Organes sensoriels

690 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent gavages, injections intrapéritonéales, une inhalation et une irradiation reproduisant l'exposition à des substances génotoxiques comme l'acétaldéhyde, le formaldéhyde ou les UV, pour étudier la réparation de l'ADN et le risque de cancer. Le porteur indique que les irradiations peuvent provoquer une inflammation aiguë de la peau et affirme que l'exposition aux produits mutagènes sera trop courte pour causer des lésions visibles. Les souris sont ensuite tuées pour analyse des tissus et organes.

Objectifs

Les ultraviolets et les psychotropes comme le tabac ou l’alcool contribuent au développement de tumeurs. L’exposition à la lumière UV ainsi qu’aux drogues récréatives endommagent l’ADN des cellules humaines et augmentent le risque de cancers dans la population en induisant des mutations sur l’ADN. Les altérations produites par ces substances nuisibles à l’ADN sont pris en charge par des systèmes de protection de l’ADN tels que la réparation par excision de nucléotides (NER) et, à défaut, par les polymérases translésionnelles (TLS). Des lésions non réparées entraînent des mutations qui augmentent le risque de cancers. Ces produits communément présents dans de nombreuses drogues récréatives, tels que l’acétaldéhyde, le formaldéhyde et le benzo(a)pyrène, ainsi que l’exposition prolongée et chronique aux UVs, produisent une large gamme de lésions à l’ADN qui sont réparées par le NER. Xeroderma Pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare causée par une déficience constitutive du NER. Les patients XPs ont un risque de cancer de la peau 10 000 fois plus élevé, dû à leur inaptitude à réparer les dommages induits par les UV. Il a été montré que les patients XP ont un risque de cancer interne plus de 100 fois plus élevé. Les processus mutationnels impliqués ne sont pas bien compris. Il est possible qu’ils soient dus à l’action de sources mutationnelles interne ou externe au corps, telles que l’acétaldéhyde ou le formaldéhyde. De plus, une augmentation du risque de cancers corrélé à des mutations délétère sur un allèle (mutation inactivant une copie d’un gène, c’est-à-dire une mutation hétérozygote) de gènes du NER a été montrée dans des modèles murins et humains. La consommation excessive des psychotropes cités pourrait impacter le risque de cancer chez des porteurs de ces mutations NER dans la population générale. Certaines populations présentent ces mutations hétérozygotes de manière particulièrement fréquente, allant de 0,5 à 2% de la population. L’évaluation de la susceptibilité aux cancers associés à l’abus de ces substances, ainsi qu’à l’exposition excessive aux UV est donc de haute pertinence clinique. Notre projet vise à identifier les conséquences au niveau de l’ADN et des mutations engendrées par l’exposition chronique d’animaux adultes et pendant la grossesse à ces substances cancérigènes et au rôle joué par le NER et la voie des TLS.

Bénéfices attendus

Identifier la quantité et le type de mutations engendrés par ces sources cancérigènes chez nos souris nous permettra de préciser les diagnostiques fait pour les cancers humains, ainsi que la mise en évidence d’une potentielle population particulièrement à risque pour l’exposition à ces substances.

Procédures

Gavages: nombre= 3, durée = 2 minutes . 4 injections intrapéritonéales :30 secondes:. Inhalation (1), durée: 10 minutes. Irradiation (1) : durée: 14 minutes.

Impact sur les animaux

Les irradiations sont susceptibles de provoquer des inflammations de la peau de manière aigue et contenue à la zone d’irradiation. L'exposition aux produits mutagènes ne sera pas d'une durée suffisante pour provoquer des lésions macroscopiques qui entraîneraient des nuisances.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux se révèle essentielle pour l’étude de la mutagenèse dans un contexte prénatal. En effet il est impossible de répliquer ce processus complexe de développement ex vivo. Pour ce qui est de la tumorigenèse induite par les UV, les études In vitro, bien que points de départ nécessaires et importants, ne nous permettent pas de modéliser ni de prendre en compte le processus complexe qu’est la tumorigenèse chez un être vivant complet, avec toutes les interactions entre organes.

