Recherche appliquée

Isolées en cage individuelle pendant deux semaines à l'adolescence, soumises à un stress aigu de six minutes, à des injections dans l'abdomen et à des incisions de la queue pour prélever du sang, 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent deux chirurgies crâniennes, une à quatre semaines de vie et une cinq semaines plus tard, d'environ 35 et 40 minutes, pour implanter des dispositifs d'enregistrement neuronal. L'objectif est de savoir si l'isolement social pendant l'adolescence prédispose à l'anxiété à l'âge adulte, et le porteur écrit que les trois tests comportementaux, qu'il ne nomme pas, reposent sur des comportements innés et sont donc "sans effet indésirable attendu".

Objectifs

Il a été suggéré que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux à l'âge adulte. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long-terme en se concentrant sur le profil émotionnel, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour le contrôle des états émotionnels. La réalisation de ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre les déficits comportementaux associés à la privation sociale durant l'adolescence, et d'en aborder certains mécanismes. La compréhension de ces mécanismes devrait nous permettre à moyen terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes, mais aussi de développer des interventions préventives visant à réduire les effects néfastes de l'isolement sur la santé mentale.

Procédures

1) Hébergement individuel: il sera d'une durée de 2 semaines et sera réalisé dans l'Etablissement utilisateur 1 (EU1). 2) Injections intrapéritonéales: elles sont au nombre de 3 à l'âge de 4 semaines et 5 à l'âge de 10 semaines. La durée moyenne d'une injection, préhension de la souris inclue est de 30-40 secondes. Les injections seront réalisées dans l'EU1. 3) Stress aigu d'une durée de 6 min ou hébergement individuel d'une durée de 24 h. Ces interventions sont réalisées dans l'EU1 et concernent des animaux différents. 4) Tests comportementaux: ils sont au nombre de 3, et durent de 5 à 10 min chacun. Ils sont réalisés dans l'EU1 ou l'EU2. 5) Prélèvements sanguins: ils sont au nombre de 4 , et durent moins de 3 min, préhension de l'animal inclue. Ils sont réalisés dans l'EU1 sur des animaux n'ayant subi aucun test au préalable. 6) Chirurgie: sur animal adulte une chirurgie de 60 min environ est pratiquée; sur animal adolescent 2 chirurgies sont pratiquées, une à 4 semaines d'une durée moyenne de 35 min et une au moins 5 semaines plus tard d'une durée de 40 min environ. Les chirurgies sont réalisées dans l'EU1.

Impact sur les animaux

1) L'hebergement individuel peut induire un état de stress de degré modéré puisque de courte durée. 2) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un léger inconfort. 3) Le stress aigu sera à l'origine d'un incomfort passager, sans conséquences à long terme. 4) Les tests comportementaux sont basés sur les comportements innés des animaux et sont donc sans effet indésirable attendu. 5) Les prélèvements sanguins nécessitent une légère incision de la queue, ce qui peut entrainer une gêne et une légère douleur très locale et de très courte durée avec un risque très faible d'une hypovolémie / anémie en cas de saignement non maitrisé, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. De plus, un saignement non maitrisé pourrait entrainer une hypovolémie / anémie, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. 6) Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur postopératoire d’un degré de gravité modéré, qui sera minoré par les antalgiques administrés.

Devenir

Les souris sont toutes euthanasiées en vue de prélever le cerveau pour analyse.

Remplacement

L’étude de comportements, notamment sociaux et relatifs aux emotions, ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible leur remplacement par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience plusieurs test sur les mêmes animaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- En amont des tests comportementaux, toutes les souris seront habituées à l'expérimentateur par des pesées hebdomadaires. Elles seront acclimatées aux pièces de test pendant une durée d'au moins 45 min avant le démarrage des tests, et surveillées pendant au moins 30 min à l'issue des tests afin de détecter l'apparition d'une anomalie comportementale (stéréotypie, prostration, grooming excessif…). 2- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 3- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. Un analgésique sera injecté avant la chirurgie ainsi que 24h après. 4- Après la chirurgie, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été établis pour chaque critère avec un arbre de décision. Si l’animal perd du poids, de la nourriture enrichie humide sera fournie. Si la plaie ne cicatrise pas correctement, elle sera désinfectée et surveillée. Si la souris est en souffrance, un analgésique sera injecté. Si les anomalies persistent, le vétérinaire sera contacté afin de prendre les mesures les plus adaptées pour le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La neurogenèse dans le cerveau adulte, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. Par conséquent, la souris a été choisie comme modèle principal dans ce projet car 1) il est en continuité avec les études publiées sur des modèles équivalents , et 2) il permet l'utilisation d'outils transgeniques pour valider les hypothèses que nous pourrons formuler à l'issue des études. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact de l'isolement social à l'adolescence (P21-P35) sur la vulnérabilité / résilience à développer des troubles anxieux à l'âge adulte.

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

Une injection de virus dans la région de l'œil, sous anesthésie, ouvre le protocole pour 448 souris, dont la moitié porte des mutations reproduisant la maladie d'Alzheimer. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées à sept mois pour prélever leur sang et leur cerveau. L'injection peut provoquer un saignement oculaire et une inflammation, avec œil fermé et écoulement. Le porteur annonce quatre tests comportementaux de 8 à 70 minutes portant sur l'exploration et la mémorisation, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer MA est une maladie neurodégénérative, au cours de laquelle les cellules du cerveau dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Notre activité de recherche est dédiée à l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la MA. L’objectif est de comprendre le fonctionnement de cette maladie, afin de trouver des moyens d’action dans le système nerveux qui permettront de ralentir le développement de la MA.

