Recherche appliquée

Rendus parkinsoniens par l'injection d'une neurotoxine directement dans le cerveau, 2 025 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après cette première chirurgie de trente minutes, certains reçoivent sous la peau une pompe à diffusion continue, puis des injections quotidiennes d'une molécule proche de la dopamine pendant six semaines, jusqu'à deux fois par jour, destinées à provoquer les mouvements anormaux involontaires que développent les patients. Ces mouvements sont ensuite observés une minute toutes les vingt minutes pendant trois heures, une fois par semaine. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention pour classer les rats selon la sévérité de leur atteinte, sans préciser lesquels, et jusqu'à huit prélèvements sanguins en 72 heures. Tous les rats sont tués à la fin, pour récupérer leur cerveau, après un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’étude de l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire les effets secondaires induit par un des médicaments le plus utilisé dans la maladie de Parkinson (MP). La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones produisant la dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones) dans le cerveau, impliqués dans la coordination des mouvements. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme l’efficacité de cette molécule s’atténue et des effets secondaires très invalidants, caractérisés notamment par des mouvements anormaux involontaires appelés « dyskinésies », apparaissent. Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses visent à atténuer le caractère invalidant de ces dyskinésies. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité de ces nouvelles thérapies dans un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat. Ce modèle repose sur une injection de toxine dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer la sévérité des troubles moteurs « parkinsonien » et classer les animaux selon la sévérité de leur atteinte. Des injections journalières d’une molécule semblable à la dopamine sont ensuite effectuées sur plusieurs semaines pour reproduire les mouvements anormaux involontaires observés chez le patient en réponse à ce type de traitement. Ainsi, l’efficacité de chaque nouvelle molécule thérapeutique sera testée sur ces mouvements anormaux involontaires et pourra être comparée aux traitements de référence, c’est-à-dire à ceux déjà utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

Le modèle de toxine utilisé dans ce projet apparaît comme un modèle élaboré, mimant la mort des neurones produisant la dopamine observée dans la maladie de Parkinson et permettant l’induction des mouvements anormaux involontaires retrouvés chez les patients à la suite d’un traitement chronique avec une molécule semblable à la dopamine. Il permet de tester l’efficacité des nouvelles molécules thérapeutiques sur les mouvements anormaux involontaires. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le cerveau (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement effectués sous contention ou non (selon le test) par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à 2 fois au cours du protocole afin d'évaluer la sévérité de leurs troubles fonctionnels. Les animaux subiront des injections journalières (sur 6 semaines maximum, 2 fois par jours maximum, 1min par injection) sous la peau d'une molécule semblable à la dopamine pour induire des mouvements anormaux involontaires. Ces derniers pourront être analysés et quantifiés 1 fois par semaine sur 6 semaines. Chaque session d'observation inclut 1min d'observation toutes les 20min durant 3h. Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Lors de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés sur 72h, ou encore 4 prélèvements maximum par semaine tous les 28 jours (1min/prélèvement). Des administrations quotidiennes de molécules thérapeutiques ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (8 semaines au maximum, 2 fois par jour au maximum). Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien (liquide entourant le cerveau) sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration de la nouvelle molécule thérapeutique testée. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau de la toxine nécessitant une chirurgie. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie et peut être source d'une infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil. -Lors des sessions de tests de comportements ou d’évaluation des mouvements anormaux involontaires, les animaux devront être régulièrement placés en isolements pour de courtes durées et/ou être maintenus sous contentions pouvant générer du stress. -L’induction des mouvements anormaux involontaires, présents jusqu’à 3h après l’injection de la molécule semblable à la dopamine, entraine une altération de l’activité motrice des pattes et de la face et peut limiter l'alimentation/hydratation. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant. -Les rats subiront un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie/analgésie générale pour effectuer une chirurgie et accéder à la zone ou se trouve ce liquide (sous les muscles de la nuque).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet de nouveaux composé sur les mouvements anormaux involontaires, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux mouvements anormaux involontaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique (n=15-20 pour assurer n=12 animaux inclus dans l’analyse finale, nécessaires pour observer une différence significative entre les groupes). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère, paramètre essentiel pour induire une réponse aux traitements permettant d'induire les mouvements anormaux involontaires. De plus, parmi les animaux sévèrement lésés, seulement 80% sont sensibles à ce traitement chronique et exprimeront ces mouvements anormaux involontaires. Cela nous assure donc d’avoir 12 animaux par groupe avec 5-8 animaux de sécurité par groupe.

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2-3 par cage selon leur poids. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Par ailleurs, les animaux seront habitués à la manipulation par l'Homme ainsi qu’aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Un tapis chauffant rétrocontrôlé est utilisé pendant toute la durée de l’anesthésie pour maintenir la température corporelle des animaux à 38°C. Les zones d’injections en sous-cutanée pour les traitements récurrents avec la molécule semblable à la dopamine seront alternées entre les flancs gauches et droits.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Le modèle de lésion induite par l'injection dans le cerveau d'une toxine s'est rapidement imposé comme un modèle préclinique de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de la lésion seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

960 souris vont être utilisées, toutes injectées de cellules cancéreuses puis tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des tumeurs poussent sur leurs flancs, avec un œdème possible au point d'injection qui peut gagner les pattes arrière et gêner la marche, et des métastases dont le porteur reconnaît ne pas savoir évaluer les effets sur les organes touchés. Elles reçoivent un traitement par la bouche cinq jours sur sept et une prise de sang à la queue chaque semaine sous anesthésie, pour tester une association de deux médicaments déjà approuvés contre les rechutes du cancer du poumon. L'effectif, lui, est calé sur "le nombre d'animaux communément accepté pour une publication".

