Recherche appliquée

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trente-cinq gavages quotidiens sur cinq semaines et une prise de sang à la queue, avant d'être anesthésiée puis tuée par dislocation cervicale, son tube digestif étant prélevé pour un dosage d'ocytocine. Les composés testés appartiennent à un client du laboratoire, et le porteur reconnaît une "phase très précoce" de développement dont l'aboutissement commercial reste au conditionnel. Il indique avoir mené une première série d'essais sur cultures cellulaires, mais conclut qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité des composés dans un "organisme entier".

Objectifs

Le microbiome intestinal a été montré comme ayant un impact sur un très grand nombre de fonctions physiologiques. En effet, un nombre croissant de données indique que de nombreuses pathologies s'accompagnent d'un déséquilibre du microbiote et que la restauration de ce microbiote s'accompagne souvent d'une amélioration, voire d'une disparition des symptômes. Ainsi, certaines bactéries réduisent l'inflammation intestinale, freinent la perte osseuse, ou encore favorisent la cicatrisation des plaies cutanées. Or il a été montré que l'intestin possède des cellules capables de secréter de l'ocytocine et que cette dernière joue un rôle majeur dans l'équilibre de certaines population bactériennes et en particulier dans les effets bénéfiques. Ainsi, d'intense recherche visent aujourd'hui au développement de thérapies induisant une augmentation de la sécrétion intestinale d'ocytocine. L'objectif du présent projet est de tester la capacité d'une série de composés en développement (Composés X, Y et Z), développé par notre client, a induire une augmentation de la sécrétion d'ocytocine chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à traiter certaines pathologies inflammatoires de l'intestin ainsi que l'ostéoporose via une production accrue d'ocytocine. Bien que le projet soit une phase très précoce du développement, si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché de nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration quotidienne de placébo ou d'un candidat médicament par voie orale (35 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) à un prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (1 prélèvement; durée: 5 minute/prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des pesées régulières ainsi qu'à des administrations de traitements par gavage pendant 5 semaines (1 semaines d'habituation et 4 semaines de traitement). Deux prélèvements sanguins seront pratiqués : l'un via la veine de la queue a D0 et l'autre par ponction cardiaque après euthanasie à D28. Enfin, au dernier jour de l'étude, les animaux seront anesthésiés par un mélange kétamine/xylazine avant dislocation cervicale immédiatement suivie d'une ponction cardiaque et du prélèvement du tube digestif. En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des administrations de substances (traitements et anesthésie). Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleur légère et transitoire qui ne nécessite pas de médication lors des administrations par gavage, et des prélèvements sanguins à D0.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le tyube digestif et de réaliser un dosage d'Ocytocine tissulaire.

Remplacement

Une première série d'étude a été conduite in vitro afin de vérifier l'impact des composé testés sur un modèle de cultures cellulaires ensemencées à l'aide de la bactérie L. reuteri. Néanmoins, la complexité du microbiote intestinal ne peut pas encore être modélisée in vitro et l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de vérifier l'efficacité des composés dans un organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3-4 animaux par cage) afin de satisfaire leurs besoins sociaux et auront accés à de l'eau et de la nourriture ad libitum. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème à base de lidocaïne sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.

Choix des espèces

La souris, comme tout modèle animal, est un modèle qui présente des différences dans la composition exacte du microbiote comparativement à l'humain. Néanmoins, on observe une bonne conservation des grands types bactériens entre humain et souris. Par ailleurs, l'interaction microbiote/ocytocine est conservé chez les deux espèces. La souris reste donc un modèle d'intérêt sur le plan préclinique. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique du composé, puis jusqu'à six prélèvements sanguins en une semaine, sous anesthésie gazeuse. L'objectif est de mesurer comment un candidat médicament se répartit dans l'organisme, pour choisir la molécule et la dose qui passeront ensuite en clinique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour ce type d'étude et que les modélisations in silico ne sont "pas encore abouties".

