitney si la comparaison se fera entre 2 groupes ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est supérieur à 2. Ces tests reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer l’induction d’une toxicité pulmonaire par un composé, nécessitant ainsi l’utilisation d’un modèle animal. Des études in vitro et in vivo ont été réalisées en amont afin de sélectionner uniquement les molécules ayant le plus grand intérêt thérapeutique pour l’étude de toxicité pulmonaire.
Réduction
Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse statistique pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux, à savoir 8 souris par groupes.
Raffinement
Avant le début des procédures, les souris seront habituées aux expérimentateurs de l’étude par une observation quotidienne, afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur stress et leur détresse. Des points limites adaptés comme une surveillance quotidienne, des pesées régulières (1 fois par semaine) ont été définis pour détecter et minimiser toute souffrance, toute douleur et tout stress des animaux.Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les animaux seront hébergés 4 femelles par cage (cages : hauteur supérieure à 15cm, surface de 500cm2) dans un environnement enrichi pour limiter le stress. L’enrichissement choisi consiste en la présence d'un dome et de frissotis.
Choix des espèces
La modélisation de la toxicité pulmonaire par la bléomycine est une méthode très répandue chez la souris. Pour cette procédure, nous avons besoin d’utiliser des souris de 6 semaines ayant un système immuniatire mature.
Modèles conditionels pour étudier la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Un modèle de dystrophie myotonique est induit par la doxycycline, y compris chez des souriceaux étudiés jusqu'à sept jours de vie pour leurs vocalises, leur respiration et leur alimentation, 160 animaux étant tués sans réveil par perfusion d'un fixateur. Le porteur indique que les effets attendus des souris induites sont neurologiques et présente les autres actes comme légers. Il cherche à créer un modèle "plus performant" de la forme congénitale de la maladie et qualifie ce développement d'étape "incontournable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) conditionnel de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du cerveau permettant de décortiquer les mécanismes physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) étudier les impacts physiopathologiques des ARN DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris nouveau-nés transgéniques: analyses phénotypiques, histologiques, moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle permettra de déterminer l'implication des motoneurones des nerfs craniaux et spinaux dans la pathologie notamment dans la forme grave néonatale. L'obtention et l'étude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 848 souris de ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modérée et sans réveil. De séverité légère, sont concernées 96 souris qui seront utilisées pour l'étude des vocalises à 7 jours avec 3 minutes comme durée d'acte . De sévérité modérée, sont concernéees 592 souris: - les souris meres (128 souris) qui recevront la doxycycline au stade E11et P1 jusqu’à 7 jours, - les 16 souris qui permettront la validation du modèle après injection de l'inducteur doxycycline en injection intra-péritonéale sur une durée de 4 jours. - les 96 souris utilisées pour optimisation de la concentration de doxycycline. Cet acte durera jusqu à 7 jours de vie. - les 96 souris utilisées pour l'étude de la respiration par pléthysmographie à 7 jours. Cet acte dure au maximum 1h - les 96 souris utilisées pour l'étude de l’alimentation sur une durée de 7 jours. - les 160 souris utilisées qui recevront la doxycycline pour les etudes moléculaires jusqu’à 7 jours de vie. De classe sans réveil, sont concernées les 160 souris utilisées pour les études histologiques , perfusées au PAF pendant une durée d environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement neurologiques compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique).
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements qui sont nécessaires pour les analyses post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (mâles et femelles) seront utilisés soient 848 animaux. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques finales seront réalisées avec des lots suffisants dont le nombre a été établi par un calcul mathématique lors d’études precedents. Nous avons ainsi déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Il sera ensuite nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30- 18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques que nous avons créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie, nous permettent d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau ADN, ARN et protéines dans différents tissus, chez l'embryon et la souris adulte. Ce projet vise à comprendre les mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle murin conditionnel de la forme congénitale de la dystophie myotonique de type 1. La forme congénitale est “reproduite” chez les souriceaux d’ou le choix des analyses à 7 jours de vie.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Etudes cliniques, pathologiques et virologiques de l’infection de SRAS-CoV-2 chez deux modèles de rongeurs. Evaluation de traitements thérapeutiques et vaccinaux.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Hamsters dorés : 1000
2 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SRAS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie puis reçoivent des traitements ou des vaccins, l'infection étant létale chez la souris transgénique hACE2 avec atteinte du système nerveux central. Le porteur indique que la mise à mort est imposée par la gestion du risque lié à l'agent pathogène. Il présente cette recherche sur modèles animaux comme "essentielle" à la gestion de la crise sanitaire.
