Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de la pénétration et de la pathogénicité des auto-anticorps anti HMGCR et anti SRP dans un modèle murin de myopathies nécrosantes auto-immunes (souris SJL)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
Injectées chaque jour pendant sept jours avec des anticorps prélevés sur des malades, 55 souris subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a eu, lors de protocoles antérieurs, aucune répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en décrivant une échelle de gravité graduée jusqu'à la paralysie du train arrière, une évaluation quotidienne de la douleur par deux observateurs et un traitement analgésique préventif dès la veille de la première injection. Le muscle gastrocnémien est prélevé après une mesure de force réalisée sous anesthésie, ce qui exclut de garder les souris en vie.
Objectifs
Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante destruction des fibres musculaires sans inflammation. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) et la corrélation de leur quantité avec la destruction du muscle. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d’anticorps de malades. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’anticorps et de complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc. Cependant, aucune étude (in vitro ou in vivo) n'a démontré que les aAcs pénétraient dans les fibres musculaires et avaient un rôle direct sur leur cible intracellulaire. L'objectif général de notre programme est de déterminer si les aACs sont capables de pénétrer dans les fibres musculaires d'une souris (souche spécifique choisie car déficiente pour une molécule qui la rend plus susceptible de laisser pénétrer les anticorps) et d'évaluer la pathogénicité des anticorps sur leur cible. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la pénétration des anticorps dans les fibres musculaires permettrait de mettre à jour un nouveau mécanisme d'action des autoanticorps et de développer de nouvelles thérapies ciblées.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
Le prélèvement du muscle gastrocnémien (postérieurement à la mesure de la force in situ) pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis par un calcul de puissance de déterminer exactement les effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum (déterminé par une approcha statistique) en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologiques obervées lors de ces protocoles.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellose (cello dome) et des fibres de coton (Nestlets). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite (score 2) dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante : Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Une évaluation quotidienne de la douleur par deux personnes indépendantes sera également mise en place par une observation des changements des expressions faciales des animaux et l’apparition de signes comme le léchage et le grattage d’une zone douloureuse, l’automutilation, la déshydratation, l’agressivité, les yeux clos, les postures anormales (dos voussé…), l’activité réduite, la diminution du toilettage, la respiration anormale, ou encore la perte de poids (mesurée par pesée). Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place 24 heures avant la première injection d''anticorps pour les animaux de tous les lots par un analgésique sous forme de gélose, remplacée tous les jours, à raison de ¼ de gélose (de la taille d’un glaçon) par souris. Lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes sera atteint ou que le traitement préventif ne sera plus suffisant, un anti-inflammatoire sera administré par voie sous cutanée jusqu'à disparition de la douleur. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. De plus, lors de la mesure de la force musculaire in situ, un analgésique sera administré 30 minutes avant le début de l’intervention.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques ou largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Réponse électrophysiologique du tronc cérébral et du striatum ventral à la qualité et la quantité de protéines ingérées chez le rat anesthésié
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Mis à jeun quinze heures, puis anesthésiés pour une exploration chirurgicale de quatre heures, 192 rats reçoivent des perfusions de protéines animales et végétales directement dans l'intestin pendant qu'on enregistre l'activité de leurs neurones. Tous subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Parmi les effets indésirables prévus, le porteur ne retient que le stress du jeûne et la douleur des injections d'anesthésiques, sans mentionner l'ouverture chirurgicale elle-même. Les rats sont tués à la fin de l'enregistrement pour prélever leur cerveau et leur tube digestif, dans un projet présenté comme un appui à la transition alimentaire des êtres humains vers les protéines végétales.
Objectifs
Pour accompagner la transition alimentaire des êtres humains vers des régimes sains et durables, il faut comprendre les mécanismes qui président à la sélection et à la digestion des aliments. Les politiques de santé mondiale recommandent une transition alimentaire vers une consommation moindre de protéines et un rééquilibrage vers les protéines végétales. Au laboratoire, les rongeurs sont capables de distinguer les aliments sur la base de la quantité de protéines qu’ils contiennent, et adaptent leur alimentation en conséquence. Le nerf vague relie anatomiquement le tube digestif au cerveau. Il apporte au cerveau des informations sur la quantité et la qualité des aliments ingérés. Dans le système nerveux central, le tronc cérébral est le premier relai du nerf vague. L’objectif du projet est de mieux comprendre quelles informations relatives aux protéines ingérées le tronc cérébral reçoit par le nerf vague, et comment il les transforme. Pour y parvenir nous réaliserons des enregistrements de l’activité des neurones du tronc cérébral durant la perfusion intestinale de solutions de protéines animales et végétales chez le rat anesthésié. Si le tronc cérébral est capable de coder la quantité des aliments ingérés, en revanche ce sont d’autres structures du cerveau qui permettent de mieux qualifier ce qui a été ingéré : par exemple celles qui jouent un rôle dans l’apprentissage et la mémoire, dans l’évaluation du potentiel énergétique du repas, dans la récompense. Nous réaliserons des enregistrements de l’activité des neurones du striatum ventral pour rechercher et comparer la valeur positive de récompense de protéines animales et végétales. Dans le tronc cérébral et dans le striatum ventral, la transmission des informations nerveuses est modulée par la présence de substances chimiques, les neuromédiateurs. Nous chercherons à mettre en évidence le rôle de neuromédiateurs dans l’activité des neurones du tronc cérébral et dans celle des neurones du striatum ventral à l’aide de produits mimant (agonistes) ou bloquant (antagonistes) leurs effets. Dans l’ensemble le projet vise à fournir des preuves de l’activation du tronc cérébral et du striatum ventral par l’ingestion de protéines. Il proposera des molécules candidates à la modulation de cette activation nerveuse, une étape importante pour envisager des modèles de modification du comportement alimentaire, que ce soit dans le cadre de transition alimentaire ou de troubles du comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, la réduction de la consommation de protéines animales et un rééquilibrage en faveur des protéines végétales sont des messages largement diffusés pour des raisons environnementales et de santé. Les sociétés occidentales sont ainsi au début d’une réorientation des préférences alimentaires. Toutes les conséquences de ces réorientations ne sont pas élucidées notamment d’un point de vue de la physiologie et du comportement alimentaire. Il est donc nécessaire de les étudier en amont sur un modèle d’étude, le rat, dont la physiologie et le comportement alimentaire en relation avec la consommation des protéines est proche de l’Humain. En étudiant l’impact des apports protéiques chez le rat, ce projet permettra de fournir des données expérimentales solides pour anticiper les conséquences d’une transition alimentaire chez l’Humain et contribuer à l’établissement des recommandations pour la santé humaine notamment en termes de qualité et quantité des protéines ingérées. Le projet fournira des données de neurobiologie fondamentale sur les mécanismes par lesquels le système nerveux central détecte et intègre la nature et la quantité de protéines ingérées. Complété par des études comportementales menées chez le rat (un autre projet du laboratoire), il fournira un corpus de connaissances qui pourront être utilisées, en prenant en compte les différences physiologiques et comportementales, pour anticiper les conséquences d’une transition alimentaire chez l’Humain et contribuer à l’établissement des recommandations pour la santé humaine notamment en termes de qualité et quantité des protéines ingérées
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale d’exploration fonctionnelle, sous analgésie et anesthésie générales, après une mise à jeun de 15 heures. La procédure dure 4 h, et concerne tous les animaux. A l’issue de la procédure ils sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont le stress dû au jeun de 15 heures précédant l’anesthésie générale, les douleurs liées à l’administration de produits vétérinaires par injection d'analgésiques et d'anesthésiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte de différents tissus : le cerveau et le tube digestif.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier les signaux nerveux qui, partant du tube digestif, modulent la prise alimentaire chez un animal. Ces signaux déclenchent des réponses dans un réseau complexe de neurones répartis dans plusieurs structures. En plusieurs endroits leur action est modulée par les hormones digestives. L’emploi d’un modèle in vivo permet de conserver l’ensemble des structures mises en jeu par la stimulation du tube digestif. Ainsi les modèles in vitro (tranches de bulbe rachidien, de cerveau antérieur) ne gardent pas le lien anatomique et fonctionnel avec le tissu cible, dans notre cas le tube digestif. De plus le système hormonal intervient à plusieurs niveaux (tube digestif, complexe vagal dorsal, striatum ventral) pour moduler leur activité. Or aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions. Le modèle rat est bien établi et couramment employé par les laboratoires de référence dans ce domaine de recherches.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux par groupe a été calculé à 16 rats (8 mâles et 8 femelles) / groupe à partir de tests statistiques afin de garantir qu'avec ce nombre d'animaux les données soient interprétables.