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés afin de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la pharmaceutique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme pharmaceitique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les administrations sront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés selon la voie utilisée. Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique si besoin et sous anesthésie. 6 prélèvements maximum sont réalisés par animal sur une semaine (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Dans tous les cas l'inconfort ou le stress, si observé, sera de très courte durée, inférieur à 1 min. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets indésirables suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration. Si ces signes devaient néanmoins survenir ils seront de courte durée, inférieur à 1h.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin de calculer un minimum de statistiques descriptives (moyenne, écart-type et coefficient de variation) sur les données obtenues, un minimum de 3 animaux par conditions (molécule, voie d’administration, dose, formulation, temps de prélèvement) est nécessaire. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des souris est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les souris à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix de la souris dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiques de cette tranche d'âge permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches en limitant le biais expérimental lié à l’âge.

Les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour accepter la greffe de cellules pancréatiques humaines sans les rejeter. Elles sont 872, toutes tuées deux à six mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après destruction de leurs propres cellules bêta, elles subissent une chirurgie de greffe, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines et des tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, avec pour effets attendus des hypoglycémies et une réaction du greffon contre l'hôte pouvant leur faire perdre plus de 20 % de leur poids. Le porteur annonce un modèle plus proche de la clinique humaine et une accélération du développement de thérapies, bénéfices renvoyés au long terme.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui présente deux formes : type 1 (T1D), caractérisée par une absence de sécrétion d’insuline causée par la perte de cellules béta pancréatiques; et type 2 (T2D), caractérisée par une résistance à l’insuline. En 2021, le T1D affectait 9 millions de personnes dans le monde et le T2D plus de 537 millions de personnes (OMS). Le traitement des deux formes de diabète est un enjeu de santé publique majeur, or il n’existe aujourd’hui aucune thérapie curative. Les seuls palliatifs chroniques sont, pour le T1D, l’injection quotidienne d’insuline et, pour le T2D, les approches thérapeutiques diminuant la résistance à l’insuline ou augmentant la sécrétion d’insuline tout en améliorant le profil métabolique. Néanmoins, les traitements actuels restent inefficaces pour soigner durablement les patients. De plus, la qualité de vie des patients reste très impactée (injections quotidiennes, complications, charge mentale) et associée à des risques importants, notamment des épisodes d’hypoglycémie dont certains peuvent être fatals (à une fréquence moyenne de 0.5 à 1 événement par an chez les patients T1D traités). Il est donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques comme la modulation de la réponse auto-immune dirigée contre les cellules béta, l’optimisation de la sécrétion d’insuline et l’amplification de la masse de cellules béta endogènes. Le projet présenté vise ainsi à répondre à ces besoins thérapeutiques par le développement d’un modèle animal humanisé translationnel, plus proche de la réalité clinique humaine. L’objectif du modèle est d’accélérer le développement de nouvelles thérapies et de limiter les échecs cliniques. Les objectifs du projet sont : 1) implémentation d’un modèle humanisé avec la greffe de cellules béta pancréatiques humaines productrices d’insuline dans la souris. 2) validation physiopathologique et pharmacologique du modèle : (a) dans le cadre du diabète auto-immun (T1D) : - Etude de la réaction auto-immune contre les cellules béta humaines du modèle, par des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques ou des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) humains, - protection par des cellules immunitaires régulatrices humaines, - et étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à renouveler les cellules bêta endogènes, (b) dans le cadre du T2D : - étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à optimiser la capacité sécrétrice d’insuline de cellules béta humaines.