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) présentent, chez environ 15% des patients, des altérations dites primaires de l'EGFR, un Récepteur du facteur de croissance EGF. Malheureusement, après traitement par thérapie ciblée, une récidive de la tumeur est observée avec apparition, dans plus de 50% des cas, d'une mutation secondaire de l'EGFR pour laquelle un inhibiteur de dernière génération a été développé, l'osimertinib. Finalement, de nouveaux mécanismes de résistance ont été constatés chez des patients traités plusieurs mois avec l'osimertinib, tels qu'une amplification d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, des mutations touchant des acteurs des voies de signalisation contrôlant la survie et la prolifération cellulaire, ainsi que l'apparition d'une mutation tertiaire de l'EGFR pour laquelle il n'y a pas encore de traitement spécifique utilisé en clinique. Par des méthodes de génie génétique, nous avons généré plusieurs modèles cellulaires de résistance du cancer bronchique humain en introduisant, dans une petite sous-population de cellules de CBNPC humaine, différentes mutations de l'EGFR décrites chez les patients. Sur ces modèles cellulaires, nous avons réalisé un criblage de molécules potentiellement capables d'inhiber l'émergence de clones résistants. Finalement, un inhibiteur déjà approuvés en clinique, le sorafenib, utilisé en combinaison avec l'osimertinib, s’est montré efficace in vitro pour limiter la croissance cellulaire des lignées arborant plusieurs mécanismes de résistance décrits chez les patients récidivant. Ces résultats ont aussi été obtenus in vivo sur l’inhibition de la pousse tumorale de ces lignées dans des souris immunodéprimées. Au vu de l'importance du contexte physiologique, de la toxicité des inhibiteurs utilisés en thérapie et du microenvironnement tumoral, nous avons créé un modèle syngénique murin de cancer du poumon qui n’existait pas. Nous avons généré 6 lignées cellulaires qui récapitulent les principaux mécanismes de résistances observés dans les CBNPC. Les études in vitro menées sur ces nouvelles lignées cellulaires ont révélé des caractéristiques de croissance et de résistance à la thérapie ciblée similaires à celles observées précédemment sur les lignées humaines. Ces nouveaux modèles murins vont nous permettre désormais d'étudier l'implication du système immunitaire dans la tumorigenèse et dans la réponse au traitement, avant d'envisager tout essai clinique.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront tout d’abord de déterminer la capacité de ces nouvelles lignées cellulaires à former des tumeurs chez l’animal ; il sera possible alors de comparer les résultats de croissance tumorales de ces lignées cellulaires murines à ceux déjà obtenus avec les lignées cellulaires humaines dans des souris immunodéficientes, et confirmer ainsi l'intérêt de ce nouveau modèle d’étude syngénique de cancer du poumon chez la souris. Dans la littérature, l’implication d’EGFR muté dans l’installation d’un microenvironnement tumoral immunosuppresseur reste controversé ; notre étude va nous permettre de mesurer et caractériser l’éventuelle infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs en fonction des mécanismes de résistance mais aussi des traitements. La possibilité de mesurer la bioluminescence des cellules cancéreuses à l'aide d'un imageur du petit animal va nous premettre de détecter et suivre le développement de foyers tumoraux secondaires qu'il aurait été difficile de mettre en évidence par des méthodes d'analyses macroscopiques traditionnelles. Ces métastases pourront être mieux caractérisées (culture cellulaire, analyses génétique et moléculaire) et identifier d'éventuels nouveaux mécanismes de résistance. L'intérêt de notre étude est de mieux comprendre les mécanismes responsables de la rechute tumorale de la tumeur primaire et des métastases en fonction du contexte immunitaire et des traitements.

Procédures

Les animaux seront injectés avec une aiguille adaptée de petite taille et de petit diamètre et sous anesthésie et analgésie. Des prélèvements sanguins au bout de la queue seront réalisés sur animaux anesthésiés chaque semaine. Les animaux recevront 5 jours par semaine un traitement par voie orale. Cet acte est rapide et non douloureux pour l'animal.

Impact sur les animaux

Peu d'effets indésirables sont attendus sur les animaux injectés en sous-cutané. Il pourrait être observé cependant dans de rares cas des démangeaisons ou un œdème au point d’injection qui s’il s’étend aux pattes arrière pourrait perturber la locomotion quelques jours, le temps qu’il se résorbe. La croissance des tumeurs sur les flancs de la souris, ne perturbe pas la vie de la souris, il n'y a normalement pas de modification du comportement individuel ou social. Une nuisance possible serait que la tumeur, dans sa croissance, puisse gêner les déplacements de l’animal ou altérer sa souplesse entrainant un défaut d'alimentation ou de sa toilette. Concernant les animaux développant des métastases, il est difficile d'évaluer leurs effets sur la fonction des organes touchés, mais un suivi très régulier permettra de détecter le moindre signe clinique défavorable et de procéder à l'arrêt immédiat de l'expérimentation.

Devenir

La totalité des animaux de l'étude sera injectée avec des cellules cancéreuses puis mise à mort pour études.

Remplacement

L’utilisation des animaux est indispensable pour confirmer in vivo l’efficacité de la combinaison d’inhibiteurs identifiée in vitro sur les lignées humaines. Dans le protocole présenté ici, la souris est utilisée comme modèle préclinique obligatoire pour évaluer l'implication du système immunitaire dans la croissance tumorale. Ceci n’est pas possible autrement que chez l’animal vivant, et nécessaire avant toute évaluation chez l’Homme.

Réduction

Les transplantations de nos modèles cellulaires seront réalisées sur l'animal uniquement après obtention de résultats in vitro significatifs permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux par groupe en fonction de l'importance de l'effet obtenu. L'objectif est de collecter un nombre suffisant de données pour respecter le nombre d'animaux communément accepté pour une publication, et appliquer des tests statistiques fiables et adaptés. Les traitements ne concerneront que les lignées cellulaires pour lesquelles une croissance tumorale significative aura été observée. A noter que s'il n'y a pas de différence statistique entre mâles et femelles, la taille des effectifs pourra être réduit à 6 au lieu de 10 animaux (3 mâles et 3 femelles).

Raffinement

Afin d'éviter toute souffrance ou stress, les animaux seront hébergés dans une zone exempte de germe pathogène, à 5 maximum par cage (530 cm2 au sol) dans un environnement enrichi (tube en polycarbonate rouge et Arbrocel Roll), et anesthésiés avant chaque intervention. Nous serons vigilants pour évaluer chaque jour l'apparition d'éventuels signes de souffrance (perte de poids, poils hérissés, prostration) et dans le cas de critères présents, une prise en charge analgésique appropriée sera mise en place ; et dans le cas d'une non amélioration des symptomes, l'animal serait mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'étude de la croissance tumorale car il permet de mimer les conditions de formation des tumeurs de manière assez proche de celles rencontrées chez l'Homme. La greffe récapitule les évènements se déroulant lors d'une tumorigenèse : croissance 3D, interaction avec le stroma et le système immunitaire, angiogenèse et métastase. Enfin la souris est le modèle d'étude le plus utilisé dans la communauté scientifique, cela permet des échanges à un niveau international. Les injections de cellules tumorales seront réalisées comme classiquement décrites dans la littérature sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines.

Les souris de ce projet développent seules une maladie neurologique, avec perte de poids, retard de croissance, faiblesse musculaire et troubles de l'équilibre ou de la marche. 180 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à un âge choisi ou dès qu'un point limite est atteint, pour que leurs organes soient examinés. Le porteur écrit pourtant que "les animaux ne vont pas subir d'intervention", la procédure consistant à les laisser tomber malades et à les observer. Leurs géniteurs, eux, retournent à l'accouplement pour produire d'autres animaux atteints.