Réduction

Notre projet n’étudie pas de caractéristiques quantifiables sur les animaux mêmes, mais sur des séquençages fais à partir de tissus récupérés sur ces animaux. De ce fait, les statistiques elles-mêmes sont fait sur les résultats de séquençage, et ne prennent pas en compte le nombre d’animaux. Nous avons besoin de 10 individus différents par génotypes et traitements pour rendre nos statistiques robustes sur l’analyse haut débit.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux, ceux-ci sont suivis quotidiennement par le même manipulateur et les mêmes animaliers. Pour les interventions et procédures des anesthésies seront effectuées. Un traitement d’appoint sous forme de crème analgésique est prévu en cas d’inflammation cutanée suite aux expositions aux ultraviolets. Des points limite et des critères d'arrêt de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Les 9 modèles nécessaires sont tous d’ores et déjà existants chez la souris sur un fond génétique C57BL/6 et/ou BALB/c. L’organisation du système vasculaire de la souris et les relations avec le microenvironnement tumoral sont très proches de celles observées chez l’Homme. L’utilisation de la souris permet d’obtenir des effectifs suffisants et des lots homogènes permettant une reproductibilité des résultats. Les stades choisis sont justifiés par les maladies qui peuvent apparaître, suivant les carcinogènes, à différents stades de la vie dans l'espèce humaine. Des femelles et mâles à maturité sexuelle (à partir de 8 semaines) pour les expériences sur les animaux adultes et pour permettre un maintien de la lignée. Des femelles pour les traitements au cours de la gestation. Pour analyser la mutagenèse prénatale après exposition aux différentes génotoxines, nous aurons besoin d'individus âgés de 2 à 3 semaines.

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.

Objectifs

Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.

Bénéfices attendus

L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.

Procédures

Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).

Impact sur les animaux

L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.

Devenir

A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.

Remplacement

Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.

44 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraoculaire d'un outil de thérapie génique sous anesthésie générale, des examens oculaires répétés et deux prélèvements sanguins, avant le prélèvement des deux yeux et la mise à mort, pour tester une correction de la maladie de Stargardt. Le porteur retient le primate car la fovéa, région ciblée de la rétine, n'existe que chez les simiens. Il présente l'étude comme une preuve de concept en vue d'essais chez l'humain.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie aveuglante de l’œil pour laquelle il n'existe encore pas de traitement à ce jour. Elle est caractérisée par une dégénérescence progressive des cellules photosensibles de la partie centrale de la rétine et touche 1 personne sur 20000 à 30000. Les patients présentent une atteinte progressive de la vision centrale impactant de manière significative la lecture, la conduite, la reconnaissance faciale et la perception des couleurs mais conservent la vision périphérique. La maladie de Stargardt est d’origine génétique et a pour cause dans 20% des cas une mutation d’un gène appelé ABCA4 présent sur le chromosome 1. Cette modification du gène par rapport à un gène normal entraine par conséquence une altération de son fonctionnement et de l’activité des cellules photosensible de la rétine. En effet, chez des personnes présentant une vision normale, ce gène est responsable de la synthèse d’une protéine impliquée dans l’élimination de déchets cellulaires (acides rétinoïdes) produits par les photorécepteurs de la rétine lors du cycle normal de la vision. Le dysfonctionnement du gène mène à l'accumulation de ces déchets et plus gravement à la dégénérescence progressive des cellules photoréceptrices de la rétine. Les avancées de la recherche en thérapie génique permettent aujourd'hui de modifier le matériel génétique de certaines cellules pour guérir des maladies liées à l'atteinte du génome. Plus précisément, les nouvelles approches d'édition du génome sont très prometteuses et permettent aujourd'hui de modifier précisément des parties spécifiques de gènes présentant une ou plusieurs mutations. La force de ces outils est telle qu’elle permet de modifier de manière extrêmement précise une petite partie de gène sans altérer le reste de l'ADN. Ces nouvelles approches permettent aujourd'hui d'espérer positivement pourvoir corriger des mutations pouvant causer des pathologies oculaires sévères chez l'Homme. C’est ainsi dans ce cadre que ce projet s’inscrit avec pour objectif d'étudier les effets de l'injection d’un outil génétique correcteur du gène déficient et notamment s’assurer de sa bonne intégration dans les cellules photosensibles de la rétine chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de cette étude sera d'établir une preuve de concept solide scientifiquement permettant de pouvoir transposer directement cette technique comme outil thérapeutique fiable pour le démarrage d'essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation d'examens oculaires : 1 examen réalisé pré-injection puis plusieurs examens d’environ 20-30 minutes par animal à raison d’un examen toutes les deux semaines pendant la phase d’incubation (minimum 3 mois) ; (2) injections intraoculaires de la solution thérapeutique (une seule chirurgie par animal d’une durée d’environ 1h) ; (3) deux prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale (10 minutes par prélèvement) ; (4) prélèvement des yeux réalisé sous couverture analgésique et anesthésie profonde suivi de la mise à mort de l’animal (durée totale 60 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, les contentions répétées (2x par jour pendant 7 jours post injection) pour l’administration de pommade oculaire, une légère perte de poids consécutive à l’opération et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections intraoculaires. Une légère douleur liée à l’injection intramusculaire de l’anesthésique pour la réalisation des gestes techniques (OCT, Injection intraoculaire d’AAV sous anesthésie générale) peut être observée également. Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un leger inconfort au niveau de l'oeil le jour précédent l'injection et provoquer dans de très rare cas une légère réaction inflammatoire indolore au niveau de la sclère (autour du point d'entrée de la micropipette d'injection).