Bénéfices attendus

Le projet proposera un modèle physiologique et translationnel de souris humanisées en termes de cellules béta, insuline et glycémie humaine. Ce nouveau modèle humanisé permettra de modéliser l’attaque auto immune des CD8+ et PBMC et le rôle protecteur de cellules immunitaires régulatrices. Il permettra également d’évaluer dans un contexte physiologique, l’activité de molécules potentiatrices de la sécrétion d’insuline, en développement dans le traitement du diabète de type 2, ou inductrices du renouvellement des cellules béta humaines, en développement dans le cadre du diabète de type 1. De plus, ce modèle murin de xénogreffe de cellules béta humaines pourrait, à plus long terme, permettre de développer des modèles hautement pertinents de diabète de type 2 à travers par exemple des régimes de type High Fat Diet et ainsi d’évaluer les nouvelles approches de lutte contre l’insulino-résistance et l’amélioration du profil métabolique. A plus long terme, les bénéfices attendus sont une accélération du développement de nouvelles thérapies innovantes pour le T1D et T2D et une amélioration des résultats cliniques (diminution des échecs thérapeutiques) par un meilleur criblage thérapeutique lors des phases préclinique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes: - injection intra-péritonéale jusqu'à 1 fois par jour pendant 5 jours, durée 5 min par injection, - prélèvement sanguin, 2 fois par semaine, pendant jusqu'à 24 semaines, durée 5 min par prélèvement, - chirurgie pour greffe de cellules béta pancréatiques humaines, jusqu'à 1 fois par animal, durée 15 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - échographie, jusqu'à 2 fois par animal, durée 30 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - test de tolérance au glucose, incluant 1 injection intra-péritonéale et jusqu’à 10 prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie, procédure effectuée jusqu'à 2 fois par animal, durée 2,5 heures par procédure, - administration intra-péritonéale ou intra-veineuses de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques, jusqu'à 2 fois par animal, durée 5 min par injection.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les souris pourront être soumises à : - une ablation des cellules béta endogènes, - une chirurgie pour implanter des cellules béta humaines, - une administration de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques. Plusieurs nuisances doivent être anticipées : A) liées à l’ablation des cellules béta endogènes pouvant générer des épisodes d’hypoglycémie. B) liées à la procédure de chirurgie : - Hypothermie liée à l’anesthésie, - Saignements, douleur et stress liés à la chirurgie. C) liées à la greffe de cellules béta : - pas de douleur attendue liée à la taille de la greffe, la taille attendue restant minime, - possible hypoglycémie due à une trop forte production d’insuline par les cellules greffées pouvant éventuellement générer un état de léthargie. D) liées au suivi de la greffe de cellules béta et à l’administration de cellules immunitaires - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements de sang. - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de cellules immunitaires. - Réaction immunitaire de la greffe contre l’hôte (GvHD). Les symptômes de la GvHD sont une perte de poids (>20%), une posture courbée, un pelage hérissé et une perte d’activité, - Hypoglycémie transitoire. E) liées au molécules pharmacologiques administrées - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de molécules pharmacologiques. - Les molécules pharmacologiques qui seront utilisées sont des peptides et molécules connus et n’ont pas d’effet secondaire grave décrit chez la souris.

Devenir

Les animaux utilisés pour la mise en place du modèle diabétique seront euthanasiés 2 mois après la procédure, ce qui est le temps nécessaire pour confirmer le développement du diabète. Les animaux utilisés pour la greffe de cellules béta humaines puis pour l’évaluation de leur rejet et de leur protection seront euthanasiés au plus tard 6 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour obtenir les résultats sur la survie, le rejet et la protection des cellules béta humaines.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet ne peuvent pas être transposées efficacement dans un système in vitro tout en garantissant d’apporter des informations physiologiques pour les raisons suivantes : - Le projet vise à développer un modèle complexe multicellulaire humain d’une maladie métabolique incluant notamment des régulations faisant intervenir plusieurs tissus ; - L’objectif est d’évaluer l’impact de cellules immunitaires et de molécules effectrices sur la fonction de cellules béta humaines et sur leur capacité à maintenir une glycémie normale dans un environnement métabolique complet (foie, muscle, système digestif).

Réduction

Le principe de réduction du nombre d’animaux a été appliqué en premier lieu en se basant sur des résultats d’études similaires précédentes afin d’estimer statistiquement les nombres d’animaux nécessaires. Par ailleurs, pour les expériences de mise au point de protocoles, les nombres d’animaux nécessaires ont été estimés en se basant sur notre expérience de ce type d’approches. Le nombre de conditions expérimentales à comparer a également été calculé afin d’obtenir les résultats avec le nombre le plus faible possible d’animaux. Enfin, nous procéderons par étapes et conclusions intermédiaires afin, à nouveau, d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Un second aspect de la réduction du nombre d’animaux est que les personnes qui effectueront les expérimentations seront précisément formées et habituées à chaque procédure afin de réduire au maximum le risque d’échecs mais aussi de nuisance pour les animaux et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderont dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une reproductibilité optimale de nos résultats et, en conséquence, une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La démarche de raffinement de ce projet implique : - personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, - surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Des échelles de scoring seront utilisées pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Différentes actions seront menées : - Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus et acclimatés pendant au moins 5 jours avant une procédure. - Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. - Pour la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un analgésique. Puis une anesthésie par isoflurane. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, 2 fois par jour espacé de 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classique A2 et surveillé tous les jours. L’apparition des points limites sera surveillée avec observation des signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée. Nos procédures impactant la glycémie, des mesures, 2 fois par semaine, seront réalisées afin d’anticiper d’éventuels effets indésirables et les actions pour en minimiser les effets appliquées. Notamment dans le cas d’hypoglycémie (insulinome, mort des cellules béta), du sucrose sera fourni dans l’eau. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal, et l’euthanasie appliquée s’il n’est pas possible de soulager l'animal.