Raffinement
A leur arrivée dans l'animalerie, les rats ont une période d'acclimatation de 7 jours à leur nouvel environnement. Notre projet n'incluant que la mesure de l'activité du cerveau sous anesthésie après chirurgie, les mesures que nous prenons pour prendre en charge ces aspects sont : maintien de la température corporelle en plaçant le rat sur un tapis chauffant, analgésie puis anesthésie générales, anesthésie locale des plans chirurgicaux, monitoring du rat durant toute la durée de l'exploration et réhydratation. La mise à mort est réalisée à la fin de l'exploration fonctionnelle sans réveil de l'animal. Des points limites seront mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le rat présente un tube digestif et un comportement alimentaire proches de ceux de l'Homme. Il fait plusieurs repas séparés et son goût et son attraction pour les protéines, sont comparables à ceux de l'Homme. Le rat est un modèle reconnu et utilisé par les laboratoires étudiant les mécanismes régulateurs du comportement alimentaire. Chez le rat, un régime riche en protéine provoque rapidement l'arrêt du repas, alors qu'un régime pauvre en protéines provoque un excès de consommation. Chez le rat, les aires du cerveau qui reçoivent des informations en provenance du tube digestif sont connues et dans ces aires, la présence de plusieurs substances chimiques, les neuromédiateurs, intervenant potentiellement dans le contrôle des informations digestives a été démontrée. La petite taille des rats facilite leur manipulation sans être un obstacle à la chirurgie. Les animaux employés sont des rats de 6 à 8 semaines. Cela correspond à un stade de jeune adulte. A ce stade de développement, les besoins en protéines des rats sont les plus élevés pour assurer leur croissance. Cette période cruciale est donc idéale pour étudier l'activité cérébrale en lien avec la consommation de protéines. Ce stade de développement correspond aussi aux populations humaines visées par les recommandations de santé publique, qui sont les adultes jeunes, représentant la cible privilégiée en termes d'apprentissage de l'alimentation, des transitions alimentaires et de troubles du comportement alimentaire.
La thérapie matricielle pour le traitement de la tauopathie tel que la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Issues d'un élevage interne, réparties en sous-groupes de quinze maintenus vivants deux, quatre, six puis huit mois avant d'être tués, 2 164 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue sept jours après la naissance, puis des injections ou des administrations orales deux fois par semaine pendant huit semaines, suivies d'analyses comportementales. L'objectif déclaré est de tester deux classes de molécules sur un modèle de tauopathie exprimant une protéine tau humaine mutée, en vue de premiers dossiers cliniques. Les souris nées du croisement sans le génotype menant à la tauopathie sont réaffectées à l'étude du devenir des molécules dans l'organisme, ce que le porteur présente comme une réduction du nombre d'animaux mis à mort.
Objectifs
Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (= tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, l’efficacité de la thérapie matricielle dans un modèle de tauopathie sera évaluée dans ce projet. De précédents travaux ont déjà montré qu’il était possible de diminuer le développement de la tauopathie en utilisant des mimétiques de certains sucre complexes dans des modèles de tauopathie qui miment certains aspects de la pathologie (modèles cellulaires et de poisson zèbre). Des résultats préliminaires chez la souris, obtenus dans des modèles de tauopathie et dans d’autres modèles de maladie neurodégénératives, ont également permis de montrer la capacité de ces molécules à protéger et régénérer les neurones atteint dans ces pathologies. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans notre modèle souris de tauopathie qui reproduit plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancés…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.
Bénéfices attendus
Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies auxquelles appartiennent la maladie d'Alzheimer et les démences fronto-temporale. Le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies nécessite d'explorer de nouvelles approches, les anciennes cibles n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de mieux caractériser l'effet de deux nouvelles classes de composés thérapeutiques sur les tauopathies et de définir la localisation cérébrale des meilleurs composés sélectionnés dans les procédures suites à leur administration chez la souris, afin de pouvoir initier les premiers dossiers cliniques.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de la queue 7 jours après leur naissance pour connaitre leur génotype. Les animaux seront pesés et recevrons des traitements deux fois par semaine pendant 8 semaines (injection de solution de molécule ou administration orale de solution de molécule). Ils seront ensuite soumis à la fin des traitements à des analyses comportementales.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont liés à la biopsie de la queue 7 jours après leur naissance, à l’élevage en captivité des animaux, la manipulation répétée des animaux et les injections de composés pendant plusieurs mois : contention pour les changes et les expériences de comportement, injections répétées dans le temps des composés (2 fois / semaines pendant 2 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifiée avec les molécules aux doses utilisés.
Devenir
Les animaux de l’ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.
Remplacement
Réglementairement parlant il n’est pas possible d’aller en clinique (ni même chez le primate non humain) avec uniquement des résultats cellulaires ou in silico. Les modèles de référence pré-clinique pour la tauopathie sont développés dans des espèces rongeur (souris, rat).
Réduction
Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par sous-groupe (n=15) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. L’évolution de la pathologie sera étudiée dans les régions du cerveau touchées dans la maladie d'Alzheimer. Ainsi, chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 15 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2, 4, 6 et 8 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 2 164 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux mis à mort, les animaux générés lors du croisement des lignées parentales ne possédant pas le génotype menant au développement de la tauopathie seront utilisés pour étudier le devenir des molécules chez la souris (concentration des molécules dans les régions touchées dans la maladie après administration de la molécule).
Raffinement
Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : est-ce que son poil est hérissé ? -Sa posture, sa démarche et comportement : est-ce que la souris a le dos voûté ? Léthargie ou réticence à se déplacer ? état défensif ? grattage ou morsure ? -On explore son environnement : absence de toilettage ? redressement sur ses pattes arrière ? diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée ? L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort. En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse. Pour information, les animaux sont utilisés avant l’apparition des phénotypes dommageables (c’est à dire avant l’âge de 8 mois). Pour information, aucune toxicité n’a été identifié avec les molécules aux doses maximales utilisées dans le projet.
Choix des espèces
Notre objectif est de valider l’intérêt de la thérapie matricielle dans un modèle mammifère de tauopathie afin de poursuivre le développement de ces molécules jusqu’en clinique. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 8 mois (mise à mort à 2, 4, 6, 8 mois), c'est à dire jusqu'à l'âge ou la tauopathie commence à se développer (2 mois) jusqu'au début de l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris "contrôle" de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Pour les études de pharmacocinétique, nous utiliserons des souris portant un fond génétique proche des souris mutées. Des souris de génotype sauvage générées par le croisement des lignées parentales, seront également utilisées afin de limiter le nombre de souris générées et mises à mort pour l'étude tout en conservant un modèle pertinent. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).
Evaluation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin de pathologie rythmique cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées portent une mutation du canal sodique cardiaque qui provoque des arythmies ventriculaires et, après quatre semaines, une forte mortalité. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des expérimentations sur cœur isolé. Chacune passe un électrocardiogramme de cinq minutes sous anesthésie à trois semaines, avec pose d'une bague à l'oreille et prélèvement du bout de la queue pour le génotypage. Le porteur présente la mise à mort à quatre semaines comme une mesure éthique, puisque les souris mutées peuvent au-delà mourir subitement d'arythmie ou développer une insuffisance cardiaque, atteintes qu'il déclare par ailleurs dans des procédures de gravité légère à modérée.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations du gène codant le canal sodique cardiaque. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG), marqueur d'une anomalie de l'activité électrique cardiaque, est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative, chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de 8 molécules sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients (souris SQTL). Ces molécules ont été sélectionnées in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal sodique cardiaque, en inhibant le courant sodique anormal induit par la mutation, et des canaux sodiques neuronaux, faiblement exprimés dans les cardiomyocytes mais contribuant au déclenchement des arythmies. En parallèle, les effets indésirables cardiaques potentiels des 8 molécules, en particulier sur la conduction électrique, seront déterminés sur des coeurs isolés de souris contrôles provenant des mêmes portées.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier un nouveau traitement de prévention des arythmies associées au SQTL de type 3.
