Recherche appliquée

Gardées vivantes à l'issue de l'essai pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais, 6 vaches laitières Prim'Holstein vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles passent douze semaines à l'attache, la mobilité restreinte pour permettre la collecte totale de l'urine et des fèces cinq jours d'affilée par période, avec trois prélèvements de sang à la veine de la queue. Le porteur écrit pourtant que les régimes testés ne sont pas de nature à entraîner une douleur ou une souffrance. L'objet est zootechnique, mesurer la digestibilité de mélanges d'ensilage de luzerne et de maïs, et il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier ces flux de matière et d'azote.

Objectifs

L’élevage laitier se trouve de plus en plus confronté à la problématique du changement climatique, sous contraintes environnementales, avec le souci de réduire l’utilisation d’intrants et d’accroître l’efficience d’utilisation des ressources. Dans ce contexte en mutation, il est reconnu que la luzerne a une place de choix, comme fixatrice d’azote atmosphérique, et pour sa capacité à apporter des protéines produites de façon durable dans l’alimentation des ruminants. Une meilleure utilisation de la luzerne sous forme d’ensilage pourrait être une réponse adaptée au contexte changeant actuel, si les conditions de son utilisation sont mieux définies, notamment en termes de valorisation par l’animal. En effet, les conséquences d’associer l’ensilage de luzerne et celui de maïs sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, la valorisation des fourrages et l’efficience d’utilisation de l’azote doivent être approfondies. Cet essai aura pour but d’évaluer la valorisation énergétique (digestibilité) et protéique (déjections) à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des mélanges d’ensilage de luzerne et de maïs selon des proportions variables. Trois traitements expérimentaux seront comparés : 2 traitements diffèrent en termes de proportions des fourrages étudiées : 25%, ou 50% d’ensilage de luzerne pour respectivement 75% ou 50% d’ensilage de maïs et un troisième traitement avec 25% d’ensilage de luzerne et 75% d’ensilage de maïs, avec 200 g d’urée pour apporter plus d’azote dégradable pour les bactéries dans le rumen.

Bénéfices attendus

L’influence des régimes sur l’ingestion et la digestibilité des rations sera évaluée afin d’estimer l’efficience alimentaire, la valorisation de l’énergie et de l’azote ingérées, et les pertes d’azote vers l’environnement. Cela nous aidera à mieux valoriser ces fourrages pour nourrir les vaches laitières de façon plus durable en augmentant la diversité fourragère et l’autonomie protéique des élevages laitiers, et en réduisant les intrants de type tourteau de soja.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 12 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 3 périodes de 3 semaines chacune). Les vaches seront nourries à volonté et traites 2 fois par jour. Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, un prélèvement sanguin sera réalisé à la veine caudale, à raison de 1 par période et par vache (soit 3 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu.

Impact sur les animaux

Le dispositif de collecte de l’urine et des fèces nécessite de restreindre la mobilité des animaux, ce qui contraint de les garder à l’attache le temps de l’expérimentation. Les vaches seront attachées par leur licol avec une longueur de chaîne suffisante pour qu’elles puissent tourner la tête librement en position debout ou couchée, comme cela est pratiqué dans certains élevages. Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, un prélèvement sanguin sera réalisé à la veine caudale, à raison de 1 par période et par vache (soit 3 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang).

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie, seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci soit possible.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux de matières, d’énergie et d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes in vivo de recyclage/mobilisation/interactions digestives notamment au sein du rumen.

Réduction

Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 6 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, ne sont pas de nature à entraîner une douleur ou une souffrance.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, spécifique aux vaches laitières, nécessite de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue en France et dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches seront en milieu de lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