Bénéfices attendus

L’objectif final est d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par la MA. Les bénéfices à plus court terme, concernent d'une part la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la MA et d'autre part de trouver des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA.

Procédures

Les jeunes adultes de 3 mois recevront une injection unique (durée une minute) sous anesthésie gazeuse, d'un virus qui a pour effet de retarder l'apparition des symptômes de la MA. A l'âge de 6,5 mois, les animaux subiront 4 tests comportementaux dont la durée varie entre 8 minutes et 70 minutes. La finalité de ces tests consiste à étudier l'activité d'exploration et la mémorisation. A la fin de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés en vue d'un prélèvement sanguin et d'une perfusion.

Impact sur les animaux

L'injection du virus est susceptible de provoquer un stress lié à la manipulation de l'animal, un saignement oculaire, une inflammation (oeil fermé, écoulement oculaire...). Les tests comportementaux peuvent être à l'origine de stress de courte durée qui s'atténuera avec la fréquence des séances d'habituation des animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale profonde pour réaliser des prélèvements de sang et de tissus cérébral à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie d'Alzheimer.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles ne fournissent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la MA. En ce sens, nous développons aussi des approches expérimentales in vitro dont les résultats doivent dans tous les cas être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle souris de la MA. Ces souris représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est similaire à celle observée chez l’homme.

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total : souris Contrôles (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 - souris modèle Alzheimer (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 Soit 448 animaux. Ce nombre d'animaux a été réduit à son minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies (dômes en papier, nids végétaux à base de fibres courtes de coton). Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Au cours de l'injection dans la région de l'oeil, chaque souris sera préalablement anesthésiée et recevra une goutte de collyre (anesthésie locale). Suite à l'injection, une attention particulière sera accordée aux yeux lors de l'observation quotidienne afin d'identifier de possibles effets indésirables (œil fermé, saignement, inflammation, écoulement oculaire…). Toutes les évaluations de l'état des animaux seront faites selon une grille d'évaluation adaptée. Préalablement aux tests comportementaux, les souris seront habituées à la préhension et à l'expérimentateur.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour nos études, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées modèle de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront utilisés à 4 stades : 1) Stade jeune adulte 3 mois, dans lequel une injection sera faite, permettant ainsi l’expression des variants de protéines d’intérêt dans les neurones. 2) Stade adulte 4 mois afin de tester des stades intermédiaires sans participer aux tests comportementaux. 3) Stade adulte à l’âge de 7 mois. Cet âge représente une phase de la maladie dans laquelle nous observons des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique. Le comportement des animaux sera testé à partir de 6,5 mois, et ce pendant environ 15 jours. 4) Stade adulte à l'âge de 7 mois. A ce stade les animaux seront mis à mort.

Neuf porcs seront tués en pleine phase aiguë de la maladie d'Aujeszky pour constituer un stock d'organes infectés utile au laboratoire. 21 porcs de 13 semaines vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculés par voie oro-nasale, ils subissent trois fois par semaine deux écouvillonnages nasaux, deux écouvillonnages oro-pharyngés, un brossage des amygdales et une ponction de 13 ml de sang, auxquels s'ajoutent chaque jour ouvré un recueil de salive et un essuyage du groin, avec une fièvre pouvant durer plus d'une semaine, de l'anorexie et de la prostration. Une friandise au sirop de grenadine leur est distribuée après chaque acte. L'effectif de neuf animaux consacré à la collecte d'organes se fonde sur une estimation des "besoins" du laboratoire pour ses dix prochaines années.

Objectifs

La maladie d’Aujeszky (MA) est une maladie virale touchant les porcs et les sangliers. Elle se caractérise par des troubles nerveux entrainant la mort chez les jeunes et des signes respiratoires et des troubles de la reproduction chez les adultes. De nombreux pays d’Europe ou d’Amérique sont indemnes de MA en élevages de porcs mais le virus est présent dans les populations de sangliers de plusieurs pays ce qui constitue une menace constante pour les porcs domestiques. Par ailleurs, la MA est toujours présente en Europe de l’Est et en Asie. Les protocoles d’échantillonnages à réaliser en cas de doute clinique de MA sont fondés sur des études et méthodes relativement anciennes. Depuis ces vingt dernières années, les méthodes de diagnostic ont évolué de même que les outils disponibles pour la collecte d’échantillons (nouveaux matériaux pour les écouvillons, collecte de fluide oral…). Il est donc nécessaire de mettre à jour les données concernant la détection du virus dans les différents types d’échantillons disponibles en utilisant les méthodes de diagnostic actuelles pour aider à la mise en place des plans d’urgence dans les pays touchés par la MA. Dans l’objectif d’acquérir de nouvelles données, le projet expérimental proposé ici aura pour objectifs de 1) comparer les performances de diagnostic de différentes méthodes de prélèvements (écouvillonnage nasal, écouvillonnage oropharyngé, brossage d’amygdales), de 2) tester des approches alternatives de prélèvements pour le diagnostic (fluide oral, lingette nasale, prélèvement d’air), de 3) collecter des tissus positifs vis-à-vis de la MA utiles pour les activités du laboratoire, et enfin d’ 4) acquérir des données sur une souche isolée récemment et qui est représentative des souches circulant chez le sanglier.