Procédures
Au moment du sevrage, à l'âge de 3 semaines, un électrocardiogramme sera enregistré sous anesthésie générale pendant 5 minutes. A la fin de l'enregistrement, toujours sous anesthésie, l'identification des animaux sera réalisée par bagage d'une oreille et le bout de la queue des souris sera prélevé pour réaliser leur génotypage. Ces deux gestes durent moins d'une minute.
Impact sur les animaux
La mutation du canal sodique conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris SQTL qui conduisent, après l'âge de 4 semaines, à une forte mortalité. Les souris SQTL qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) deviennent adultes mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant la protéine déclenchant l'expression de la mutation sur une partie des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Les autres effets indésirables attendus sont le stress induit par la contention et l'anesthésie des souris par isoflurane pour l'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage, puis pour la mise à mort des animaux, ainsi que la douleur associée à la biopsie.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour les expérimentations ex vivo.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle ex vivo sur coeur isolé perfusé. Seule cette exploration peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant l'activité électrique cardiaque et en prévenant les arythmies, qui ne peuvent être obtenues sur un modèle cellulaire. Les peptides qui seront testés au cours de ce projet ont été sélectionnés pour leurs effets à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 14 souris STQL par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable, en particulier parce que toutes les souris ne présentent pas d'arythmie spontanée. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 3-4 souris SQTL par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 12 animaux. Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Un maximum de 10 souris contrôles par molécule nous semble suffisant pour tester les effets cardiaques indésirables potentiels, peu probables selon nos études in vitro, des molécules.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG, le bagage des souris et la biopsie de queue pour le génotypage seront réalisés sous anesthésie. La mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, après 4 semaines à une forte mortalité. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, le maintien de la lignée n'est pas réalisée avec des souris SQTL, mais en croisant deux lignées sans phénotype dommageable : l'une dont la mutation est intégrée dans le génome sans être exprimée et l'autre exprimant un gène permettant l'expression de la mutation chez environ 25% des souris résultant de ce croisement. De plus, cette étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès. Des points limites ont cependant été définis dans le cas, peu probable, d'une apparition précoce d'insuffisance cardiaque chez les souris SQTL, ainsi que pour les souris contrôles.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent tôt, avant l'âge adulte, ce qui est observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, les souris mutées peuvent mourir subitement par arythmie cardiaque ou développer une insuffisance cardiaque.
Potentiel thérapeutique de l’aérosolisation des nanoparticules d’apolipoprotéine A1 enrichies en alpha-1- antitrypsine chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Anesthésiées, suspendues par leurs incisives sur un panneau de plexiglas incliné à 45 degrés le temps d'une aérosolisation d'une minute : 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. L'installation de l'emphysème pulmonaire et la mesure des fonctions respiratoires sont classées en nuisance sévère, avec une évaluation du seuil de douleur au filament de von Frey et un arrêt de la procédure si une allodynie mécanique sous 0,3 g apparaît. Les nanoparticules lipidiques enrichies en alpha-1-antitrypsine sont inhalées pour établir une preuve de concept avant un éventuel essai clinique, une partie des souris étant transportée sur 80 kilomètres entre deux établissements. Le choix de l'espèce repose sur des souris privées du gène de l'alpha-1-antitrypsine, chez qui le porteur attend une destruction des alvéoles et une perte d'élasticité pulmonaire proches de l'emphysème humain.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (antiinflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.
Bénéfices attendus
Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticulesn lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.
Procédures
Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 3.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant. Enfin, si l’objectif 1 n’est pas validé, alors le projet s’arrêtera.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles,et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Développement Normal et Pathologique des Mélanocytes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour produire de nouveaux mélanomes chez la souris et y tester des molécules candidates, 4 833 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Des nouveau-nés reçoivent trois jours de suite une injection intra-gastrique d'un agent chimique déclenchant des mutations, d'autres souris reçoivent des cellules tumorales par voie sous-cutanée ou intraveineuse, d'autres encore se font implanter un fragment de tumeur sous la peau entre les omoplates, la plaie étant refermée par sutures ou agrafes. Le porteur décrit les tumeurs cutanées primaires comme n'engendrant "aucune douleur estimable" sauf ulcération, et réserve la douleur aux mélanomes métastatiques. Les expérimentations s'arrêtent à l'atteinte d'un point limite évalué par grille de score, la croissance tumorale étant suivie au pied à coulisse, par photographie ou par imagerie.
Objectifs
Les mélanocytes, cellules pigmentées de l’épiderme, synthétisent de la mélanine afin de protéger notre organisme des rayonnements ultra-violet (UV) du soleil. Mais quand ces mélanocytes sont endommagés, ils peuvent se transformer en mélanome. Le mélanome est le cancer de la peau le plus rare mais aussi le plus grave car plus susceptible d'envahir les tissus voisins et de se propager à d'autres parties du corps. La plupart des décès dus au cancer de la peau sont causés par le mélanome. Il existe actuellement deux types de thérapies principales (thérapie ciblée et immunothérapie) dans le traitement contre le mélanome, malheureusement les patients rechutent dans 30-50% des cas en raison du développement de résistance à leur traitement. Des connaissances générées à partir de biopsies de mélanomes humains, de lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de réaliser des tests in silico, in vitro et in cellulo. Notre équipe a identifié des mécanismes qui seraient impliqués dans l’initiation et la progression des mélanomes, ainsi que des molécules ciblant ces mécanismes Néanmoins, malgré des résultats intéressants, il est possible que les modèles cellulaires, même très sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les évènements qui se produisent lors de la transformation des mélanocytes en mélanome ainsi que lors du processus de résistance aux traitements. L'expérimentation dans des modèles de cancer chez la souris est maintenant nécessire pour tester le potentiel thérapeutique de ces molécules. L’objectif général de ce projet est de produire de nouveaux mélanomes murins afin de mieux comprendre ces mécanismes dans l’initiation et la progression tumorale et de tester ces molécules nouvellement identfiiées à potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Il y a encore 20 ans, les patients atteints de mélanome cutanés métastatiques mouraient rapidement après le diagnostic. Grâce à des approches combinées impliquant notamment la génétique, la signalisation cellulaire, ainsi que l’utilisation de modèles murins et de lignées de cellules de mélanomes, il est aujourd’hui possible de traiter un grand nombre de patients atteints de ce cancer. Bien que des progrès considérables aient été réalisés, notamment avec des traitements augmentant la survie à 5 ans, seule une faible proportion des patients bénéficie d’une guérison définitive. Ce succès limité s’explique par l’apparition des résistances d’origine génétique, épigénétique (processus modulant l’expression des gènes sans altérer la séquence d’ADN) et cellulaire. Il est donc indispensable de poursuivre ces recherches pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, identifier de nouvelles cibles thérapeutique et développer des approches innovantes permettant d’améliorer durablement le pronostic des patients. La première partie de cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de certaines gènes/protéines dans l’initiation des mélanomes à partir de mélanocytes, mais aussi leur rôle potentiel dans la progression des mélanomes et l’apparition de métastases. La seconde partie de l’étude se concentrera sur l’émergence de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les protéines étudiées dans la première partie de l’étude lors des différents processus, de l’initiation à la progression des mélanomes.
Procédures
Un lot d’animaux sera traité à la naissance par injection intra-gastrique 3 jours consécutifs (J1-J2-J3) par un agent chimique permettant l’expression de mutations spécifiques. Un autre lot d’animaux sera injecté avec de nouvelles molécules (la voie et la fréquence d’injection seront déterminées en fonction de la molécule) afin de déterminer la dose à utiliser en traitement Dans un autre lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées en sous-cutanées ou en intra-veineuse aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente). Pour certains de ces animaux, un suivi par imagerie sera réalisé afin de suivre la croissance tumorale interne. Pour cela, un marqueur sera injecté aux souris puis elles seront endormies par anesthésie gazeuse et placé dans l’imageur. Cela est réalisé une à deux fois par semaine. Dans un autre lot d’animaux, des fragments de tumeurs seront implantés aux souris. Le plan cutané des animaux sera ouvert sous anesthésie gazeuse et analgésie, puis le fragment sera positionné entre les omoplates et le plan cutané sera refermé soit par sutures soit à l’aide d’agrafes. Les animaux seront ensuite traités par les nouvelles molécules (voie et fréquence d’administration déterminées lors de l’expérience précédente).