Pour comparer trois crèmes brevetées à un placebo et à une crème de pharmacie, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une plaie leur est ouverte sur le dos sous anesthésie et maintenue ouverte par un anneau de silicone posé autour, pour empêcher la peau de se contracter. Pendant trois semaines, chacune vit seule en cage, anesthésiée trois fois par semaine le temps d'être photographiée et traitée, jusqu'à cicatrisation complète. Un point limite atteint fait mettre l'animal à mort avant la fin de l'étude, sans que le porteur précise lequel.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris de nouveaux dispositifs médicaux sous forme de crèmes qui seront appliqués directement sur les plaies cutanées. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 3 formulations de crème à évaluer. Ce projet constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez la souris de ces formulations sous forme de crème, en comparaison avec un placebo et une crème de référence disponible en pharmacie. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations de crème ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre leur développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme de crème, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 50 souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos et la pose d’un anneau en silicone pour éviter la contraction de la plaie cutanée, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 15 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis réitéré après si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des souris en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée et la pose d’un anneau en silicone, effectuées sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des souris est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles l’anneau en silicone, le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci. Cet hébergement en cage individuelle des souris, pendant une durée de 3 semaines maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiées et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble de tissu et d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez la souris ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. En cas d'atteinte d'un point limite, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront hébergées dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des petites briques de bois, des carrés de papier absorbant et une balançoire seront placés dans chaque cage de souris comme dispositifs d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les souris d’un même portoir.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille ne nécessitant pas l’utilisation d’un gros volume de formulation très coûteuse à produire, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez la souris saine puis diabétique. Les animaux seront de jeunes souris mâles et femelles âgées de 6 semaines et d’un poids de 18-20 g à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines et d’un poids de 20-22 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de souris utilisées lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Les rats qui présentent une cachexie, des vocalises ou des convulsions sont mis à mort avant la fin de l'étude. 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est ouverte chirurgicalement sur leur dos sous anesthésie, puis pansée, photographiée et traitée trois fois par semaine jusqu'à cicatrisation, chaque animal restant seul en cage trois à quatre semaines pour qu'il n'arrache pas le pansement. Le porteur teste sur ces plaies quatre formulations liquides brevetées, dispositifs médicaux qu'il destine à un développement préclinique puis clinique.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez le rat de nouveaux dispositifs médicaux sous forme liquide qui seront appliqués directement sur les plaies cutanées. Des études effectuées sur modèles cellulaires et modèles de peau reconstruite ont permis de démontrer des activités pro-cicatrisante, antimicrobienne et anti-inflammatoire des principes actifs sélectionnés qui composeront les 4 formulations liquides à évaluer. Ce projet exploratoire constituera la toute première évaluation sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ces formulations liquides, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. A l’issue de l’étude, des analyses biologiques seront effectuées sur le sang, la peau cicatrisée et des organes vitaux. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner la ou les formulations liquides ayant la meilleure efficacité pour en poursuivre leur développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

La cicatrisation des plaies cutanées est un phénomène naturel de reconstruction de la barrière cutanée mais si les plaies sont mal soignées, cela peut aboutir à des complications. La cicatrisation cutanée fait intervenir différentes phases qui entrainent la disparition de la lésion et le remplacement des cellules atteintes par des cellules saines. Les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les plaies chirurgicales, les ulcères du pied chez le diabétique, les ulcères veineux… représentent un fardeau pour les patients, les professionnels de la santé et les systèmes de soins de santé, affectant plus de 40 millions de patients et induisant des coûts d’environ 50 milliards d’euros annuellement, et avec un taux de mortalité plus élevé que dans la population générale, pouvant atteindre jusqu’à 20% en fonction de la pathologie considérée. Il est donc très important de tester de nouvelles substances, de nouveaux pansements ou de développer de nouveaux dispositifs médicaux sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de ces plaies, surtout les plaies chroniques. Nous allons donc évaluer l’efficacité de nouveaux dispositifs médicaux expérimentaux brevetés se présentant sous forme liquide, tout d’abord sur un modèle de plaie simple, dans la perspective de réalisation par la suite d’études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques et infectées ou non chez le rat sain et diabétique. Ces nouveaux dispositifs médicaux pourraient ainsi à terme, être utilisés chez l’Homme, pour le traitement de plaies cutanées chroniques qui ne cicatrisent pas ou très difficilement.

