Recherche appliquée

Injectées avec des cellules de lymphome B, 1 300 souris sur les 1 800 du projet développent des tumeurs ganglionnaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le grossissement des ganglions peut réduire leur mobilité, voûter leur posture, accélérer leur respiration et leur faire perdre du poids. L'équipe cherche à comprendre comment les cellules tumorales produisent leur énergie, et pourquoi certains lymphomes résistent aux immunothérapies quand d'autres y répondent. Toutes les souris sont tuées à la fin pour récupérer les tumeurs, geste que le porteur présente comme la seule façon d'étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses.

Objectifs

Les Lymphomes Diffus à Grandes Cellules B (LDGCB) sont des cancers du système immunitaire qui touchent les lymphocytes B, des cellules chargées de défendre l’organisme contre les infections. C’est le type de lymphome le plus fréquent dans les pays industrialisés. Ce cancer est très variable d’un patient à l’autre. Une des raisons principales est la façon dont les cellules cancéreuses produisent l'énergie pour se développer et se multiplier. Pour produire cette énergie, elles peuvent utiliser deux grands mécanismes: l'un rapide mais peu efficace, tandis que l'autre est plus complexe mais plus efficace. Des études ont montré que, chez certains patients, le lymphome dépend de l'un ou l'autre de ces mécanismes. Cette différence peut influencer leur réponse aux traitements actuelement disponibles. Notre objectif vise à mieux comprendre pourquoi ces cancers ne fonctionnent pas tous de la même manière. Nous cherchons notamment à déterminer si ces différences sont liées à des facteurs génétiques ou à l'environnement des cellules tumorales. Nous étudierons si d'autres modifications du métabolisme sont associées à la croissance des cellules cancéreuses. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons un modèle expérimental de souris reconnu et largement utilisé pour l'étude des lymphomes en laboratoire.

Bénéfices attendus

Ce projet est à la base des recherches menées par notre équipe pour mieux comprendre pourquoi certains lymphomes sont résistants aux traitements actuels (immunothérapies et thérapies ciblées), alors que d'autres y sont sensibles. Il s'intéresse à la manière dont les cellules tumorales produisent l'énergie nécessaire à leur développement. À court terme, il permettra d'identifier les mécanismes qui favorisent la croissance des lymphomes. À plus long terme, ces travaux aideront à mieux comprendre les causes de la résistance aux traitements et pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de traitements plus efficaces et mieux adaptés aux caractéristiques de chaque patient.

Procédures

Dans ce projet les souris seront soumises à des contentions (environ 30 secondes, 1 à 3 fois par semaine). 1300 animaux recevront une injection de cellules tumorales (environ 30 secondes). Parmi elles, 1000 souris recevront une injection ultérieure (environ 30 secondes). 300 souris auront un prélevement de sang (environ 45 secondes), suivi de 2 injections (environ 30 secondes chacune).

Impact sur les animaux

La croissance des lymphomes dans les ganglions lymphatiques pourra entraîner une augmentation du volume des ganglions et, selon leur localisation, provoquer une gêne modérée chez les animaux. Celle-ci pourra se traduire par une diminution de la mobilité, une posture voûtée, une baisse de l'activité, une respiration plus rapide ou une perte de poids.

Devenir

Afin de mieux comprendre comment les cellules des lymphomes produisent et utilisent l'énergie nécessaire à leur survie et à leur multiplication, nous devons récupérer les tumeurs développées chez les animaux à la fin de l'expérience. Cela nécessite de procéder à la mise à mort de l'ensemble des animaux du projet. Les analyses réalisées sur ces tumeurs après leur prélèvement sont indispensables pour étudier le fonctionnement interne des cellules cancéreuses, comprendre les mécanismes biologiques qui favorisent leur développement et identifier de nouvelles caractéristiques pouvant être exploitées pour améliorer les traitements des lymphomes.

