Recherche appliquée

Toutes tuées pour analyse de leurs organes, 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie sous anesthésie générale leur implante des cellules tumorales dans le pancréas, suivie d'échographies hebdomadaires sous anesthésie, d'un à deux traitements par champ électrique pulsé par semaine et d'injections intratumorales ou intrapéritonéales répétées. Le porteur indique que la croissance des tumeurs pancréatiques peut entraîner une perte de poids et des signes de souffrance, et que la chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste. Les essais chez des patients atteints de cancer du pancréas restent une perspective, et le porteur écarte les cultures cellulaires en affirmant qu'elles ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

Pour vérifier qu'éliminer un type de lymphocyte rend une immunothérapie plus efficace, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur ouvre l'abdomen sous anesthésie gazeuse pour implanter des cellules tumorales dans le foie ou le cæcum, puis elles reçoivent des injections dans le ventre trois fois par semaine pendant trois semaines et passent deux séances d'imagerie hebdomadaires. Celles dont la tumeur régresse complètement sont gardées deux mois de plus avant d'être tuées. Le porteur annonce une grille d'évaluation des points limites sans en donner les seuils, tout en décrivant le développement de grosses tumeurs et de métastases comme un effet indésirable possible.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des points de contrôle a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris, d’injecter des cellules tumorales dans le foie ou le caecum. Ces interventions chirurgicales pourraient entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement de grosses tumeurs mais également de métastases pourrait avoir des effets indésirables. L’injection des traitements peut générer des désagréments au moment de l’injection. Les traitements seront injectés par voie péritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. Le groupe qui aura les deux traitements n’aura qu’une seule injection IP à chaque fois. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. L’imagerie nécessitera une injection intrapéritonéale de l’agent d’imagerie, 2X par semaine pendant 3 semaines puis 1X par semaine pendant 2 mois. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Quatre groupes (Controle, les deux traitements seuls et la combinaison de traitement) de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance statistique pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées à l’expérimentation animale et à la chirurgie afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manières indépendantes. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Avant la chirurgie, les souris recevront une antibiothérapie préventive et une analgésie. Les procédures d’imagerie et de chirurgie abdominale seront réalisées sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante ou couveuse, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée en permanence et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge analgésique adaptée en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et un analgésique sera injecté en sous-cutanée 2 fois par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour tester facilement les nouveaux outils permettant de faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée et dans l’organe d’origine de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Opérés sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif médical dans l'œil, lors d'une chirurgie pouvant durer jusqu'à deux ou trois heures, 300 lapins et 150 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le porteur indique que l'hématome ou l'œdème au niveau du site opératoire peut entraîner une diminution ou une perte importante de la vision. Ces implantations servent à constituer les dossiers d'autorisation de mise sur le marché de produits d'ophtalmologie, testés pour le compte de donneurs d'ordre. L'effectif est arbitré à partir de l'estimation du nombre d'études signées avec ces clients sur les cinq ans du projet.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en ophtalmologie (exemple : produit ou matériel utilisés pour les chirurgies de la cataracte ou du glaucome...).). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité et tolérance lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux de données de performance et de tolérance des produits de santé en ophtalmologie. Ainsi, il est possible d'analyser ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.

Procédures

Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer de quelques minutes à jusqu’à 2h à 3h). Cette intervention peut avoir lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - stress liés à la réalisation d’une anesthésie générale et d’une chirurgie (stress de la contention, , stress lors du réveil). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours. -hématome ou œdème au niveau du site opératoire pouvant entrainer une diminution ou une perte importante de la vision. - retrait de la nourriture chez le porc qui est de 12 à 24h, pour la mise à jeun per opératoire en vue de l’anesthésie.

Devenir

Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induits par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé. En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en ophtalmologie.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" des produits à tester différents. Les études de screening et les études pilotes peuvent être menées en amont pour permettre de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, ou pour déterminer le meilleur modèle pour le dispositif à tester, réduisant de réduisant le nombre d’animaux utilisés pour les études réglementaires à plus grande échelle, quidoivent répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir de l’estimation du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet.