Procédures

Les 50 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire, durée suffisante selon notre expérience sur ce modèle de plaie cutanée. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète, sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux, en 2 minutes environ.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux le pansement de couverture et les sparadraps protégeant les plaies cutanées et permettant le maintien des traitements au contact de celles-ci. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 4 semaines maximum, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 50 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids très importante est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des dispositifs d’enrichissement seront placés dans chaque cage de rat pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité sur des modèles de plaies chroniques chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Entassés une heure par jour pendant dix jours dans un bassin dont on abaisse le volume d'eau, 440 tilapias perdent du poids, refusent de s'alimenter et finissent par perdre une partie de leurs écailles au niveau des nageoires. Ils sont sortis de l'eau dix fois en trois mois pour être pesés et prélevés, subissent une prise de sang, puis sont tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le stress leur est infligé volontairement, pour mesurer si des taux de vitamines supérieurs aux recommandations aident les poissons d'élevage à mieux le supporter, au bénéfice des producteurs. Le porteur écrit que les prélèvements post mortem serviront à optimiser les rations alimentaires "pour leur bien-être", quand le protocole consiste à entasser et affamer les animaux avant de les tuer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer des taux d’incorporation optimum de vitamines dans les rations alimentaires des poissons face à un stress. L’amélioration des conditions d’élevage participe au développement d’une aquaculture plus raisonnée. La nutrition vitaminique joue un rôle clé dans l'optimisation des performances de production et la résistance au stress. Cependant, les conditions d'élevage actuelles ont révélé que les niveaux de vitamines recommandés ne permettent plus d’optimiser la croissance et la résistance au stress et ainsi de promouvoir la santé des poissons d’eau chaude. En effet, la diminution de l’utilisation de la farine de poisson, au profit d’ingrédients d’origine végétale de plus en plus présents dans les rations alimentaires, ainsi que la pression exercée pour limiter l’usage des antibiotiques, rendent nécessaire une réévaluation régulière des apports en vitamines. Ces derniers doivent être adaptés aux différents stades de développement des poissons ainsi qu’aux divers facteurs de stress auxquels ils sont exposés. Malgré l’importance des fonctions des vitamines, peu d’études ont été réalisées pour déterminer les besoins vitaminiques des poissons d’eau chaude. De plus, ces études, réalisées dans des conditions de laboratoire contrôlées et optimales, se basaient uniquement sur la modification d’une seule vitamine dans la ration alimentaire, négligeant de ce fait les interactions de fonctions entre les vitamines et les autres nutriments. Ainsi, les recommandations précédemment établies pour les niveaux d'inclusion de vitamines alimentaires étaient probablement biaisées et sous-optimales pour des applications pratiques avec des formulations alimentaires modernes. Plusieurs études menées sur la truite et la crevette, dont une réalisée sur la truite arc-en-ciel dans le cadre d’un projet antérieur, ont mis en évidence les effets bénéfiques de l’incorporation de niveaux de vitamines supérieurs aux recommandations nutritionnelles. Ces apports renforcés ont notamment amélioré la croissance et la santé des poissons, en particulier lors d’épisodes de stress. Le concept de vitamine optimale s’avère une stratégie nutritionnelle bénéfique afin d’optimiser la physiologie du poisson et les fonctions du système immunitaire en réponse à des conditions de stress. L’objectif de ce projet est de montrer les effets bénéfiques de taux élevés de vitamines chez les poissons d’eau chaude en utilisant le tilapia comme modèle.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront à court terme de mieux comprendre les effets de taux élevés de prémélange de vitamines sur la capacité des poissons d’eau chaude à faire face à des conditions de stress. La mise à disposition des résultats et leur interprétation permettra aux producteurs de poissons d’améliorer leurs conditions d’élevage et de participer à une pisciculture plus raisonnée. Les résultats de ce projet permettront ensuite de comprendre si la supplémentation du précurseur de la forme active de la vitamine D, seul ou en combinaison avec des taux élevés de vitamines, est bénéfique aux poissons d’eau chaude.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 17 jours, dont 10 jours de stress d'entassement et 7 jours de récupération. Au cours du stress, le volume de l'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours Sortie hors de l’eau des poissons pour les pesées et les prélèvements (10 fois en trois mois ; moins de 30 secondes). Prélèvement de sang réalisé une fois par animal avec un temps de prélèvement qui ne dépassera pas une minute.

Impact sur les animaux

Durant la période de stress : Perte de poids, diminution de l'indice corporelle, refus de s’alimenter, dégradation de l’état corporel (pertes partielles des écailles au niveau de la nageoire pectorale et caudale en fin de période de stress). Douleur transitoire à l'endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.