Objectifs

Il existe plus de 1 000 maladies neurologiques d'origine génétique, dont plus de 500 affectent l’appareil neuromusculaire. La grande majorité d’entre elles ne disposent d’aucun traitement. Pour une fraction significative des cas (>30 %), l'origine moléculaire reste inconnue. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques apparaissant spontanément chez les souris de laboratoire élevées couramment pour d'autres projets. L’identification des défauts moléculaires chez la souris est partiellement facilitée par l’uniformité du fond génétique des souris de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’identification des nouveaux défauts moléculaires responsables de maladies neurologiques utilisables comme nouveaux modèles de maladie neurologique pour la recherche biomedicale. L’identification de nouveaux modèles de maladies neurogénétiques est une étape indispensable pour progresser dans la compréhension des mécanismes des maladies et pour favoriser le développement de nouveaux traitements.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention. Ils seront suivis régulièrement afin mettre en évidence l'apparition ou non de phénotypes dommageables puis ils seront mis à mort dès qu'ils atteindront l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem ou s'ils atteignent les points limites établis dans cette procédure. Leurs géniteurs seront remis en accouplement afin de générer d'autres animaux malades.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet pourront développer des problèmes neurologiques se manifestant avec une perte de poids, un retard de croissance, une faiblesse musculaire, des troubles locomoteurs ou de l'équilibre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure et prélevées à différents âges pour vérifier les changements histologiques et biochimiques associés à leur pathologie.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire des problèmes neurologiques.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser, en nous limitant à utiliser seulement la fratrie, ainsi que les géniteurs des animaux développant des nouveaux phénotypes neurologiques d’apparition spontanée qu’on avèrera être d’origine génétique. Les fratries composées d'aucun animal à phénotypes dommageable ne seront pas étudiées.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la SBEA (Structure chargée du Bien-Être Animal), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En cas d’apparition de symptômes, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Si l'état des animaux atteint les points limites fixés, ils seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies neurologiques humaines, car l'organisation de son système nerveux est très similaire à celles de l'homme. A priori, il est impossible de savoir si les nouvelles souches auront une diminution de l’espérance de vie. Il est donc impossible d'établir à quel âge les animaux vont développer un phénotype neurologique, quel phénotype neurologique, ni si cela sera sévère. Il sera nécessaire de poursuivre une étude d’observation clinique dans le temps pour déterminer ces éléments. Les souris seront utilisées à divers stades post-naissance, avant qu’elles ne développent les points limites définis.

Issues de pontes relevées en mer dans des casiers ou pondues par des génitrices captives, 555 seiches vont être exposées à des résidus de médicaments, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'exposition dure trois semaines sur la fin du développement embryonnaire, ou tout le premier mois de vie. Les jeunes seiches passent ensuite un quart d'heure en arène libre, un quart d'heure sur chacun de trois fonds pour mesurer leur camouflage et une demi-heure face à un leurre imitant un prédateur. Le porteur qualifie ce protocole de conforme aux 3R parce qu'il cherche des effets en deçà de la mort et travaille sur un invertébré, alors que les 555 seiches sont tuées à l'issue des tests pour qu'on dose les polluants dans leur cerveau.

Objectifs

La présence de polluants dans les écosystèmes aquatiques est une préoccupation grandissante du fait des effets néfastes qu'ils peuvent avoir sur la faune sauvage. Il est ainsi fondamental d’évaluer les risques environnementaux qui y sont associés. Parmi ces polluants, les résidus de médicaments à usage humain et vétérinaire attirent de plus en plus l'attention du fait de leur fréquente détection dans l'environnement, sans qu'il n'y ait de normes réglementant les concentrations maximales acceptables n'engendrant pas d'impact négatif sur les organismes, principalement dû au manque de connaissance de leurs effets potentiels. Un effort de recherche est donc requis pour évaluer correctement les dangers environnementaux liés à leur présence dans les milieux naturels, ceux-ci s'ajoutant à la pression qu'exercent déjà les changements climatiques sur les organismes. Ces substances peuvent de plus engendrer des effets sublétaux, en dessous des seuils de toxicité classiques, incluant par exemple une perturbation du système nerveux, pouvant entrainer une modification de comportements essentiels à la survie et nécessitant le développement de tests innovants pour les détecter. Ainsi, au moyen d'approches complémentaires in vitro, ex vivo et in vivo, des effets des 10 résidus médicamenteux les plus fréquemment quantifiés dans les eaux de surface seront recherchés chez la seiche, espèce modèle d’intérêt économique et scientifique. Ce projet vise également à répondre au besoin de pertinence écologique en prenant en compte l'évaluation nécessaire des effets des polluants en mélange et associés au changement climatique. Il s’agit plus précisément (1) de déterminer in vitro et ex vivo des critères de neurotoxicité et de neuroperturbation, permettant de tester les 10 substances et offrant une base pour permettre la sélection des 2 substances les plus préoccupantes, de (2) tester ces 2 substances in vivo pour évaluation de leurs effets sur les comportements essentiels à la survie (locomotion, camouflage, réponses au stress), de (3) fournir des données de bioaccumulation dans les tissus biologiques et (4) d'évaluer la neurotoxicité (in vitro) et la neuroperturbation (ex vivo et in vivo) dans un contexte de contamination environnemental et de changement climatique.

Bénéfices attendus

Les substances pharmaceutiques sont de plus en plus souvent détectées dans les eaux côtières, dernier réceptacle de la pollution chimique continentale, mais l'évaluation de leur impact reste rare et se concentre sur des espèces d'eau douce. Les polluants sont de plus fréquemment testés individuellement alors qu’ils sont retrouvés ensemble dans l’environnement, et leur présence est concomitante avec les changements climatiques non pris en compte dans les tests réglementaires (augmentation de la température et acidification de l’eau), s’éloignant ainsi de la réalité écologique. L'apport de données écotoxicologiques sur les résidus médicamenteux effectivement présents dans les eaux de surface, obtenues dans ce projet sur une espèce marine, et prenant en compte l’effet du changement climatique et l’effet cocktail (mélange), permettra ainsi une évaluation pertinente des dangers environnementaux et sanitaires associés. Ce projet permettra également la valorisation des données de quantification obtenues dans le cadre du suivi des eaux de surface, apportant une image de la contamination par les médicaments, mais ne permettant pas leur intégration dans l'évaluation de la qualité des eaux par manque de connaissance de leurs effets. La mise à disposition des biotests développés dans ce projet permettra d’évaluer le potentiel neurotoxique de substances d’intérêt émergent pour lesquelles il n’existe donc pas encore de Normes de Qualité Environnementales réglementaires (NQE), pouvant ainsi aider à leur préconisation dans l’évaluation du bon état chimique des masses d’eau de surface de la Directive Cadre sur l'Eau (DCE). De plus, à ce jour, le biotest le plus largement appliqué en environnement aquatique est un test de toxicité aigüe mené sur 42 à 60 poissons exposés à la substance d’essai avec la mort comme critère d’effet toxicologique (ligne directrice 203 de l’OCDE). Ce projet priorise quant à lui la recherche de critères toxicologiques sublétaux chez un invertébré marin et le développement d’approches ex vivo/in vitro, une stratégie conforme au principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les bénéfices attendus de ce projet sont donc la mise à disposition de tests écotoxicologiques sublétaux innovants, s'inscrivant dans la stratégie des 3R, permettant l'évaluation de l'impact écotoxicologique de résidus médicamenteux fréquemment retrouvés dans les masses d'eau locales, pouvant mener à une réévaluation de leur bon état chimique.