Bénéfices attendus

La comparaison des performances de diagnostic en fonction des différents prélèvements génèrera des données utiles aux autorités qui mettent en place une surveillance clinique de cette maladie dans leurs pays. En outre, les tissus positifs collectés au cours de ce protocole seront utilisés pour les activités du laboratoire. Ils pourront notamment être utilisés pour organiser des essais inter-laboratoires permettant de vérifier l’aptitude des laboratoires à réaliser un diagnostic de la maladie à partir d’organes.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Selon les groupes, les animaux recevront 5ml par voie oro-nasale de virus de la maladie d’Aujeszky (2 souches différentes seront utilisées) ou de milieu de culture (lot contrôle). L’inoculation oronasale prend moins d’1 minute. La moitié des animaux inoculés avec du virus sera mise à mort lors de la phase aigüe de la maladie afin de collecter des organes positifs alors que tous les autres animaux (infectés et témoins) seront suivis pendant 3 semaines post-infection. Tout au long de la procédure expérimentale, les animaux infectés par le virus de la MA seront soumis 3 fois par semaine aux prélèvements suivants : 2 écouvillons nasaux, 2 écouvillons oro-pharyngés, 1 brossage amygdalien et 1 ponction sanguine (total de 13ml). De plus, tous les jours du lundi au vendredi, du fluide oral individuel sera collecté (1ml de salive) ainsi qu’une lingette nasale (gaze de 4cm x 4cm utilisée pour essuyer le groin de l’animal). Un prélèvement d’air quotidien sera effectué à l’échelle de la salle. La cadence de prélèvements du lot contrôle sera plus faible que celle prévue pour les lots infectés, l’objectif étant de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques sans générer un nombre excessif de prélèvements. Ainsi ce lot sera prélevé 1 fois par semaine (mêmes prélèvements que ceux indiqués ci-dessus). Tous ces actes sont réalisés par un personnel très expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible (environ 1 minute 30). A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques induits par une infection des porcs par le virus de la maladie d’Aujeszky sont dépendants de l’âge des animaux et de la souche utilisée. Si l’infection de jeunes animaux provoque des signes neurologiques et une forte mortalité, l’infection de porcs de plus de 3 mois se limite généralement à une forte fièvre, une baisse d’appétit et des troubles respiratoires. Compte tenu de l’âge des animaux (13 semaines) et des souches qui seront utilisées dans ce projet, aucune symptomatologie sévère n’est attendue. Les signes cliniques attendus sont : de la fièvre pouvant durer plus d’une semaine, de l’anorexie, de la prostration, des problèmes respiratoires, de la toux et des éternuements. Un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Un suivi rapproché sera mis en œuvre dès que l’évolution de l’état de santé d’un animal le nécessitera. L’animal concerné sera observé le matin, en début d’après-midi et en fin de journée (y compris le week-end) afin d’évaluer l’évolution de son état de santé et de procéder à sa mise à mort en cas d’atteinte de l’un des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir récolter des prélèvements d’organes et, pour certains d’entre eux, de gros volumes de sang.

Remplacement

Pour répondre aux objectifs de ce projet, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

Pour répondre aux objectifs 1 et 2 de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 porcs infectés avec une souche de référence et qui seront suivis jusqu’à la fin de la procédure de façon à avoir des données statistiques fiables. Le nombre de 3 porcs témoins est l’effectif minimal pour permettre de s’assurer de la conservation de leur statut négatif et de la spécificité des techniques de prélèvement. Enfin, le nombre de 3 porcs infectés avec la souche nouvellement isolée est l’effectif minimal pour obtenir des données préliminaires relatives à cette souche, qui seront comparées aux données des 6 animaux précédemment mentionnés (objectif 4). L’effectif de 9 animaux pour la collecte d’organes (objectif 3) se base sur une estimation des besoins du laboratoire pour ses activités des dix prochaines années. Il n’est pas possible d’attendre la fin de la procédure et d’utiliser les 12 porcs mentionnés ci-dessus (pour les objectifs 1, 2 et 4) puiqu’à ce stade de l’infection, le virus de la MA ne sera plus présent dans la plupart des organes. Il est donc nécessaire de collecter ces organes lors de la phase aigüe de la maladie pour avoir des organes positifs.

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de la durée du projet. Ils seront répartis dans 4 animaleries contenant chacune un à deux parcs. Du début à la fin de la procédure, chaque parc accueillera 3 animaux. Les porcs seront alimentés et abreuvés à volonté. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets type "mordille", "tourniquet", etc. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine leur sera distribuée. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d’atteinte d’un des points limites, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus de la maladie d’Aujeszky. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de cette procédure. Les porcs seront sevrés à 4 semaines d’âge. Ils seront inoculés à 13 semaines d’âge (phase d’engraissement). Cet âge a été choisi pour que les animaux survivent à l’infection et ainsi permettre de suivre l’excrétion virale pendant 3 semaines post-inoculation.

Un traumatisme crânien est provoqué chirurgicalement chez 500 souris, qui reçoivent ensuite une injection d'antidépresseur dans l'abdomen à l'état vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour l'analyse post-mortem des processus oxydatifs et inflammatoires du cerveau. Le médicament testé est déjà autorisé chez l'être humain, et le porteur espère lui ouvrir une nouvelle indication pour les personnes victimes de traumatisme crânien. Comment le traumatisme est produit, avec quel appareil et à quelle énergie, n'apparaît nulle part, pas plus que les tests censés révéler les troubles de la mémoire et les signes d'anxiété annoncés chez les animaux.