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort. En effet, un prélèvement des deux yeux réalisé sous anesthésie profonde sera nécéssaire pour analyse des tissues oculaires nécéssitant la mise à mort de l'animal suite au prélèvement.

Remplacement

La maladie de Stargardt affecte les cellules photoréceptrices de la fovéa, c'est pourquoi l’utilisation de modèles animaux "inférieurs" tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa, structures oculaires cible dans cette étude. De plus, les vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validés in vitro sur des explants rétiniens humains et permettent de restaurer la sensibilité à la lumière. Toutefois, aucune étude in-vitro ou substitutive ne permet à ce jour de reproduire les manifestations observées dans la pathologie humaine. La maladie de Stargardt est une maladie de la vision invalidante pour laquelle il n'existe pas de traitement à l'heure actuelle. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à plus long terme une application pour des études cliniques chez l'Homme. Ce passage à la clinique nécessite donc une validation dans un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables pour chacune des condition nécéssaire pour valider la bonne intégration de la construction génétique injectée. Quarante quatre macaques Cynomolgus seront ainsi utilisés sur 5 ans.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L'ensemble des méthodes expérimentales ont été pensées et choisies pour éviter toute souffrance des animaux. Leur état de santé sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites. Ces points limites permettront d'intervenir immédiatement s'il y a signe de souffrance en cas d'effets indésirable et de veiller au bien-être des animaux. Ces derniers seront hébergés au minimum par paire, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et un programme d'enrichissement adapté sera mis en place tout au long de l'étude (ex : enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, nourrissage à la main).

Choix des espèces

La maladie de Stargardt est une maladie altérant spécifiquement les photorécepteurs de la partie centrale de la rétine. Cette région de l’œil contient les cellules (cônes) nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs ce qui invalide par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque Cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH les plus utilisées en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque Cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine comparable à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux jeunes adultes âgés de 3 à 15 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.

1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une section chirurgicale du nerf vague puis, pour certaines, un régime gras induisant une stéatohépatite, avant des prélèvements post-mortem, pour étudier le lien entre foie, nerf vague et inflammation de la rétine. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ces chirurgies n'entraînent ni douleur ni détresse et un rétablissement complet, sur la foi de ses projets antérieurs. Il conclut que l'étude dans un "organisme entier" ne peut être reproduite sur cultures cellulaires.