Raffinement

Des mesures sont mises en place pour limiter : -Le stress des animaux : avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…) - La douleur des animaux : en phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et complétés par des scores de suivi de la douleur. La présence d’un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter la souffrance.

Choix des espèces

Le lapin et le porc sont des modèles reconnus dans la littérature scientifique en ophtalmologie, en raison des grandes similitudes anatomiques avec l’œil humain. Le choix de l’espèce se fera selon le type de dispositif et les contraintes normatives associées, afin de répondre à ce que demande la réglementation pour la mise sur le marché des dispositifs médicaux. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requière, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l’utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.

Vingt-trois heures seules en cage métabolique pour récolter séparément leur urine et leurs excréments : 672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant quatre semaines, elles mangent une nourriture contaminée par une mycotoxine et reçoivent chaque semaine de l'alcool par gavage, avec des prélèvements de sang à la queue, à la joue et à la veine saphène. Le porteur indique que la mycotoxine peut réduire leur prise de poids, que le gavage peut irriter leur œsophage et que l'isolement en cage peut les stresser. Il retient une lignée de souris connue pour développer des maladies du foie, alors que l'étude porte précisément sur les atteintes hépatiques.

Objectifs

Tout au long de sa vie, l'Homme est exposé à un large éventail de contaminants alimentaires d'origines diverses. Les mycotoxines, produites par certaines moisissures, sont les contaminants naturels les plus fréquents présents dans nos assiettes. La mycotoxine étudiée se retrouve dans près de 50% des céréales, les concentrations augmentent avec le changement climatique et aujourd'hui environ 80% des individus y sont exposés. Elle perturbe le fonctionnement de l'intestin notamment en provoquant une inflammation qui pourrait jouer un rôle dans l'apparition et la gravité des maladies inflammatoires de l'intestin. Elle ne provoque pas de dommages sur l'ADN mais exacerbe ceux qui sont provoqués par des contaminants alimentaires connus pour endommager l’ADN dits génotoxiques. L'alcool est l'une des substances qui affecte le système nerveux (psychoactive) les plus fréquemment consommées en France et est responsable d'environ 3 millions de décès par an. La consommation d'alcool affecte principalement l’intestin et le foie et est associée à diverses maladies inflammatoires. L'alcool provoque des dommages à l'ADN qui, s'ils sont mal réparés peuvent devenir le point de départ des cancers. L’effet de l’alcool et de la mycotoxine étudiée en mélange pourrait ainsi être à l'origine d'effets encore plus importants. Les objectifs de ce projet sont d'étudier et caractériser ces effets sur différents paramètres physiologiques au niveau du foie et de l'intestin. Comme par ailleurs il est connu que les capacités de détoxification sont différentes entre les hommes et les femmes, nous chercherons à vérifier l'hypothèse que, dans des conditions réalistes de multi-exposition, ces effets seront différents entre les mâles et les femelles.

Bénéfices attendus

Certains consommateurs sont quotidiennement exposés à des aliments contaminés par la mycotoxine étudiée présente dans les aliments à base de farine de blé, de maïs, etc.. Ils consomment aussi de l’alcool de manière occasionnelle. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons in vivo chez la souris si l’exposition chronique à cette mycotoxine augmente les effets néfastes dus à une exposition aiguë à l’alcool, mimant une consommation occasionnelle. Les données expérimentales permettront d’évaluer comment une exposition combinée impacte notamment la santé digestive et hépatique. Nous mesurerons des marqueurs de génotoxicité et d’inflammation et des lésions de l’intestin et du foie. Les résultats attendus de ce projet sont importants en termes de santé publique, car les consommateurs sont chroniquement exposés à ces contaminants en mélange. Si l’hypothèse d’une exacerbation de leurs effets individuels lorsqu’elles sont combinées est confirmée, les données produites seront valorisées dans des publications scientifiques et pourront être prises en compte dans l’évaluation du risque d’exposition chez l’homme.