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement modifiés développeront des mélanomes cutanés pouvant provoquer des irritations. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (douleur légère de courte durée). Suite à l’injection du de traitement, un retard de croissance peut être observé le premier mois de vie qui est compensé très rapidement sans séquelle. Les animaux greffés avec des cellules tumorales/ou des fragments de tumeurs par chirurgie développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de la chirurgie sont celles liées à l’ouverture du plan cutané (douleur de faible intensité). Aucune douleur de l’animal n’est observée lorsque le renouvellement des mélanocytes n’a pas lieu ; les souris deviennent blanches et ne subissent aucun ostracisme de la part de leurs congènères. Les seules douleurs qui sont possibles peuvent avoir lieu lorsque les souris développent des mélanomes métastatiques. Les tumeurs cutanées primaires n’engendrent pas de douleur estimable sauf éventuellement en cas d’ulcérations.
Devenir
A la fin de chaque expérience, les souris sont mises à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les connaissances générées à partir des biopsies de mélanomes humains, à partir des lignées de mélanomes humains et de mélanocytes humains, nous permettent de tester in silico (modèles informatiques), in vitro et in cellulo (modèles cellulaires) les modifications au niveau des protéines et du fonctionnement des cellules ainsi que le métabolisme de ces cellules. L’utilisation de systèmes plus complexes mimant des stuctures en 3D constituées de cellules (systèmes 3D, sphéroïdes (cellules cultivées en suspension sous forme de sphère) ou peaux reconstituées) nous permet de mieux appréhender l’importance de certaines protéines ou de certaines mutations dans les processus sus-cités. Bien que les modèles cellulaires soient utilisés majoritairement comme paradigme pour étudier ces processus, il est possible que les modèles cellulaires, même sophistiqués, ne reproduisent pas entièrement les événements qui se produisent lors du développement embryonnaire, lors du renouvellement des mélanocytes, lors de la transformation des mélanocytes en mélanome. De plus, la recherche systématique de traitement contre le mélanome a révélé que l’hétérogénéité cellulaire au sein d’un mélanome engendre des résistances génétiques et épigénétiques qui ne sont pas reproductibles in vitro. En conséquence, l’utilisation de modèle physiologique sophistiqué proposé uniquement aujourd’hui le modèle mammifère est obligatoire dans un but cognitif et thérapeutique.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des souris qui présentent un bagage génétique identique et l’ensemble de nos souris mutés le sont pour un gène donné sur un fonds génétique connu. La conséquence est que la variabilité d’individu est réduite, et en conséquence nous avons besoin de moins d’animaux. Nous optimiserons les accouplements en utilisant dès que cela est possible des croisements avec des souris présentant des mutations à l’état homozygote afin de réduire le nombre de souris produites. L’étude ne se fera qu’avec des molécules qui auront été validées in vitro avant tout test sur animaux. Nous utiliserons un suivi d’imagerie longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser.
Raffinement
En cas de retard de croissance pour les nouveaux-nés génétiquement modifiés, injectés avec des traitements, nous introduirons dans la cage des aliments gélifiés et hyper calorique afin d’augmenter les apports caloriques pour ces petits. Nous raffinerons les mutations en ciblant uniquement les cellules d’intérêt sans affecter les autres cellules de l’organisme. Les souris sont suivies régulièrement afin d’assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées dès l’atteinte d’un point-limite(mise en place d’une grille de score) Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec utilisation d’analgésiques. Nous ajouterons dans la cage post-chirurgie des aliments gélifiés et de petites croquettes dans le fond de la cage afin que la souris n’ait pas à se redresser pour se nourrir et s’hydrater. Les animaux seront suivis trois fois par semaine à quotidiennement. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas d’atteinte d’un point-limite. Nous suivrons le devenir de la tumeur primaire ou des métastases en utilisant régulièrement (en fonction) un pied à coulisse, un appareil photo ou l'imagerie.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris car il s’agit de l’espèce de choix pour les expériences menées en cancérogénèse et de recherche en thérapeutique du cancer. De plus, la souris est un modèle reconnu pour étudier la robe chez les mammifères. Ce modèle animal nous permet (i) de générer des mutations spécifiques, conditionnelles ou non, dans le lignage mélanocytaire, (ii) de contrôler au mieux le la présence de mutation génétique ce qui permet de réduire le nombre d’animaux car la variablité entre individus est plus faible. Nouveau-né et adulte, développement de tumeurs chez l’animal adulte @ Nous prendrons des nouveaux-nés lorsque nous les induirons à l’aide d’un agent chimique. L’induction est réalisée à la naissance avant la formation des poils, et les mélanocytes sont sensibles à cet agent chimique. @ Nous suivrons l’apparition des tumeurs au cours du temps chez l’adulte.
Propagation de l’information sonore le long des voies auditives chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Gerbilles de Mongolie : 630
Opérés de l'oreille ou du cerveau pendant une à quatre heures, maintenus la tête fixée deux à quatre heures pour enregistrer leur activité cérébrale, ou exposés une fois à 100 décibels pendant deux heures, 1 710 souris et 630 gerbilles de Mongolie vont être utilisés dans des procédures allant de la chirurgie sans réveil aux atteintes modérées. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'un animal transgénique, injecté d'un vecteur viral ou porteur d'un implant ne peut être ni réutilisé ni placé. L'objectif déclaré est de décrire la transformation des vibrations sonores en activité du nerf auditif et de tester un implant cochléaire à stimulation optique. La perte auditive provoquée par l'exposition sonore est présentée comme légère et réversible en une semaine, "ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans".
Objectifs
Répondre à certaines interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore le long des voies auditives. : a)Au niveau périphérique, la cochlée traite les informations sonores avant même que le cerveau n’entre en action. Le premier objectif est d'obtenir une description précise de la transformation des vibrations sonores en activité électrique du nerf auditif. Au-delà de son intérêt pour la recherche fondamentale, cette approche sera importante pour améliorer les aides auditives et les implants cochléaires actuels et développer de nouvelles stratégies de stimulation. b)Un son peut être entièrement caractérisé par sa fréquence et son intensité. Cependant, au niveau perceptif ces 2 dimensions interagissent (un son fort parait plus aigu par exemple). Cette interaction apparait dès la cochlée, c’est-à-dire au niveau le plus précoce du traitement de l’information sonore. Afin de pouvoir contrôler précisément l’information envoyée par la cochlée au cerveau, nous allons développer une méthode de stimulation optique du système auditif périphérique. Ceci nous permettra de déterminer qu’elle est l’information nécessaire et suffisante pour identifier les sons. c)Au niveau du circuit auditif, l’information auditive est relayée à différents noyaux avant d’atteindre le centre auditif. De façon remarquable, certaines informations comme l’information fréquentielle est propagée le long des voies auditives grâce au contrôle précis de la connectivité entre les différents noyaux. Ici, nous utiliserons des approches de marquage de certains types cellulaires afin de caractériser finement les connexions neuronales le long réseau auditif. d)Au niveau central, les 2 hémisphères du cerveau traitent les informations fréquentielles et temporelles différemment. Chez l’humain, la latéralisation du traitement du langage en constitue un exemple qui a été amplement décrit. Notre objectif est ici de tester l’hypothèse que le centre auditif gauche répond de manière sélective aux attributs temporels de vocalisations conspécifiques, alors que le centre auditif droit répond préférentiellement aux attributs de fréquence. 2)Proposer un nouveau type de traitement de surdités profondes en déterminant les avantages et les inconvénients d’un nouveau type d’implant basé sur la stimulation optique de la cochlée. Nous réaliserons dans ce projet nos expériences sur le rongeur mais transféré à l’humain.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de répondre à des interrogations scientifiques concernant le traitement de l’information sonore à la fois au niveau périphérie (oreille interne) et au niveau central (voies auditives). Il permettra de caractériser finement comment les sons complexes sont analysé par le système auditif et quel est le réseau neuronal qui permet à l’information sonore de se propager efficacement le long des voies auditives. A la fin du projet, nous aurons une meilleure compréhension de ces phénomènes fondamentaux de codage de l’information sensorielle et du circuit neuronal permettant de véhiculer efficacement l’information auditive.