Objectifs

Nous avons précédemment démontré comment l'inflammation pathogène est un moteur important de la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Nos données préliminaires montrent que l'innervation vagale a un impact profond sur l’inflammation, et que des vagotomies expérimentales augmentent considérablement l'accumulation de macrophages pathogènes dans un modèle de DMLA. Une aggravation similaire des vagotomies est observée dans le modèle NASH et il a été démontré que l'innervation vagale contrôle le métabolisme hépatique, qui influence la libération de macrophages de la moelle osseuse et probablement du réservoir des monocytes spléniques. Dans l'ensemble, l'image d'un mécanisme de la voie anti-inflammatoire du nerf vague, relie le métabolisme hépatique et la régulation des populations de monocytes et macrophages. L’influence du foie, et en particulier de la NASH, sur l’état inflammatoire systémique et son impact sur une maladie inflammatoire comme la DMLA reste mal connue. Nous proposons d'analyser ces interactions en utilisant des approches chirurgicales et génétiques, des techniques de séquençage d'ARN en masse et unicellulaires. Notre projet aidera à déchiffrer les rôles joués par le foie, la moelle osseuse et la rate dans la voie anti-inflammatoire du nerf vague.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle du nerf vague et du foie dans la réponse inflammatoire systémique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra d’établir des stratégies anti- inflammatoires qui pourront bénéficiées aux patients atteints de la DMLA et de NASH. De plus ce projet pourra éclaircir un rôle potentiel de la NASH dans la pathologie de la DMLA.

Procédures

Les souris seront soumises à des chirurgies : vagotomies cervicales gauche et des branches hépatiques du nerf vague ou des chirurgies sham (contrôles). Chaque souris subira une seule opération qui dure 15-20 min sous anesthésie et analgésie. Elles auront ensuite une période de récupération de 3 semaines. Ce type de chirurgie est bien connue de notre équipe ; les souris se rétablissent complètement et rapidement et on n'observe généralement ni douleur ni détresse. Les souris seront ensuite soumises à une diète standard ou à une diète riche en lipide induisant le Nash, qui n'induit pas de détresse particulière. Nous étudierons l’impact de ce régime sur 2 temps : un temps court (4 semaines) et un temps long (12 semaines). Tous les prélèvements se feront suite à l’euthanasie par méthode réglementaire de l’animal.

Impact sur les animaux

Avec ce projet les nuisances attendues sont celles des chirurgies. Ces chirurgies sont bien connues de notre équipe et on observe généralement un rétablissement complet et rapide sans douleur ni détresse particulière. Toutefois, en cas d’infection et non cicatrisation de la plaie (ce que nous n’avons jamais observé sur ce type de chirurgie dans nos projets passés ou en cours) l’animal sera sorti de l’étude. Le régime WD n’entraîne pas de douleur ou de détresse perceptible (pas de changement du comportement de la souris), seulement une prise de poids qui sera surveillée.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’études des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.

Réduction

Nous devons induire plusieurs expériences en raison de la variabilité entre les souris d'un même lot et en raison du nombre d'analyses différentes post-mortem (FACS, biologie moléculaire et histologie) pour lesquelles les techniques recquièrent l'intégralité des tissus. Nous aurons donc besoin de 10 animaux par lots pour un total de 1080 souris. Le nombre de 10 animaux par groupe est basé sur les résultats de nos expériences dans notre laboratoire afin de permettre la réalisation des analyses statistiques adéquates pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Les animaux auront une période d'une semaine d'acclimatation avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux sont identifiés par bagues numérotées. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine et de Xylazine. En prévention de la douleur, nous administrerons de la buprénorphine en sous cutanée. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique (LUBRITHAL) est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux qui ont subi une chirurgie sont observés quotidiennement avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. On observe généralement un rétablissement complet après les chirurgies sans douleur ou détresse particulière.