Procédures

Les interventions de ce projet sont des expositions à des résidus de médicaments et leurs conséquences. Ces expositions se feront d'une part durant le dernier tiers du développement embryonnaire des seiches (1 exposition chronique de 3 semaines) qui seront soumises à divers tests non invasifs pendant le développement et à son terme, puis des prélèvements post-mortem seront réalisés. D'autres animaux seront exposés de manière chronique dès la naissance pendant le premier mois de vie de l'animal, au cours duquel des tests comportementaux non-invasifs seront appliqués 3 fois maximum. Ces tests consistent en la mesure des déplacments de l'animal dans une arène libre (1 test de 15 min), en la mesure de l'efficacité du camouflage par changement de couleurs sur 3 types de fonds différents (15 min par fond) et en la mesure des réponses comportementales et physiologiques face à un stimulus artificiel mimant un prédateur (30 min).

Impact sur les animaux

Les expositions chroniques aux résidus médicamenteux sont susceptibles d’entraîner des altérations légères à modérées des capacités de locomotion (stabilité de l'animal dans la colonne d'eau), du camouflage, du comportement prédateur et de la réponse aux stimuli sensoriels. En cas d’exposition aiguë, les effets attendus sont des altérations modérées à sévères du métabolisme. Aucune nuisance n’est attendue dans le cadre des manipulations et des tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans les procédures seront mis à mort à la fin des tests, sans délai. Cela permettra de prélever leurs organes (notamment le cerveau) afin de quantifier le taux de contamination des animaux par les différents polluants ou d'analyser l'impact sur le développement du système nerveux et son fonctionnement.

Remplacement

Les substances pharmaceutiques, de par leurs modes d’action divers et diffus, ont le potentiel d’impacter les grandes fonctions physiologiques d’un organisme dans son ensemble. Il est donc fondamental de travailler sur des animaux vivants. Toutefois, dans le cadre du développement de biotests ciblant des critères toxicologiques précis, les approches ex vivo/in vitro peuvent être pertinentes et doivent être encouragées. Dans le cas présent, l’analyse de l’activité des chromatophores sur échantillons de peau est une approche qui permettra de tester plusieurs traitements (substances ou concentrations) sur des échantillons issus d’un même individu, de même que l'utilisation de cellules nerveuses maintenues en culture primaire. S'agissant de prélèvements post-mortem, les individus ne seront ainsi pas exposés à des substances néfastes pouvant engendrer une souffrance.

Réduction

Le choix des substances à tester représente un compromis entre la possibilité de mener une évaluation comparative et un criblage relativement large des effets toxicologiques, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. (1) Les 10 substances seront d'abord évaluées in vitro et ex vivo afin de n'exposer les animaux qu'à 2 substances, limitant le nombre de lots et donc d’animaux. (2) Trois concentrations seulement de chaque substance seront utilisées lors des expositions par balnéation afin de limiter le nombre de lots et donc d’animaux. . Ces trois concentrations ont été choisies à la suite d’une campagne d’échantillonnage où les concentrations moyennes en résidus ont été calculés, cette moyenne constitue donc la concentration environnementale. Quant aux deux autres concentrations elles représentent des scénarios pessimistes, parfois vérifiés dans le cadre de contaminations environnementales exceptionnelles observées. (3) Chaque animal sera sollicité pour un maximum d'analsyes compatibles entre elles, c'est à dire ne présentant pas d'interférence méthodologique ou biologique. Garantissant ainsi une optimisation des données obtenues par animal tout en garantissant la validité scientifique des résultats. (4) Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif ou de modèles mixtes permettant l’utilisation de mêmes animaux pour des tests successifs. Un programme d'analyse de la puissance statistique des tests utilisés a été utilisé pour ajuster les effectifs.

Raffinement

Ce type de projet incluant une exposition par balnéation à des molécules limite les conditions de stabulation. Toutefois, plusieurs dispositions seront prises : (1) le maximum sera fait pour s’approcher le plus possible des conditions naturelles, notamment via l’utilisation de proies naturelles et locales (crevettes ou crabes) de taille adaptée aux animaux, via la régulation de la température de l’eau et de l’éclairage proche des variations naturelles ainsi qu'en limitant au minimum la manipulation des animaux . (2) Les tests comportementaux sont non invasifs (basées sur la prise d’images et de vidéos) (3) Les animaux seront obtenus par prélèvement de pontes de génitrices en captivité ou par prélèvement de pontes par des techniques non invasives (relevé de casiers ou d'orins). L’impact de ce prélèvement sur les populations de seiches est minime puisqu’en milieu naturel, une faible fraction des jeunes arrive à maturité. (4) Les animaux seront suivis quotidiennement afin de prévenir un état de douleur, de souffrance ou d’angoisse avec comme points limites : une réduction ou un arrêt de la prise alimentaire, une altération du contrôle de la flottaison, l’apparition de lésions cutanées liées ou non à des réactions de stress (mouvements désordonnés de rétropropulsion, jet d’encre excessif). Le cas échant, l'animal sera placé en quarantaine et, s'il n'y a pas d'amélioration (guérison des lésions cutanées et diminution du stress) ou de rétablissement complet après 48h (prise alimentaire et flottaison), mis à mort.

Choix des espèces

Les mollusques sont reconnus comme des espèces modèles de choix en écotoxicologie car ils sont particulièrement sensibles aux polluants organiques. Dans le cadre de la recherche de critères d’effets toxicologiques sublétaux, les céphalopodes offrent l’avantage de manifester des signes facilement analysables de leur état physiologique et de leurs chances de survie à long terme tels que leurs comportements de survie (locomotion, prédation, efficacité de leur camouflage). La seiche est une espèce modèle bien étudiée d’un point de vue neuroéthologique et physiologique. Nous disposons par conséquent d’une large gamme d’outils analytiques de son comportement et de son camouflage. Pour couvrir les étapes clés du développement cérébral, comportemental et cognitif de la seiche, se déroulant près des côtes et correspondants de plus aux stades de vie les plus exposés à la pollution chimique et aux changements climatiques dans la nature, les animaux seront utilisés durant les 24 premières heures post-éclosion ou pendant le premier mois post-éclosion.

Aucune souris ne sera gardée vivante au-delà de quatre-vingts jours après l'injection des cellules leucémiques, ni si son état atteint un point limite. 166 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une irradiation du corps entier, puis des cellules leucémiques humaines dans la veine, une injection hebdomadaire dans le ventre et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang étalées sur neuf semaines, en restant éveillées à chaque fois. Le porteur attend une perte de poids et des tumeurs abdominales, et cherche à montrer qu'un type de cellules immunitaires modifiées s'épuise moins vite qu'un autre, une comparaison dont il renvoie les retombées cliniques à un second temps.

Objectifs

Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.

Procédures

-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.

Impact sur les animaux

La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.