Objectifs

Le traumatisme crânien (TC) est l'une des principales causes de mortalité et de handicap chez les jeunes, et malheureusement, à ce jour, aucun traitement efficace ne permet de limiter ces déficits. Les séquelles post-TC sont en partie liées à l’activation précoce de mécanismes de stress oxydant et d’inflammation, et de récentes études suggèrent que la modulation de différentes voies biologiques permet de limiter ces processus dans des modèles précliniques de TC. Les TC légers concernant le plus grand nombre d’individus en clinique, nous proposons d’évaluer si un médicament antidépresseur (ayant obtenu une autorisation d’utilisation chronique en clinique humaine) pourrait également exercer des effets bénéfiques en traitement ponctuel dans un modèle de TC léger chez la souris, notamment sur le stress oxydant et l’inflammation post-traumatiques, ce qui aboutirait in fine à une nouvelle indication en clinique pour ce médicament.

Bénéfices attendus

Etant donné que le médicament que nous évaluerons dans ce projet est d’ores et déjà autorisé en clinique humaine, s’il se révèle bénéfique dans notre modèle murin, son utilisation chez les patients victimes de traumatisme crânien pourra rapidement être proposé, ce qui constituera donc une nouvelle indication pour ce médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale puis à une injection d’antidépresseur par voie intrapéritonéale en vigile.

Impact sur les animaux

Etant donné que le degré de traumatisme crânien visé est léger, et sur la base de notre expérience et des données de la littérature, la mortalité des animaux subissant l’intervention nécessaire au modèle est généralement nulle. Cependant, suite à l’anesthésie gazeuse, la mortalité peut survenir par non reprise d’une respiration spontanée, même si cet évènement reste très rare d’après notre expérience. Toujours d’après notre expérience, la modélisation du TC s’accompagnera d’une période de baisse de prise de nourriture mais sans conséquence significative sur les paramètres de suivi quotidien des animaux (poids, apparence, comportement spontané et lors de la manipulation). Le comportement des animaux exposés au TCL pourra être légèrement modifié : ils pourraient développer des problèmes de mémoire et montrer des signes mineurs d’anxiété.

Devenir

A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort pour analyse post mortem, permettant d’évaluer si le traitement antidépresseur utilisé permet de réduire significativement ces processus post-traumatiques et donc d’améliorer la récupération après le TC.

Remplacement

Nos recherches portent sur l’intégrité du cerveau en contexte de traumatisme crânien, en s’intéressant plus particulièrement aux phénomènes oxydatifs et inflammatoires impliquant de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires. Si certains de ces mécanismes peuvent être étudiés à l’aide de modèles in vitro, le recours à des modèles animaux reste indispensable pour appréhender les processus complexes propres aux animaux vivants. Le modèle murin est essentiel à cette étude visant à mieux comprendre ces mécanismes dans une perspective thérapeutique.

Réduction

Les études prévues nécessiteront l’utilisation 500 animaux au maximum. L’effectif nécessaire a été évalué de manière statistique, et dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux, tout en s’assurant d’atteindre les objectifs spécifiques fixés. L’étude pilote réalisée uniquement sur les animaux TC permettra d’identifier la dose optimale d’antidépresseur ; dans une deuxième étape du projet, l’étude sera poursuivie à la dose optimale d’antidépresseur et les groupes contrôles seront cette fois-ci inclus. Ainsi, l’étude pilote permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour notre projet. L’effectif prévu nous permettra d’évaluer si notre traitement diminue les processus oxydatifs/inflammatoires post-traumatiques chez le mâle et la femelle, tout en déterminant la dose optimale à utiliser.

Raffinement

Les procédures prévues ont été raffinées pour réduire au maximum le stress physique et physiologique, et toute forme de souffrance chez les animaux au-delà du phénomène traumatique que nous étudions. Les animaux seront habitués aux conditions d’hébergement de l’établissement utilisateur. Ils seront hébergés en groupes de 4-5 individus dans un environnement enrichi. Des aliments (croquettes) ainsi que de l’eau gélifiée seront déposés directement dans chaque cage à la suite de la procédure chirurgicale afin de favoriser à la fois la consommation de nourriture et l’hydratation des animaux. Une fiche de suivi sanitaire (annexe 1) permettra de suivre l’état général des animaux pendant les 48 heures post chirurgie (poids, apparence et comportement spontané et lors de la manipulation) et de s’assurer que les points limites ne soient pas atteints. L’ensemble du personnel en charge de la surveillance des animaux sera formé à l’utilisation de cette fiche de suivi sanitaire. Les animaux seront mis à mort de manière précoce par dislocation cervicale dans le cas où les points limites seraient atteints.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé en raison de sa pertinence biologique, génétique et physiopathologique, permettant d'étudier de manière fiable les mécanismes impliqués dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du traumatisme crânien dans le respect des principes des 3R. Ce modèle est au cœur de notre recherche, car il permet de reproduire des lésions cérébrales et d’observer les mécanismes sous-jacents aux dysfonctionnements neurologiques. En outre, la souris est un modèle bien établi pour étudier les effets des traumatismes crâniens et le stress oxydatif, ce qui nous permet de situer nos résultats dans un cadre scientifique validé. Son utilisation permet également de tester plus facilement des stratégies thérapeutiques innovantes. Cette espèce animale constitue ainsi un outil essentiel au sein de notre équipe pour approfondir la compréhension des altérations cérébrales et des mécanismes sous-jacents aux lésions cérébrales dans le cadre de pathologies neurodégénératives. Les animaux arriveront dans l’animalerie de l’établissement à l’âge de 8 semaines. Ils auront 9-10 semaines au moment de la chirurgie, ce qui correspond au stade de jeune adulte, stade pertinent car c’est un âge particulièrement propice aux traumatismes crâniens en clinique humaine.