Choix des espèces

Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour le NASH et la vagotomie. En outre, il est relativement simple d'examiner le système visuel et d'autres tissus chez la souris, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Les animaux seront utilisés entre 2 et 4 mois, âges auquels ils sont succeptibles de développer la pathologie.

480 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sons puis reçoivent des médicaments administrés localement dans l'oreille et subissent des tests auditifs sous anesthésie pouvant durer jusqu'à quatre heures, avant une mise à mort pour prélever les cochlées. Le porteur affirme que les expositions sonores, inférieures au seuil de douleur, ne produisent aucun effet indésirable, et choisit la gerbille pour son champ auditif proche de celui de l'humain. Il annonce des retombées thérapeutiques contre les surdités professionnelles et prévoit un dépôt de brevet, ces essais cliniques restant projetés à cinq ans.

Objectifs

Il est aujourd’hui admis que les forts niveaux de stimulations sonores provoquent la mort des cellules sensorielles de la cochlée et l’apparition d’une surdité définitive. Une exposition sonore à des niveaux modérés entraine une dégénérescence des fibres du nerf auditif, sans altération des cellules sensorielles. Fait surprenant, la perte de fibres auditives peut atteindre plus de 50%, alors que les seuils audiométriques demeurent strictement normaux. Autrement dit, une audiométrie normale n'est pas synonyme d'une audition normale. Cette neuropathie cochléaire pourrait résulter d’un excès de neurotransmetteur (excitotoxicité) libéré par les cellules sensorielles lors d’une surexposition sonore. Si cette hypothèse est validée, elle ouvre des pistes pharmaceutiques nouvelles qui consistent à utiliser des agents pharmaceutiques capables de protéger les neurones auditifs ou de stimuler leur repousse. Toutes les expériences seront réalisées in vivo chez la gerbille de Mongolie. En plus d’être un animal couramment utilisé dans des projets pharmacologiques, la gerbille présente comme avantage d’avoir un champ auditif proche du champ auditif humain facilitant ainsi le transfert clinique.

Bénéfices attendus

Les surdités sont un problème majeur de santé publique. L’organisation Mondiale de la Santé estime que 1,5 milliard de personnes dans le monde présentent des déficits auditifs et que ce chiffre devrait atteindre 2,5 milliards d'ici 2050. Il est reconnu que le traumatisme sonore est l'une des causes les plus fréquentes de surdité et un problème coûteux au sein du monde du travail. Outre la surdité, les traumatismes sonores sont responsables de la survenue d’acouphènes (sifflements, bourdonnements d’oreille), voire d’hyperacousie douloureuse (intolérance au bruit). Ce projet a pour finalité d’améliorer la santé des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Les agents pharmaceutiques identifiés et évalués dans ce projet pourront être proposés à visée préventive (protection préexposition) ou thérapeutique (post-exposition). La démonstration de leur efficacité devrait à moyen terme dans les 5 ans déboucher sur des essais cliniques. Cette étude porte sur les traumatismes sonores devraient intéresser des personnes exposées à des bruits environnementaux (militaires, musiciens, techniciens du son, ouvriers dans l’industrie). Une fois la preuve de concept faite, nous déposerons un brevet.

Procédures

En principe aucun animal ne devrait souffrir au cours de la mise en œuvre de ce projet car les tests auditifs sont tous réalisés sous anesthésie générale. Tout au long de l'anesthésie qui dure au maximum 4 heures, l’expérimentateur surveille attentivement la profondeur de l'anesthésie et le bien-être de l'animal. Le pouls et la température corporelle sont monitorées durant toute l'anesthésie. A l’issue des tests, les animaux sont placés en zone de réveil. Après leur réveil, ils sont réintroduits dans leur cage habituelle et le suivi consiste en une visite quotidienne. Lorsque que l’animal sort du protocole, il est mis à mort pour prélever ses cochlées pour des observations morphologiques.