Irradiées éveillées pendant cinq minutes, puis injectées dans la veine de la queue avec des cellules leucémiques, 410 souris subissent ensuite une prise de sang à la joue chaque semaine pendant un mois et, si la maladie ne se voit pas dans le sang, une ponction d'aiguille dans le fémur. Certaines reçoivent en plus une à deux injections dans le ventre par jour pendant cinq jours. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, alors que le développement attendu de la leucémie comprend un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, une prostration, une déshydratation et une hypothermie. Toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever leur moelle osseuse et leur rate, où logent les cellules leucémiques.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) à core-binding factor (CBF) sont un type particulier de cancer du sang qui est difficile à soigner. Des chercheurs ont remarqué que la façon dont les cellules cancéreuses s’organisent entre elles pourrait avoir un lien avec la façon dont les patients réagissent aux traitements. Mais on ne comprend pas encore très bien ce lien. Peut-être que cette organisation aide certaines cellules à résister aux médicaments, ou bien qu’elle montre juste qu’un autre problème plus profond est à l’origine de cette résistance. Dans notre laboratoire, on utilise des souris particulières pour essayer de mieux comprendre ce qui se passe. On veut vérifier si les changements dans les gènes des cellules cancéreuses sont bien responsables de la manière dont les cellules s’organisent entre elles et si cela les rend plus résistantes à la chimiothérapie (un traitement contre le cancer).

Bénéfices attendus

Les résultats de notre étude vont nous aider à confirmer s’il y a bien un lien entre l’état des cellules cancéreuses et la façon dont elles s’organisent dans ce type de leucémie. Plus largement, cela nous aidera à mieux comprendre comment le cancer se forme et pourquoi il peut résister aux traitements.

Procédures

Les souris, qui ne sont pas endormis au début, seront d’abord exposées à de faibles radiations pendant 5 minutes. Cela permet aux cellules cancéreuses qu’on leur injecte dans la veine de la queue de s’installer dans leur moelle osseuse. L’injection dure moins de 20 secondes. Ensuite, on leur prélèvera un peu de sang, au maximum une fois par semaine, en piquant une petite veine de la joue. Chaque prise de sang dure moins d’une minute et sera faite toutes les semaines, pendant 4 semaines. Cela nous permet de de voir si la maladie progresse et de récupérer du matériel pour faire des analyses plus tard. Si on ne trouve pas de cellules cancéreuses dans le sang, on ira en chercher dans l’os de la cuisse (le fémur) avec une petite aiguille. Pour cela, la souris sera endormie et ne ressentira pas de douleur. Cette opération dure moins de 5 minutes. Quand on est sûr que les cellules cancéreuses se développent, certaines souris recevront un traitement tous les jours pendant 5 jours. On leur fera une injection dans le ventre. Si on teste plusieurs médicaments en même temps, il peut y avoir deux injections par jour.

Impact sur les animaux

Les animaux traités avec les différentes molécules, greffés avec des cellules leucémiques ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre le développement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal de se déplacer et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas d’introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition d’amas de cellules cancéreuses forment une masse, dans diverses localisations (organes, tête).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever la moelle osseuse et la rate, deux organes où se localisent les cellules leucémiques. Cela permettra d'étudier finement leurs caractéristiques.

Remplacement

Bien que certains modèles cellulaires in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de résumer toutes les conditions de développement de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles de souris.

Réduction

Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés. Nous utiliserons un groupe contrôle pour différentes expériences.

Raffinement

En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort à l’intérieur des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés tous les jours en faisant particulièrement attention aux symptômes et changements de comportement. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des prélèvements de moelle osseuse car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis d’identifier les points limites qui, seuls ou cumulés, vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide sera prise pour éviter toute souffrance animale excessive. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal. Si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une euthanasie de l’animal sera réalisée.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé dans ce projet est déjà validé pour l’étude des mécanismes impliqués dans la leucémie aigüe myéloïde. Ce modèle présente une forte transposabilité aux données humaines en raison de la conservation des voies moléculaires clés entre la souris et l’homme. Son utilisation se justifie également par la robustesse des résultats préliminaires obtenus in vitro, qui nécessitent désormais une validation fonctionnelle in vivo dans un système pertinent et contrôlé. Ces modèles préalablement décrits utilisent des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, âge pour lequel la prise de greffe des cellules cancéreuses est optimal.

Une neurotoxine leur est injectée dans le cerveau au cours d'une chirurgie d'une trentaine de minutes, pour détruire les neurones qui produisent la dopamine. 2 625 rats vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé. Certains reçoivent une seconde chirurgie d'implantation de pompe sous la peau, puis un traitement quotidien pendant six semaines, des prises de sang à la queue sur animal éveillé et un prélèvement de liquide céphalorachidien. Le porteur annonce trois tests de comportement sous contention, répétés jusqu'à trois fois, sans dire lesquels, et prévoit d'écarter les 20 % de rats dont la lésion cérébrale se révélera insuffisante.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est, par sa prévalence de 1,5 pour mille, la plus fréquente des pathologies neurodégénératives, après la maladie d’Alzheimer. Elle touche environ 160 000 personnes en France. La MP se caractérise par un syndrome moteur défini par une lenteur d’initiation des mouvements associée à un tremblement de repos, une rigidité musculaire et une instabilité posturale. La principale caractéristique neuropathologique de la maladie de Parkinson est la mort progressive et massive des neurones en charge de la coordination des mouvements et qui produisent la dopamine. Les évènements qui sous-tendent cette mort restent mal connus. Ceci rend le diagnostic de la maladie de Parkinson difficile, d’autant que l’apparition des symptômes ne se produit qu’après une perte neuronale importante. À l’heure actuelle, le traitement de la maladie est donc essentiellement symptomatique et vise à compenser le déficit en dopamine (un messager chimique permettant la communication entre les neurones dans le cerveau) par l’administration d'une molécule semblable. Néanmoins, à long terme son efficacité s’atténue et des effets secondaires très invalidants (troubles moteurs, digestifs,cardiovasculaires, comportementaux, somnolence,…). Compte tenu de ces complications, des stratégies médicamenteuses alternatives sont en cours de développement et visent soit à retarder la prise de cette molécule soit à l’associer avec d’autres composés. L’objectif du présent projet est de tester l’efficacité antiparkinsonienne de nouveaux médicaments sur trois modèles précliniques de la maladie de Parkinson chez le rat. Ces modèles reposent sur une injection de toxines dans le système nerveux central en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine afin de mimer la mort des neurones entraînant la pathologie. Au cours du protocole, des tests comportementaux sont utilisés pour évaluer l’efficacité antiparkinsonienne des traitements testés. L’efficacité du nouveau médicament sera comparée aux médicaments actuels représentant le traitement de référence.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester l’effet antiparkinsonien des composés candidats pouvant avoir des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.