Objectifs
Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SRAS- CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SRAS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SRAS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire des rongeurs modèles de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SRAS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, en particulier muqueux, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SRAS-CoV-2.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.
Procédures
L’inoculation de la souche virale est réalisée en 8 minutes, par voie nasale sous anesthésie à l’isoflurane, en prise unique. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés en 2 minutes, par voie sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire à l’animal vigile. Le traitement par voie nasale est administré en 8 minutes sous anesthésie à l’isoflurane. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés en 10 minutes, au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié. Le volume de sang prélevé est de 100 à 300 μl selon l’espèce.
Impact sur les animaux
Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SRAS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection. En revanche, dans les mêmes conditions, l’infection est létale chez la souris transgénique hACE2 à 7 jours post-infection avec une perte de poids et une infection du système nerveux central conduisant à une chute de l’activité motrice et des capacités respiratoires. Cette lignée de souris est la seule à ce jour qui présente une létalité. L’impact physiopathologique de l’infection des autres lignées de souris utilisées dans ce projet sera systématiquement évalué. Il a été observé que l’infection de souris non transgéniques pour hACE2 par la souche murinisée MACo3 entraîne des symptômes légers ou modérés.
Devenir
La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.
Remplacement
L’étude de la physiopathologie de l’infection ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies vaccinales et thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées (cellules VeroE6 ou Calu3). L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SRAS-CoV-2 ainsi que le choix de l’antigène vaccinal sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l'innocuité et l’efficacité du traitement.
Réduction
Les modèles d’infection à SRAS-CoV-2 chez les rongeurs sont validés et totalement maîtrisés. L’utilisation de la souche historique française dénommée D614G définit les conditions standard des protocoles expérimentaux auxquelles se réfèrent l’étude des variants préoccupants ou VoC. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de Répétabilité et Reproductibilité satisfaisantes. La comparaison des traitements s’établit à l’aide de tests non paramétriques (Mann-Whitney).
Raffinement
Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les hamsters sont hébergés individuellement et les souris par 5 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.
Choix des espèces
Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SRAS-CoV-2 et représente un modèle de choix pour étudier la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires, l’animal contrôlant naturellement l’infection. La souris transgénique K18 ou KI exprime le récepteur humain ACE2 au SRAS-CoV-2 et permet le développement clinique et virologique des infections à SRAS-CoV-2. La souris non transgénique pour hACE2 est sensible à l’infection par la souche murinisée MACo3 et présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt (surexpression ou suppression) nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des hamsters ou des souris de 6 à 8 semaines d’âge. Mais des hamsters plus âgés (> 6 mois) pourraient être enrôlés dans des études spécifiques selon l’évolution des connaissances.
Mise au point d’un système de conservation statique actif des greffons pulmonaires : création d’une glacière perfusante connectée
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
12 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit un prélèvement du bloc cœur-poumon pour évaluer un nouveau dispositif de conservation des greffons pulmonaires par perfusion à froid. Le porteur présente le porc comme l'animal de référence pour l'étude du poumon isolé, ses organes étant proches de ceux de l'humain. Il justifie la mise à mort par la nécessité d'évaluer la fonction pulmonaire et d'éviter une transplantation tant que le bénéfice du dispositif n'est pas prouvé.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de créer un nouveau dispositif médical de transport d’organe, capable de perfuser du liquide de conservation, avec une température contrôlée, afin de diminuer le risque de défaillance primaire du greffon. Il comprendra un monitorage continu des paramètres de perfusion transmis aux chirurgiens via une application Bluetooth, offrant un outil de première évaluation de la qualité de l’organe. L’application intégrera un GPS permettant aux différents intervenants (chirurgiens du prélèvement et de l’implantation, anesthésistes) de connaitre la position de greffon en temps réel afin de mieux coordonner les équipes et donc de réduire le temps d’ischémie. Avant de chercher un investissement industriel, nous souhaitons faire une étude de faisabilité pour vérifier que la perfusion hypothermique n’est pas nocive pour le poumon.