Devenir

Les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet de concentrations élevées en vitamines sur la résistance des poissons au stress d'élevage et d'optimiser de ce fait les rations alimentaires pour leur bien-être.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, l"apport en vitaminique sera évaluée au niveau des organes et dans la circulation sanguine. Or, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico intégrés capables de mettre en évidence ce type d’effet sur la stimulation du système immunitaire pour faire face aux stress d’élevage subis par les poissons. Enfin les paramètres zootechniques sont également d’importance pour cette évaluation car étroitement liés à la physiologie du poisson et nécessitent des animaux vivants.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur les paramètres du stress (réponse immune, expression de gènes…) chez la truite arc en ciel ayant subis un stress d'élevage. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Avant toute manipulation, les tilapias seront anesthésiés. Le stress dû à la capture, à la sortie des bassins et aux les prises de sang seront réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans la procédure qui définit le volume limite de sang et les périodes de récupération nécessaires. Pour protéger le bien-être des animaux, ils seront suivis au moyen de grilles d'évaluation du bien-être animal, et des points limites adaptés seront appliqués immédiatement si un animal semble éprouver des effets indésirables imprévus. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte à ce que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les concentrations de vitamines évaluées chez le tilapia sont destinées à être incorporées dans les aliments comme additif alimentaire pour les poissons d’eau chaude. Le tilapia est le deuxième plus important groupe de poissons élevé, il est peu exigeant et résistant aux conditions d'élevage. Au début de l’étude les tilapias pèseront 30 grammes. Ils seront élevés pendant 12 semaines, pour pouvoir effectuer les échantillonnages d’organes et les prélèvements de sang demandés par la procédure.

384 souris porteuses d'une mutation qui détruit la cohésion des cellules du cœur vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La thérapie génique leur est injectée entre le deuxième et le cinquième jour de vie, sur souriceau vigile, puis chaque animal passe quatre à six examens cardiaques, électrocardiogramme sans anesthésie ou échographie sous anesthésie légère. Le porteur indique qu'une mort subite peut survenir à partir de huit mois, comme chez les personnes atteintes, et que les souris reproductrices seront tuées à cet âge. Il décrit par ailleurs les tissus cardiaques humains qu'il fabrique en trois dimensions à partir de cellules souches comme très prometteurs, avant de conclure qu'un modèle animal "reste nécessaire".

Objectifs

La cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit est une maladie génétique du cœur qui touche environ 1 personne sur 5000, soit plusieurs milliers de cas en France. Elle provoque une perte de cohésion entre les cellules du cœur, ce qui entraîne des troubles du rythme cardiaque et peut provoquer une mort subite chez de jeunes adultes. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour cette maladie. Les recherches se concentrent sur le muscle du cœur, pour mieux comprendre sa structure et son fonctionnement. Pour étudier la maladie de façon réaliste, il est nécessaire d’utiliser une lignée de souris qui reproduit fidèlement la maladie humaine. L’objectif est de tester chez ces souris une thérapie génique capable de prévenir l’apparition de la maladie ou, au minimum, d’en ralentir le développement.

Bénéfices attendus

Ce projet utilise un modèle de souris déjà existant, qui reproduit très fidèlement la maladie humaine appelée cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. Cette maladie génétique empêche les cellules du cœur de bien rester attachées entre elles, ce qui provoque des troubles du rythme cardiaque et peut conduire à une mort subite chez de jeunes adultes. Les résultats de ces recherches permettront de valider une stratégie de thérapie génique et pourront aussi aider à mieux comprendre d’autres formes de la maladie causées par d’autres gènes. À long terme, l’objectif est de mettre au point une thérapie génique capable de traiter tous les patients atteints de cette maladie, quelle que soit l’anomalie génétique en cause.

Procédures

Dans ce projet, la thérapie génique sera testée avec une seule injection, effectuée sur le souriceau vigile. L’injection ne dure que quelques secondes. Pour suivre l’évolution, chaque souris sera examinée minimum 4 fois au cours de sa vie (et 6 foix au maximum) grâce à des méthodes simples et indolores : un électrocardiogramme sur animal vigil pour contrôler le rythme du cœur, ou une échographie cardiaque sous légère anesthésie pour observer son fonctionnement. Ces examens sont rapides (environ 15 minutes au total) et réalisés de façon regroupée pour limiter le stress et les manipulations des animaux.

Impact sur les animaux

L’injection prévue peut provoquer une douleur légère et passagère chez le nouveau-né. Comme pour toute injection, il existe aussi un faible risque d’infection à l’endroit où elle est réalisée. La manipulation des animaux peut être une source de stress. Avant l’âge de 8 mois, certains animaux peuvent présenter une augmentation des troubles du rythme cardiaque, ce qui peut leur causer un inconfort. À partir de 8 mois, une mort subite peut survenir, comme cela est décrit dans cette maladie. Les examens cardiaques (électrocardiogramme et échographie)sont non invasifs et largement utilisés, sans effets secondaires connus. Pour l’échographie, une anesthésie légère est nécessaire : elle peut entraîner un refroidissement de l’animal, un ralentissement de la respiration et du rythme cardiaque, mais ces effets sont contrôlés et réversibles.