Procédures

Les animaux subissent une première chirurgie afin d’injecter la neurotoxine dans le système nerveux central (durée environ 30 minutes). Une deuxième chirurgie pourra être réalisée afin d’implanter sous la peau un dispositif permettant de diffuser un traitement en continu (durée environ 15 minutes). Des prélèvements répétés de sang pourront être réalisés sur animal vigile, à la veine de la queue (durée : 5min) ainsi qu’un prélèvement terminal sur animal anesthésié. Des administrations quotidiennes de candidat médicament ou de traitement de référence pourront être effectuées pendant toute la durée du protocole (6 semaines au maximum). Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement en fin de protocole effectués sous contention par l’expérimentateur (durée totale : 20min) jusqu’à trois fois au cours du protocole. Un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie pourra être réalisé. A la fin du protocole, les animaux seront mis à mort afin de prélever le cerveau.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du nouveau médicament et des molécules de référence. Un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut-être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. -Les animaux seront soumis à une administration dans le cerveau d'une toxine nécessitant une chirurgie réalisée sous anesthésie gazeuse. Cette étape peut engendrer des douleurs durant les 24-48h suivant la chirurgie minorées par des antalgiques. La peau du crâne sera ensuite suturée ce qui peut provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation,un risque de retrait du point par l'animal et un risque rare d'infection. Une perte de poids des animaux peut être observée ainsi qu’une altération de la mobilité avec des rotations contraires au site d’injection pendant quelques jours après la chirurgie. -Une chirurgie d’implantation de pompe diffusant des subtances liquides sera réalisée nécessitant une anesthésie gazeuse, avec une ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou une gêne au réveil -Les animaux réaliseront des tests de comportements nécessitant des contentions et des isolements courts dans des espaces restreints pouvant générer du stress. -Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile soumis à une contention, impliquant parfois des piqures dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille pouvant être à l’origine 1) d’une douleur légère de courte durée, 2) de stress et 3) d’un écoulement sanguin persistant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est necessaire de récupérer le cerveau de l'animal pour faire des analyses sur ce dernier.

Remplacement

L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet antiparkinsonien du composé sur le comportement de l’animal, le recours à un modèle animal est nécessaire. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’induire et d’étudier les répercussions comportementales associées aux déficits parkinsoniens ni d’évaluer la présence du composé dans les organes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe pour ce projet est basé sur des données préalables obtenues au sein de l’entreprise sur ce modèle préclinique de la maladie de Parkinson induite par l’injection de toxines dans le cerveau en ciblant spécifiquement les neurones produisant la dopamine (n=15 dont n=12 inclus dans l’analyse finale). Ce nombre se justifie pour les raisons suivantes : après la chirurgie induisant la lésion, environ 20% des animaux ne présentent pas de lésion sévère (

Raffinement

Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Des enrichissements multiples sont proposés aux animaux (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Après chaque prélèvement de sang, une réhydratation sera réalisée afin de compenser la perte du volume sanguin. Les chirurgies intracérébrales seront réalisées sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire durant 48h. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Par ailleurs, les animaux seront habitués aux environnements nouveaux dans lesquels seront réalisés les tests comportementaux afin de réduire le stress relatif à cela.

Choix des espèces

Les rongeurs, classiquement utilisés en laboratoire, présentent plusieurs similitude sur l'anatomie cérébrale et de l'activité des neurones produisant la dopamine que celles que l'on retrouve chez l'Homme. Les modèles de lésion induite par l'injection dans le cerveau de toxines se sont rapidement imposés comme des modèles précliniques de référence pour le test de nouveaux médicaments car ils reproduisent la mort des neurones produisant la dopamine. Des rats adultes d'environs 7 semaines (pesant entre 250 et 320g) le jour de la chirurgie de lésion dopaminergique seront utilisés dans ce projet car la grande majorité des résultats de la littérature concernant ce modèle a été obtenue sur des rats appartenant à cette gamme de poids. De même, les coordonnées exactes utilisées pour procéder à la lésion dans le cerveau proviennent de données issues d'un livre qui a également été réalisé sur la base d’observations faites sur des rats entre 250-300g. En fonction des objectifs de l’étude et des composés à tester, des rats mâles ou femelles pourront être utilisés puisque cette pathologie touche aussi bien les hommes que les femmes.

Une partie des souris utilisées est dépourvue de système immunitaire, donc exposée aux infections, et une autre partie est castrée avant même sa maturité sexuelle. 3 720 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des tumeurs de mélanome ou de cancer du sein, un implant sous la peau, des injections jusqu'à trois fois par semaine, une prise de sang hebdomadaire et deux séances d'irradiation, la croissance des tumeurs pouvant gêner leurs déplacements, se nécroser et gagner les poumons. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, l'objet déclaré étant de comprendre pourquoi les femmes résistent mieux au cancer que les hommes.

Objectifs

En France, les cancers sont non seulement plus fréquents mais aussi plus mortels chez les hommes que chez les femmes. Les mécanismes responsables de ces différences liées au sexe dans les cancers sont peu documentés et probablement complexes. A côté du mode de vie (consommation d'alcool, de tabac ...) qui peut varier entre les hommes et les femmes, nous pensons que des facteurs biologiques qui sont différents en fonction du sexe tels que les hormones sexuelles (estrogènes, androgènes) ou encore des facteurs génétiques (gènes du chromosome X ou du chromosome Y) pourraient aussi contribuer à expliquer la meilleure résistance des femmes au cancer en augmentant leur réponse immune anti-tumorale. Les grands objectifs de notre projet sont doubles. D’une part, nous identifierons si des facteurs génétiques liés au sexe contribuent aux meilleures réponses anti-tumorales chez les femelles et influencent leur réponse aux immunothérapies. D’autre part, nous évaluerons si les hormones sexuelles féminines (estrogènes) participent aux meilleures réponses immunitaires chez les femelles.

Bénéfices attendus

Bien qu'observables pour la plupart des cancers, les mécanismes à l'origine des différences dans le cancer entre les hommes et les femmes sont encore très peu explorés et largement négligés dans le diagnostic et la prise en charge thérapeutique. Il est en effet admis que la plupart des cancers se déclarent non seulement plus tôt chez les hommes mais que leur incidence et leur taux de mortalité associée sont plus élevés chez les hommes en comparaison aux femmes, supposant de meilleures réponses immunes antitumorales chez les femmes. Notre projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de ce dimorphisme sexuel dans l'immunité anti-tumorale. Ces mécanismes pourraient être exploités pour les thérapies de nouvelle génération et la gestion du cancer en fonction du sexe.

Procédures

Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris mâle ou femelle - Implant sous la peau réalisée sous anesthésie générale ( 30 sec), dure moins de 5 min - - des injections sous-cutanées et intraveineuses (durée moins de 1 min) au maximum 3 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure - deux irradiations de moins de 4 minutes chacune