Bénéfices attendus
Les avantages attendus de la glacière perfusante connectée sont nombreux: monitorage continu des constantes du greffon ce qui permettra de l’évaluer et d'anticiper ses performances chez le receveur; alarmes paramétrables: en cas de détection d’une anomalie, la perfusion s’arrêtera pour éviter toute lésion d’hyperpression mais la température cible restera maintenue afin de protéger le greffon; perfusion par un soluté dédié permettant un lavage des débris intravasculaires pulmonaire, une diminution de la charge immunologique du greffon du donneur vers le receveur et un effet anti-oedémateux et anti-inflammatoire. De plus cette glacière permettra un refroidissement homogène de l’organe à la température optimale de +10°C (la température n’est pas surveillée dans les glacières et une importante hétérogénéité de température des greffons est constatée) et ce pour tous les greffons.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 20 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant au prélèvement du bloc coeur-poumon à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure. En cas d’échec de l’anesthésie/analgésie au cours de l’expérimentation, l’animal sera euthanasié. La mort de l’animal sera confirmée par l’arrêt permanent de la circulation (arrêt d’activité cardiaque suivie par ECG).
Devenir
La finalité de l'étude est d'évaluer la fonction pulmonaire et les lésions du greffon pulmonaire après perfusion hypothermique. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour évaluer la fonction pulmonaire lors de notre protocole (durée 6h). Il n'existe pas d'autre modèle pour étudier ce système de conservation. Le sort prévu à ces animaux permet d'éviter une transplantation des organes prélevés tant qu'il n'existe pas de preuve du bénéfice de ce système de préservation pulmonaire.
Remplacement
Du fait de son anatomie et sa physiologie respiratoire, le porc est l’animal de référence pour l’étude de la perfusion de poumon isolé. Le matériel dont nous nous servons (glacière et machine de perfusion, avec sa connectique) est celui utilisé chez l’homme afin d’assurer une bonne applicabilité future. Ils imposent d’utiliser des poumons similaires anatomiquement et physiologiquement à ceux d’un humain.
Réduction
Nous avons choisi de réaliser une évaluation physiologique, biologique et scannographique des organes isolés seulement pour comparer les deux méthodes de conservation. Nous évitons ainsi le recours à un modèle de transplantation pulmonaire qui aurait nécessité le double du nombre d’animaux (un donneur et un receveur). Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est évalué à 12, soit 6 par groupe, afin de pouvoir réaliser des comparaisons entre les groupes via des tests statistiques.
Raffinement
Période d’acclimatation de 7 jours entre l’arrivée dans le service et l’inclusion dans le protocole. Arrivée et hébergement en groupe pour vivre entre congénères. Environnement enrichi avec : promenade régulière, planche à gratter, distributeur de nourriture. Evaluation quotidienne du bien être animal seon plusieurs grilles d'avaluations. Ce protocole ne comprend aucune expérimentation ou acte invasif sur un animal conscient (anesthésie générale sans réveil).
Choix des espèces
La machine de perfusion que nous utilisons est faite pour des organes humains et impose donc d’utiliser des organes similaires, tant sur le plan des paramètres de perfusion que de la connectique. Le porc charcutier a des poumons proches de ceux d’un humain sur le plan anatomique et physiologique (fréquence cardiaque 100 battement/mn, débit cardiaque 3-5 L/mn, pression artérielle pulmonaire moyenne < 15mmHg). Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une physiologie cardio-pulmonaire semblable à l’homme et des poumons du même ordre de grandeur.
Compréhension des mécanismes expliquant l’activité anti-pseudomonale de deux souches de Lactobacillus dans un modèle murin de pneumonie à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
84 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Anesthésiées à l'isoflurane, elles reçoivent dans les narines une instillation de Pseudomonas aeruginosa, bactérie responsable de pneumonies, puis sont tuées 24 heures plus tard. Le porteur indique que les souris recevant seulement la bactérie peuvent subir une perte de poids, des douleurs et une mobilité réduite. Il affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des cultures cellulaires et choisit donc de conserver le modèle animal pour tester des probiotiques.
Objectifs
Contexte : Pseudomonas aeruginosa est la première bactérie responsable de pneumonies nosocomiales. Ces pneumonies à P. aeruginosa sont grevées d’une mortalité variant de 30 à 70%. Cette bactérie colonise également les voies aériennes inférieures de 40% des patients atteints de mucoviscidose âgés de plus de 18 ans, entraînant une dégradation respiratoire. Cette bactérie, qui possède déjà de nombreuses résistances innées, peut acquérir des résistances à d’autres antibiotiques voire à tous les antibiotiques habituellement actifs. Cette quasi résistance à tous les antibiotiques disponibles conduit à des impasses thérapeutiques d’où la nécessité d’alternatives aux traitements par antibiotiques. Les probiotiques, qui sont des bactéries bénéfiques pour la santé de l’hôte, et notamment les Lactobacillus qui semblent avoir une efficacité dans le traitement de ces infections.