Remplacement

Les lymphomes B peuvent utiliser différentes sources d’énergie selon leur environnement, ce qui influence leur sensibilité aux traitements. Lorsqu’on étudie ces cellules cancéreuses en laboratoire dans des conditons de culture in vitro, cette diversité n'est plus observée. En effet, ces conditions sont très artificielles et ne reproduisent pas fidèlement l’environnement réel de la tumeur dans l’organisme. De plus, les milieux de culture contiennent des nutriments spécifiques présents à des concentrations élevées et non-physiologiques, qui “forcent” les cellules tumorales à utiliser certaines réactions biochimiques. Avec le temps, les cellules s’adaptent à ces conditions artificielles et finissent par se comporter différemment des celles qui évoluent dans l'organisme (in vivo). C’est pourquoi, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, notamment des souris, pour étudier correctement cette diversité métabolique et mieux comprendre le comportement biologique des lymphomes.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au strict minimum tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide d’un outil informatique de calcul, en tenant compte des connaissances que nous avons acquises au cours des 15 dernières années avec le modèle animal utilisé dans cette étude.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera assuré par la mise en place de mesures de raffinement adaptées au modèle de lymphome B étudié. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière (une à trois fois par semaine selon la procédure expérimentale), voire quotidiennement (selon la phase expérimentale), incluant l'évaluation de leur état général, de leur comportement, de leur mobilité, de leur poids et de l'évolution du développement tumoral. La palpation régulière des ganglions lymphatiques permettra également de suivre la progression de la maladie.

Choix des espèces

La souris présente de nombreuses similitudes biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté à l'étude des lymphomes. Le choix de cette espèce repose également sur l'existence de modèles murins génétiquement modifiés bien caractérisés, qui reproduisent certaines caractéristiques des lymphomes B humains et permettent d'étudier les mécanismes impliqués dans leur développement et leur réponse aux traitements. La souris présente par ailleurs l'avantage de disposer d'un système immunitaire et d'un environnement tumoral étudiables dans leur intégralité, ce qui est essentiel pour analyser les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. De plus, comparativement au plasma humain, les concentrations en nutriments observées dans le plasma murin sont globalement conservées. Ces similitudes suggèrent que l'environnement nutritionnel disponible pour les cellules tumorales est comparable entre les modèles murins et humains, renforçant ainsi la pertinence de ce modèle pour l'étude du métabolisme tumoral. Les animaux utilisés seront des souris âgées d’environ 6 semaines au début des procédures expérimentales. Cet âge correspond à une période compatible avec les greffes cellulaires, les analyses métaboliques et le suivi du développement tumoral dans ce modèle.

1 600 souris rendues obèses par une alimentation enrichie en graisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à 91 administrations de traitement, 89 pesées et 13 prélèvements sanguins. Elles sont hébergées seules pendant l'étude, ce que le porteur décrit comme une nuisance d'isolement chez une espèce sociale, puis toutes tuées sous anesthésie pour prélèvement d'organes. Le projet teste des composés contre l'obésité, seuls ou associés au tirzépatide, avec l'idée d'en limiter la perte de masse musculaire. Le porteur indique qu'aucune méthode de substitution ne permet cette étude et que l'essai in vivo reste une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier de passage aux études cliniques.