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées que nous utiliserons, et dont nous disposons d’ores et déjà au laboratoire dans ce projet n’ont pas de phénotype dommageable hormis les souris immunodéficientes. Ces souris dépourvues de système immunitaire sont plus sujettes aux infections. Une partie des animaux sera ovariectomisée ou castrée. Les animaux récupèrent parfaitement de ces opérations. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires. Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires au point d’injection. La croissance des tumeurs primaires de mélanome et de cancer du sein peut induire des difficultés de déplacement. La croissance tumorale peut aussi être associée au développement de nécrose. Le lieu préférentiel de métastase du mélanome est le poumon et peut donc être accompagnée de troubles respiratoires. Globalement, la pousse tumorale et le développement de métastases peuvent être associés à une altération de l’état général (absence de nidification, absence de toilettage, asthénie, léthargie, tremblement, dos arqué) et à une perte de poids. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections et de la mesure du volume tumoral). Une grille de scoring decrit avec précision les actions à mener.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les réponses immunes anti-tumorales misent en place pour l’élimination efficace des cancers sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (site tumoral, site de dissémination métastatique, ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons aussi interrogé des chercheurs maitrisant ces modèles et leur robustesse. Nous en avons conclu que le nombre minimal d’animaux est de 10 par groupe. Le calcul d'effectif a été réalisé en utilisant un test non paramétrique de rang. Les expériences seront reproduites 2 fois. Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal : étude longitudinale de mesure de la pousse tumorale et étude cytométrique/transcriptomique/histologique sur les tissus post-mortem.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, en particulier les animaux immunodéficients, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (igloos, sizzelnest pour la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du serum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Un collyre anésthésiant sera appliqué sur l'oeil avant les injections en retro-orbitaire. L’ovariectomie, la castration et l’implantation des cellules tumorales mammaires sera réalisée sous anesthésie générale. Un anesthésique local sera administrée au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures. Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire anti-tumorale chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site tumoral ou dans les organes lymphoïdes). Une partie des souris devra être castrée avant maturité sexuelle (4-6 semaines), donc avant toute sécrétion d'hormones sexuelles. Toutes les autres procédures seront réalisées sur des animaux agés de 8-30 semaines. Cet âge correspond à l'âge adulte chez la souris, période durant laquelle nous souhaitons étudier l'impact des facteurs liés au sexe sur la réponse immune anti-tumorale.

Les femelles sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, et les embryons pour qu'on prélève leur cerveau. 964 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 164 femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie, jusqu'à quarante-cinq minutes, puis vivent seules en cage de une heure à une semaine, et 800 embryons reçoivent dans le cerveau, à travers un capillaire de verre, une injection que le porteur qualifie lui-même de douleur aiguë et modérée. Sur ce total, 20 femelles et 160 embryons servent à former de nouveaux intervenants aux gestes.

Objectifs

Notre recherche est orientée vers l’étude des maladies du développement du cerveau d’origine génétique. En particulier, l’objectif principal de notre travail est de mieux comprendre, au cours de ce processus complexe de développement, les mécanismes nécessaires à la maturation des cellules souches neuronales en neurones. Ici nous souhaitons comprendre comment le contrôle de la synthèse protéique participe au développement du cerveau. Nous avons récemment mis en évidence un rôle clé des acides ribonucléiques de transfert qui sont des petites molécules adaptatrices de la traduction protéique. Cependant, il reste à étudier comment les voies moléculaires liées à ces molécules adaptatrices contribuent à la génération des neurones. Nous souhaitons donc étudier la teneur en molécules adaptatrices dans les cellules souches neuronales et les neurones à différents stades du développement du cerveau in vivo chez la souris. Pour isoler les différentes populations cellulaires présentes à des stades clés, nous nous appuyons sur une technologie dite FlashTag qui consiste en l’injection, dans les cerveaux d’embryon de souris, d’une molécule fluorescente. En mettant à mort les animaux à des temps variés après injection nous pouvons marquer différentes populations cellulaires dont la date de naissance correspond au stade auquel l’injection a eu lieu. En combinant FlashTag et le tri de cellules basé sur la fluorescence (FACS) , nous souhaitons isoler des populations pures de cellules à différents stades du développement sur lesquelles nous réaliserons un séquençage des acides nucléiques de transfert. Nous avons 3 objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient Au total, un nombre de 144 souris gestantes, soit environ 640 embryons (+512 embryons de stade inférieur aux 2/3 de gestation) seront utilisés dans cette étude. Nous ajouterons 20 femelles et 160 embryons pour la formation de nouveaux intervenants

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de comprendre la fonction du contrôle de la synthèse protéique dans le développement du cerveau.

Procédures

164 femelles gestantes vont subir une chirurgie abdominale (laparotomie) unique, réalisée sous anesthésie générale et analgésie. La durée totale de la chirurgie n'excèdera pas 45 minutes. La cicatrisation peut induire une douleur modérée et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles, mais auront toujours un contact visuel et auditif avec leurs congénères pour des durées variant entre 1 h et 1 semaine selon l’objectif visé. Les souriceaux (n=640) vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 5 secondes) entrainant une douleur aigue et modérée.

Impact sur les animaux

La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits, il en résulte une douleur modérée lors de la cicatrisation et une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages individuelles et de ce fait privées de congénère pendant quelques jours de convalescence, en gardant un contact visuel et auditif, induisant un stress léger. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires (E12, E13, E14, E15, E16 et E17), entrainant une douleur aigue et modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou après la collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour prélever les cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer les stades du développement auxquels nous intervenons.

Réduction

Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique avec le test adéquat. De plus, certaines expériences seront utilisées dans 2 objectifs : nous pourrons utiliser les données de l’objectif 1 dans l’objectif 2.

Raffinement

Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal, notamment avec l’ajout de nid et de tunnel dans les cages d’hébergement. L’intervention chirurgicale sera effectuée sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. La cicatrice au niveau du ventre de la mère et le site d’injection sont surveillés et en cas d’infections importantes à ce niveau, ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement. Des points limites ont été déterminés et seront appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour comprendre la fonction du contrôle de la synthèse des protéines dans le développement du cerveau. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de déterminer les stades auxquels nous intervenons. La chirurgie pratiquée dans ce projet est réalisée en routine au laboratoire sur cet animal. Les femelles gestantes seront utilisées à maturité sexuelle car elles doivent être gravides. Les embryons seront injectés à différents stades du développement du cerveau avec une molécule fluorescente. Ils seront mis à mort à des stades précis, et les cellules fluorescentes triées pour répondre aux questions des différents objectifs : 1. déterminer si, au sein des cellules proneuronales, les quantités d’acides ribonucléiques de transfert varient au cours du développement 2. déterminer si, au cours de la spécialisation de la cellule en neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert sont différentes. 3. déterminer si, au cours de la maturation du neurone, les quantités d’acides nucléiques de transfert varient

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des ingrédients d'origine végétale censés réduire l'anxiété. Elles reçoivent le produit par la bouche une à deux fois par jour pendant quinze jours, puis passent une fois un test d'enfouissement défensif de vingt minutes, où l'anxiété se mesure à la façon dont l'animal enfouit un objet qu'il perçoit comme menaçant. Le porteur écrit qu'"aucune procédure n'engendrera de douleur", tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée. Celles qui le peuvent seront réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques dans l'établissement, les autres tuées, au service de ce que le porteur décrit comme "un enjeu sociétal et économique majeur".

Objectifs

Les troubles anxieux et liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Selon l'American Institute of Stress, ce problème est à l'origine de 75 à 90% des nouvelles consultations médicales et de 60 à 80% des accidents de travail. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. Dans le cas de stress chronique, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.