Choix des espèces

Le choix du modèle mus musculus est lié à la praticité du modèle (taille, accessibilité) et à la disponibilité d’animaux immuno-déprimés qui favorisent l’implantation de cellules humaines ainsi qu’aux données déjà publiées sur ce type d’approches. Plus spécifiquement, le choix du modèle mus musculus est lié à l’existence de modèles publiés de greffe des cellules EndoC-bH® ainsi que d’injection de lymphocytes T ou de PBMC pour induire le rejet de greffe de cellules béta humaines. Les souris qui seront utilisées seront âgées d’entre 6 et 9 semaines au moment de l’ablation des cellules bêta endogènes. Ceci afin que les implantations de cellules EndoC-bH®, prévues 1 à 4 semaines après, soit faites sur des souris âgées de 7 à 13 semaines soit un âge permettant que l’animal ne soit pas trop petit afin de faciliter la chirurgie, tout en garantissant que les animaux seront adultes sans être trop âgés en fin de protocole soit jusqu’à 6 mois après l’implantation initiale de cellules béta.

164 lapins reçoivent une greffe de tumeur, implantée par chirurgie dans le foie ou injectée sous la peau du dos, de l'oreille ou de la glande mammaire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur peut provoquer un inconfort pendant 42 jours, et une détection tardive de métastases pulmonaires peut s'accompagner de douleurs. Le porteur déclare vouloir développer la culture cellulaire pour cesser de produire cette lignée tumorale sur l'animal, tout en programmant l'usage de ces lapins sur cinq ans. Tous sont tués pour prélever et exploiter les tumeurs.

Objectifs

En 2023, plus de 400000 nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués. Les thérapies combinant différentes traitements ainsi que le développement de nouvelles technologies et techniques associées à la chirurgie se sont largement développées aux cours des dernières années. Il y a donc une nécessité urgente à disposer de modèles précliniques adaptés afin de pouvoir valider ces nouveaux traitements avant de les proposer aux patients. Les modèles in vitro et in vivo (rongeurs) ont leurs limites et il est primordial de pouvoir disposer de modèles moyen / gros animaux, notamment pour les dispositifs médicaux humains ne pouvant être utilisés sur des petites espèces. Parmi les animaux de taille moyenne notamment compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme, le lapin est le seul modèle animal pour lequel un modèle tumoral est disponible: le cancer de la peau. Globalement, ce modèle permet de réaliser des tests de traitements et sa caractérisation permettra d’améliorer les pratiques lors de son utilisation. L’objectif de ce projet est la caractérisation de ce cancer permettant une standardisation. Cela permettra d’une part, un raffinement du modèle ainsi qu’une réduction à terme du nombre d’animaux utilisé notamment grace à des techniques alternatives comme la culture cellulaire en 3D. D’autre part, une meilleure connaissance du modèle permettra d’étendre les applications de recherche à différents types de cancer/traitement.

Bénéfices attendus

Les connaissances qui découleront de ce projet permettront d’aider aux développements de traitements contre le cancer par la mise au point de modèles fiables.