Impact sur les animaux

Les expositions sonores ne produisent pas d’effet indésirable sur l’animal. Les niveaux sonores utilisés dans ce projet sont bien inférieurs au seuil de la douleur de l’animal (~140 dB SPL). De plus, ce type d’exposition sonore est utilisé depuis plus de vingt ans dans des dizaines de laboratoire de recherche dans le monde. Les auteurs des études n’ont jamais observé d’effet indésirable post-exposition. Par ailleurs, l’administration locale de drogues thérapeutiques ainsi que les explorations physiologiques sont réalisées sur l’animal anesthésié donc la principale nuisance est liée ici à la piqûre de l'anesthésie.

Devenir

Chaque animal est mis à mort à l’issue de la chirurgie pour prélever les cochlées pour des observations morphologiques.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales. Dans ce projet, le modèle expérimental s’appliquera à la Gerbille (Meriones unguiculatus) qui possède une gamme auditive de basse fréquence représentant un modèle précieux pour la compréhension de l'audition humaine. Par ailleurs, une grande partie des études sur les mécanismes auditifs a été réalisée sur la gerbille de Mongolie, afin de permettre une comparaison des résultats obtenus avec ceux déjà publiés il est essentiel d’utiliser cette espèce. Elles possèdent également des caractéristiques anatomiques uniques qui permettent l'application locale de drogues dans l'oreille moyenne par voie transtympanique.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Une étude statistique nous a conduits à utiliser 480 gerbilles pour 3 procédures expérimentales lors de cette étude qui se déroulera sur 5 ans. Le nombre d'animaux par groupe experimental a été calculé en utilisant un logiciel statisitique.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement surveillés après les expositions (bruit et drogue) pour évaluer tout signe de souffrance : en cas de baisse du poids, de modification de l’apparence (yeux mi-clos, le poil hérissé, le dos courbé, animal prostré), ou de problème post-chirurgical (saignement, ouverture de la cicatrice, infection cutanée). La reprise d’activité motrice ainsi que la reprise de l’alimentation normale (nourriture et hydratation) sont contrôlées deux fois par jours après les interventions. Les gerbilles conservées sont isolées dans des grandes cages dans un milieu enrichi, avec des copeaux dans la litière, des tunnels et des maisons en plexiglass. Les animaux potentiellement en souffrance (évaluation selon les signes de souffrance classiques incluant les mimiques faciales stéréotypées, le dos vouté, la prostration, le poil ébouriffé, l'anorexie) seront soulagés par une injection d'un analgésique ou mis à mort en cas de souffrance persistante au-delà de 24 heures. Une fiche d’évaluation de la douleur sera également utilisée pour consigner tout signe de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous entreprenons cette étude chez la gerbille, un animal dont la gamme de sensibilité auditive recouvre de manière significative celle de l'homme et dont les différences de distribution des sous-types fonctionnels de fibres du nerf auditif sont connues. La gerbille est de plus un modèle expérimental bien établi pour la recherche auditive et permet d'utiliser toute la panoplie des approches électrophysiologiques, moléculaires et d'imagerie modernes. La facilité d'accès à la cochlée facilite également l'administration locale de médicaments. Les animaux utilisés seront agés de 8 à 20 semaines afin de se préserver des effets liés à l’âge sur l’audition (presbyacousie).

24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être déficientes en vitamine A active, elles subissent une série de tests comportementaux moteurs et cognitifs, des examens de la rétine sous anesthésie et des injections répétées d'un marqueur, avant une mise à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur indique vouloir caractériser les conséquences de cette déficience sur le système nerveux et la vision. Il affirme que le modèle murin "n'est pas remplaçable" et reste "indispensable", les modèles cellulaires ne reflétant pas selon lui la diversité des mécanismes in vivo.

