Organes sensoriels
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections de produits de contraste sous anesthésie pour régler les paramètres d'un appareil d'IRM, l'enjeu déclaré étant d'optimiser les réglages de l'imageur plutôt que de produire une connaissance biologique. Le porteur décrit ces injections comme n'entraînant "aucune douleur ou stress" puisque réalisées sous anesthésie, et prévoit la mise à mort des animaux de réforme après la séance comme des animaux extérieurs en fin de projet. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" parce que l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Recherche d’un traitement pour une maladie neurologique rare MCOPS12.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Porteuses ou non d'une mutation liée à une maladie neurologique rare, elles reçoivent quatre traitements par injection, gavage ou alimentation, suivis de tests comportementaux répétés, avant d'être tuées par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque. Le porteur affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et que la mutation "n'engendre aucune souffrance". Les doses testées sont décrites comme faibles, très en deçà de la dose létale.
Objectifs
Des mutations ponctuelles du recepteur à l’acide rétinoique beta (Rarb) sont à l’origine d’une maladie neurologique rare responsable de symptomes cognitifs et moteurs importants et progressifs. En effet, cette pathologie possède un caractère neurodeveloppemental ainsi qu’un caractère neurodégénératif (perte progressive de mobilité, perte de la coordination des membres), avec un pronostique vital ne dépassant pas l’adolescence. Des modèles murins de cette pathologie ont été générés et nous permettront d’étudier les mécanismes associés à ces mutations ponctuelles. Les souris mutantes présentent des symptomes moteurs similaires à ceux observés chez les souris porteuses d’une mutation invalidant complètement l’activité du récepteur. Nos études antérieures ont permis d’identifier le rôle du récepteur dans le dévelopement et dans l’homéostasie de striatum, la structure cérébrale impliquée dans le contrôle moteur et la cognition. Nous avons montré que pendant le développement embryonnaire RARb contrôle le développement d’une sous-population de neurones dans le striatum exprimant le récepteur à la dopamine 1 (Drd1+), alors que à l’âge adulte nous avons identifié son rôle dans la neuroprotection d’une sous population de neurones exprimant le récepteur à la dopamine 2 (Drd2+). Notre premier objectif est de normaliser les symptomes moteurs et cognitifs en modulant la signalisation dopaminergique de deux manières : - Par l’augmentation simultanée de l’activité de la signalisation par les neurones Drd1+ et Drd2+, à la suite de l’administration du traitement L-DOPA, un précuseur de la dopamine, utilisé pour le traitement de la maladie de Parkinson. - Par l’augmentation de l’activité dopaminergique liée aux neurones Drd2+ par l’administration de pramipexol. Notre deuxième objectif est d’utiliser des traitements précoces, déjà utilisés dans la maladie de Parkinson, afin de prévenir l’apparition des symptomes : - L’utilisation de la molécule cGP connue pour son implication dans le neurodégénrescence lorsque qu’elle est dérégulée. C’est un traitement qui est déjà utilisé dans la maladie de Parkinson pour favoriser la survie neuronale. - L’utilisation de rétinyl acetate permettra quant à elle la normalisation de la voie de l’acide rétinoïque qui est extrêmement importante pour le développments et les fonctions striatales.
Bénéfices attendus
Pour chacun des quatre traitements (pramipexol, L-DOPA, cGP et rétinyl acetate), nous testerons des doses faibles afin de normaliser la signalisation dopaminergique dans le striatum ou de prévenir l’apparition des premiers symptomes liés à la neurodégénérescence. Dans ce but, le pramipexol sera injecté (et comparé à des injections de salin (véhicule), qui permettra de contrôler les effets de l’injection) à une dose très faible de 0.2 mg/kg et à une dose faible de 2 mg/kg avant des tests comportementaux (5 differents). Ces traitements seront réalisés sur le même lot d’animaux à 1 semaine d’écart afin d’étudier l’effet dose réponse du traitement. En résumé, la procédure se déroulera comme suit : J 1 : Injection n°1 (0.2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 4 : Injection n°2 (0.2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 7 : Injection n°3 (0.2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 9 : Injection n°4 (0.2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Une semaine de battement entre les injections J 17 : Injection n°1 (2mg/kg) suivie des tests 1 (30min) et 2 (3 x 5min) J 20 : Injection n°2 (2mg/kg) suivie du test 3 (32h) J 23 : Injection n°3 (2mg/kg) suivie du test 4 (30min) J 26 : Injection n°4 (2mg/kg) suivie du test 5 (30min) Toutes les injections seront effectuées avec des aiguilles fines. Les molécules sont injectées à des doses pharmacologiques faibles. Ce dosage est couramment utilisé dans les tests comportementaux chez les souris sans poser de problème. Il est d'ailleurs très largement en deça à la dose létale murine de 168,8mg/kg par injection intra-veineuse. L’administration de L-DOPA se fera par gavage des animaux à une dose de 10mg/kg, qui se fera avant chaque test comportemental. Ces tests seront réalisés de la même manière et dans le même ordre que pour le pramipexol. Le traitement cGP se fera par l’eau des biberons à une dose de 3mg/kg pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux. Le traitement se fera donc par l’intermédiaire des mamans qui allèteront les jeunes souris. A la suite du traitement, les cinq différents tests comportementaux se feront dans le même ordre et de la même manière que décrit pour les traitements au L-DOPA. Enfin, le traitement au rétinyl acetate se fera grâce à une supplémentation de la nourriture avec du rétinyl acetate (1.8mg/kg). Ce traitement sera effectué pendant 8 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux et sera suivi des mêmes tests comportementaux indiqués pour lestraitements au L-DOPA.
Procédures
Tous les traitements notifiés ci-dessous se feront sur 3 groupes distincts d’animaux porteurs, ou non, d’une mutation agés de 15 à 30 semaines pour les traitements au pramipexol et L-DOPA et agés de 6 à 10 semaines pour les traitements au cGP et rétinyl acetate. Dans un premier temps, un traitement au pramipexol (5 secondes par traitement, 12 animaux traités/groupe à 0.2 et 2 mg/kg) et d’un traitement contrôle (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (test 1 = 30min; test 2 = 3 x 5min; test 3 = 32h; test 4 = 30min; test 5 = 30min). Les tests comportementaux 1 et 2 feront suite à la même injection. Les souris changeront de groupe pramipexole-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 8 injections, dont 6 maximum de pramipexol. Dans un deuxième temps, un traitement au L-DOPA (15 secondes par traitement), admisnistré par gavage, (12 animaux traités/groupe) et d’un traitement avec de la solution saline (6 animaux traités au véhicule/groupe), soit un total de 54 mâles et 54 femelles = 108 animaux au total. Ce traitement sera suivi d’un test comportemental et sera réitéré avant chaque nouveau test comportemental (voir ci-dessus). Les souris changeront de groupe L-DOPA-véhicule à chaque test selon un roulement et recevront donc au maximum 4 traitements, dont 3 maximum de L-DOPA. Dans un troisème temps, un traitement au cGP administré dans l’eau des biberons pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux visant à évaluer la motricité et la cognition des animaux traités (identiques aux autres traitements). Dans un quatrième temps, un traitement au rétinyl acetate administré par l’intermédiaire de la nourriture pendant 6 à 10 semaines dès la deuxième semaine de vie des animaux (12 animaux traités/groupe) soit un total de 36 mâles et 36 femelles = 72 animaux. Ce traitement sera suivi par 5 tests comportementaux (identiques aux autres traitements). La moitié des animaux de chacun des quatre traitements = 180 animaux, sera ensuite euthanasiée par perfusion intracardiaque après anesthésie générale. Une vérification de la perte des reflexes au niveau des membres et palpébral est réalisée avant tout acte chirurgical.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal. En effet, les tests comportementaux moteurs effectués avant et après les traitements ne sont pas sujet à causer de la souffrance. Une légère modification de l’activité motrice et cognitive est à prévoir après les traitements, sans toutefois causer d’effets indésirables. Ces effets légers seront perceptibles jusqu’à deux heures après le traitement. De plus, la mutation n’engendre aucune souffrance chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé, permise par le PFA4% administré de manière sistémique par voie intracardiaque.