Objectifs

Depuis 1975, le nombre de personnes en situation d’obésité a fortement augmenté dans le monde, faisant de cette maladie un enjeu majeur de santé publique. De nombreux traitements sont actuellement en développement pour améliorer la prise en charge des patients. Parmi eux, le tirzépatide permet une perte de poids importante, mais cette perte peut aussi s’accompagner d’une diminution de la masse musculaire, ce qui peut être problématique. Ce projet prévoit la réalisation de 10 études sur les cinq prochaines années afin d’évaluer de nouveaux traitements contre l’obésité chez des souris rendues obèses par une alimentation riche en graisses. Les traitements seront testés seuls ou en association avec un traitement de référence déjà utilisé contre l’obésité. L’objectif est d’évaluer leur efficacité sur la perte de poids, mais aussi leur capacité à limiter les effets indésirables sur la fonction musculaire.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, dont le tirzépatide qui est le plus efficace et le plus prescrit. Néanmoins, le tirzépatide présente un effet délétère sur la masse et la fonction musculaire lors d'administration chroniques. Le bénéfice attendu du présent projet est double car si les résultats sont concluants, le composé X pourra venir compléter l'arsenal thérapeutique anti-obésité, en administration seule ou combinée avec le composé de référence, et dans ce dernier cas, il pourrait en améliorer l'efficacité tout en contrant ses effets secondaires au niveau musculaire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (89 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration des traitements (91 administrations ; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (13 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Prélèvements sanguins (13 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 5) Anesthésie générale avant mise à mort et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, de composition corporelle ainsi que le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations occasionneront également une douleur de faible intensité et de faible durée aux animaux. La mise à jeun de 4h ou 6h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères. De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes et analyses biochimiques et histologiques ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre de 12 animaux par groupe pour les souris obèses a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de tunnels, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. L'administration des traitements sera réalisée par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue une semaine avant la phase de traitement afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans le tube de couleur rouge permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures. Les prélèvements sanguins seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages pharmacocinétiques ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Avant la mesure des dépenses énergétiques en cages métaboliques, les animaux seront également habitués à leur nouvel environnement durant 20h. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'anti-inflammatoire en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses (45% ou 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documentés dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques.

Nourries pendant trente-huit semaines avec un régime riche en graisses et en cholestérol pour les rendre obèses, 30 souris sur les 40 du projet subissent en plus un jeûne nocturne pouvant atteindre quinze heures, une injection de glucose sur souris consciente et six prélèvements de sang à la queue en deux heures. Toutes sont tuées après ces trente-huit semaines pour prélever le foie, le sang et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'obésité ainsi provoquée est décrite comme les rendant "un peu moins actives", et l'objet est de tester un composé contre la fibrose du foie, pour laquelle le porteur indique qu'aucun traitement efficace n'existe. L'effectif de 40 souris est présenté comme calculé pour obtenir un effet statistique significatif, sans que ce calcul soit rapporté.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie représentent un enjeu majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Parmi ces maladies, la stéatose hépatique non alcoolique, qui correspond à une cirrhose du foie sans consommation d’alcool, est en forte progression à cause de l’augmentation de l’obésité ou encore du diabète de type 2. Dans cette maladie, il y a une accumulation importante de graisses dans les cellules du foie ,ce qui entraine une cicatrisation du foie appelée fibrose hépatique. Cette fibrose va rigidifier des parties du foie conduisant progressivement à une perte de fonction du foie et pouvant évoluer vers une insuffisance hépatique terminale. De plus, la fibrose hépatique chronique peut être responsable du développement de cancer du foie, ce qui accentue la gravité de cette pathologie. La stéatose hépatique non alcoolique est souvent diagnostiquée à un stade avancé, lorsque les lésions dans le foie sont déjà présentes. A l’heure actuelle il n’existe aucun traitement efficace pour inverser ou ralentir cette fibrose. Le développement de traitements efficaces contre la fibrose étant un enjeu majeur en santé, l’objectif principal de ce projet est de tester chez la souris un nouveau composé pour traiter la stéatose hépatique non alcoolique.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est le développement d’un traitement efficace pour lutter contre la progression de la fibrose hépatique. De plus ce projet permettra de mieux connaitre les mécanismes biologiques encore mal connus responsables du développement de la maladie.

Procédures

Pendant 38 semaines, 30 souris seront nourries avec un régime riche en graisses et cholestérol pour les rendre obèses et 10 souris recevront un régime standard. Pour tester la glycémie au cours du régime, 20 souris parmi les 40 souris du projet seront mis à jeun sur la nuit (maximum 15h) APRES 16 SEMAINES DE REGIME. Le lendemain, une injection de glucose (moins de 20 secondes) sera réalisée sur l'animal conscient et des prélèvements de sang se feront au niveau de la queue. Les prélèvements seront réalisés sur un temps court (durée inférieure à 2 minute) et de façon répétée en 6 fois sur une période de 2h dans la même journée. APRES 37 SEMAINES DE REGIME, UN AUTRE TEST DE LE GLYCEMIE APRES UNE PERIODE DE JEUNE MAXIMALE DE 6H SERA REALISE SUR LES 30 SOURIS NOURRIES AVEC LE REGIME GRAS DONT 10 SOURIS AURONT DEJA SUBI CE TEST A LA SEMAINE 16. Un autre prélèvement sanguin au niveau de la queue (une seule prise) sur la totalité des 40 souris sera réalisé 11 semaines plus tard.