Procédures

Dans cette étude, un traitement sera administré une à deux fois par jour sur les 240 animaux vigiles (éveillés) par voie orale et ce jusqu'à 15 jours maximum. Un test comportemental sera réalisé une fois pendant 20 minutes sur ces 240 animaux pour évaluer les effets des traitements sur le stress et l'anxiété. Aucune procédure n’engendrera de douleur.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés par voie orale s’effectueront sur animal vigile, l’administration ne prend pas plus de 15 secondes par animal et ne nécessitent pas une anesthésie. De plus, l’administration orale sur animaux vigiles limite le risque de fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, n’est nécessaire et ne sera donc utilisée. Le test comportemental s’effectuera sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, pour ne pas perturber l’activité des animaux.

Devenir

Lorsque cela sera possible, les animaux seront réutilisés pour la formation aux gestes pratiques au sein de l’établissement. Tous les animaux non réutilisés seront mis à mort dans des conditions éthiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, les études in silico (modélisation informatique) ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets sur l’anxiété d’un traitement. Le modèle rongeur est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre ces pathologies. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rongeur. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.

Raffinement

Les animaux auront dans leur cage d'hébergement plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la phase de test comportementale. Les expérimentateurs sont formés et habitués aux évaluations comportementales et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celle-ci. Les souris seront observées tout au long de la réalisation du test comportemental. Les traitements seront effectués sur animaux vigiles par du personnel entrainé ayant les compétences requises pour effectuer ces gestes et une observation régulière des animaux sera effectuée après la réalisation de chaque traitement. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons l'atteinte d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques

Choix des espèces

Le modèle souris est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests défensifs visant à étudier les comportements de type anxieux. Dans cette étude afin d’être le plus représentatif possible nous utiliserons des souris des deux sexes. Les animaux utilisés seront des souris mâles de 10 semaines à l’arrivée au laboratoire et des femelles d'âge équivalent. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles.

Anesthésiés jusqu'à cinq fois pour être mesurés et pesés, 4 320 médakas marins passent l'intégralité de leur cycle de vie, six mois, dans une eau contaminée. Douze combinaisons de polluants, de température et d'acidification sont testées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tous les poissons sont tués pour doser la contamination et analyser leurs organes. Le porteur reconnaît ne pas savoir si six mois d'exposition produiront des effets modérés ou graves, aucune étude n'ayant encore couvert l'ensemble du cycle de vie. Cinq tests comportementaux de cinq à neuf minutes sont annoncés comme non invasifs, sans qu'aucun soit nommé, et la rubrique consacrée à la réduction du nombre d'animaux tient en deux phrases.

Objectifs

La production et l'utilisation de divers produits chimiques ont considérablement augmenté depuis le milieu du XXe siècle, conduisant à l'émergence de nouveaux contaminants appelés contaminants émergents. Ces substances, qui incluent des produits pharmaceutiques, des pesticides, des produits de soins personnels et des plastifiants, sont souvent retrouvées dans l'environnement aquatique en raison de leur usage intensif et d'une gestion inadéquate des déchets. En raison de leur nature diverse, ces contaminants peuvent persister, s'accumuler et interagir avec des organismes aquatiques de manière complexe. Pourtant, les effets chroniques de ces substances sur les écosystèmes marins restent encore largement méconnus. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer la toxicité chronique de différents contaminants émergents chez un poisson marin, tout en explorant comment les conditions de changement climatique, telles que l'augmentation de la température et l'acidification des océans, peuvent modifier leur impact environnemental.

Bénéfices attendus

Les recherches présentées dans cette demande s'attacheront à identifier les effets des contaminants émergents sur les populations de poisson. Cela devrait à terme fournir des données scientifiques nouvelles sur les risques liés à ces contaminants émergents pour les écosystèmes aquatiques et ainsi permettre de mieux réglementer leur rejet et informer le public sur les risques environnementaux associés à ce type de produits, sous la contrainte du changement climatique.

Procédures

Durant le projet, chaque individu pourra subir jusqu'à cinq anesthésies pour des mesures biométriques (taille et poids), chaque intervention durant moins de 5 minutes, incluant le transfert en bac de réveil. Un sous-échantillon d'individus sera soumis à cinq tests comportementaux non-invasifs d'une durée entre 5–9 minutes répartis sur 4 jours. Une période de repos de 24 h suit chaque test, avec alimentation et maintien en bac individuel en contact visuel avec les congénères.

Impact sur les animaux

Des études précédentes ont montré l’absence de toxicité lors d’expositions aiguës ou chroniques de courte durée aux contaminants de différentes natures chez le médaka marin et d'autres espèces, bien que certains effets négatifs mais non létaux aient été observés, comme un ralentissement de la croissance (moindre gain de poids par rapport aux contrôles) et une diminution de la fécondité (réduction du nombre d’œufs produits par femelle). Cependant, aucune étude n’a encore évalué les effets des contaminants émergents en milieu marin sur l’ensemble du cycle de vie des poissons, en interaction avec des changements de température et d’acidification. Il reste donc incertain que ces expositions, sur une durée de six mois, entraînent des effets modérés ou graves. Néanmoins, certains signes précurseurs peuvent apparaître dès le début de l’exposition, permettant une réaction rapide et la mise en place de mesures correctives.

Devenir

En cours ou en fin de projet, tous les animaux seront prélevés après euthanasie pour des analyses moléculaires, des dosages de la contamination et des analyses histologiques des organes.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer les animaux dans cette étude, car nous analysons l’impact des polluants et du climat sur les poissons à un niveau individuel, ce qui nécessite des organismes vivants pour pouvoir comprendre comment fonctionne l’ensemble du système.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés a été calculé pour être le plus bas possible tout en garantissant des résultats fiables. Nous utilisons des méthodes statistiques pour analyser les résultats et comparer les effets en fonction du sexe et de la condition des poissons.

Raffinement

Les poissons sont élevés en groupe dans un environnement adapté et observés régulièrement pour détecter tout signe de malaise (changement de couleur, difficulté à nager, etc.). Pendant certaines expériences, ils sont placés seuls pendant quatre jours, mais ils peuvent toujours voir d’autres poissons pour éviter le stress. Lors des mesures de taille et de poids, ils sont manipulés uniquement sous anesthésie pour leur bien-être.

Choix des espèces

Le médaka marin est un modèle animal qui permettra d’aborder les effets physiologiques des contaminants émergents sur les poissons osseux en milieu marin. L'espèce est caractérisée par une reproduction non-saisonnière en laboratoire, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts qui permettent d’aborder aisément les questions des effets à long-terme impliquant des expositions de l’ensemble des stades de vie. L'exposition aux 12 conditions climatiques et chimiques commencera lors de l'installation des animaux dans leur bac de 10L (15 jours post éclosion) et se poursuivra durant l’ensemble de leur cycle de vie afin d’étudier la toxicité des différentes conditions sur les différents stades aux sensibilités différentes (croissance juvénile, maturation sexuelle). Ils seront manipulés au stade juvénile (1, 2 mois) et adulte (jusqu'à 6 mois) pour des mesures de croissance, d'évaluation de la reproduction et de comportement (maturité du système nerveux optimale) respectivement.