Remplacement
Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les réseaux neuronaux dans leur ensemble. En effet, la complexité biologique des signalisations dopaminergique et rétinoïdiennes ne permet par de remplacer les animaux par des modèles mathématiques ou in vitro, parce qu’il ne reflettent pas la diversité des mécanismes biologiques observés in vivo.
Réduction
Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés : le nombre d'animaux utilisé (groupe de 12) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues chez des souris à la suite du test qui est le moins discriminant parmis les tests effectués ici, ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques provenant d’autres laboratoires. Une différence significative entre les groupes (de même sexe) sera recherchée par application d’un test statistique cohérent avec les analyses effectuées. De plus, les animaux traités avec le vehicule (contrôle de l’effet des traitements pramipexol et L-DOPA) seront reparti dans deux groupes de 6 animaux (et pas 12 comme pour les autres groupes). En effet la méthode de traitement ne devrait pas modifier le comportement de l’animal, ce qui permettra de regrouper les deux sous groupes lors des analyses.
Raffinement
En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, effectuées avec ou sans injection préalable de composés pharmacologiques. Les molécules pharmacologiques sont utilisées à des doses faibles permettant simplement de révéler des dysfonctionnements ou de limiter/supprimer le phénotype. Des plus, les points d’injections de promipexol seront alternés entre les côtés gauche et droit de l’abdomen de l’animal. Ils seront attentivement surveillés pendant les heures suivant l’injection afin d’éviter toute infection.
Choix des espèces
Pour étudier le rôle de les mutations du gène RARb (identifiée chez l’homme) dans la mise en place et la progression de la maladie MCOPS12, les performances comportementales et les fonctions du système dopaminergique, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain et de la disponibilité de différentes lignées porteuses de mutations géniques ciblées permettant de couvrir l’ensemble des processus physiopathologiques : neurodégénérescence et neurodéveloppement. Pour les tests programmés nous utiliserons dans la plupart des cas des animaux adultes d’entre 15 et 30 semaines afin d’oberver les changements de comportements des animaux à la suite des traitements et de diminuer l’hétérogénéité des résultats qui pourraient être apporté par l’augmentation de l’âge des souris. Pour les tests au cGP et au rétinyl acetate, les animaux seront testés entre 6 à 10 semaines pour évaluer l’effet des traitements directement après l’arret de ces derniers.
Etude fonctionnelle d’un mécanisme de restauration de la vision par stimulation optogénétique des photorécepteurs de la rétine chez le macaque cynomolgus.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraoculaire de vecteurs viraux, des examens oculaires répétés et des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis leurs yeux sont prélevés après mise à mort, pour tester une restauration de la vision par optogénétique. Le porteur décrit des contentions répétées, une perte de poids postopératoire et de rares réactions inflammatoires de l'oeil. Il affirme que les rongeurs, chiens et porcs sont inutilisables faute de fovéa et que le passage à la clinique humaine "nécessite" cette phase sur primate.
Objectifs
Aujourd'hui, beaucoup de maladies oculaires héréditaires touchant la rétine peuvent entraîner une malvoyance incurable, pouvant dégénérer jusqu'à la cécité complète et pour laquelle l'émergence de nouvelles techniques de soins par thérapie génique redonne espoir car malheureusement aucun traitement permettant de redonner la vue n'existe à l'heure actuelle. Ces maladies rétiniennes héréditaires sont caractérisées par des mutations dans des gènes uniques et entrainent pour la plupart un dysfonctionnement et/ou une dégénérescence des photorécepteurs de la rétine sensible à la lumière tels que les cônes ou les bâtonnets. Aujourd'hui, les gènes responsables sont connus pour plus de 270 de ces maladies. Bien que les thérapies géniques aient fait une avancée considérable depuis ces dernières années, la complexité génétique et la diversité des maladies rétiniennes héréditaires rend difficile le développement de thérapies applicables et spécifiques à chaque maladie. De plus, il n'est pas encore certain que ces thérapies géniques à visée de modification du génome puissent être bénéfiques lorsque la rétine n’est plus fonctionnelle ou lorsqu'une neurodégénérescence consécutive est observée. C'est pourquoi, ce projet vise l'utilisation d'une approche thérapeutique permettant de restaurer la vision, indépendamment des mutations causant les maladies héréditaires, via l'utilisation d'une technique appelée optogénétique. Cette technique, considérée comme une forme de thérapie génique, peut rendre tout type de cellule sensibles à la lumière grâce à des protéines bactériennes activées génétiquement. Dans ce contexte, l’optogénétique prend tout son sens car pour beaucoup de maladies rétiniennes héréditaires, les photorécepteurs perdent leur capacité naturelle à percevoir la lumière mais ces cellules restent vivantes à un stade dit dormant et peuvent ainsi être réactivées grâce à l'optogénétique. Cette méthode permettrait donc de restaurer la vision de manière très efficace puisque les connexions rétiniennes et le traitement des informations au niveaux de l'œil et du cerveau restent intacte. Cette stratégie ciblant directement les photorécepteurs n’a encore jamais été évaluée dans des essais cliniques, c'est pourquoi l'approche proposée dans ce projet est unique. L'objectif de ce projet vise ainsi à valider la fonctionnalité de la construction optogénétique chez le primate non-humain dans l’optique de pouvoir évaluer cet outil dans de futurs essais cliniques chez l’Homme.
Bénéfices attendus
A terme, le bénéfice de cette étude sera d'établir une preuve de concept solide scientifiquement permettant de pouvoir transposer l'utilisation de cette construction génétique comme outil thérapeutique fiable de restauration de la vision pour le démarrage d'essais cliniques chez l'Homme.
Procédures
Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation d'examens oculaires par tomographie en cohérence optique : 1 examen réalisé pré-injection puis plusieurs examens d’environ 20 minutes par animal à raison d’un examen toutes les deux semaines pendant la phase d’incubation (minimum 3 mois) ; (2) injections intraoculaires de la construction optogénétique (une seule chirurgie par animal d’une durée d’environ 1h) ; (3) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale ; (4) prélèvement des yeux réalisé sous couverture analgésique et anesthésie profonde suivi de la mise à mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, les contentions répétées (2x par jour pendant 7 jours post injection) pour l’administration de pommade oculaire, une légère perte de poids consécutive à l’opération et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections intraoculaires. Une légère douleur liée à l’injection intramusculaire de l’anesthésique pour la réalisation des gestes techniques (OCT, Injection intraoculaire d’AAV sous anesthésie générale) peut être observée également. Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un leger inconfort au niveau de l'oeil le jour précédent l'injection et provoquer dans de très rare cas une légère réaction inflammatoire indolore au niveau de la sclère (autour du point d'entrée de la micropipette d'injection).
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de tissus oculaires.
Remplacement
Les maladies rétiniennes héréditaires affectent les cellules photoréceptrices de la fovéa, c'est pourquoi l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa, structures oculaires cible dans cette étude. De plus, les vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validés in vitro sur des explants rétiniens humains et permettent de restaurer la sensibilité à la lumière. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à plus long terme une application pour des études cliniques chez l'homme. Ce passage à la clinique nécessite donc cette phase sur modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Huit macaques Cynomolgus seront ainsi utilisés sur 5 ans.
Raffinement
Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L'ensemble des méthodes expérimentales ont été pensées et choisies pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, nourrissage à la main).
Choix des espèces
Les maladies rétiniennes héréditaires sont des maladies altérant les photorécepteurs de la fovéa, partie centrale de la rétine. Cette région de l’œil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de 3 à 10 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.