Procédures
Certains animaux seront soumis à 1 ou 2 des interventions chirurgicales de l’oreille ou du cerveau, sous anesthésie générale et durant de 1 à 4 heures. Les animaux transgéniques seront génotypés afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, un prélèvement à l’oreille sera fait au moment du sevrage. L’intervention est brève (1 minute par animal) et ponctuelle (le prélèvement ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la durée de vie de l’animal). Certains animaux seront maintenus en contention pendant 2-4 heures pour mesurer leur activité cérébrale sur animal éveillé en réponse à des stimuli auditifs. Chaque animal effectuera 5-8 séances d’habituation qui seront suivies par au maximum 5 séances d’expérimentation. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures.
Impact sur les animaux
L’injection de vecteurs viraux (chez le nouveau-né ou chez l’animal adulte) nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 30 minutes chez le nouveau-né et jusqu’à 2 heures chez l’adulte. Cela peut donner lieu à des douleurs contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire de courte durée. L’implantation chirurgicale d’implant cochléaire ou de fenêtre crânienne chez l’animal adulte nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 3 heures. Cela peut donner lieu à des douleurs modérées contrôlées par un traitement antalgique et à une sensibilité post-opératoire pendant une semaine. Les séances d’enregistrements de l’activité cérébrale sur animal éveillé nécessitent une contention par fixation de tête. Ceci est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin que l’animal se familiarise avec l’expérimentateur et l’environnement et pour pouvoir réaliser des séances d’enregistrement d’une durée de 3 heures, une période d’habituation progressive sera mise en place. A la fin de cette période, un maximum de 5 séances en contention avec un minimum de deux jours de repos entre séances consécutives seront réalisées. Pour étudier l’effet de pertes auditives sur la façon de percevoir les sons, certains animaux subiront une exposition sonore unique à 100 décibels pendant 2 heures. Ceci génèrera une perte auditive légère (environ 30 décibels, ce qui correspond à la perte auditive usuelle de personnes âgées de 60 ans) qui sera réversible et durera environ 1 semaine.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés pour au moins l’une des raisons suivantes : - Nous utiliserons certains animaux pour le prélèvement d’organes. - Certaines chirurgies seront sans réveil. - Nous utiliserons des animaux transgéniques ou subissant une injection de vecteur viral ou étant appareil avec un implant, lesquels ne peuvent pas être réutilisés ou placé.
Remplacement
L’organe auditif est le fruit de millions d’années d’évolution et il n’est pas possible de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux qui permettraient de reproduire le circuit auditif. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement naturel du système. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative pour remplacer l’expérimentation animale par des expériences purement in vitro ou in silico car nous avons besoin d’étudier le système auditif périphérique dans son ensemble. Afin de comprendre le fonctionnement cochléaire sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme la souris ou la gerbille chez qui l’architecture du système auditif périphérique (la cochlée) est similaire à celle de l’Homme. Notre stratégie expérimentale implique l’expression de protéines exogènes dans la cochlée ou le cerveau de la souris ou de la gerbille. Ceci est permis grâce aux outils génétiques dont nous disposons. La production de ces protéines nécessite un organisme vivant.
Réduction
Ce projet impliquera sur une durée de 5 ans un total de 1710 souris et de 630 gerbilles qui entreront dans des procédures sans réveil, légères ou modérées. Des méthodes d’analyse statistique ont été utilisées afin de déterminer la taille optimale des groupes expérimentaux pour répondre aux questions scientifiques posées. Ce chiffre a été estimé avec l’aide d’une équipe de biostatisticiens afin de calculer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les animaux transgéniques seront systématiquement génotypés pour garder uniquement les génotypes souhaitables. Des expériences pilotes sur un nombre réduit d’animaux seront réalisées afin d’éviter des pertes dues aux difficultés techniques. Toutes les procédures utiliseront mâles ou femelles confondus. Cependant, si un des sexes ne s’engage pas de la même façon dans les tests comportementaux, nous privilégierons le sexe le plus réceptif aux tâches comportementales. L’utilisation de nouvelles technologies d’enregistrement neuronal à haute densité permettant d’enregistrer en parallèle plusieurs dizaines de neurones à partir de différentes zones d’intérêt signifie que la quantité de données obtenue par séance d’enregistrement sera maximisée. Dans le cas d’enregistrements sur animal éveillé, la réutilisation de chaque animal pour plusieurs séances d’enregistrement augmentera encore davantage la taille de l’échantillon de neurones obtenues par animal et contribuera à réduire le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données statistiquement robustes.
Raffinement
Les animaux impliqués dans le projet seront suivis régulièrement et seront anesthésiés, lorsque c’est nécessaire, pour éviter toute forme de souffrance. Des traitements analgésiques et antalgiques seront mis en œuvre et adaptés à l’âge des animaux en préopératoire et postopératoire pour obtenir une analgésie idéale pour chaque procédure. Après la chirurgie, les animaux bénéficieront d’un chauffage de la cage et d’un gel hydrique spécialisé. La plaie sera examinée tous les jours pendant une semaine pour repérer des signes d’infection ou toute autre anomalie physique, comportementale ou développementale (chez le nouveau-né). Un traitement analgésique post-opératoire sera observé pour réduire ces effets indésirables à leur minimum. Une perte de poids dans les premiers jours suivant la chirurgie peut se manifester. La pesée régulière des animaux au cours de la première semaine post-opératoire permettra de surveiller que cette perte reste transitoire et ne dépasse pas les 15% du poids initial de l’animal. Dans de très rares cas, des infections au niveau de l’implant ou de la fenêtre crânienne peuvent survenir. Si l’infection persiste malgré un traitement antibiotique, l’animal sera mis à mort. La contention par fixation de tête est susceptible de générer du stress et de l’anxiété chez les animaux. Afin de réduire ce stress autant que possible, des séances de maniement permettront aux animaux de se familiariser avec l’expérimentateur. De plus, l’habituation à la fixation de tête se fera de façon progressive sur plusieurs séances, tout en prenant en compte la vitesse de progression de chaque animal individuellement. Les expériences comportementales auront lieu dans les cages d’hébergement et sans restriction hydrique. Comme les souris sont hébergées dans ce dispositif expérimental, elles ne seront pas effrayées par un nouvel environnement et pourront réaliser la tâche selon leur volonté. L’état général de santé des souris et des gerbilles sera caractérisé par un score d’état corporel qui prend en compte différent facteur (perte de poids, changement de posture, yeux plissés, manque de toilettage etc.) et qui nous permettra d’évaluer l’état de l’animal tout au long de la procédure et de déterminer des points limites spécifiques et précoces. En fin de procédure ou si nous observions un comportement anormal l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Afin de comprendre le fonctionnement périphérique et central du traitement de l’information sonore sur un modèle réaliste, il est important d’utiliser des animaux comme les rongeurs chez qui l’architecture du système auditif est similaire à celle de l’Homme. En effet, la cochlée est seulement présente chez les mammifères. Au niveau cérébral, les différents centres neuronaux du traitement auditif sont largement conservés et chaque noyau possède son homologue chez l’espèce humaine. Il est également démontré que la souris et la gerbille possèdent un répertoire considérable de vocalisations qui peuvent servir de modèle au langage humain. La souris étant parmi les espèces le plus couramment utilisés en biologie, il existe de nombreux modèles de surdité génétique ayant un équivalent chez l’Homme. La gerbille présente l’avantage par rapport à la souris d’être sensible à une gamme de fréquences très proche de l’humain et représente donc une étape importante pour en vue d’applications translationnelles. Dans le cas d’injection virale pour exprimer les molécules d’intérêt dans les cellules de l’oreille interne, l’administration est plus efficace à un stade précoce du développement. Nous utiliserons des animaux juvéniles (de 1 à 3 jours) qui seront ensuite soit mis à mort pour en extraire les tissus soit soumis à l’expérimentation électrophysiologique ou comportementale à l’âge adulte. Ensuite, chaque procédure du projet impliquera des animaux à un stade de développement où le système auditif périphérique et central est totalement mature (>6 semaines). Cependant, les souris qui sont largement utilisées en laboratoire commencent à présenter des pertes auditives à partir de 15 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des souris plutôt jeunes (6 à 10 semaines) pour les expériences d’exploration de la fonction auditive. Les expériences comportementales durent plus longtemps et seront réalisées sur des souris entre 4 et 14 semaines. Les expériences sur les gerbilles seront réalisées à des âges identiques car les trajectoires de développement sont similaires.