1 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tumeurs et de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales, jusqu'à seize injections de traitement en deux mois et une irradiation localisée de douze minutes sous anesthésie générale. Le porteur annonce une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité et des modifications du comportement social liées à la croissance des tumeurs et aux traitements. Il promet en retour un "nouveau paradigme" de radio-immunothérapie et une "transformation significative" des stratégies thérapeutiques, alors que le projet en est au stade de combiner trois traitements chez la souris.

Objectifs

Les agonistes des récepteurs étudiés sont des peptides intestinotropes connus pour leurs effets bénéfiques sur la barrière intestinale et leurs capacités immunomodulatrices. Comparés aux traitements immunologiques classiques, ils présentent un profil de tolérance favorable, tout en modulant efficacement l'inflammation locale et en préservant l'intégrité épithéliale intestinale. Parallèlement, l'irradiation intestinale à faible dose apparaît comme une approche innovante capable de remodeler le microbiote intestinal, d'activer les cellules dendritiques et d'induire un effet immunitaire antitumoral à distance (effet abscopal). Toutefois, malgré les succès notables des inhibiteurs de points de contrôle immunitaire, leur efficacité reste limitée dans les tumeurs dites "froides" ou peu immunogènes. Le projet actuel vise précisément à explorer la synergie thérapeutique potentielle entre ces différentes stratégies dans un modèle murin de cancer colorectal. Cette approche multidimensionnelle pourrait ouvrir la voie à une nouvelle génération de thérapies combinatoires, dépassant les limites actuelles des immunothérapies classiques, souvent entravées par un microenvironnement tumoral immunosuppressif et une toxicité intestinale significative. En établissant clairement le bénéfice thérapeutique de cette combinaison innovante, ce projet pourrait conduire à une transformation significative des stratégies thérapeutiques actuelles, notamment en réduisant les effets secondaires et en augmentant significativement les taux de réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à explorer une stratégie innovante combinant la radiothérapie intestinale à faible dose, un agoniste de récepteur et une immunothérapie, afin de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d'améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette approche multimodale vise non seulement à optimiser la réponse immunitaire antitumorale, mais également à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation du microenvironnement intestinal. À travers une conception expérimentale rigoureuse et des analyses multi-paramétriques approfondies, ce projet ambitionne de poser les bases d’un nouveau paradigme de radio-immunothérapie ciblant l’axe microbiote – barrière intestinale – immunité adaptative, tout en réduisant les effets secondaires associés aux traitements combinés. En décryptant les mécanismes synergiques entre ces trois stratégies :modulation du microbiote et activation locale, la réparation de la muqueuse intestinale et réduction de l'inflammation et l’activation de lymphocytes T cytotoxiques, cette étude fournira une base translationnelle solide pour le développement de futurs essais cliniques combinés, alliant efficacité thérapeutique et toxicité minimale.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés comme les injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques injectés en intra-péritonéale. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer l’effet thérapeutique combiné de l’irradiation intestinale à faible dose (ILDR), d’un inhibiteur du point de contrôle immunitaire (anti-PD-L1) et d’un modulateur immuno-métabolique, un agoniste du récepteur GLP-2 (GLP-2RA), sur la réponse tumorale. Étant donné que l’ILDR, le blocage de PD-L1 et le GLP-2RA agissent sur un réseau complexe d’interactions entre l’hôte, la tumeur et le microbiote intestinal, l’étude de ces mécanismes nécessite un système immunitaire intact, un microenvironnement intestinal fonctionnel et un état métabolique stable. Cette complexité multifactorielle ne peut être reproduite de manière fiable ni par des cultures cellulaires (in vitro), ni par des modèles informatiques (in silico). Par conséquent, afin de caractériser avec précision les mécanismes d’action et l’efficacité thérapeutique de cette approche combinée, le recours à un modèle animal vivant, immunocompétent et métaboliquement intact, est indispensable.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique à priori, (avec G*Power) afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie (isoflurane/Lidocaïne) adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections intrapéritonéales. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes.

6 500 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une greffe de tumeur prélevée sur un patient, puis jusqu'à 160 injections de médicament par étude, certaines molécules étant administrées deux fois par jour pendant seize semaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires. Un même animal peut rester trente-six semaines dans le protocole. Ces modèles de tumeurs résistantes, le porteur les met à disposition de la communauté scientifique et les emploie dans des collaborations académiques et industrielles pour valider ou réfuter des hypothèses sur des composés, et il affirme qu'il est "indispensable" de créer de nouveaux modèles sur un "organisme complexe" comme la souris.

Objectifs

Depuis plusieurs années, le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses a permis des avancées notables, notamment pour améliorer la survie des patients atteints de cancers difficiles à traiter. Cependant, la résistance aux traitements, phénomène appelé résistance acquise, demeure un défi majeur en oncologie, limitant l’efficacité à long terme des thérapies. Ce problème survient généralement après quelques mois de traitement, entraînant la progression de la maladie. Les échecs thérapeutiques résultent souvent d’un manque de compréhension des mécanismes d’action des médicaments et des voies biologiques impliquées dans l’échappement des cellules tumorales. Mutations génétiques, altérations de la signalisation cellulaire ou modifications du microenvironnement tumoral influencent la réponse aux traitements. Une meilleure connaissance de ces mécanismes permettrait d’identifier de nouvelles cibles et de développer des thérapies plus efficaces, personnalisées et durables. Dans cette optique, les modèles issus de greffes de tumeurs humaines chez la souris, jouent un rôle clé. Ces modèles conservent les caractéristiques génétiques et pharmacologiques des tumeurs humaines, offrant une reproduction réaliste des réponses cliniques et des mécanismes de résistance. Ils sont ainsi devenus des outils indispensables pour évaluer les effets de nouveaux traitements et combinaisons thérapeutiques. Notre projet vise à développer des modèles de greffes de tumeurs de patients à partir de biopsies de patients ayant développé des résistances à des thérapies innovantes en développement. Ces modèles permettront d’étudier les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, ainsi que de tester de nouvelles stratégies, notamment des combinaisons thérapeutiques. À ce jour, notre équipe a généré de nombreux modèles de ce type, utilisés pour des recherches approfondies sur les mécanismes de résistance et le développement de nouveaux traitements. L’objectif de ce projet est de caractériser pharmacologiquement ces modèles, de tester des composés innovants et de mener des études pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. Ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et à l’optimisation des thérapies contre le cancer.