Evaluation de 2 formulations à 2 doses sur la cicatrisation chez la souris Hairless Skh-1
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
20 souris Hairless vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie de 6 mm est pratiquée sur chaque flanc puis traitée avec deux formulations en gel tous les deux jours jusqu'à cicatrisation, les animaux étant maintenus isolés en cage individuelle. Le porteur reconnaît une douleur possible durant les 24 heures suivant l'induction des plaies et un stress lié à la privation d'interactions sociales. Il affirme que ni culture cellulaire ni explant cutané ne reproduisent la complexité de la cicatrisation, qui ne peut être appréhendée qu'in vivo.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 formulations sous forme de gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris Hairless Skh-1.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel des ces formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur les flancs gauche et droit de chacune des 20 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie gazeuse et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Impact sur les animaux
L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des 24 heures suivant celle-ci. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci. Pour ces raisons, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront mises à mort. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre connaissance du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, angiogénèse, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par le Département Statistiques de notre client qui développe un nouveau programme informatique dans lequel sont compilées les données d’études in vitro et in vivo réalisées sur plusieurs années avec des composés de nature proche. Ce programme informatique modélise ainsi la transposition des résultats d’études in vitro aux études in vivo dans le but premier de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation, l’objectif final étant de développer une alternative à l’expérimentation animale. Selon le test de puissance statistique effectué, en prenant en compte les mêmes conditions expérimentales, il est ainsi nécessaire d’utiliser au moins 3,6 animaux avec 2 plaies cutanées par animal donc 4 animaux (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des morceaux de papier absorbants seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau proche de celle de l’Homme permettant une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.
Etude des effets rénaux et oculaires de la protéine Claudine19
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de légers à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie sans réveil. Modèles d'une maladie rénale rare, elles sont hébergées sept jours en cage à métabolisme et subissent jusqu'à onze prises de sang par ponction de la veine mandibulaire, la mise à mort se faisant par ablation des reins sous anesthésie provoquant une hémorragie fatale. Le porteur indique qu'une partie des animaux peut développer une cécité progressive et éprouver angoisse et douleur lors des ponctions. Il affirme que le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'étudier une mutation sur un organisme "entier".
Objectifs
Chez l'humain, les anomalies de la protéine claudine-19 sont responsables d'une maladie rare appelée hypomagnésémie familiale avec hypercalciurie et néphrocalcinose ; cette maladie est caractérisée par une perte massive de calcium et de magnésium dans l'urine, qui se complique de dépôts de calcium dans le rein (néphrocalcinose) et d'insuffisance rénale chronique, nécessitant le recours à la dialyse et à la transplantation rénale entre 20 et 40 ans. Elle se complique également d'une atteinte oculaire menant à la cécité. La fonction de la protéine claudine-19 est inconnue. Le but de cette étude est de déterminer cette fonction. Les objectifs sont -d'identifier les anomalies sanguines et urinaires provoquées par l'inactivation de la protéine claudine-19, -de mesurer les conséquences de l'inactivation sur la capacité du rein à conserver le calcium et le magnésium, -d'étudier l'évolution de la fonction rénale au cours de la vie des animaux - d'étudier l'apparition et le développement de la néphrocalcinose, d'étudier le développement et les mécanismes de l'atteinte oculaire.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer le rôle de la protéine claudine-19 dans le fonctionnement du rein et de l'œil des mammifères terrestres. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes de transport transépithélial des électrolytes dans divers épithéliums. Cette étape est un préalable sur le chemin devant permettre de développer un traitements efficace de l'hypomagnésémie familiale avec hypercalciurie et néphrocalcinose et de prévenir les complications délétères (insuffisance rénale et cécité). Le projet permettra 1. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de claudine-19 sur l'homéostasie ionique, 2. de comprendre l'adaptation des différents segments tubulaires rénaux à la perte de fonction de claudine-19, de comprendre le phénotype global et, 3. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de claudine-19 sur la physiologie oculaire.
Procédures
Les animaux sont soumis - à un hébergement en cage à métabolisme individuelle pendant 7 jours pour recueil d'urine - à un prélèvement sanguin, unique pour certains des animaux ou répétés chez d'autres animaux (jusqu'à 11 sur une période de 10 mois) par ponction de la veine mandibulaire chez l'animal vigile - à une anesthésie terminale par injection intrapéritonéale. Par ailleurs, indépendamment des effets indésirables des procédures énumérés ci-dessus, il est possible, mais pas certain, que les animaux développent une cécité progressive au cours de leur existence.
Impact sur les animaux
Les effets ci-après ne sont pas tous attendus mais ils sont possibles ; perte de poids, angoisse et intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme, hémorragie au point de ponction, douleur lors de la ponction transcutanée
Devenir
Mise à mort : A l'issue de chaque procédure, le projet prévoit une éxérèse des reins pour étude des transcrits et des protéines ou pour dissection d'une branche large acendante de l'anse de Henle pour expérience de microperfusion tubulaire ; dans tous les cas, l'éxérèse des reins est réalisée sous anesthésie générale et provoque une hémorragie fatale
Remplacement
La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux et de leurs conséquences systémiques est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences d'une mutation génétique sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact. La description phénotypique des rétines des souris ne peut s’envisager que sur des rétines entières parcourues par une vascularisation active, du vivant de l'animal ; pas de remplacement possible à ce stade de l’étude.
Réduction
Cent soixante (160) animaux seront utilisés dans cette étude. Les 2 examens ophtalmologiques pratiqués n’étant pas invasifs pour les yeux (il s’agit d’imageries), nous examinerons les 2 yeux de chaque animal et nous pratiquerons l’OCT et l’angiographie l’une après l’autre sur les mêmes animaux, profitant des mêmes anesthésies générale et locale. Ceci diminue de beaucoup le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les 2 yeux de chaque souris serviront à la fois à ces examens vivo et à d’autres analyses ex vivo (après euthanasie), puisque la précision de ces examens remplace l’histologie de la rétine et économise les animaux qui auraient dû être euthanasiés pour cela. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en appliquant des tests statistiques appropriés. Les comparaisons intergroupes seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques sans appariement, en raison de l’absence de certitude quant à la normalité de la distribution des variables. En se basant sur notre expérience de la dispersion des variables pertinentes, nous avons calculé que pour une puissance beta de 80 %, un risque alpha de 5% et une différence des médianes des groupes d’au moins 40 %, les effectifs nécessaires étaient de 10 animaux par groupe.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance.
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation génique de la claudine 19 a été développé chez la souris. Les animaux sont utilisés à partir de l'âge de 8-9 semaines. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures. Leur taille permet la réalisation des manoeuvres expérimentales.
Perception des éoliennes par les oiseaux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
570 oiseaux de 57 espèces vont être utilisés dans des procédures classées en gravité légère, sans prélèvement ni chirurgie, puis tous rendus à leur établissement. Les oiseaux sont placés en volière ou dans une caisse transparente pour des tests de perception visuelle du mouvement et des contrastes, avec un stress possible pour seul effet déclaré. Le porteur cherche à comprendre comment les oiseaux voient les éoliennes afin d'en réduire les collisions, qui tueraient selon lui environ 59 000 oiseaux par an en France. Il affirme qu'il n'est pas envisageable de remplacer les oiseaux par un modèle non biologique pour ces tests de vision.
Objectifs
La Programmation Pluriannuelle de l’Energie vise un doublement de l’énergie produite par les éoliennes, alors qu’en moyenne 59000 oiseaux sont tués par collision chaque année en France, dont 81% d’espèces protégées. Dans le cadre des politiques de protection de l’environnement, les exploitants de parcs éoliens ont pour obligation de réduire la mortalité aviaire liée aux collisions, en particulier lorsqu’ils affectent des espèces au statut de conservation défavorable ou des espèces protégées. Actuellement, pour répondre à ces injonctions réglementaires, les exploitants de parcs éoliens utilisent des dispositifs automatisés (caméras) de détection des oiseaux à proximité du parc dans le but de réduire les collisions en les effarouchant ou en arrêtant les turbines. L’efficacité de ces systèmes est débattue et variable selon les groupes d’oiseaux. Une manière plus directe pour réduire les collisions serait de rendre les éoliennes plus facilement détectables par les oiseaux afin qu’ils puissent les éviter. Pour cela une compréhension globale des capacités visuelles des oiseaux est nécessaire, or certaines informations essentielles sont encore manquantes. Dans la littérature scientifique, il est mis en évidence une sensibilité à la collision accrue chez les rapaces diurnes (Accipitriformes et Falconiformes), les calaos (Bucerotiformes), les martinets (Apodiformes), les cigognes, flamants et ibis (Ciconiiformes), certains corbeaux (Passeriformes), certains limicoles et goélands (Charadriiformes) et certains pigeons (Columbiformes). Les espèces d’intérêts pour cette étude font partie des différentes familles fortement impactées par ces collisions. Des espèces non concernées par ce problème seront également étudiées en tant qu’espèces témoins. Il sera donc possible de comparer les capacités visuelles des espèces en fonction de leur sensibilité à la collision. L’objectif ultime de cette étude est de comprendre comment les oiseaux perçoivent les éoliennes, afin de proposer des solutions pour augmenter la détectabilité de celles-ci par les oiseaux et, éventuellement, pouvoir se passer des dispositifs de détection/effarouchement. Ce projet de thèse de doctorat propose d’étudier ces différents éléments via 2 axes de recherche : l’étude de la perception visuelle (1) du mouvement rotatif et (2) des contrastes.