Contrôle de la régression tumorale à long terme par les lymphocytes T antiviraux modifiés génétiquement
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, puis d'un traitement cellulaire, prélevées de sang sept fois et passées sept fois sous imagerie sous anesthésie de quarante minutes, 36 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La leucémie qui s'installe se traduit par des poils hérissés, une baisse d'activité, une perte de poids et, dans les cas extrêmes, un début de paralysie des pattes arrière, auxquels peuvent s'ajouter des signes de maladie du greffon contre l'hôte avec lésions cutanées et diarrhées. L'objectif déclaré est de comparer un nouveau type de lymphocyte anticancéreux issu de donneurs sains au traitement de référence, sur un suivi porté à 56 jours. Aucune souris n'est gardée au-delà de ces 56 jours, ni au-delà du point limite atteint.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse à partir des cellules du patient modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses (appelées CAR-T cells) permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells. Après avoir montré que les cellules issues d’un seul donneur sont aussi efficaces que le traitement actuel, nous devons reproduire ces résultats sur des cellules provenant de deux autres donneurs, et assurer un suivi d’efficacité plus long, jusqu’à 56 jours
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer avec certitude si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique reproductible et comparable au traitement de référence par CAR-T cells, et plus long, afin de permettre la mise au point de traitements efficaces à long terme.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 Imageries sous anesthésie (40min)
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction. - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Dans les semaines qui suivent l’injection des cellules d’intérêts (CAR T cells ou CAR VST), les souris peuvent présenter des signes de maladie de greffon contre l’hôte, caractérisés par une perte de poids, une altération de la fourrure avec lésions cutanées, un mal-être et des diarrhées. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, sous contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 56 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour valider lepotentiel anti-leucémique des cellules issues de donneur sains de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés de façon à obtenir des effets significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Nos précédents travaux nous ont permis de déterminer ce nombre via l’utilisation d’un logiciel appliqué.
Raffinement
Les souris seront logées dans de grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien ventilée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Offre de prestation pour évaluer les candidats médicaments : étude de l’audition et de la réponse immunitaire sur des modèles pathologiques inflammatoires chez la souris
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
L'évaluation de candidats médicaments pour des clients extérieurs est ici vendue comme une prestation. 5 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour la collecte des tissus. Elles reçoivent des composés pro-inflammatoires, parfois directement dans l'oreille sous anesthésie, puis des candidats médicaments jusqu'à sept jours de suite, avec une mesure de l'audition sous anesthésie générale de deux heures chaque semaine. Le porteur attend des gonflements articulaires, des boiteries, une altération de l'état général à partir du troisième jour et une perte d'audition moyenne, et qualifie le recours aux animaux non-humains d'"indispensable" faute de méthode validée pour reproduire une inflammation systémique. La prestation est adossée à une thèse financée par un contrat industriel, qui doit aboutir à au moins une publication.
Objectifs
Les maladies auto-immunes touchent environ 4% de la population. Ces maladies se produisent lorsque le système immunitaire du corps attaque par erreur ses propres tissus sains. Parmi ces maladies, la polyarthrite rhumatoïde est particulièrement répandue. Elle provoque principalement une inflammation des articulations, mais peut aussi affecter d'autres parties du corps, y compris l'audition. Des études récentes ont montré que les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde ont un risque plus élevé de souffrir de perte auditive que la population générale. Cette perte d'audition peut toucher jusqu'à 40% des patients, ce qui en fait un problème de santé important mais souvent négligé. L'inflammation générale du corps causée par la polyarthrite rhumatoïde pourrait être responsable de ces problèmes auditifs. Elle pourrait affecter les vaisseaux sanguins et le fonctionnement de l'oreille interne. De plus, certains médicaments utilisés pour traiter la polyarthrite rhumatoïde peuvent avoir des effets négatifs sur l'audition. Pour mieux comprendre ce lien entre inflammation et perte auditive, les chercheurs utilisent des modèles animaux. Ces modèles permettent d'étudier comment l'inflammation affecte l'oreille et l'audition. Ils montrent que l'inflammation peut endommager les cellules de l'oreille interne responsables de la perception des sons. Comprendre cette relation entre la polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive pourrait aider à améliorer la qualité de vie des patients. Cela pourrait conduire à de meilleurs traitements et à une prise en charge plus complète de la santé des personnes atteintes de maladies auto-immunes.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant les maladies inflammatoires et la perte auditive. Ces connaissances pourraient guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter efficacement ces troubles, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les impacts sur le système de santé. Une thèse CIFRE vient de débuter afin de mettre au point les 2 premiers modèles décrits dans ce projet et pourra aboutir à au moins 1 publication dans un journal international.
Procédures
L'administration de composés à tester ou de produits de référence suivent les bonnes pratiques vétérinaires et sont des gestes nécessitant quelques dizaines de secondes à moins de 5 minutes. Les composés pro-inflammatoires seront administrés 1 à 3 fois dans l'étude, sur animal anesthésié lorsque l'administration est réalisée directement dans l'oreille (phase de 30 minutes maximum), et sur animal vigile lorsqu'il s'agit des autres voies d'administration. Les candidats médicaments seront administrés tous les jours, au maximum pendant 7 jours, directement dans l'oreille (animal anesthésié, au maximum 30 minutes) ou par voie orale (animal vigile) La mesure de l'audition sera réalisée sous anesthésie générale (2 h) 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables incluent des douleurs, des gonflements des articulations pouvant se traduire par des boiteries, des difficultés locomotrices et une altération de l’état général des animaux à partir du 3ème jour après l’injection et le temps de la durée de l’étude. Une perte d’audition moyenne est attendue.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car la collecte des différents tissus pour analyse histologique requiert l’euthanasie des animaux.
Remplacement
Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complémentaires mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux. Dans ce but, nous envisageons, en collaboration avec notre partenaire, le développement d’organoïdes lymphoïdes (des modèles in vitro de culture cellulaire complexes) pour approfondir l’étude des mécanismes immunitaires liés au processus d’induction d’auto-immunité. Toutefois les composés qui rentrent en phase de test in vivo ont préalablement démontré une activité pharmacologique intéressante pour le traitement de maladies inflammatoires Le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthode alternative validée pour mimer l’inflammation systémique Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction d’une inflammation systémique et ces effets sur la perte auditive, afin de développer à terme, des nouvelles thérapies pour traiter ces pertes d’auditions. Ceci nécessite des modèles expérimentaux dotés d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique afin de progresser dans cette perspective les expérimentations animales sont indispensables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour assurer que les résultats soient statistiquement significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En ce qui concerne les modèles de polyarthrite rhumatoïde, le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrite chez la souris et le degré de variabilité expérimentale liée à la magnitude de la réponse immunitaire. En ce qui concerne les autres modèles inflammatoires, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé sur la base d’études publiées dans la bibliographie et le degré de variabilité expérimentale liée à la réponse immunitaire.
Raffinement
Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvement, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique aux rongeurs mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. De l’aliment (gel Diet) sera mis sur le sol des cages après l’administration des composés si nécessaire afin de faciliter l’accès à la nourriture. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15 minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants et un gel oculaire est appliqué. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquelles des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet. Le choix de la souche est justifié par leur système immunitaire compétent et pour leur susceptibilité à développer les modèles inflammatoires d’intérêt. Ces souches de souris sont aussi adaptées pour le suivi des mesures de leurs capacités auditives. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte.
Investigation du mécanisme d’action d’une approche de thérapie cellulaire chez la souris âgée
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
864 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, dont 480 irradiées pour préparer une greffe, 64 soumises à une chimiothérapie de conditionnement et 160 nouveau-nés transplantés dès la naissance, 128 d'entre eux recevant une seconde transplantation neuf à douze mois plus tard. Une irradiation de moins de cinq minutes, que le porteur qualifie de "rapide et non douloureuse", précède la greffe, alors qu'il attend par ailleurs un amaigrissement et une anémie liés au conditionnement. Les animaux âgés de neuf à douze mois sont retenus parce que leur thymus vieilli ressemble à celui de patients humains conditionnés pour une greffe de moelle osseuse. Toutes sont tuées pour le prélèvement de la moelle osseuse, de la rate et du thymus, à l'appui de bénéfices annoncés en termes d'essais cliniques et d'économies pour les systèmes de santé.