Impact sur les animaux

Les souris qui recevront sur 38 semaines le régime riche en graisses et cholestérol vont prendre du poids et devenir un peu moins actives à cause de l'obésité. Durant la période de jeûne de 14-15h sur la nuit, les souris privées de nourriture pourront ressentir une sensation de faim. Lors de l’injection de glucose, le passage de l’aiguille de petite taille au travers de la peau sera de très courte durée (moins de 20 secondes) et entrainera un inconfort chez les souris. Des prélèvements sanguins à la queue seront pratiqués sur animaux conscients après 16, 27 ET 37 semaines de régime. Ces prélèvements bien que rapides (durée < 2 minutes) sont susceptibles d’induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Après les 38 semaines de régime, tous les animaux seront mis à mort par une méthode d'euthanasie réglementaire pour prélever les tissus et le sang. L'analyse de ces prélèvements nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement dans le foie de la fibrose et d'identifier les cibles thérapeutiques de notre composé.

Remplacement

ll n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire de manière fiable l’environnement in vivo que l'on retrouve dans un organisme vivant et dans lequel plusieurs types de cellules interagissent entre elles et participent au développement de la fibrose . De plus, cette maladie se développe lorsqu’il y a des problèmes métaboliques (ex hausse de la glycémie) dans l’organisme entier suralimenté, ce qui justifie l’utilisation d’animaux. Enfin il n’existe pas de méthode alternative n’utilisant pas l’animal de laboratoire pour tester l’efficacité d’un composé sur la fibrose hépatique.

Réduction

Le nombre total de souris a été calculé pour avoir un effet statistique significatif sur les paramètres étudiés. A la fin de l’étude, des tissus autres que le foie pourront être prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe en lien avec d’autres maladies étudiées dans notre laboratoire (obésité, pré-diabète, atteintes cardiaques, rénales). Pour l’analyse des données recueillies lors des différentes expériences nous appliquerons les tests statistiques appropriés en utilisant un logiciel d'analyse.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement et la litière des cages sera plus fréquemment changée. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel expérimenté. Pour diminuer le stress lors des prélèvements de sang, les animaux seront habitués au mesure de contention quelques semaines avant la prise de sang. Pour éviter d’avoir recours au gavage source de stress, le traitement sera administré quotidiennement (5 jours sur 7) dans de la nourriture constituée de beurre de cacahuète pour l’appétence. Le traitement avec le composé a déjà été administré chez le rongeur (rat et souris) dans de précédents travaux sans entrainer d’effets indésirables

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet sont très sensibles au régime riche en graisses et développe une obésité et une stéatose hépatique non alcoolique similaire à la maladie humaine. Les souris utilisées seront de jeunes mâles âgés de 5 à 6 semaines car la plupart des études sur le modèle murin pour étudier cette maladie sur une longue période utilisent de jeunes souris adultes. Ainsi, grâce aux nombreuses études scientifiques publiées, de nombreuses informations sur la souris sont disponibles et permettront de mieux comparer les résultats obtenus dans ce projet.

Récupérées parmi les femelles dont d'autres projets n'avaient pas l'usage et qui auraient été tuées au sevrage, 50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont rasées sur le ventre sous anesthésie, incisées au cou pour atteindre la veine jugulaire et l'artère carotide, reçoivent jusqu'à deux injections, puis dix minutes d'ultrasons sur le thorax et trois points de suture, pour une trentaine de minutes en tout. Leur cœur est prélevé après la mise à mort, afin de vérifier où les nanoparticules se sont fixées. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire de recourir à un organisme entier" pour étudier cette distribution, et présente ce passage par la souris comme "indispensable" avant d'envisager un plus gros animal puis la clinique.