Bénéfices attendus
Dans le cas de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°1 les seuils limites de perception du mouvement rotatif, définis sur un certain nombre d’espèces, permettront de proposer un nouveau cahier des charges aux constructeurs d’éoliennes afin d’élaborer des modèles de pâles et rotors ne dépassant pas cette vitesse tout en maintenant une production d’énergie électrique rentable. Dans le cas de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2, si le contraste proposé par les éoliennes par rapport à l’environnement n’était pas perceptible par la majorité de l’avifaune, il serait judicieux de proposer une teinte différente accentuant ce contraste.
Procédures
Aucun prélèvement ou intervention chirurgicale ne sera réalisé sur les animaux au cours des différentes procédures. Au cours des procédures les oiseaux seront vigiles. En cas de stress les oiseaux seront sortis du dispositif et remis dans leur volière. Sur 57 espèces d'oiseaux, au maximum 10 individus par espèces seront utilisés dans chaque procédure. Les individus utilisés dans la première procédure ne seront pas ré-utilisés dans la deuxième. Dans le cadre de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°1 les oiseaux seront placés dans la volière d'expérimentation entre 30 minutes et deux heures par jour, tous les jours, pendant deux mois. Dans cette volière les oiseaux devront effectuer un choix entre deux stimuli. Selon le choix réalisé l'oiseau sera récompensé avec de la nourriture ou non. Les oiseaux seront libres de leur mouvement. Dans le cadre de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2 les oiseaux seront placés dans une caisse transparente pendant une à trois heures consécutives. La caisse sera placé devant des écrans sur lesquels seront diffusés différents patterns. Au cours de la PROCEDURE EXPERIMENTALE N°2 chaque oiseau passera au maximum 3 heures dans le dispositif, découpable en plusieurs séances de quelques minutes si besoin. Les dimensions de la caisse transparente sont adaptables pour chaque espèce de manière à ce que l'oiseau soit libre de ses mouvement, mais dans un espace restreint : l'oiseau pourra se tenir debout, se coucher et se retourner.
Impact sur les animaux
Les oiseaux ne souffriront pas de la faim ou de la soif, d’inconfort, de douleurs, de blessures ou de maladies au cours des procédures. Le seul effet indésirable possible serait du stress au moment de l’expérimentation, qui devrait disparaitre dès la fin de la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront gardé en vie et replacé au sein de leur établissement utilisateur.
Remplacement
S’agissant d’études comportementales sur la vision des oiseaux, il n’est pas envisageable de remplacer les oiseaux par des modèles non biologiques.
Réduction
Le nombre d’oiseaux utilisés sera réduit au minimum pour donner des résultats statistiquement corrects, soit 10 individus par espèces. Ce chiffre est basé sur des études similaires et permettront d’acquérir les informations suffisantes en relation avec les questions posées. La personnalité et la motivation de chaque individu rentrant en jeu dans toute expérience, ce chiffre permettra de prendre en compte la variabilité individuelle.
Raffinement
Ces expériences nécessiteront peu de manipulation et n’engendreront aucune douleur ou souffrance des animaux. Toutes les précautions seront prises pour limiter toute forme de stress. Le protocole est notamment conçu pour pouvoir arrêter l’expérience à tout moment en cas de signes de stress. Les expériences menées étant basées sur le comportement, les résultats ne seraient pas exploitables si les oiseaux étaient stressés.
Choix des espèces
Pour étudier la perception des éoliennes par les oiseaux afin de réduire les collisions aviaires avec les éoliennes, nous étudierons 57 espèces, réparties entre celles impactées par ces collisions, et des espèces témoins non concernées par les collisions. Afin de limiter le nombre d’individus étudié, seules quelques espèces de chaque famille seront utilisées, en privilégiant des espèces accessibles en captivité et étant d’intérêt majeur la filière éolienne. La taille de l’œil et les capacités visuelles sont dépendantes du stade de développement et se stabilisent au moment de l’envol quand l’individu a atteint sa taille adulte. Les expériences seront donc menées uniquement sur des oiseaux de taille adulte.
Rôle de variants d’histone H3.3 dans le développement de la peau
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris génétiquement modifiées développent une alopécie et un retard de développement important, puis sont tuées par dislocation cervicale au vingt-deuxième jour pour prélever leur peau. Le porteur étudie une protéine qu'il dit potentiellement impliquée dans le psoriasis et les cancers de la peau, en s'appuyant aussi sur des cultures de cellules. Il affirme que la souris est le seul mammifère permettant le mutant conditionnel recherché.
Objectifs
Le projet s'intéresse à une protéine potentiellement impliquée dans les cancers de la peau et le psoriasis. L'objectif principal est donc de mieux comprendre les fonctions de cette protéine dans la prolifération, dans la différenciation cellulaire et dans le développement de la peau. L'étude sera effectuée sur l'épiderme d'une souris transgènique n'exprimant plus la protéine d'intérêt dans sa peau. Le modèle utilisé permet de réaliser efficacement des expérimentations complémentaires sans utilisation d'animaux mais avec des cellules de la peau en culture.
Bénéfices attendus
Savoir si la protéine est impliquée dans certaines maladies de la peau telle que le psoriasis ou le cancer de la peau. Comprendre le mécanisme d'action de cette protéine dans la prolifération et la différenciation de kératinocytes de l'épiderme et donc dans les autres cellules de l’organismes et donc de comprendre un mécanisme clef de l’épigénétique. On rappelle que l’épigénétique est la science qui étudie l’expression du génome par les cellules, une des clefs du vieillissement et des cancers, entre autres…
Procédures
Pas d'intervention sur ces animaux. Les souris avec un phénotype vont être mises à mort au 22éme jour et la peau sera par la suite prélevée.
Impact sur les animaux
Les souris avec un phénotype vont avoir de l'alopécie (problème d'émergence de poils) et un retard de développement important. Il n y’a pas de mortalité entre la naissance et le 22éme jour.
Devenir
Les animaux seront mises à mort par disolocation cervicale pour récupérer la peau.
Remplacement
Les souris nous permettrons de procéder à la délétion complète de la protéine d'intérêt (qui est exprimer par deux gènes) à un temps voulu et qui sera spécifique à l’épiderme. Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile n’offrent pas les mêmes possibilités d’étudier différenciation et prolifération). A partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes.
Réduction
À partir des mêmes souris avec un phénotype, des prélèvements de peau seront prélevés pour effectuer différentes analyses. En plus, à partir de ses souris, nous pourrons ensuite étudier les processus moléculaires et biochimiques à l’aide de cultures primaires de kératinocytes. Nous travaillerons aussi sur animaux mâles et femelles afin de diminuer le nombre d’animaux dans l’élevage nécessaire.