Bénéfices attendus
Les nouvelles données obtenues grâce à ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’action bénéfique in vivo des Lactobacillus vis-à-vis des pneumonies à Pseudomonas aeruginosa, pathogène souvent responsables d’infection respiratoire chez les patients atteint de mucoviscidose et entrainant un déclin de leur fonction respiratoire) et sujet à une résistance aux antibiotiques importante et croissante. Si plusieurs des mécanismes d’action envisagés sont impliqués (immunomodulation, préservation de la barrière alvéolo-capillaire), il existera des arguments importants pour la construction future des essais cliniques de phase I pour valider cette thérapeutique alternative aux antibiotiques.
Procédures
Les souris seront pesées dès leur arrivée à l’annexe de l’animalerie infectieuse, et quotidiennement jusqu’à leur mise à mort, soit une fois par jours pendant 4 jours, ce geste dure environ 30 secondes. Ensuite, les animaux seront préalablement anesthésiés avec de l’isoflurane gazeux afin de leur administrer deux instillations intranasales à 18h d'écart ; nous déposons, à l’aide d’une pipette à l’entrée des narines des souris une suspension qui sera inhalée par la souris via ses mouvements respiratoires naturels. Ce geste est très court, également environ 60 secondes.
Impact sur les animaux
Ce projet peut induire un stress chez les animaux lors des pesées quotidiennes (30 secondes). Ce stress peut exister également lors de l’anesthésie gazeuse (30 secondes) nécessaire à l’instillation intranasale, technique qui permet l’introduction de bactéries au niveau pulmonaire et qui prends moins de 30 secondes. Le temps total incluant l’anesthésie, l’instillation et la récupération de l’animal dans la cage est d’environ 60 secondes. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa (souche de laboratoire PAO1) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire une inactivité.
Devenir
Les 84 souris C57BL/6 mâles seront mises à mort 24h après l’instillation de Pseudomonas aeruginosa
Remplacement
Les données de la littérature et les résultats obtenus dans nos précédentes études in vivo mettent en avant les effets bénéfiques des Lactobacillus sur les pneumonies à Pseudomonas aeruginosa. Nous souhaitons donc poursuivre sur cette voie en analysant les mécanismes d’actions des Lactobacillus au niveau du parenchyme pulmonaire ; la cytométrie de masse en image sur le tissu pulmonaire permet d’analyser ex vivo sur une même coupe les cellules épithéliales respiratoires, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P.aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P.aeruginosa et celui recevant du Lactobacillus préalablement à l’instillation de P.aeruginosa, à l’aide d’un test de Student réalisé sur les données log-transformées afin de respecter la condition de normalité requise. En cas d’écart à la normalité persistant malgré cette transformation, un test non paramétrique de Mann-Whitney sera utilisé. La différence attendue sur les données transformées est donc de 1 point pour un écart type de 0,6 point (données personnelles). Afin de garantir une puissance de 80 %, 6 souris sont nécessaires dans chaque groupe lorsque ce groupe est comparé au groupe contrôle P. aeruginosa. Pour chacune des 3 expérimentations, le nombre total sera de 84.
Raffinement
Avant toute instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés par isoflurane gazeux. Une analgésie sera mise en place en fonction de notre table de suivi de soin par injection de buprénorphine pour réduire au minimum la douleur. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie sans augmenter les inoculums de Pseudomonas (comme pour les souris BALB/c en particulier qui sont naturellement plus résistantes. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Évaluation de la biodistribution de bactéries thérapeutiques (LBP : Live Biotherapeutic Products) après leur administration dans les voies respiratoires du macaques cynomolgus
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.
Objectifs
Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.
Procédures
L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.
Impact sur les animaux
L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.
Remplacement
L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.
Réduction
Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.
Raffinement
Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.
Choix des espèces
La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.