Devenir

Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés en fin de procédure. Les animaux surnuméraires dans un groupe serviront pour compléter d'autres groupes. En fin d'inclusion, des euthanasies seront effectuées par une méthode règlementaire.

Remplacement

Depuis plusieurs années, nous essayons de développer des modèles de cœur humain en laboratoire, grâce à des cellules souches et à des techniques de bioingénierie en 3 dimensions. Ces approches permettent de créer des tissus cardiaques et de réduire l’utilisation d’animaux pour les recherches. Cependant, il n’est pas encore possible de reproduire en laboratoire toute la complexité d’un organisme vivant, avec l’ensemble des mécanismes qui régulent le cœur et expliquent l’apparition de maladies comme la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit. De plus, l’effet réel d’une thérapie génique ne peut pas encore être évalué uniquement avec ces méthodes de substitution, même si elles sont très prometteuses. C’est pourquoi un modèle animal reste nécessaire pour répondre à certaines questions essentielles, notamment pour vérifier et valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Pour ce projet, nous avons utilisé des simulations statistiques afin de déterminer le nombre minimal de souris nécessaires. L’objectif est d’obtenir des résultats fiables tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Les calculs tiennent compte des différents groupes de comparaison (selon les gènes et les traitements) et de la mortalité attendue dans certains cas. De cette façon, nous nous assurons d’avoir 5 à 10 animaux par groupe en fin d’étude, ce qui est le strict minimum pour pouvoir tirer des conclusions solides. Les deux sexes sont utilisés et répartis de façon équilibrée. Les naissances sont ajustées au fur et à mesure pour éviter un excès d’animaux, et les souris surnuméraires sont intégrées uniquement si elles permettent de compléter un groupe manquant. Au total, le plan de recherche prévoit environ 384 souris sur 5 ans, auxquelles s’ajoutent une petite marge liée à la reproduction nécessaire pour maintenir la lignée. Ce chiffre correspond au nombre le plus réduit possible, tout en permettant de répondre aux questions scientifiques posées.

Raffinement

Les souris sont élevées dans de bonnes conditions de confort, en groupe avec leurs congénères, dans des locaux où la température, l’humidité et l’alternance jour/nuit sont soigneusement contrôlées. Elles ont en permanence accès à de la nourriture et de l’eau grâce à un système automatique. Leur environnement est maintenu parfaitement sain grâce à la stérilisation du matériel et à l’utilisation d’eau purifiée. Des objets d’enrichissement (papier, coton, bois, rouleaux en carton ou abris) sont également ajoutés pour stimuler leur comportement naturel. La santé des animaux est vérifiée chaque jour. Pour limiter le stress, les manipulations sont réduites au minimum, faites rapidement et avec douceur. Lors des injections, tout est prévu pour réduire au maximum l’inconfort : les souriceaux sont sortis de la cage pour une durée très courte, maintenus au chaud, manipulés avec précaution, puis replacés immédiatement dans leur nid, avec vérification qu’ils soient bien repris par leur mère. Pendant les examens cardiaques non-invasifs, des mesures spécifiques assurent leur bien-être : l’échographie est réalisée sous une anesthésie très légère pour stabiliser cœur et respiration, et un gel protecteur est appliqué sur les yeux si l’examen dure plus de dix minutes ; l’électrocardiogramme (ECG) est effectué sans anesthésie, afin d’éviter des manipulations supplémentaires. Les animaux sont suivis attentivement tout au long de leur vie. Une surveillance renforcée est mise en place dès l’âge d’un mois pour les animaux les plus fragiles. Si un problème de mobilité survient, de la nourriture hydratée est placée au sol pour qu’ils puissent s’alimenter facilement.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé et le mieux documenté pour étudier les maladies du cœur. La lignée sur laquelle nous travaillerons reproduit fidèlement la cardiomyopathie arythmogène du ventricule droit chez l’homme, une maladie grave pour laquelle il n’existe pas encore de traitement curatif. C’est le seul modèle connu qui permette de tester une thérapie génique et d’étudier les modifications au niveau des cellules, des molécules et du fonctionnement du cœur. L’objectif est de stabiliser les structures des cellules cardiaques affectées par la maladie. Le suivi du cœur se fera grâce à des examens non invasifs qui permettent de mesurer le rythme et la contraction cardiaque, et de vérifier l’efficacité de la thérapie. Les résultats obtenus chez la souris pourront ensuite servir à envisager un développement de cette thérapie chez l’homme. Comme la maladie se déclare tôt chez l’homme, les injections de thérapie génique seront réalisées sur des souris très jeunes (2 à 5 jours), et les animaux seront suivis jusqu’à l’âge de 6 mois. Les souris utilisées pour la reproduction seront employées jusqu’à 8 mois avant d’être euthanasiées, conformément aux règles de l’expérimentation animale.