Raffinement
Les souris seront observées selon une fréquence adaptée à la survenue des symptômes. Un enrichissement adapté à l'état de la souris sera mis en place (en particulier, des matériaux pour un nid volumineux seront fournis), l'alimentation aussi sera adaptée pour faciliter la lactation de la mère allaitante (mettre des croquettes mouillées ou de l'hydrogel). De la buprénorphine sera administrée en attente du point limite si besoin.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris se justifie par le fait que c’est un mammifère proche de l’Homme, qui est un très bon modèle pour les manipulations génétiques puisque nous partageons plus de 95% de nos gènes. De plus, la connaissance approfondie de cette espèce assure une bonne prise en charge de l’animal, de son environnement (enrichissement du milieu) et de sa potentielle douleur. De plus, nous avons besoin d’un mutant conditionnel pour les deux gènes considérés, la souris est la seule espèce mammifère où cela est possible. Les autres modèles eucaryotes (levure, C. elegans et drosophile) n’offrent pas les mêmes possibilités d’études. L'étude sera effectuée sur des souriceaux qui ont 22 jours, car le phénotype commence à apparaitre à partir de 18éme jour. On constate de l'alopécie qui est présente sur la souris et un retard de développement et quelques échantillons pris à ce stade ont été déjà envoyés à des collaborateurs. Donc, la suite de l'étude doit être effectuée au 22éme jour.
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence induite chez la souris : rôle de la protéine YAP
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Chaque animal reçoit une injection dans l'œil de molécules inflammatoires sous anesthésie, puis des injections dans l'abdomen dont une destinée à provoquer une dégénérescence de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération des cellules de la rétine en modulant l'inflammation, avec l'espoir renvoyé au long terme de traitements pour les patients. Il décrit un modèle d'explants ex vivo mais affirme qu'il ne remplace pas l'animal vivant, la physiologie de l'œil entier n'y étant pas reproduite.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Que ce soit chez la souris ou le poisson, les cellules de Müller expriment YAP. Ce n’est donc a priori pas son expression qui est le facteur limitant mais cela pourrait être son activité. Nous souhaitons nous concentrer sur l’environnement inflammatoire et ses relations avec l’activité de YAP qui pourraient bien être la clef vers la réactivation du processus régénératif chez la souris. Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris, moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller avec un focus particulier sur la régulation de l’activité de YAP dans différents contextes inflammatoires.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telles que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Nous déterminerons également si le co-activateur de transcription YAP dont on connaît déjà les propriétés pro-régénératives vis-à-vis des cellules de Müller est nécessaire à l’induction de la prolifération induite par les molécules inflammatoires. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet aboutit, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à trois actes expérimentaux : (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 30 minutes. (ii) injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal anesthésié pour réaliser l'injection. Les molécules injectées sont soit un véhicule (tampon Phosphate Buffer Saline, ou PBS), soit des molécules pro-inflammatoires (Lipopolysaccharides (LPS), Zymosan, Interleukine-6 (IL-6), ou Tumor Necrosis Factor (TNF-α)), soit une molécule anti-inflammatoire (anticorps anti-TNF-α). Ces molécules sont toujours injectées en présence d’un analogue nucléotidique (5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) pour suivre la prolifération des cellules de Müller)), (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra au minimum 3 injections : 2 injections de 4-Hydroxy-Tamoxifen (ou 4-OHT) pour induire la déplétion de notre protéine d’intérêt (YAP), une injection de N-Méthyl-N-Nitrosurée (ou MNU) pour induire la dégénérescence rétinienne puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU pour suivre la prolifération des cellules de Müller selon le nombre de jours nécessaires à la procédure.
Impact sur les animaux
- Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. - Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement anti-VEGF de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthanasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
En amont du présent projet, des expériences seront réalisées ex vivo sur des cultures explants de rétines provenant d'animaux euthanasiés sans manipulations préalables. Cette technique est un bon modèle alternatif de dégénérescence rétinienne pour tester l’effet de molécules pro- ou anti-inflammatoires sur la capacité régénérative des cellules de Müller. Ce modèle ex vivo va permettre de sélectionner les molécules inflammatoires les plus efficaces. Cependant, il ne se substitue pas au modèle in vivo chez l’animal car il ne récapitule pas toute la physiologie d’un œil.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi (litière, abri en cellulose, tunnel en carton, frisures de papier, carré de coton, croquettes et biberon d’eau ad libitum). Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs, et à déterminer si YAP joue un rôle dans ce processus. Les lignées de souris utilisées permettent de choisir le moment auquel la délétion du gène Yap sera réalisée, ainsi que le type de cellules dans lesquelles nous souhaitons effectuer la délétion. Les animaux seront donc utilisés à partir du stade auquel les cellules de Müller de la rétine sont matures (i.e. 10 jours après la naissance). Ainsi, le gène Yap sera délété spécifiquement dans les cellules gliales de Müller à partir de 10 jours après la naissance. Les stades auxquels les expériences de modulation de l’inflammation seront réalisées dépendent du modèle choisi : - soit 21 jours après la naissance : cas de la lignée de souris présentant une mutation spontanée induisant naturellement une rétinite pigmentaire à partir de 16 jours après la naissance jusqu’à 30 jours. 21 jours après la naissance, 40% des photorécepteurs ont disparu, ce qui correspond à une dégénérescence moyenne modélisant bien la pathologie, - soit à deux mois : cas de la lignée de souris dans laquelle nous induisons la dégénérescence des photorécepteurs par injection de MNU.
Evaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques dans un modèle de psoriasis induit chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un immunomodulateur appliqué chaque jour sur le dos et les oreilles provoque des lésions de psoriasis, puis des molécules candidates sont administrées avant une mise à mort par ponction intracardiaque et dislocation cervicale. Le porteur indique que l'induction s'accompagne d'une perte de poids pouvant atteindre 15 pour cent, d'excoriations et de plaies liées au léchage et au grattage, avec une mise à mort au-delà de 20 pour cent de perte de poids. Il affirme qu'il est "indispensable" de tester ces molécules sur ce modèle, aucun système in vitro ne remplaçant selon lui complètement la peau.
Objectifs
Ce projet est nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité de molécules thérapeutiques ayant une activité sur le psoriasis. Ces tests sont requis pour permettre le choix des meilleures molécules ou traitements thérapeutiques avant essai chez l’homme (tests cliniques).
Bénéfices attendus
Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus). Dans cette espèce, l’administration topique d’un immuno-modulateur comme l’imiquimod permet d’induire très rapidement en moins d’une semaine des lésions de psoriasis similaires à celles observées chez l’homme: érythème, desquamation et épaississement de la peau. Ce projet utilisera donc cette molécule, l’imiquimod, sous forme de crème, comme agent inducteur du psoriasis qui sera appliqué quotidiennement sur le dos et l’oreille des animaux sur une période de 7 jours. Les symptômes de psoriasis seront évalués cliniquement par enregistrement du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT) permettra une évaluation supplémentaire des symptômes liés à la pathologie. Suite à l’induction, mais aussi lors de l’induction, des traitements thérapeutiques seront administrés, par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse, aux animaux afin d’en évaluer leur efficacité thérapeutique ou prophylactique. Cette efficacité sera évaluée cliniquement par suivi quotidien du score d’érythème, de désquamation, d'excoriations et d’épaississement de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse, ainsi que par un suivi longitudinal par imagerie non invasive optique (Tomographie par Cohérence Optique ou OCT). Lorsque les procédures sont terminées, tous les animaux sont mis à mort et des échantillons de tissus sont prélevés pour analyses complémentaires (dosages de cytokines inflammatoires dans le plasma, histologie...).
Procédures
Les animaux seront administrés topiquement sur la peau du dos et des oreilles avec un immunomodulateur afin d'induire des lésions de psoriasis. Cette administration sera effectuée une fois par jour, pendant 7 jours. Des traitements seront administés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre du psoriasis. Une évaluation clinique des sympômes de psoriasis sera effectuée quotidiennement : scoring (erythème, desquamation, excoriations) et mesures de l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles au pied à coulisse. Un suivi par imagerie non invasive OCT sous anesthésie sera réalisé. Le sang des animaux sera prélevé une fois en cours d'étude à la veine mandibulaire à l'aide de lancettes dédiées à ce type de prélèvement. Ces prélèvements se feront sous anesthésie à l'isoflurane. Le volume maximal deprélèvment sanguin est de 0.1mL. En fin de procédure un prélèvement sanguin total sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane).