Objectifs

Les arythmies cardiaques ventriculaires sont la principale cause de mort subite cardiaque. Chaque année, environ 250 000 personnes sont victimes de mort subite en Europe. De manière générale, les résultats de l’ablation de tachycardie ventriculaire par cathéters (stratégie actuellement utilisée en clinique) sont mauvais avec environ 50% de récidives. Nous souhaitons développer une méthode permettant de réaliser une ablation combinant différentes stratégies. Pour cela, il est envisagé une délivrance de molécules thérapeutiques encapsulées dans des nanoparticules, facilitée par l’ouverture préalable de pores dans la barrière vasculaire grâce à l’utilisation de microbulles et d’ultrasons, pour permettre aux nanoparticules d’atteindre la cible cardiaque avec une forte concentration et d’ainsi augmenter leur efficacité.

Bénéfices attendus

L’intérêt de la démarche est d’améliorer le pronostic des patients souffrant de tachycardie ventriculaire en traitant sélectivement la région cardiaque responsable de l’arythmie, de façon plus efficace et sécuritaire que les techniques actuelles. De manière plus large, ce projet pourra ouvrir des perspectives d'application au-delà du traitement des arythmies cardiaques ventriculaires (traitement de maladies génétiques, protection du cœur après un infarctus).

Procédures

Tous les gestes potentiellement douloureux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie (2 maximum par animal). Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale sous anesthésie générale pour des raisons d'imagerie (1 par animal, environ 2min). Des incisions sous-cutanées seront réalisées pour l'analgésie (3 maximum par animal) Des incisions seront réalisées au niveau du cou pour accéder aux vaisseaux (veine jugulaire, artère carotide) afin d’injecter les traitements (2 injections maximum par animal). Un appareil générateur d’ultrason sera appliqué sur le thorax de l’animal afin d’envoyer les ultrasons au cœur (1 par animal, environ 10 min). 3 points de sutures par animal seront réalisés pour suturer l'incision réalisée. Les animaux seront imagés sous anesthésie générale (1 par animal,

Impact sur les animaux

Il s’agit d’une approche impliquant une chirurgie légère (pour accéder à la veine jugulaire et à l’artère carotide), une administration intraveineuse de nanosystèmes non toxiques et l’application ciblée (thorax) d’ultrasons non délétères. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasionner du stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur et l’analyse (histologie) des tissus afin de confirmer l’efficacité de la thérapeutique étudiée.

Remplacement

Il est nécessaire de recourir à un organisme entier pour étudier le profil de distribution des molécules injectées et évaluer l'efficacité de l'ouverture de la barrière vasculaire cardiaque par les ultrasons. La preuve de concept sur l’efficacité de cette nouvelle approche sur petit animal vivant est indispensable avant d’envisager des études plus approfondies sur plus gros animal, puis un transfert à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Le sexe des animaux n’ayant pas d’importance d’un point de vue scientifique dans ce projet, les femelles non-utilisées d’autres projets (dont le sexe d'intérêt sont les mâles) seront utilisés dans ce projet au lieu d’être mises à mort au sevrage.

Raffinement

Durant toute la durée des protocoles, les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Une analgésie sera mise en place avant et après l'étape de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour les études de diffusion des nanoparticules dans le cœur. De plus, ce modèle est parfaitement compatible avec une approche par ultrasons cardiaque.

Jusqu'à quinze injections par souris, un prélèvement de tissu à l'oreille sur souris vigile et la séparation répétée des souriceaux de leur mère : 1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs os longs, leurs vertèbres et leur crâne sont prélevés après la mise à mort, pour mesurer l'effet d'un traitement administré avant et après la naissance. L'effectif de 1 440 souris n'est appuyé que sur la littérature et l'expérience du laboratoire, sans calcul rapporté. Le résumé ne nomme ni les maladies osseuses visées, qualifiées seulement de génétiques et rares, ni la molécule testée.