Étude de l’activité anti-Pseudomonas aeruginosa d’une souche clinique de Porphyromonas instillée en prophylaxie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris reçoit deux instillations nasales de suspensions bactériennes à dix-huit heures d'intervalle, puis est tuée vingt-quatre heures plus tard pour récupérer ses poumons ou réaliser des lavages, les groupes recevant Pseudomonas aeruginosa pouvant perdre du poids et devenir inactifs. Le porteur affirme ne pas pouvoir répondre à sa question avec des outils de culture cellulaire et choisit donc de conserver le modèle animal. Il retient la souris pour sa sensibilité permettant de provoquer une pneumonie sans mortalité trop importante.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer le mécanisme d’action de cette souche potentiellement bénéfique avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart. 24h plus tard, les animaux sont mis à mort avant récupération des poumons ou réalisation de lavages broncho alvéolaires.
Impact sur les animaux
Ce projet a été conçu pour minimiser les effets indésirables. Ce projet peut induire un stress chez les animaux. Un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec une table de suivi de soins permettent également une diminution de ses effets. Les groupes recevant seulement Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 ou Pseudomonas aeruginosa résitant à plusieurs antibiotiques (PA MDR) peuvent être sujets à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec la table de soins. Pour les groupes recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.
Devenir
Les 90 souris C57BL/6 mâles survivantes sont mis à mort à l’issu du protocole
Remplacement
Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer son effet sur le système immunitaire. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.
Réduction
Approche statistique : Le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant uniquement du P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous avons choisi de suivre nos souris uniquement jusqu’à 24 h post-infection et non 7 jours pour limiter le nombre d’individus en nous basant sur l’expérience apportée par notre équipe lors de DAP précédentes. Nous nous limitons à une seule espèce de Porphyromonas (P. catoniae) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon et une seule souche clinique parmi les 7 isolées par notre équipe.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table de suivi de soins. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux
Choix des espèces
Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Respir’Ante: Etude de l’alvéolisation chez la souris en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au modéré. Les mères gestantes reçoivent un régime appauvri en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance, et une partie des souriceaux subit une injection intrapéritonéale quotidienne pendant dix jours avant d'être tués pour prélever leurs poumons entiers, d'autres étant anesthésiés puis curarisés pour explorer leur fonction respiratoire. Le porteur affirme que ce régime est le modèle le moins invasif et que l'étude d'un organe aussi complexe que le poumon ne permet pas pour le moment de méthode de remplacement. Les retombées annoncées, un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains, sont renvoyées au moyen terme.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir une alvéolisation pulmonaire anormale chez le nouveau-né prématuré. L'alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de souris en étudiant la morphométrie et la fonction respiratoire ii) de mieux caractériser les différents types cellulaires dans le poumon et leur répartition grâce à la technique du Single Cell RNA seq et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des analogues de la voie PPAR ou SREBP (Sterol Response Element Binding Protein) en se basant sur une culture cellulaire en 3D créant in vitro un poumon aussi appelé organoïde alvéolaire.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les souris femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des souriceaux (n=32 sera anesthésiée puis curarisée pour explorer leur fonction respiratoire (âge aux eplorations fonctionnelles: 21 à 60 jours, durée des explorations: 1 jour). Une partie des souriceaux (n=288) recevra du premier jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse de 100µL maximum (injections une fois par jour pendant 10 jours) . Les animaux seront mis à mort ensuite pour analyser leurs poumons entiers en utilisant des organoïdes alvéolaires. Le reste des animaux (n= 200) sera anesthésiée avant mise à mort pour analyse de poumons selon les différentes techniques proposées (ScRNAseq, morphométrie ou organoïdes alvéolaires) (Mise à mort au 120ème jour de vie maximum sans procédure durant leur vivant).
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication observée pour elles-mêmes ou leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur induite par l'injection elle-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les souriceaux seront mis à mort.
Devenir
Les souris gestantes seront gardées en vie à la fin de la procédure 1 (régime) pendant au moins 3 semaines. Les souriceaux recevant les injections (procédure 3) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les souriceaux de la procédure 2 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les animaux seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement de l'ensemble des poumons.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les souris gestantes seront exposées pendant toute la gestation à un modèle de restriction protidique LPD ou à un régime contrôle. Les souriceaux issus de ces souris seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de souris et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des souriceaux (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les souriceaux. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les souriceaux seront euthanasiés. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de plus de 20 % de poids, la souris gestante sera sortie de l'expérimentation et euthanasiée (CO2).
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer chez la souris et aller plus loin dans les analyses moléculaires. En effet, les possibilités d’analyse avec des anticorps sont plus importantes chez la souris et la mise au point de KO est plus développée chez la souris que chez le rat.