Impact sur les animaux
Les effests indésirables observés sur les animaux sont souvent liés à l'induction de la pathologie chez les animaux. Nous observons généralement une forte perte de poids (jusqu'à -15% ) ainsi qu'une légère déshydratration des animaux pendant les 3 premiers jours. Les animaux présentent des symptomes du psoriasis (érythème, desquamation, excoriation) pouvant entrainer l'apparition de plaies suite à du léchage ou grattage intensif. Les autres effets indésirables observés peuvent etre attribués à l'administration des molécules thérapeutiques : mauvaise tolérance, irritation en cas d'application topique...
Devenir
A l'issu des procédures tous les animaux seront mis à mort selon la méthode de ponction intracardiaque suivie d'une dislocation cervicale le tout sous anesthésie générale (isoflurane).
Remplacement
Afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de psoriasis pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux appliqués directement sur la peau en application externe (voie dermique / topique). - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme). Ce projet s’effectuera chez la souris (Mus musculus).
Réduction
La stratégie d'expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d'imagerie. Cette approche expérimentale permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANAOVA; seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d'initier les phases de traitement. Le nombre d'animaux sera de 8 par groupe (groupe d'animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence commercialisé type bétaméthasone). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15%, une puissance de 70% et une différence à souligner de 20% entre groupes témoins et tersts comparativement à l'approche classique. Cette approche permet donc de réduire le nombre d'animaux de 50% au moins. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées (histologie/ immunohistologie/ PCR/ cytométrie et approches "omiques") afin d'obtenir le plus d'informations possibles relatives à l'efficacité des molécules administrées sur les animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement par l’expérimentateur afin de s'assurer de leur bien-être (alimentation, boisson...). Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, igloo, cotons, bâtonnets de bois) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Leur poids sera évalué au minimum tous les 2 jours, cette mesure aidera à déceler une quelconque souffrance et/ou détresse. De la nourriture humidifiée ou du gel diététique sera ajouté dans leur cage. Au moindre signe de déshydratation, les animaux recevront une injection intra-péritonéale de sérum physiologique (20mL/kg). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative ; En cas de dépassement, les animaux seront euthanasiés selon la méthode prévue. (anesthésie à l'isoflurane, prélèvement sanguin terminal et dislocation cervicale).
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes type CD1, C57Bl6 ou Balb/c) sont d'excellents modèles de psoriasis. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation du psoriasis induit dans ces espèces. Ces animaux développent des symptomes de psoriasis très semblables à ceux observés chez l'humain. De plus, ces modèles présentent certains intérêts pratiques indéniables : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Tous les animaux auront le même âge. Les résultats publiés avec ce modèle utilisent des animaux de cet âge.
L’inflammation pour stimuler la régénération rétinienne dans un modèle de dégénérescence induite aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Une dégénérescence de la rétine leur est provoquée, puis elles reçoivent sous anesthésie une injection dans l'œil et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales, avant d'être tuées de 4 à 72 heures plus tard pour analyse de la rétine. Le porteur cherche à réveiller les capacités de régénération de la rétine en modulant l'inflammation, en s'appuyant sur ce qui s'observe chez le poisson. Les retombées pour les patients atteints de dégénérescence rétinienne sont renvoyées au conditionnel, le porteur jugeant la souris "indispensable" malgré un modèle d'explants qu'il utilise en amont.
Objectifs
La rétine est soumise à des pathologies dégénératives dont la plupart restent non traitables jusqu'à ce jour. La stimulation de la capacité de régénération des cellules souches de la rétine des mammifères, qui est naturellement limitée, pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante. Les cellules souches de la rétine, les cellules gliales de Müller, possèdent un potentiel de régénération extraordinaire chez les amphibiens et les téléostéens, mais celui-ci est très limité chez les mammifères. Cependant, elles ne sont pas dépourvues de propriétés régénératives puisque l’on peut les forcer à se reprogrammer et à générer de nouveaux neurones. L'une des différences entre les deux espèces est la réponse inflammatoire aux dommages. Dans le système nerveux central des mammifères (cerveau et rétine), il est considéré que l'inflammation empêche la régénération du tissu. Dans la rétine du poisson, les médiateurs de l’inflammation (e.g. les cytokines de la famille du TNF-α ou de l'interleukine 6 (IL-6)) favorisent la reprogrammation et la prolifération des cellules gliales de Müller après une blessure. En ce sens, il a été montré que les cellules immunes de la rétine (les microglies) favorisent la régénération chez le poisson, bien qu'elles deviennent préjudiciables si l’inflammation se prolonge. Chez les mammifères, l'inflammation favorise la gliose, la fibrose et la cicatrisation, mais pas la régénération. Ceci suggère une interaction microglie-Müller différente selon l’espèce. L’ensemble de ces résultats indiquent que chez la souris, des propriétés régénératives existent mais sont restreintes soit par des mécanismes intrinsèques aux cellules de Müller, soit par leur environnement (par exemple environnement pro- ou anti-inflammatoire défavorable). Dans ce contexte, nous souhaitons chez la souris moduler l’inflammation via l’injection intraoculaire de molécules pro- ou anti-inflammatoires, et étudier les conséquences sur le réveil régénératif des cellules de Müller.
Bénéfices attendus
A ce jour, les différences d'efficacité de régénération observées entre espèces restent inexpliquées. La régénération rétinienne très efficace des espèces telle que les poissons nécessite une régulation fine de l'inflammation. Notre projet vise à reproduire des conditions inflammatoires favorisant la régénération chez la souris. Notre ambition est de réussir à débloquer les propriétés régénératives latentes des cellules souches de la rétine en modulant l'inflammation. Si le projet abouti, cela ouvrirait la voie vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour soigner les patients atteints de dégénérescence rétinienne.
Procédures
Les animaux du présent projet seront soumis à quatre actes expérimentaux: (i) anesthésie : une fois pendant la procédure juste avant l'injection intraoculaire afin d'éviter la douleur qui aurait été générée par l'injection. La durée de l'anesthésie est d'environ 20 minutes. (ii)- injection intraoculaire : une fois pendant la procédure. L'injection s'effectue rapidement en 5 minutes maximum en comptant le temps nécessaire à placer correctement l'animal pour réaliser l'injection. (iii) injection intrapéritonéale : selon l'expérience, chaque animal recevra entre 2 (MNU, puis EdU) et 5 injections intrapéritonéales (MNU, puis de façon journalière 1 à 4 injections d'EdU) selon le nombre de jours nécessaires à la procédure. (iv) alimentation formulée : de P45 à la fin de l'expérience (P60+4h, P61, P62, ou P63).
Impact sur les animaux
(i) Les phénotypes des animaux utilisés dans nos expériences sont restreints à la rétine. (ii) Les différentes procédures ont un niveau de sévérité de classe légère et sont couramment utilisées dans le domaine de la recherche ophtalmologique. La technique d’injection intraoculaire est utilisée couramment en clinique chez l’homme dans le cadre du traitement de la forme humide de la dégénérescence maculaire liée à l’âge et n’a pas de conséquence néfaste.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront gardés en vie un certain temps (4h, 24h, 48h, 72h) selon l'expérience puis euthnasiés pour réaliser des expériences d'analyses phénotypiques.
Remplacement
Préalablement aux expériences in vivo nous validerons nos hypothèses grâce à la technique de culture d’explants rétiniens issus de souris euthanasiées n’ayant subi aucune procédure préalable. Les explants rétiniens cultivés ex vivo dégénèrent progressivement. Ils sont un excellent modèle pour tester l’effet de molécules anti- ou pro-inflammatoires, ou à potentiel régénératif. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que l’œil est un organe complexe composés de différents tissus en communication permanente les uns avec les autres ainsi qu’avec la circulation sanguine systémique et le cerveau via le nerf optique. Ces interactions sont cruciales pour l’obtention d’un signal visuel correct et participent à tous les processus cellulaires y compris la réparation et la régénération. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales sans utilisation d'animaux vivants n’apportent pas la même pertinence d'information.