Objectifs

La vitamine A et ses formes actives jouent des rôles très importants au cours du développement et dans la physiologie de divers organes. Ces molécules sont les ligands de certains récepteurs nucléaires qui contrôlent l’expression de gènes. Si les fonctions développementales de la vitamine A et de ses récepteurs sont bien caractérisées, les fonctions aux stades adultes restent encore mal connues. Ceci s’explique par le fait que des modèles murins génétiquement modifiés pour étudier la fonction de la vitamine A ne sont pas compatibles avec la survie de l’embryon. La solution trouvée pour palier à ce problème a été de produire un modèle murin génétiquement modifié, déficient en certaines formes actives de la vitamine A, mais supplémenté en celles-ci via l’alimentation maternelle, afin d’obtenir des embryons viables. Ces mutants ainsi obtenus pourront être analysés à l’âge adulte pour caractériser les défauts fonctionnels résultant d’une déficience en vitamine A. L’objectif de ce projet est de caractériser les conséquences liées à un déficit de la forme active de vitamine A : (1) au niveau du système nerveux central, en effectuant un ensemble de tests comportementaux pour analyser les fonctions motrices et cognitives ; (2) au niveau de la vision (les déficits visuels étant la première caractéristique de la déficience en vitamine A chez l’humain) par des analyses des performances visuelles; (3) après complétion des tests, les cerveaux des animaux seront utilisés pour des analyses moléculaires supplémentaires afin de déterminer si le déficit en vitamine A affecte la prolifération cellulaire, et d’analyser ses gènes cibles potentiels.

Bénéfices attendus

Des déficiences dans le métabolisme de la vitamine A se caractérisent chez l’Homme par des troubles de la vision. La vitamine A est obtenue dans l’organisme sous forme bioactive par une enzyme spécifique. Ces formes bioactives de la vitamine A sont ensuite capables de se lier à différents récepteurs pour réguler l’expression de gènes. Différents modèles murins spécifiquement mutants pour ces récepteurs ont été conçus mais ceux-ci ne permettent pas d’étudier les conséquences d’une déficience en vitamine A, contrairement à notre nouveau modèle murin. Celui-ci est déficient en l’enzyme spécifique permettant d’obtenir la vitamine A, privant l’animal de la forme bioactive de la vitamine A. Ainsi, grâce à des études comportementales et visuelles et des analyses moléculaires, les conséquences de cette déficience seront comparées aux différents modèles murins mutés pour les récepteurs de la vitamine A. Ce projet permettra pour la première fois de décrire précisément les conséquences comportementales et visuelles de souris déficientes en formes actives de la vitamine A. Des mutations de certains récepteurs de la vitamine A, avaient déjà été décrites chez l’Humain mais pas entièrement caractérisées, d’où l’intérêt de ce projet pour compléter les connaissances déjà acquises jusqu’ici. Des influences environnementales, notamment nutritionnelles, vont vraisemblablement impacter la santé des individus atteints. C’est pourquoi il est important de disposer de modèles mammifères permettant de reproduire ces anomalies, afin d’en tirer les bénéfices applicables à la santé humaine par la suite. En effet, ils permettent de caractériser les conséquences fonctionnelles et pathologiques, et de les traiter par des stratégies (nutritionnelles, pharmacologiques …) pouvant aussi être mises en œuvre chez les patients humains.