Objectifs

Les pathologies osseuses étudiées sont des maladies génétiques rares. L’objectif du projet est de tester en prénatal et en post-natal un traitement afin de proposer aux patients une prise en charge plus précoce.

Bénéfices attendus

Ce projet préclinique permettra d'envisager un traitement précoce et plus adapté pour ces pathologies.

Procédures

Prélèvement de tissu sur animal vigile (une fois, 5 secondes). Contention pour les injections (maximum 15 fois, une minute). Injections (maximum 15 fois, une minute). Prélèvement sanguin sous anesthésie et analgésie (une fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Le prélèvement à l'oreille provoque une douleur brève. Les injections causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention au moment de l'injection peut aussi provoquer un stress chez les souris. La séparation courte et ponctuelle des souriceaux de la mère pour le geste d'injection peut causer un stress de courte durée.

Devenir

A l’issu du projet les animaux seront mis à mort car nous prélevons les os longs, les vertèbres et le crâne afin d'étudier l'impact du traitement sur le squelette.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de tester des molécules thérapeutiques avec un traitement précoce sur l’ensemble du squelette. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de développement d’un mammifère dans sa complexité avec les nombreux types cellulaires qui interagissent.

Réduction

Le nombre de souris est réduit à son minimum. Il a été déterminé en accord avec les données de la littérature et d’après notre propre expérience sur le modèle souris.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un environnement adapté. Les animaux subissant un prélèvement sanguin reçoivent une anesthésie générale. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole. Les points limites définis dans le projet seront strictement respectés afin que la douleur soit limitée au minimum. Les animaux présentant des signes de détresse seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour tester un traitement ayant un impact sur le squelette grâce à la similarité de développement et de structure avec l’Homme. Chez la souris, la formation du cartilage débute au stade embryonnaire E14.5 et les anomalies de croissance sont visibles au niveau des os longs et du crâne pendant la période anténatale, il est donc pertinent de commencer un traitement à ce stade de développement pour avoir un impact sur la formation osseuse. La période de traitement s'étend jusqu'à 15 jours après la naissance pour couvrir une longue période de la croissance. Nous disposons de modèles mimant bien les pathologies osseuses étudiées. L'étude de l'impact de la molécule thérapeutique est réalisée en prénatal et post-natal.

Six tests comportementaux par souris sur trois semaines, dont un labyrinthe en Y et une piscine équipée d'une plateforme de sortie, plus quatre prélèvements sanguins isolés et trois séries de prélèvements étalées sur deux heures : 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de dix-huit jours reçoivent de l'ovalbumine par voie intrarectale sous anesthésie, puis sont tués par dislocation cervicale une heure après leur réveil. L'objet est de mesurer les effets des additifs des laits infantiles sur l'intestin et le cerveau, avec des résultats destinés à éclairer l'Efsa et l'Anses. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de "non invasifs et n'induisant pas de stress", tout en annonçant que certaines souris pourraient développer une inflammation intestinale chronique et un comportement anxieux.

Objectifs

Le lait maternel joue un rôle essentiel dans la croissance des nouveau-nés. Il module entre autres le microbiote intestinal, qui lui-même participe au bon développement du cerveau et de la santé. De nombreux nourrissons sont alimentés avec des laits de substitution en poudre. Ces préparations contiennent des additifs, utilisés notamment pour améliorer leur texture ou leur conservation. Il a déjà été montré que certains de ces additifs peuvent perturber l’équilibre du microbiote intestinal, entraînant une dysbiose et une inflammation intestinale chez l’adulte. En revanche, leurs rôles et leurs conséquences sur le développement du cerveau durant la période néonatale sont peu explorées et leurs effets à plus long terme sur le comportement restent inconnus. Ce projet a pour objectif d'étudier chez l'animal les effets de la consommation durant la période néonatale de laits contenant ces additifs sur l’axe intestin-cerveau à différentes périodes de la vie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples. Sur le plan fondamental, ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les mécanismes par lesquels l'alimentation agit sur la santé intestinale et le développement cérébral durant la période néonatale, et sur la façon dont les perturbations précoces du microbiote peuvent influencer l’apparition d’inflammation intestinale et le comportement à long terme. Sur le plan appliqué, les résultats viendront éclairer les évaluations des risques sanitaires liés à ces additifs chez les nourrissons. Ils pourront orienter l'optimisation des formulations des laits infantiles et fournir des éléments scientifiques utiles aux instances de réglementation (Autorité européenne de sécurité des aliments (Efsa), agence nationale de sécurité sanitaire (Anses)), dans une perspective de meilleure protection de la santé des nouveau-nés. Enfin, ces travaux contribueront à enrichir les recommandations nutritionnelles destinées aux familles et aux professionnels de santé.