Réduction
Nous avons estimé à 12 souris le nombre minimum d’animaux par groupe. Ce nombre correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des effets biologiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides et prenant en compte les aléas techniques. A noter également que dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses en même temps, de sorte que les deux rétines de chaque individu seront utilisées.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Nous aurons recours aux procédures anesthésiques appropriées. Les points limites de nos expériences sont déterminés grâce au suivi de l’état des yeux suite à l’injection, et en fonction de la santé générale des animaux ayant subi des manipulations de leur vivant. Les doses d’agents inflammatoires injectés seront réajustées à la suite de la survenue de manifestations extérieures de mal-être. Nous nous baserons sur les doses définies précédemment dans la littérature. Chacune des injections intraoculaires sera effectuée sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. La lignée de souris sauvages C57BL/6JRj choisie ne présente aucune mutation induisant une dégénérescence rétinienne contrairement à la lignée C57BL/6NRj qui développe spontanément une dégénérescence des photorécepteurs. Nos expériences visent à tester la capacité de l’inflammation à réveiller les propriétés régénératives des cellules gliales de Müller dans différents contextes dégénératifs. Pour déterminer le stade auquel nos expériences seront réalisées, il nous faut prendre en compte les contraintes liées au développement de la rétine et du système immunitaire chez la souris, ainsi que les contraintes techniques. Les souris de la lignée C57BL /6J seront utilisés à partir de P45 quand la rétine est totalement mature pour les expériences nécessitant l'utilisation d'une alimentation formulée. Il faut un minimum d'une dizaine de jour pour obtenir une diminution significative du nombre de microglies. Afin d'induire la dégénérescence rétinienne, le MNU sera injecté à P59 puis la suite des actes expérimentaux aura lieu 16h après (temps nécessaire à l'enclenchement du processus de dégénérescence).
Effets de la cécité sur le développement et la plasticité du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la moitié des petits naissant aveugles, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de "dommageable". Les animaux testés subissent trois chirurgies du crâne sous anesthésie, avec incision au-dessus des bulbes olfactifs pour de l'imagerie optique, répétées à un mois d'intervalle, puis sont tués à la dernière séance. Quinze reproducteurs voyants n'ayant subi aucune chirurgie sont réutilisés dans un autre projet, les souris aveugles ne pouvant l'être. Le projet vise à comprendre la plasticité de l'odorat après une cécité précoce, le porteur affirmant que cette imagerie ne peut s'envisager sur modèle in vitro.
Objectifs
À l’échelle mondiale, environ 2,2 milliards de personnes présentent une déficience visuelle, touchant aussi bien les nouveau-nés prématurés que les personnes de plus de 50 ans (OMS). La théorie du «darwinisme neuronal» stipule que l'absence d'une modalité sensorielle, comme la vision, induit une plasticité cérébrale permettant la potentialisation des autres sens afin d’aider l’individu à s’adapter à son environnement. Si ce phénomène de potentialisation sensorielle a été largement décrit, son évolution au cours du développement et ses mécanismes font encore l’objet de nombreuses questions. Ainsi, une des questions principales est d’étudier comment se met en place au cours du temps cette plasticité chez un individu privé de la vision, à la fois du point de vue comportemental, mais également au niveau des processus cérébraux sous-jacents. À ce jour, l’impact de la cécité sur la fonction olfactive, qui est un sens invisible mais critique dans notre quotidien, reste peu étudié, en particulier au niveau des mécanismes de réorganisation sensorielle cérébrale. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le développement et la plasticité fonctionnelle du système olfactif induite par l’absence de système visuel périphérique au cours du développement. Nous avons choisi d’aborder cette question chez les rongeurs, des macrosmates qui utilisent principalement leur sens olfactif pour la perception de leur environnement (interactions sociales, recherche de nourriture, détection des prédateurs). Nous allons ainsi utiliser un modèle murin de cécité congénitale afin d’appréhender les mécanismes liés au développement et à la plasticité des systèmes sensoriels. Grace à la combinaison de plusieurs approches expérimentales, nous allons chercher à quel niveau et avec quel décours temporel interviennent les mécanismes de plasticité cérébrale afin d’apporter de nouvelles données pour mieux comprendre comment cette plasticité se met en place chez l’humain privé d’un sens.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant répond à l’un des enjeux clés des neurosciences : la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale. Il est bien établi que la cécité précoce entraîne une amélioration des modalités sensorielles résiduelles non visuelles qui est accompagnée d'une plasticité cérébrale fonctionnelle et anatomique. Alors que les fonctions auditives et tactiles ont été largement étudiées, les données concernant les fonctions olfactives sont moins documentées et les résultats moins cohérents. Le but de la présente étude est d’évaluer, sur un modèle de souris présentant une cécité congénitale, les performances olfactives et de corréler les changements observés à l’activité des aires cérébrales impliquées dans la perception des odeurs. Cette étude sera menée à différents stades de développement afin d’évaluer comment ces modifications se mettent en place au cours du temps. Étant donné que les données concernant les fonctions olfactives chez les humains aveugles sont controversées, ce modèle murin nous permettra d’approfondir nos connaissances de la plasticité du système olfactif et de clarifier, avec des approches de pointe, l’effet de la cécité sur les fonctions olfactives. De nombreuses études ont montré qu’il était possible d’éduquer notre fonction olfactive comme l’illustre parfaitement l’exemple des parfumeurs, mais également de la rééduquer après une perte olfactive. Ce projet, en étudiant comment la plasticité se met en place au cours du développement, pourra fournir des données sur les périodes critiques au cours desquelles on pourrait proposer une éducation olfactive chez les enfants aveugles congénitaux visant à améliorer encore leur perception du monde qui les entoure.
Procédures
La procédure 1 concerne la mise en reproduction des souris et il n’y a donc aucune intervention sur ces dernières. La procédure 2 comprend deux session expérimentale. La première vise à enregistrer la respiration des souris dans un pléthysmographe corps entier. Afin de limiter le stress des animaux lié au changement d’environnement par rapport à leur cage d’hébergement, ils seront habitués à l’appareil pendant 10 minutes les deux jours précédant cette session. La durée totale de cette session sera de 30 minutes. La deuxième session expérimentale a lieu de lendemain de la première. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis placés dans un cadre stéréotaxique. Suite à un traitement anesthésique local, la peau du crâne sera incisée au niveau des bulbes olfactifs (ouverture de 0,5 cm environ). Une session d’imagerie optique sera alors réalisée pendant 30 minutes et en présentant différentes odeurs. L’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la procédure. La peau du crâne sera ensuite recousue et l’animal replacé dans sa cage d’hébergement. La durée de cette session n’excédera pas 60 minutes. Cette procédure sera répétée 3 fois pour chaque animal à 9/11 jours post-natal (P9/11) à P30 et à P60. Après chaque session expérimentale, les souris (en particulier les plus jeunes à P9) seront replacés le plus rapidement possible avec leur mère ou leurs congénères. A la suite de la dernière session d’imagerie (P60), les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
La procédure 1, qui concerne la reproduction des animaux, va engendrer la naissance (la moitié de la portée) de souris aveugles qui est un phénotype dommageable. La procédure 2 comprend deux sessions expérimentales sur chaque animal. La première, qui concerne l’enregistrement dans la cage de pléthysmographie peut potentiellement générer un léger stress pour le jeune animal séparé de sa mère. La deuxième nécessite une chirurgie de gravité modérée réalisée sous anesthésie qui consiste en l’incision de peau au-dessus des bulbes olfactifs puis a la suture de celle-ci. Cette intervention peut engendrer une douleur post-opératoire. Cette intervention sera répétée à 30 jours d’intervalle.
Devenir
Procédure 1 : les souris reproducteurs et reproductrices voyantes (soit 15 souris) n’ayant subies aucune chirurgie ni geste invasif pourront, comme leur progéniture excédentaire, être réutilisés dans un autre projet de recherche. Il est difficile d’envisager la réutilisation des souris de phénotype aveugle dans une autre procédure, la plupart de celles-ci nécessitant un animal « voyant ». Si nous avons des pertes des juvéniles lors de la procédures 2, nous pourrons considérer utiliser ces animaux pour nos enregistrements chez l’adulte. Procédures 2: les animaux ayant subis 3 chirurgies au cours de leur développement et ayant été testé avec des odeurs dans le pléthysmographe ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc mis à mort à la fin de la procédure après la 3ème et dernière session d’imagerie.