Objectifs
La greffe de cellules souches du sang, appelées aussi cellules souches hématopoïétiques (CSH), est le traitement de référence pour de nombreuses maladies du sang, malignes (comme les leucémies ou les lymphomes) et non malignes (incluant les déficits immunitaires, en particulier chez les enfants). Cependant, la maladie du greffon contre l'hôte, les infections et les rechutes sont des obstacles majeurs au succès de cette thérapie. Certains de ces obstacles sont liés à une lente reconstitution du système immunitaire après la greffe de CSH. Dans ce contexte, une nouvelle stratégie thérapeutique a été développé pour améliorer la régénération immunitaire lors des greffes de CSH et augmenter la chance de survie des patients greffés. Cette stratégie repose sur la production in vitro de progéniteurs lymphoïdes et leur greffe, pour favoriser une production rapide de cellules immunitaires. Par rapport à la transplantation de CSH, la transplantation des progéniteurs lymphoïdes à des souris immunodéficientes nouveau-nées conduit à une régénération plus rapide des cellules du système immunitaire qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes et les cellules cancéreuses. Les progéniteurs lymphoïdes transplantés sont immatures, une caractéristique qui confère une grande sécurité à ce produit en termes de risque de maladie du greffon contre l’hôte. Toutes ces caractéristiques soulignent un fort potentiel d’applications cliniques pour accélérer la reconstitution immunitaire et surmonter les complications post-transplantation. Nos objectifs de recherche du projet proposé sont de tester ces progéniteurs T produits in vitro pour leur capacité à régénérer les lymphocytes T de patients âgés. En effet, avec l’âge, le thymus, organe jouant un rôle central dans la production des lymphocytes T, fonctionne moins bien ce qui complique la reconstruction du système immunitaire. De précédentes études expérimentales ont suggéré que l’ajout de progéniteurs lymphoïdes lors de la transplantation de CSH améliorerait le fonctionnement du thymus. Ce processus encore mal compris nécessite une investigation approfondie pour en optimiser les effets dans le cadre de futures applications thérapeutiques de ces progéniteurs chez les personnes âgées. Cela passe par une meilleure compréhension des mécanismes de vieillissement et par l'amélioration du système immunitaire après la greffe, dans le but d'augmenter les chances de survie des patients.
Bénéfices attendus
Le projet actuel présente des bénéfices potentiels significatifs, tant à court qu'à long terme. Tout d'abord, les résultats attendus permettront d’approfondir la connaissance du produit de thérapie cellulaire à base de progéniteurs lymphoïdes T. Ce projet permettra d'éclaircir son mode d'action chez les individus âgés, d'affiner ses caractéristiques de qualité et d'évaluer son efficacité au-delà de la simple reconstitution des lymphocytes T. Ces découvertes pourraient déboucher sur de nouveaux essais cliniques ou sur l'optimisation des essais en cours, favorisant ainsi des avancées thérapeutiques. En outre, ce projet ouvre la voie à l'élargissement des applications thérapeutiques du produit, initialement conçu pour traiter l'immunodéficience combinée sévère chez les enfants. Les progéniteurs lymphoïdes pourraient également bénéficier à d'autres groupes de patients, notamment ceux dont la fonction thymique est diminuée, que ce soit en raison du vieillissement, du VIH/SIDA ou de l'exposition aux radiations ionisantes. Cela pourrait aboutir à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces populations vulnérables. Enfin, d'un point de vue sociétal et économique, les progéniteurs lymphoïdes pourraient réduire les hospitalisations post-greffe de cellules souches hématopoïétiques et diminuer les risques de rechutes, entraînant ainsi des économies substantielles pour les patients et les systèmes de santé. Ces bénéfices contribueront non seulement à l'amélioration des traitements actuels, mais aussi à la réduction des coûts de santé à l'échelle globale. Ce projet vise également à approfondir notre compréhension des processus de vieillissement, de dégénérescence et de régénération du thymus, organe essentiel pour la production de cellules du système immunitaire. Il propose notamment d'identifier des molécules capables d'influencer le vieillissement immunitaire et les altérations du thymus. Une connaissance fine des mécanismes permettrait une régénération de l'architecture thymique dégradée avec l’âge et faciliter une greffe plus efficace des progéniteurs lymphoïdes et une meilleure reconstitution des cellules immunitaires.
Procédures
480 animaux vigiles seront conditionnés à la greffe par une irradiation d'une durée inférieure à 5 minutes. Ce procédé est rapide et non douloureux. 64 animaux vigiles recevront une chimiothérapie de conditionnement pour la greffe, chaque traitement durant environ 1 minute/animal. 96 animaux, sous anesthésie gazeuse, recevront des molécules de régénération du thymus d’une durée de 1 minute/traitement et un seul traitement/animal. 96 animaux vigiles recevront en vigile différentes molécules de conditionnement/régénération du thymus chaque jour pendant 15 jours, chaque traitement durant 1 minute/animal. 704 animaux sous anesthésie gazeuse seront transplantés avec des cellules souches/progénitrices, durée de l’action 1 minute/animal. 160 animaux nouveau-nés vigiles recevront une transplantation de cellules (1 minute/animal). 128 d’entre eux recevront sous anesthésie une seconde transplantation, 9 à 12 mois plus tard, chaque action durant 1 minute, une seule action/animal. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront un prélèvement sanguin juste avant leur euthanasie. 160 animaux sous anesthésie gazeuse subiront deux prélèvements sanguins au cours de leur suivi, à au moins 5 mois d’intervalle. Chaque prélèvement sanguin dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les conditionnements à la greffe (chimiothérapie ou irradiation), nécessaires pour préparer l’organisme à recevoir une greffe de CSH et mimer ainsi les conditions des patients humains, peuvent occasionner chez la souris des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress transitoire. Le traitement par voie orale peut provoquer un stress, une douleur, et une légère irritation au niveau de l’œsophage chez l’animal surtout lors des traitements en continu. L’anesthésie gazeuse générale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux.
Devenir
Afin de mesurer la production des cellules lymphoïdes T humaines après injection, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (Moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou non de l’injection effectuée.
Remplacement
Ce projet n'a pas d'alternative non animale. L’utilisation d’un modèle préclinique in vivo capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’Homme est indispensable pour évaluer et comprendre les effets de la greffe de progéniteurs lymphoïdes sur la reconstitution du système immunitaire. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine
Réduction
Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Toutes les souris sont hébergées en portoir à cages ventilées dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12h/12h. Chaque cage est indépendante des autres, l’air entrant est filtré et l’eau utilisé est filtrée, et donc constitue une entité séparée. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires chez les animaux greffés. Toute irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. Les greffes seront précédées par une anesthésie générale. Lors des greffes chez le nouveau-né, l’expérimentateur transfère l’odeur de la cage sur ses gants en le frottant sur la litière pour ne pas risquer une réaction négative de la mère par rapport à ses petits. En outre, les mères sont isolées durant les greffes afin de diminuer leur stress durant la manipulation des petits. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l’euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunodéficientes qui reproduisent de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l’Homme. Le déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines normales et offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules humaines in vivo. Nous utiliserons les souris âgées entre 9 et 12 mois. Le thymus des souris immunodéficientes âgées ressemble à celui des patients humains atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une transplantation de moelle osseuse. De nombreuses données sur l’étude de la différenciation des lymphocytes T humains chez ces souris sont disponibles, ce qui nous permettra d’évaluer l’efficacité des progéniteurs lymphoïdes produits par nos équipes dans un environnement similaire à celui des patients. Nous utiliserons aussi les animaux nouveau-nés pour humaniser leur système hématopoïétique sans passer par l’irradiation.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique dans des modèles de neuropathies douloureuses chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 844
1 170 souris et 844 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement de nerfs et de cerveaux. Trois chirurgies sont prévues : l'injection d'un candidat médicament directement dans le nerf sciatique ou facial, la ligature de ce nerf, puis sa ligature ou sa section pour installer une neuropathie traumatique. S'y ajoutent une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie et des tests comportementaux hebdomadaires, sur des animaux chez qui le porteur attend des douleurs neuropathiques, une mobilité réduite et, dans certains groupes, une obésité et une hyperglycémie sur six à dix semaines. Il annonce des essais chez l'être humain entre 2027 et 2029 et conclut que l'expérimentation animale reste "le seul véritable moyen" d'aborder ces maladies du nerf.