Une posture inhabituelle, un poil hérissé, un dos voûté, un retrait des congénères : ces signes déclenchent la mise à mort immédiate de l'animal. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus impliqués dans l'homéostasie calcique. Une maladie rénale chronique leur est induite par un changement d'alimentation qui provoque une perte de poids culminant au dixième jour, avec vingt et un gavages quotidiens et quatre prises de sang sous contention. Ce que le projet doit établir tient en une phrase du porteur, savoir si une molécule "dont l'utilisation a récemment été protégée par un brevet" prévient ou guérit la maladie.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques (MRC) touchent environ 10% de la population mondiale et représentent une cause majeure de morbidité et de mortalité. Actuellement, les traitements disponibles ralentissent la progression mais ne permettent pas la régénération des tissus rénaux ni l’arrêt complet de la maladie. La compréhension fine des mécanismes de fibrose, d’inflammation et de perte néphronique est indispensable pour développer des thérapies innovantes. Le présent projet vise à déterminer si une molécule innovante dont l'utilisation a récemment été protégée par un brevet, prévient, ou traite les MRC.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si le traitement permettra de prevenir ou de guérir la MRC.

Procédures

Quatre prises de sang suivie d'une compensation hydrique sur animal vigile sous contention à une distance d'au moins 15 jours (30 secondes par prelevement). Vingt et une administration journalière par gavage (30 secondes par administration). Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé.

Impact sur les animaux

Comme la MRC, ce modèle est accompagné d'une perte de poids qui atteint son pic à jour 10 après changement de nourriture (modérée). Si les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera mis à mort immédiatement (sévère). Aucun effet secondaire n'a été rapporté pour la molécule utilisée dans cette étude. Bien que ce risque soit quasiment nul, la répétition des gavages par une personne formée en utilisant des sondes adaptées à la taille de la souris pourrait conduire à une fausse route (modérée). Les prises de sang dont la contention pourrait produire un stress (léger).

Devenir

En cas de point limite atteint et à la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser les différents tissus impliqués dans l'homéostasie calcique.

Remplacement

La physiologie rénale murine présente une très forte analogie avec celle de l'Homme permettant une transposition pertinente des résultats. Les reins ont une structure complexe et des interactions cellulaires impossibles à reproduire intégralement in vitro. Les modèles animaux permettent d’étudier l’évolution de la maladie sur le long terme dans un organisme complet, de tester l’efficacité et la sécurité des molécules candidates avant le passage chez l’humain, et de comprendre les voies de signalisation impliquées.

Réduction

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses de variances utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques.

Raffinement

L'environnement sera enrichi pour l'ensemble des animaux. La surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis tout au long de l'expérience, par observation de leur comportement général, ainsi que par mesure de leurs poids tous les 2 jours ouvrés. Après les prises de sang, une compensation hydrique sera réalisée ainsi qu'une surveillance de la zone de prélevement. Pour eviter un stress supplémentaire, les souris seront hebergées en groupe de 2-5 et tous les animaux auront de la nourriture liquide gélifiée dans la cage à partir de l'instant où un animal est amaigri. Une grille de scoring de la douleur sera utilisée pour l’évaluation de la douleur, et la mise à mort ne sera effective que si suffisamment de critères sont réunis d’après la dite grille. Un volume equivalent de NaCl tiédi sera administré pour respecter la compensation hydrique et une surveillance du site de prélevement sera réalisée dans les 24 heures suivantes. Après les gavages, la capacité des souris à se déplacer et s'alimenter sera surveillée.

Choix des espèces

La physiologie rénale murine présente une très forte analogie avec celle de l'Homme permettant une transposition pertinente des résultats. La MRC se declarant à l'age adulte, nous utiliserons des souris males et femelles agées de 8-10 semaines.