Procédures

Ici, nous voulons étudier les conséquences de la déficience en vitamine A sur le cerveau et les fonctions visuelles. Pour cela, nous réaliserons divers tests comportementaux cognitifs et moteurs sur l’ensemble des animaux utilisés ici (n=24, 12 contrôles ; 12 mutants). Ensuite, la moitié des animaux (n=12) recevront une anesthésie générale par voie respiratoire (pendant 5min) afin de visualiser la rétine et ses potentiels défauts (par observation du fond de l’œil par exemple) chez le mutant. Une semaine après, une seconde expérience sous anesthésie générale par injection dans l’abdomen d’anesthésique et d’analgésique (5sec) sera réalisée pour évaluer la réactivité de la rétine à des flashs lumineux. Enfin, pour caractériser l’effet moléculaire de la déficience en vitamine A, nous procéderons à la mise à mort de l’animal pour ensuite prélever le cerveau et réaliser des analyses moléculaires. Pour déterminer l’effet cellulaire généré par la mutation de l’enzyme spécifique, nous injecterons un produit chimique dans l’abdomen de l’autre moitié des animaux (n=12) pour marquer les cellules en croissance 2 fois par jour (matin et soir) pendant 3 jours pour augmenter le signal du marquage. A l’issue de la dernière injection, les animaux seront anesthésiés généralement et recevront une perfusion intracardiaque afin de fixer les tissus et de prélever le cerveau pour réaliser des analyses immuno-histochimiques. Aucun animal n’est maintenu en vie au cours de ces expériences car nous préleverons le cerveau pour réaliser des analyses moléculaires et immuno-histochimiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ne dépasseront pas la douleur occasionnée par l’introduction d’une aiguille dans l’abdomen de l’animal pour les injections intra-péritonéales. En effet, les tests comportementaux à effectuer ne sont pas sujets à causer la moindre souffrance, et les analyses rétiniennes sont réalisées sous anesthésie générale sans endommager les yeux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort de deux manières différentes : d’une part par dislocation cervicale qui permettent de prélever tous les organes nécéssaires pour les analyses moléculaires. D’autre part, une mise à mort par perfusion intracardiaque sera effectuée pour la réalisation de marquages immuno-histochimiques qui nécéssitent une fixation complète et homogène de l’échantillon prélévé.

Remplacement

Le modèle murin N’EST PAS REMPLAÇABLE et reste indispensable afin d’évaluer l’impact des mécanismes biologiques sur le comportement moteur ainsi que pour étudier les fonctions cérébrales. Il permet de même les investigations des fonctions visuelles dans le modèle le plus proche de l’Homme. En effet, la complexité biologique des signalisations par la voie rétinoïde ne permet par de remplacer les animaux par des modèles, par exemple cellulaires, parce qu’ils ne reflètent pas la diversité des mécanismes biologiques in vivo.

Réduction

Afin de REDUIRE au maximum le nombre d’animaux utilisés, le nombre d'animaux utilisés (groupes de 12, 6 expérimentaux, 6 témoins) correspond au nombre minimal d'animaux à inclure pour obtenir des données statistiquement exploitables selon les impératifs de réduction. Ces effectifs ont été déterminés d'après les données de la littérature et les procédures en vigueur à l'animalerie. Nous nous sommes basés sur des données obtenues, chez des souris de fond génétique mixte à la suite du test Openfield (le moins discriminant des tests effectués ici) ainsi que sur des données comportementales obtenues à la suite d’injection de composés pharmacologiques. Une différence significative entre les groupes sera recherchée par application d’un test two-way ANOVA, suivi de tests post-hoc. Il a été vérifié préalablement que la distribution des valeurs est normale avec ce type de test. La seule variable incompressible est le nombre de femelles gestantes qui permettra d’obtenir, dans les portées, le nombre de mutants requis pour les procédures. Dans l’optique de réduction, un nombre limité d’accouplements

Raffinement

En vue de RAFFINER les procédures, les animaux sont hébergés dans des conditions optimales et ils font l’objet d’un suivi adapté et de soins vétérinaires au besoin. Les expériences réalisées ici ne sont pas douloureuses. Elles consistent uniquement en des études comportementales, dans une plateforme phénotypique à la pointe de l’art (Institut Clinique de la Souris), effectuées en conditions standard sans aucune administration, par exemple, de composés pharmacologiques.

Choix des espèces

Pour étudier le rôle de la vitamine A et les conséquences physiopathologiques de sa dysfonction, la souris est un modèle optimal du fait de la similitude des génomes murin et humain, des grandes fonctions physiologiques, de l’existence de tests fonctionnels validés pour ce modèle, et de la possibilité de mettre en œuvre des approches préventives (nutritionnelles) ou thérapeutiques qui pourront être ensuite transposées vers l’Humain. Chez l’humain les déficiences en vitamine A se caractérisent par des troubles de la vision. Afin de mieux caractériser le rôle de la vitamine A dans ces troubles, nous utiliserons des animaux adultes (10 semaines).