Remplacement
L’étude de l’activité fonctionnelle du bulbe olfactif et du cerveau ainsi que des fonctions respiratoires et olfactives nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Les enregistrements optiques, s’ils ne sont pas invasifs au niveau cérébral, nécessitent la réalisation d’une fenêtre dans l’os du crane et rendent donc ces expériences non envisageables chez le sujet humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 80 souris pendant la durée du projet. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum et choisi en fonction 1) du calcul de la puissance statistique (avec alpha =0.05 et puissance statistique de 0.8) et 2) de nos travaux antérieurs et des données bibliographiques d’autres groupes. Les tests statistiques seront basés sur des ANOVA factorielles (aveugle VS voyant) (comparaison des fréquence respiratoires, surface des aires activées en imagerie optique) et des ANOVA à mesures répétées (test d’habituation/cross habituation). De plus et de façon critique, les approches expérimentales choisies (pléthysmographie et imagerie optique) permettent une approche longitudinale sur les mêmes animaux au cours du développement, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser les mêmes animaux pour les mesures physiologiques (mesure de la respiration) et l’imagerie optique dans la procédure 2. Pour limiter tout effet de portée, seules 2 souris par phénotype seront testées à l'intérieur de la même portée, soit 2 souris aveugles (1 femelle et 1 mâle) et 2 souris voyantes (1 femelle et 1 mâle) pour un total de 4. Les animaux surnuméraires seront proposés pour être réutilisés dans d’autres procédures au sein de l’établissement. Si ce nombre idéal n’est pas possible dans une portée (par exemple une femelle aveugle et 2 mâles, 1 aveugle, 1 voyant), nous inclurons ces animaux dans notre procédure et inclurons 1 animal supplémentaire d’une autre portée pour compléter notre groupe).
Raffinement
Nous avons choisi d’enregistrer la respiration de façon non-invasive en utilisant une cage de pléthysmographie. Cette technique permet d’étudier très finement un ensemble de paramètres respiratoires comme la fréquence et les volumes inspiratoires et expiratoires de manière spontanée ou en présence d’une stimulation odorante. Ces enregistrements ont lieu sans aucune contrainte chez l’animal comme c’est le cas, par exemple, avec l’utilisation d’une ceinture placée autour de la cage thoracique. L’animal est libre de ses mouvements. Pour les expériences d’imagerie optique, l’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la chirurgie ou de l’enregistrement. La douleur post-opératoire sera quantifiée et une couverture analgésique sera mise en place. Étant donné que la moitié des souris présentera un phénotype dommageable dû à l’absence de perception visuelle, un milieu d’hébergement ultra-enrichi est préconisé. Le matériel utilisé sera le suivant : une grande cage, hébergement en groupe, la nourriture est mélangée avec la litière, un tunnel et une roulette / cage, et du matériel de nidification. Cette souche de souris, en offrant la possibilité d’avoir nos deux phénotypes d’intérêt au sein d’une même portée, permet de ne réaliser qu’un seul élevage.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier les souris sont un modèle de choix pour l’étude du système olfactif en général et pour cette étude en particulier pour plusieurs raisons : (1) Les souris nouveau-nées naissent sans entrées auditives et visuelles (jusqu'aux jours 9 et 14-15, respectivement); Elles sont donc d'abord guidées par la chimioréception; (2) Le système olfactif de la souris fonctionne avant la naissance, contribuant ainsi très tôt à l'induction expérientielle de phénotypes comportementaux ; (3) Après la naissance et à l’âge adulte, les souris utilisent de façon critique les indices olfactifs pour guider leur comportement ; (4) Des tests comportementaux standardisés sont conçus pour évaluer les fonctions cérébrales et le comportement chez les souris adultes et en développement ; (5) L'accès à de nombreux génotypes obtenus par mutation ou par manipulation génétique permettent de disséquer de nombreuses fonctions cérébrales et notamment la plasticité. Pour répondre à la question des effets de la cécité sur la plasticité cérébrale et les performances sensorielles non visuelles, nous avons choisi d'utiliser une souche de souris mutante (la souche de souris ZRDBA). Lors de la reproduction, cette souche permet d’obtenir, au sein d’une même portée, une moitié de congénères aveugles et l'autre moitié voyants normalement. C’est un critère majeur lorsque l’on étudie le développement puisque l’on peut comparer des animaux de phénotypes différents issus d’une même portée. Ces animaux ont donc reçu les mêmes soins maternels et ont été exposés aux mêmes stimuli lors de leur développement. L’objectif est de tester l’impact de l’absence du système visuel périphérique sur l’activité du système olfactif au cours du développement. Nous utiliserons donc des souris à 3 stades développementaux différents : avant qu’elles n’ouvrent les yeux à un âge post-natal compris entre P9 et P11, quand elles ont ouvert les yeux et sont séparées de leur mère entre P30 et P32 et à l’âge adulte (>P60).
Apport de la thérapie génique pour traiter les déficits visuels, auditifs et d’équilibre dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
5 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 954 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 620 un niveau léger et 120 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans la cochlée ou sous la rétine sous anesthésie, puis des tests auditifs, des tests d'équilibre (rotarod, suspension par la queue, nage) et des électrorétinogrammes, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Usher. Le porteur indique que les souris déficientes présentent surdité et troubles de l'équilibre et n'attend aucune aggravation. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit le fonctionnement de la rétine et de l'oreille interne.
Objectifs
Le syndrome de Usher de type 1B (USH1B), causé par une mutation dans le gène MYO7A, représente plus de la moitié des formes héréditaires de surdicécité. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B (USH1B). Nous testerons deux stratégies de transfert de gènes (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (déjà créées ou à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome de Usher de type 1B et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation de souris humanisées nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - L’injection des formes courtes de la Myosine 7A (mini-MYO7A) nous permettra de mieux comprendre le rôle des différents domaines constituant la Myosine 7A et leur implication dans le syndrome de Usher de type 1B. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de la thérapie génique dans la correction des troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez des souris porteuses de mutations dans le gène Myo7A. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques et qui permettront de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome de Usher de type 1B. Ceci inclut : - la découverte d’un mini gène fonctionnel et prêt pour de potentiels essais cliniques, - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques, Les méthodes que nous allons développer pourraient permettre de traiter d’autres maladies affectant des gènes de grande taille.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections intracochléaires ou à des injections sous-rétiniennes. Ces injections se feront sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées par voie intrapéritonéale puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Les potentiels auditifs évoqués seront enregistrés à l’aide d’électrodes sous-cutanées placées à proximité du nerf facial. Les produits de distorsion des oto-émissions acoustiques seront enregistrés à l’aide d’une sonde placées à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux destinés à évaluer leur fonctions vestibulaires. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système de vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifié à l’aide d’un système rotarod (31 minutes) et d’un test de maintien sur une plateforme surélevée (2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à un test de suspension par la queue (15 secondes) et par un test de retournement (15 secondes). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des électrorétinogrammes (ERG) entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie par voie intrapéritonéale, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées par les photorécepteurs et neurones rétiniens seront enregistrés à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des ERG seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition de 3 minutes à une intensité lumineuse déterminée). Prélèvement d’organes : Les tissus seront récupérés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en myosine VIIa (souris shaker-1) sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces nouvelles lignées de souris déficientes en Myosine-7a. Les injections intracochléaires et sous-rétiniennes seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté Myo7a contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car ne pouvant être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par les photorécepteurs ou les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux cellules ganglionnaires de la rétine ou aux neurones spiraux de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimum d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests paramétriques ou non paramétriques. Pour certaines procédures, les mêmes animaux seront utilisés pour nos tests comportementaux et auditifs, puis mis à mort pour collecte des tissus.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes en carton et de bâtonnets en bois. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles, complétés de ceux que nous souhaitons créer, vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. Les injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.