Procédures

Pour l’anesthésie générale, les animaux subiront deux fois une injection. Un rasage sera appliqué sur les zones d’implantation des greffes une fois. Sous anesthésie générale et antidouleur, certains animaux subiront une chirurgie (incision d’environ 3 cm) qui durera environ 30 minutes. Cette opération permettra la mise en place d’un fragment tumoral ou une suspension cellulaire dans le foie. Chez d’autres animaux, le fragment ou la suspension cellulaire sera injectée dans le foie à travers la peau (5 minutes). Enfin, d’autres animaux recevront l’injection de fragment ou suspension de cellules au niveau du dos ou de l’oreille ou de la glande mammaire sous la peau. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine sur six semaines maximums soit 18 fois maximum. Des mesures échographiques ou au pied à coulisse sur l’animal vigile sous contention seront réalisées au minimum une fois par semaine pour suivre l’évolution des tumeurs soit maximum 8 fois sur 6 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement marqués par : - Une douleur modérée possible durant 1 à 2 jours après la chirurgie au niveau de la zone chirurgicale et au niveau des oreilles (pose de cathéter). - Un inconfort après la chirurgie (42 jours maximum) peut être généré par la présence de la tumeur sous la peau. - Dans l’éventualité d’une détection tardive de métastase, une douleur possible de l’animal peut avoir lieu sur quelques jours lors du développement de métastase (notamment pulmonaire). - Un stress de quelques minutes peut avoir lieu lors de la manipulation pour les anesthésies/injections/mesures des tumeurs et pesées.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort dans le but de prélever, étudier et exploiter les tumeurs.

Remplacement

Le lapin est le seul modèle moyen / gros animal présentant un modèle tumoral : le VX2 (carcinome épidermoïde) pouvant être compatible avec un geste chirurgical tel qu’effectué chez l’Homme ainsi que l’utilisation de dispositifs médicaux humains. Un des objectifs de ce projet est de développer la culture de cellules pour de ne plus à avoir utiliser l’animal pour produire la tumeur.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour permettre le maintien, la production et la caractérisation de tumeur VX2 au cours des 5 ans. Le nombre de 4 animaux par groupe va permettre d’obtenir des données suffisantes à l’avancée du projet (pertinence des techniques et sites d’implantation, du type de greffons). Les tests in vitro réalisés en amont et l’optimisation au fur et à mesure vont permettre une réduction d’une nombre de groupe. Toutes les conditions ne seront pas testées en memes temps ce qui permettra d’arrêter le projet dès qu’on obtient un bon développement de tumeur. D’autre part, il s’agit d’une étude descriptive visant à valider de nouvelles techniques sans nécessité de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes sociaux de 2 ou 4 lapins en concertation avec l’éleveur. Ils seront isolés sur la période post-chirurgie et seront remis ensemble lorsqu’il n’y aura aucun risque pour eux de s’abîmer la cicatrice. Les animaux sont habitués aux techniciens par des temps d’échanges et distribution de friandises. L’état des animaux est évalué par un scoring biquotidien en semaine et quotidien le week-end basé sur l’aspect de l’animal, le suivi de l’alimentation et de l’abreuvement.

Choix des espèces

Le lapin est le seul modèle animal non rongeur disposant d’un modèle tumoral fiable et reproductible. Des animaux au stade adulte (environ 12 semaines) seront utilisés. Ce stade permet d’avoir des animaux avec un système immunitaire peu mature (3-3,3kg) favorisant le développement d’une tumeur.

Pour tester une irradiation par rayons X fins comme alternative à la chirurgie de l'épilepsie, 94 souris sont rendues épileptiques par injection d'une molécule dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de quinze minutes, des IRM et une irradiation pouvant durer une heure, une seconde chirurgie de trente minutes pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de trois heures toutes les deux semaines pendant huit mois. Le cycle reproducteur des femelles est évalué seize jours de suite, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress répété. Toutes sont tuées pour prélever les cerveaux, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant l'apport d'un gel hypercalorique.

Objectifs

Une grande partie des patients épileptiques souffrent d’un type de la maladie qui est résistante aux médicaments. Cette forme d’épilepsie est caractérisée par des crises et est souvent associée à plusieurs troubles de la mémoire et de l’apprentissage. La chirurgie permet d'enlever la partie du cerveau malade qui génère les crises, mais c’est une opération qui présente certains risques et peut générer des effets secondaires. Nous étudions différentes formes de rayons X afin de développer une thérapie alternative sans avoir besoin d’ouvrir la boîte crânienne. Nous proposons d’utiliser un appareil qui permet d’appliquer des rayons X semblables à ceux actuellement utilisés en clinique humaine, mais aussi avec des faisceaux plus fins et moins nocifs, afin d'évaluer l’effet des différentes formes de rayons X. Ces expériences sont cruciales pour transférer la technologie des rayons X en faisceaux plus fins dans la pratique clinique. En démontrant sa faisabilité et son efficacité en tant que traitement non invasif de l'épilepsie pharmacorésistante, nous avons pour ambition de fournir une preuve de concept préclinique pour une application thérapeutique à l’horizon de 2030.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les patients souffrant de certains types d’épilepsie répondent mal aux traitements pharmacologiques classiquement prescrits. Le meilleur traitement reste la chirurgie de retrait de la zone du cerveau malade après ouverture de la boîte crânienne. Malgré un taux d'efficacité de 60%, cette technique présente de nombreux risques, tels que des infections et des troubles de la mémoire et de l’apprentissage. De plus en plus de patients sont réticents à cette méthode. Il est donc nécessaire de trouver des traitements alternatifs efficaces et non invasifs. Notre étude par irradiation avec des rayons X plus fins que ceux utilisés actuellement permettrait de développer une nouvelle méthode de traitement, plus efficace que la chirurgie, non invasive, avec moins d’effets secondaires et une durée d’hospitalisation moindre.