Bénéfices attendus

L’utilisation des modèles de greffes de tumeurs de patients sur aimaux permet de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux thérapies, contribuant ainsi à l’avancée des connaissances scientifiques. Au sein de notre équipe, nous avons développé une activité de recherche dédiée à l’identification des mécanismes de résistance et des modes d’action de thérapies innovantes. Au cours des dernières années, nous avons lancé plusieurs projets de recherche, notamment sur la résistance précoce aux thérapies. Ces travaux ont permis de générer de nouvelles connaissances sur les mécanismes de résistance et d’action des médicaments, avec des implications directes pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer. Nos modèles sont également mis à la disposition de la communauté scientifique et peuvent être intégrés dans des projets de recherche fondamentale, préclinique et translationnelle. Par exemple, les tests pharmacologiques réalisés dans le cadre de collaborations académiques et industrielles ont permis de valider ou de réfuter les hypothèses sur des modèles plus sophistiqués que les lignées cellulaires, et plus représentatifs des caractéristiques humaines. Un autre avantage majeur de ces modèles réside dans leur capacité à conserver les caractéristiques pharmacologiques, génétiques et histologiques des tumeurs des patients. Cela offre la possibilité de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ou de nouveaux composés sur des tumeurs issues de patients en progression sous thérapies innovantes. À terme, ces recherches ouvrent la voie à des essais cliniques pour de nouveaux médicaments. À ce jour, notre équipe a validé, grâce à ces modèles, des combinaisons thérapeutiques capables de surmonter la résistance ainsi que de nouveaux inhibiteurs, dont certains sont déjà en cours d’évaluation clinique.

Procédures

Chaque souris incluse dans l’étude fera l’objet d’une greffe tumorale sous-cutanée sous anesthésie générale, représentant une intervention unique d’environ 10 à 15 minutes. Un sous-groupe recevra également, au moment de la greffe, un implant hormonal, inséré sans intervention supplémentaire, en sous-cutané, durant la même anesthésie générale. À l’issue de la phase de croissance tumorale, une partie des souris sera traitée selon différents protocoles expérimentaux. Les traitements seront administrés pendant une période pouvant aller jusqu’à 16 semaines, à une fréquence variant de 1 à 5 jours par semaine, selon les groupes. Certains médicaments nécessiteront une administration biquotidienne, portant le nombre maximal d’injections médicamenteuses à 160 par animal et par étude. La durée moyenne de chaque procédure (de l’implantation tumorale jusqu’à la fin du traitement) est estimée à 20 semaines, tandis que la durée maximale est fixée à 36 semaines par animal. Des prélèvements sanguins ponctuels ou séquentiels pourront être réalisés au cours de l’étude. Chaque prélèvement durera environ 5 minutes. Lors de cinétiques courtes (sur une semaine), jusqu’à 3 prélèvements maximum seront effectués. Pour des cinétiques longues, un prélèvement par semaine pendant une durée maximale de 6 semaines sera réalisé.

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanée peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux. Les prises de sang peuvent entraîner une douleur locale modérée transitoire.

Devenir

L’ensemble des animaux sera euthanasié à l’issue de chaque procédure afin de permettre la récupération des échantillons tumoraux et/ou tissulaires pour les analyses post-traitement (pharmacologiques, histologiques, ou génétiques).

Remplacement

Il s'agit ici d'un projet de recherche dont l'objectif est d'étudier les mécanismes de résistance aux thérapies, de mieux comprendre les mécanismes d'action des médicaments innovants et de développer de nouvelles thérapies pour les patients. Les tumeurs greffées dérivées de patients que nous avons générés, et que nous continuons à développer à partir de biopsies de patients résistants à des thérapies innovantes (saisine valider), constituent des modèles précieux et uniques. Ils offrent une opportunité essentielle pour approfondir notre compréhension des résistances et des mécanismes sous-jacents. Ces modèles, plus proches à la fois génétiquement, pharmacologiquement et histologiquement des tumeurs humaines, permettront d’augmenter le succès du développement de traitements efficaces en clinique. Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de créer de nouveaux modèles sur un organisme complexe tel que la souris, avec une activité métabolique pouvant modifier la distribution et l’efficacité thérapeutique. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et certaines interactions entre différents systèmes biologiques sont impossibles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils représentent beaucoup mieux les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, les interactions entre différents organes et systèmes de l'organisme ne peuvent être étudiées que chez les animaux vivants.

Réduction

En parallèle du développement de tumeurs greffées dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation (respect des 3R), nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettront des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles de greffes de tumeurs de patients sur souris plus proches de la biologie humaine. Les effectifs d'animaux ont été calculés au plus juste en utilisant des calculs de psuissance. Les résultats seront exploités grâce à des tests statistiques (modèles linéaires non non-linéaires).