Procédures

Les animaux subiront 4 prélèvements uniques de sang pour une durée inférieure à 1 minute afin de mesurer la gly-cémie. Les animaux subiront 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements mul-tiples seront séparés d’au moins une semaine afin de mesure la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose. Les animaux adultes seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs et n'induisant pas de stress chez l'animal. Les animaux adultes seront au préalable soumis à une phase d’habituation d’une semaine qui n'induira que peu ou pas de stress chez: chaque jour, ils seront exposés à l’expérimentateur et à la salle de comportement pendant une durée de 30 minutes à 1 heure, afin de réduire le stress lié à la manipulation et à l’environnement expérimental. À l’issue de cette période, une série de tests comportementaux sera réalisée pour évaluer différents aspects tels que l’anxiété, la sociabilité, la mémoire et l’hyperactivité. Ces évaluations reposeront sur les paradigmes suivants : • tes de l’anxiété : Les dispositifs expérimentaux combineront des zones ouvertes/éclairées et des zones fermées/protégées. Le temps de présence dans chaque type de zone sera quantifié sur une période de 10 minutes • évaluation de la mémoire : phase d’habituation de 10 minutes durant laquelle l’animal est placé dans une arène contenant des objets, dans un labyrinthe en Y ou dans une piscine équipée d'une plateforme pour permettre à l'animal de sortir de l'eau. Suite à une modification de la configuration (changement d’objets ou d’accessibilité des zones), une phase de test de 10 minutes permettra de mesurer la capacité de reconnaissance ou de spatialisation de l’animal. • évaluation de la sociabilité : mesureront la préférence naturelle de l’animal à interagir ou à passer du temps à proximité d’un congénère plutôt que d’un objet inanimé, sur une durée de 10 minutes Chaque test comprendra une phase d’habituation de 10 minutes à l’arène, suivie d’une phase de test de 10 minutes par animal. La fréquence des tests est limitée à un seul test par jour et par animal au maximum, pour un total d’environ 6 tests par animal répartis sur une période de trois semaines. • animaux jeunes adultes agés de 18 jours subiront une administration intrarectale d’ovalbumine après anesthésie à l’isoflurane. Après 1h de phase de réveil, ils seront mis à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Certaines procédures pourraient induire une inflammation intestinale chronique de bas bruit sans ulcération majeure et qui n’a pas de conséquences visibles sur le phénotype. De plus, certains animaux pourraient développer des dérégulations métaboliques, caractérisées notamment par une augmentation de la masse grasse ainsi que présenter un comportement anxieux. Les tests comportementaux réalisés sur animaux adultes entraineront peu ou pas de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car l’analyse de leurs organes est nécessaire pour répondre à notre hypothèse de travail.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant, le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment cerveau/intestin/microbiote en lien avec le développement d’inflammation chronique de bas bruit et de troubles du comportement. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie du développement cérébral et du comportement de ces animaux est très différente de celle des mammifères.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 12 souris par condition et par sexe était nécessaire afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les tests statistiques envisagés dans le cadre de ce projet l’ont été après avis recueilli auprès de biostatisticiens pour des projets similaires. De plus, il s’agit d’une expérience au design longitudinal, ce qui nous permet d’observer le phénotype des souris aux différents stades de développement et donc limiter le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Dans un souci de raffinement, un suivi étroit des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. Des points limites spécifiques et précoces sont définis pour chaque protocole. Dès l’apparition d’un signe clinique, différentes méthodes de raffinement seront appliquées pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la douleur : utilisation de gel de réhydratation, réhydratation sous-cutanée, renforcement de l’enrichissement.