Objectifs
Le système nerveux périphérique des mammifères est composé des nerfs qui commandent les mouvements (motoneurones) et des nerfs qui renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps (neurones sensitifs). Le dysfonctionnement des motoneurones entraîne une faiblesse ou paralysie musculaire alors que celui des neurones sensitifs entraîne une sensibilité anormale ou une perte de sensibilité. La douleur neuropathique résulte d’une lésion ou d’un dysfonctionnement du système nerveux et peut également provenir d’une complication du diabète. Pour traiter la douleur, différents types d’analgésiques sont utilisés: les anti-inflammatoires et les opioïdes lors de douleurs intenses. Cependant les opioïdes peuvent créer une dépendance. L’objectif du projet est de valider des nouvelles approches thérapeutiques pour introduire dans les cellules des nerfs des candidats médicaments efficaces pendant plusieurs années pour prévenir ou réduire les troubles moteurs et sensoriels responsables de la douleur. Les traitements seront directement injectés dans les nerfs chez des modèles de rongeurs de neuropathies douloureuses. Ce projet validera nos candidats médicaments en vue de futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Avantages court-terme: Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une biobanque pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme: Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. L’injection locale envisagée n’endommage pas le nerf et évite une dissémination des vecteurs dans tout l’organisme avec pour objectif la diminution des symptômes existants et l’arrêt de l’évolution et possible réversion de la maladie. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2027 et 2029 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Procédures
- Trois types de chirurgies o La première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent et consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques ou le nerf facial. Elle durera 20-30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisé. o La deuxième chirurgie de ligature unilatérale du nerf sciatique ou facial sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 30 minutes. o La troisième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique (ligature ou transection du nerf sciatique) sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 20 minutes. - L’analyse de la conduction nerveuse du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 20 minutes. - Les tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois par semaine sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
- Chirurgies selon les bonnes pratiques vétérinaires - Douleurs post-opératoires (4 jours) traitées par des analgésiques puissants - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie (6 à 10 semaines et une évolution progressive). Dans les modèles de névralgie faciale, les animaux présenteront une gêne au niveau de la face en ipsilatéral à la ligature ou compression du nerf facial. Dans le modèle de neuropathie douloureuse, les animaux présenteront une gêne au niveau de la patte en ipsilatéral à la ligature ou transection du nerf sciatique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons des tissus (nerfs, cerveaux) pour étudier l’effet du traitement sur les pathologies étudiées.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude, qui repose principalement sur une profonde collaboration entre la myéline et les axones qu'elles couvrent, rend difficile la modélisation et la reproduction complète du système in vitro. Il existe des méthodes pour étudier les nerfs mais leur structure obtenue par ces méthodes reste incomplète et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il a été montré que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
L’étude du nombre d’animaux utilisés dans les articles scientifiques ainsi qu’à partir de nos données internes sur lesquelles nous avons réalisé des tests de puissance statistique avec un logiciel spécialisé nous ont permis de déterminer le nombre d’animaux composant chaque groupe expérimental. Nous avons prévu de faire des calculs de puissance statistique sur les cohortes recevant la première dose avant de tester la deuxième dose afin de réduire si nécessaire le nombre d’animaux. Les procédures 2 à 4 sont des études longitudinales. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Le nombre exact d’animaux nécessaire aux études sera commandé auprès de fournisseurs agréés pour limiter la production d’animaux inutiles. Dans la procédure 1, dans la mesure du possible nous réutiliserons les animaux n’ayant passés que des tests de comportement pour de la formation en chirurgie et en électrophysiologie s’il y a un nouvel employé à former sur ces tests.
Raffinement
Les rongeurs auront une période d'acclimatation de 5 jours lors de laquelle ils ne seront pas dérangés puis une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée à partir du 6ème jour pour diminuer leur stress. Ils seront observés quotidiennement par du personnel formé et compétent. Les conditions d'hébergement des rats et souris respecteront les bonnes pratiques en matière d'hébergement (matériel de nidification, copeaux, frisottis et maison en carton). La fréquence du change des cages et des biberons des souris diabétiques sera augmentée. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie et la prise en charge de la douleur pré et post opératoire sera traitée par l’utilisation d’analgésiques puissants. Les points limites précis et spécifiques du projet seront appliqués de manière stricte. La méthode d'injection locale des vecteurs viraux est un raffinement par rapport à l'injection systémique (diminution de la dissémination et des effets secondaires). Des fiches de suivi des animaux sont mises en place pour évaluer la sévérité de la neuropathie et l'état clinique des animaux en post-opératoire. Selon des critères précis pour une évaluation de la souffrance animale, il y aura une discussion avec le vétérinaire et/ou la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) pour décider des soins à apporter. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, en cas de déshydratation un apport d'eau gélifiée ou une injection sous-cutanée d'une solution isotonique d'électrolytes pourra être effectuée et en cas de perte de poids ou d'état affaibli, de la nourriture humidifiée sera déposée sur le sol de la cage. Avant leur mise à mort, les souris et les rats seront sédatés.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de rongeurs, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Différents modèles de douleurs neuropathiques existent à la fois chez le rat mais aussi chez la souris, nous avons choisis d’utiliser les modèles les plus pertinents et les plus étudiés en recherche fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments afin de pouvoir anticiper les résultats que nous pourrons obtenir chez le gros animal avant d’évaluer leur efficacité chez l’homme. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements soit au début de l’apparition des symptômes pour prévenir la démyélinisation pathologique ou la dégénération axonale (stade précoce), soit une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin de bloquer la progression de la maladie ou de favoriser la régénération. Rat/souris : mâle et femelle jeunes adultes (4 à 6 semaines d’âge) et adultes (8 semaines d’âge).
Développement de CAR-T cells à visée thérapeutique pour la thérapie des cancers dans un modèle de souris immunodéprimées NSG NOD-SCID (mus musculus).
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées sous la peau avec des cellules de cancer humain, pesées dix fois, injectées par voie intraveineuse de lymphocytes CAR-T, mesurées quinze fois au pied à coulisse sur cinq semaines et prélevées de sang à cinq reprises sous anesthésie, 1 500 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que la tumeur grossit sur le flanc et que des effets indésirables apparaissent en fin d'expérience, surtout dans les groupes témoins laissés sans traitement. L'objectif déclaré est de sélectionner le meilleur lymphocyte CAR-T anticancéreux en vue d'essais cliniques. Toutes sont tuées pour que leurs tumeurs et leurs tissus soient prélevés et analysés.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d'un nouveau traitement anti-O-Acétyl GD2 (OAcGD2) dans un modèle de souris greffées en sous cutanée avec des cellules de cancers humains ou PDX (Patient-Derived Xenograft, en bref des tumeurs de patient d'origine humaines.) Cette possibilité d’utiliser ce nouveau traitement plutôt que des anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients sans les contraintes des multiples injections. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester nos différentes constructions sur des modèles de tumeurs xénogéniques.
Bénéfices attendus
Le meilleur CAR-T thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles thérapies sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.
Procédures
Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Implantation de la tumeur sur animal vigile : 1 injection, maximum 1 minute/ animal Injection intraveineuse CAR-T sur animal vigile (1 injection, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 24 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (5 prélèvements, 2 minutes maximum chacune + temps de mise en boîte de contention + prélèvement, soit 10 minutes au total). Mesure de la tumeur tous les 3/4 jours sur environ 5 semaines (15 mesures, maximum 1 minute / animal = 15 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liés à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration de la tumeur puis du traitements (injections sous-cutanées puis intraveineuse). Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation d’une tumeur sur le flanc de l’animal, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les CAR-T (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe attachée à cette demande de projet.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des CAR-T et de réaliser également des analyses complémentaires
Remplacement
Avant de réaliser ce projet, les CAR-T cells ont été caractérisés in vitro afin de vérifier que les cellules CAR-T ont bien été modifiées et qu'elles expriment le récepteur chimérique correct. De plus, un test fonctionnel permettant de visualiser en temps réel la destruction des cellules tumorales par les CAR-T a été également réalisé. Cependant, aujourd’hui il est impossible de reproduire les tissus tumoraux dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation et le développement du modèle par notre partenaire, nous a permis d’optimiser les injections, les prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe.
Raffinement
Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 5 souris maximum par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application d'un anesthésique local sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en immunologie. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe partenaire a déjà évalué des traitements de d’autres CAR-T et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 7 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 7 semaines avaient également été utilisées dans des traitements avec des anticorps.