Raffinement

Lors des interventions, telles que les greffes sous-cutanées ou l'ajout de pastille hormonale, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale) et reçoivent un médicament contre la douleur. Elles sont surveillées quotidiennement pour évaluer leur état de santé. La taille des tumeurs est mesurée régulièrement à l'aide d'un pied à coulisse, pour surveiller la taille des tumeurs. L'alimentation des souris sera adaptée à leur prise alimentaire et remplacée par une alimentation appétente et plus facilement préhensile en cas de perte d'appétit. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par la facilité d’utilisation des modèles murins pour le développement préclinique. Par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de faciliter la croissance tumorale. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Jusqu'à huit instillations oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine sous microscope chirurgical : 740 souris et 740 rats rendus diabétiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au bout d'un mois de diabète, les rats malades ne pèsent plus que 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, boivent et urinent davantage, perdent leur tonus et se voûtent. Presque tous sont tués à l'issue pour les analyses histologiques, 80 animaux écartés avant l'étude pour un défaut de l'œil pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur retient le rat et la souris pour la rapidité d'apparition des signes de rétinopathie, et annonce un modèle destiné à tester des traitements, dont la mise au point occupera la première des cinq années du projet.

Objectifs

L’objectif du projet est d’utiliser un modèle de rétinopathie chez le rat et la souris diabétique afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'œil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des petits vaisseaux sanguins de la rétine. Ces vaisseaux deviennent poreux, ils perdent leur étanchéité ce qui conduit à des hémorragies et des exsudats qui lèsent la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec une production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un œdème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète a également des conséquences sur la cornée et le cristallin, structures dont la transparence est nécessaire pour la vision. Le projet s'étale sur 5 ans, après une période de mise en place des modèles dans notre établissement pendant la première année, nous estimons que pourront se dérouler des études de test d'efficacité de traitement. Ces études comporteront au maximum 5 groupes de 10 animaux, pour comparer l'efficacité de plusieurs concentrations d'une molécule ou plusieurs molécules entre elles par rapport à un traitement placebo. Nous estimons pouvoir réaliser 2 études par an, pendant 4 ans.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et préserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection d’un produit qui agit sur le pancréas. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injections. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques, leur glycémie augmente. L’hyperglycémie altère les vaisseaux sanguins et les nerfs avec une répercussion sur différents organes, ce qui peut entrainer notamment des troubles cardiovasculaires, au niveau des reins, et au niveau de l’œil. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris qui serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète. Les examens qui seront pratiqués pour la réalisation du projet ou les administrations de produit par instillations (gouttes oculaires), ou par injections seront rapides (quelques minutes) et ne devraient pas porter atteinte au bien-être de l'animal, elles impliquent le maintien de l'animal manuellement afin de l'immobiliser, cette manipulation est transitoire et sans impact sur sa locomotion future. Certains examens ou administration de produits, notamment au niveau de l'œil, nécessitent l’immobilisation complète pendant plusieurs minutes de l'animal, seront pratiqués sous anesthésie légère. L’animal est replacé rapidement dans son environnement habituel, sans conséquences majeures sur son état, si ce n’est la gêne transitoire due à l’injection de produits. Des prélèvements pourront être réalisés sur animal vigile et la durée de l'action ne dépassera pas les 5 min, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode vie de l'animal une fois l'action finie.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.

Remplacement

Compte tenu des particularités physiologiques et anatomiques de l’organe concerné et l’absence pour l’instant de modèle alternatif pour ce type de projet, nous aurons recours à des animaux. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. L’œil est un organe complexe soumis à de nombreuses interactions. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen) de physiologie différente soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les souris permettent d’étudier les effets systémiques de la maladie sur les structures de l’œil. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Les souris et les rats permettent de suivre l’évolution de la maladie au cours du temps.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe avec de l’enrichissement adapté à l'espèce. En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, une couche plus épaisse de litière sera déposée dans la cage et elle sera changée plus fréquemment, un biberon supplémentaire sera ajouté ; Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

L’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. Dans la littérature, les rats et les souris ont une sensibilité durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Cinq jours d'administration orale par canule, une injection qui déclenche un état septique ou un sérum toxique pour les reins, puis pour un quatrième groupe un mois de régime hypergras : 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traceur fluorescent leur est ensuite injecté et un capteur fixé sur le dos, avec deux anesthésies successives pour la pose et le retrait, et quelques heures d'isolement. Le porteur annonce les atteintes attendues, irritation de la gorge, saignements, œdème, péritonite, prise de poids massive et pelage gras pour les souris rendues diabétiques, risque d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, les prélèvements post-mortem étant présentés comme le seul moyen d'obtenir les tissus recherchés.