Procédures

Les souris subiront dans un premier temps une chirurgie d’environ 15 min visant à les rendre épileptiques, par injection d’une molécule dans une région précise du cerveau. Des IRM seront effectuées pendant une durée n’excédant pas 60 minutes. L’irradiation dure moins de 60 minutes. Afin de mesurer les effets de l’irradiation sur les crises, des électrodes intra-cérébrales seront positionnées (chirurgie d’environ 30 min). Les souris seront ensuite soumises à un enregistrement de leurs crises pendant 3 heures toutes les deux semaines pendant 8 mois après irradiation afin de vérifier l’efficacité et la stabilité du traitement. De plus, des tests évaluant le comportement des animaux seront effectués 4 et 8 mois après l’irradiation. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Cette étude se déroule sur plusieurs mois et peut comporter certains effets indésirables pour les animaux. La première étant l’épilepsie. Les animaux font essentiellement des crises partielles qui ne présentent pas de signes de douleurs apparentes lors de leur déclenchement, et qui sont indolores chez l’homme. Certaines souris peuvent présenter des crises convulsives occasionnellement, qui peuvent entraîner un stress et des douleurs musculaires. Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir des douleurs et potentiellement des problèmes pour se nourrir et s’hydrater pendant les premières 24 heures. Les souris épileptiques sont plus réactives et doivent être hébergées séparément pour éviter tout conflit entre individus et/ou une altération possible de l’électrode. Il est possible que les souris subissent un léger stress lors des déplacements vers les salles expérimentales. Après irradiation, il est possible que les souris présentent des effets indésirables comme une perte de poids et une perte de poil au niveau de la zone irradiée. Le cycle menstruel des souris femelles sera également évalué de manière répétée pendant 16 jours consécutifs, ce qui peut induire un stress répété.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et d’observer au niveau structural et cellulaire les effets de la radiothérapie.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier ce type d’épilepsie. Il n’existe aucun modèle in vitro ou sur ordinateur qui permette de mettre en évidence ce type d’épilepsie dans le cerveau, ni de le traiter par irradiation. Le modèle de souris choisi pour cette étude est reconnu dans la littérature pour reproduire la pathologie chez l’homme : crises spontanées, perte des neurones, inflammation du tissu nerveux, modification de l'architecture neuronale du cerveau, résistance aux traitements antiépileptiques, autres symptômes de la maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire est calculé en fonction de notre connaissance de ces procédures et des analyses statistiques des résultats qui seront utilisées. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Toutes les procédures (chirurgie pour l’épilepsie, IRM, chirurgie d’implantation de l’électrode, irradiation) sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pour minimiser la douleur et le stress de l’animal. Pendant les premières 48h post-chirurgies et irradiation, des croquettes seront placées directement dans la cage, et un suivi journalier du poids et de l’état général de l’animal sera effectué. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet, pendant et entre les procédures, et une échelle de douleur nous permettra d’intervenir rapidement par l’administration d’analgésique ou la mise à mort de l’animal. Du gel hypercalorique et appétent sera donné en cas de perte de poids constatée (plus de 20%). De plus, la manipulation des animaux sera faite de manière douce pour éviter un stress supplémentaire. Des sessions d’habituation (aux expérimentateurs, salles de comportement) seront également effectuées.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie chez la souris que nous utilisons est actuellement un modèle de référence, parmi les plus proches des conditions observées chez l’homme. Des animaux adultes âgés de 8 semaines seront utilisés dans ce projet. Le modèle a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long des procédures.