Choix des espèces

Cette étude privilégie la souris comme modèle de référence pour analyser l'impact des additifs alimentaires sur le microbiote intestinal et le développement cérébral néonatal. Ce choix se justifie par la capacité à suivre précisément les interactions microbiote-système immunitaire dès la naissance grâce à des outils d'analyse avancés. Bien que simplifiée, la physiologie mu-rine offre une pertinence conceptuelle et souvent directe pour comprendre les mécanismes chez le nouveau-né humain. En pratique, la souris est indispensable : sa reproduction rapide permet d'obtenir de grandes portées pour suivre les effets à long terme d'une exposition nutritionnelle précoce, de la nais-sance à l'âge adulte. De plus, c'est l'espèce la mieux maîtrisée pour évaluer les fonctions co-gnitives et comportementales en milieu contrôlé. Ces avantages combinés garantissent une efficacité optimale dans la recherche tout en assurant une représentation physiologique fiable des processus biologiques humains. Le premier groupe sera suivi jusqu’à l’âge du sevrage, soit environ trois semaines. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le cerveau sont particulièrement sensibles à l’environnement nutritionnel. Le second groupe sera suivi jusqu’au 18ème jour de vie. Cette période constitue la phase d’exposition aux additifs ; c’est également une fenêtre de développement où le microbiote intestinal et le système immunitaire sont modulés par l’environnement nutritionnel. Le troisième groupe sera maintenu dans les mêmes conditions jusqu’à l’âge adulte, l’exposition aux additifs étant limitée à la seule période néonatale. Ce suivi longitudinal permettra de vérifier si les éventuelles perturbations observées chez le jeune animal perdurent et influencent le comportement et l’état général à long terme. L’utilisation de ces deux stades est indispensable à la démarche scientifique : la période néonatale représente le moment critique de l’exposition alimentaire, tandis que l’évaluation à l’âge adulte est nécessaire pour mesurer l’existence d’effets différés.

Pour reproduire chez la souris une malformation d'une veine du cerveau qui touche les enfants, 572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent l'ouverture de l'abdomen sous anesthésie générale pendant 45 minutes, avec points de suture, puis des injections sous anesthésie une fois par jour pendant deux jours. Les embryons reçoivent dans le cerveau une injection de cinq secondes, qui peut provoquer leur mort. L'effectif n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant l'avoir réduit "au minimum nécessaire" et renvoyant l'analyse à un test statistique qu'il qualifie d'"adéquat".

Objectifs

Notre projet a pour objectif de générer un modèle d’étude de la malformation anévrysmale de la veine de Galien chez la souris. Cette pathologie pédiatrique due à la connexion directe anormale entre une artère et une veine cérébrales et conduisant à un anévrysme est associée à des troubles neurologiques graves. Ce projet vise à étudier l’interaction entre le développement du cortex cérébral et du système vasculaire, en exprimant la forme humaine contrôle et des formes mutées de deux gènes impliqués dans cette pathologie chez un modèle de souris contrôle.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est de connaître l’implication du système neuronal, en particulier le rôle de certains neurones, dans l’apparition des troubles neurologiques de la malformation de la veine de Galien dans un modèle de souris contrôle. Ce projet permet également d’étendre nos connaissances sur le rôle de ces cellules d’intérêt sur le développement vasculaire cérébral et du cerveau en général.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Certaines subiront 1 fois 1 injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Elles subiront des injections sous anesthésie générale, 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection intracérébrale d’une durée de 5 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction de l’anesthésie gazeuse et la chirurgie des femelles gestantes entrainent un stress modéré. Les injections intra-cérébrales in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses phénotypiques.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. En effet, le développement cérébral et vasculaire ne peut être étudié qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau et des vaisseaux sanguins.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté. Lors des actes chirurgicaux, les souris seront anesthésiées et placées sur une plaque chauffante et régulièrement hydratées. Elles recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral et de la vascularisation du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.