Objectifs

Les maladies rénales, aigues ou chroniques, sont un problème majeur pour la santé publique, affectant des millions de personne dans le monde. Même si des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification des mécanismes responsables de leur progression, il n’existe aucun traitement spécifique permettant à l’heure actuelle de diminuer ou d’arrêter la progression des maladies rénales de manière probante. Par conséquent, la détection de la maladie à des stades très précoces ainsi que la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques sont d’une importance cruciale pour mettre au point un traitement efficace Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d'une protéine impliquée dans la mort de cellules de petits vaisseaux sanguins dans la maladie rénale. En effet, la surexpression de cette protéine est associée à une dégradation de la fonction rénale dans différents modèles de maladies rénales expérimentales. Plus précisément, nous avons récemment montré que cette protéineest fortement surexprimée dans des cellules qui assurent la fonction de filtration du rein et que cette surexpression conduit à une mortalité de ce type cellulaire dans des cultures de ces cellulesin vitro. L’objectif principal de ce projet est de définir le rôle de la protéine dans l’adaptation fonctionnelle et structurelle du rein en réponse à des agressions aigues et chroniques, glomérulaires ou vasculaires, en utilisant desmodèles de souris transgéniques pour lesquelles une surexpression ou bien une inhibition de la protéine d'intérêt est inductible dans le temps et de manière tissu spécifique. Ces expériences permettront de répondre à ces questions : La surexpression de la protéine peut elle induire ou aggraver la maladie rénale dans plusieurs modèles expérimentaux? A l'inverse, est ce que l’inhibition de la protéine peut ralentir la progression de l’insuffisance rénale ? Peut on mettre en place une stratégie thérapeutique bloquant la surpression de la protéine afin de préserver la fonction rénale dans un contexte pathologique ?

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies rénales chroniques est en constante augmentation, affectant environ dix pour cent de la population mondiale, bien que beaucoup de cas restent non diagnostiqués en raison de leur évolution silencieuse. Une prise en charge précoce et une sensibilisation accrue sont essentielles pour prévenir leur progression vers l'insuffisance rénale terminale, nécessitant dialyse ou transplantation. Nous espérons que notre étude permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur cette protéine et la proposera comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance rénale. Nous effectuerons durant et après ces protocoles différentes analyses fonctionnelles, histologiques, cellulaires et moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés . Ainsi, nous espérons faire un pas supplémentaire vers le développement de stratégies thérapeutique ciblant cette protéine afin de ralentir la progression des maladies rénales voire la faire régresser.

Procédures

Un premier lot reçoit une administration orale une fois par jour pendant cinq jours, chaque session durant environ 30 secondes par animal. Ensuite, une administration unique est effectuée à l’état vigile, afin d’induire le modèle septique, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un deuxième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Deux administrations par voie veineuse sont ensuite effectuées sous anesthésie, afin d’induire le modèle, chacune prenant 10 secondes par souris. Un troisième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Une seule administration d’une molécule est ensuite effectuée à l’état vigile, pour induire le modèle, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un quatrième lot reçoit un régime hyper gras. Un inhibiteur génétique leur est administré deux fois par semaine pendant un mois, (30 sec par souris) à l’état vigile. Alternativement, un stimulateur sera ajouté à l’eau de boisson et administré durant 30 jours. Une mesure de la fonction rénale est réalisée sur les trois derniers lots grâce à une nouvelle technique nécessitant une anesthésie gazeuse. Cette procédure inclut l’administration d’un traceur fluorescent et l’installation d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal, pour une durée totale de cinq minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie est nécessaire pour retirer le capteur, ce qui prend environ deux minutes. En fin de protocole, les quatre lots font l’objet d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie (une minute par souris), suivi de l’euthanasie des animaux selon une méthode règlementaire, en vue des analyses et prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Un premier lot d’animaux subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique pour induire le modèle septique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le modèle pourra induire une perte d’activité et de poids et une élévation de la température. Un second lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique de sérum toxique pour les reins associé à un risque de saignement et œdème. Cette administration étant effectuée sous anesthésie générale courte, les nuisances de l’anesthésie sont ici très limitées. Un troisième lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration d’une molécule toxique pour les reins pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Un quatrième lot d’animaux diabétiques sera exposé à un régime riche en lipide qui s’accompagne d’une prise de poids massive, d’un soin altéré avec un pelage gras, d’une activité réduite avec un risque infectieux plus important. Une partie des animaux seront traitée par administrations répétés pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Il y a aussi un risque de péritonite et de saignements liés aux administrations répétées. Une autre partie sera traitée via l’eau de boisson pouvant conduire à une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie des souris. Les trois derniers lots subiront une mesure de la fonction rénale incluant deux anesthésies de courte durée pour la pose et le retrait du capteur pouvant induire un stress, un risque de saignement et d’œdème associé à l’administration du traceur fluorescent nécessaire à la mesure et un stress social lié à l’individualisation durant quelques heures. Tous les animaux subiront un prélèvement sanguin en fin de période de maintien sous anesthésie. L’anesthésie générale pourra conduire à des complications telles que : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de notre protéine cible sur le rein est la modification de la fonction rénale, qui est mesurée soit pas dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter individuelle du phénotype étudié dans nos modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique dédié aux calculs de puissance statistique avec comme paramètre principal la mesure de la fonction rénale. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 620 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour les souris diabétiques il y a des mesures de raffinement supplémentaires, change plus régulier à cause de la polyurie, nombre réduit de souris par cages et bâton à ronger à cause des croquettes molles riches en gras. En dehors d'une courte période d’hébergement individuel limité à deux heures pendant une mesure, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière. L'administration orale aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, la prostration, l'hérissement du pelage. Administration : Il existe aussi un risque de saignement qui sera limité par l’utilisation d’aiguille fines et leur réalisation par du personnel expérimenté. L’anesthésie permet de limiter la douleur pour certaines administrations, qui seront suivies d’une application de gel ophtalmique pour limiter l’inconfort. Pour diminuer les risques de détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique liés à l’anesthésie, les souris seront placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce: modèles bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique , plus que dans d'autres espèces. possibilités de tester l'implication de la voie de signalisation de la protéine cible dans l'insuffisance rénale grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. Concernant le stade de développement: Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore des signes de vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.