Procédures

Les souris hébergées en groupe seront exposées à la mycotoxine via l’alimentation pendant 4 semaines. Une fois par semaine elles recevront le traitement à l’alcool par gavage, durée du geste 30 secondes et un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux vigiles dont la durée est inférieure à 1 minute. Lors de la dernière semaine du protocole, les animaux seront soumis également à un jeûne de 4 heures, à un gavage avec un marqueur fluorescent (durée du geste 30 secondes) ainsi qu'au prélèvement de deux gouttes de sang à la queue pour mesurer la perméabilité intestinale, ce prélèvement ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pour 23h au maximum pour récolter séparément les urines et les fèces pour analyses. A la fin de chaque procédure, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la joue puis les animaux seront euthanasiés et des organes prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

La consommation d’un aliment contaminé par la mycotoxine peut entrainer une réduction de la prise de poids des animaux. L’administration de l’alcool par gavage peut entrainer une modification transitoire du comportement. Le gavage oral peut induire une irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins à la veine maxillaire, à la veine caudale et à la veine saphène peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention et une douleur liée à la piqure de l’aiguille. L’isolement de l’hébergement individuel en cage à métabolisme peut être stressant pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes destinés à être analysés pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Des études précédentes ont permis de montrer que la mycotoxine étudiée en mélange avec l’alcool exacerbe la réponse inflammatoire de cellules d’intestin ou de foie en culture. Cependant lorsqu’ils sont ingérés par un organisme vivant, leur devenir puis leurs effets vont dépendre notamment de leur absorption dans l’intestin et de la façon dont ils sont détoxifiés dans le foie. Ce projet nécessite donc l'utilisation d'animaux de laboratoire car nous souhaitons étudier les conséquences d’une co-exposition alimentaire à la mycotoxine et à l’alcool sur un organisme entier, ce qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives comme la culture de cellules.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Le nombre d'animaux a été limité au maximum (n=12 animaux/groupe). Cet effectif a été déterminé en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Lors du suivi quotidien des animaux, nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et nous utiliserons une grille d'évaluation de leur état général portant sur l’apparence générale, le comportement, les signes cliniques et l’alimentation. Le cumul du score de chacun de ces critères permettra de décider d’un éventuel arrêt de la procédure. Les souris seront hébergées en groupe pour respecter leurs comportements sociaux et un enrichissement de type abri en inox ou un élément de nidification sera ajouté dans la cage. Une habituation à la préhension par l'expérimentateur sera réalisée avant le début de l'expérimentation pour diminuer ce stress. Le gavage sera réalisé par une personne expérimentée, l’observation des animaux sera renforcée après l’administration afin de s’assurer du bien-être des animaux. Une crème anesthésiante sera appliquée avant les prélèvements de sang. Les cages individuelles utilisées durant 23h maximum sont transparentes, incluent l’abri en inox et les animaux sont à proximité de leurs congénères afin de permettre le contact visuel. Durant ce séjour, le suivi du bien-être est renforcé avec plusieurs visites par jour.

Choix des espèces

Les lignées de souris sont largement utilisées dans la recherche sur le métabolisme. Il est connu que la lignée utilisée dans cette étude développe des maladies hépatiques. La souris présente des similitudes avec l’espèce humaine pour ce qui est des maladies et de leurs effets sur le corps. C’est d’autre part le modèle le plus utilisé pour étudier et reproduire les effets de la consommation d’alcool ou de l’exposition à des mycotoxines comme en atteste la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte car nous avons besoin d’avoir un tractus digestif et un système immunitaire mature. Les souris sont adultes à partir de 8 semaines.

Leur accès à l'eau est contrôlé pour qu'ils restent motivés par les tâches à accomplir. Six macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, aucun ne devant être tué : trois seront replacés et trois réutilisés dans d'autres projets. Chacun subit deux interventions chirurgicales de quatre à cinq heures, onze examens d'imagerie cérébrale sous anesthésie générale dont six avec injection directe dans le cerveau, et des séances comportementales quotidiennes d'une heure trente à deux heures pendant quatre à cinq mois. Le projet vise à cartographier les circuits sous-corticaux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, le porteur retenant le macaque comme l'espèce "la plus près de l'être humain".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

Placés jusqu'à vingt-quatre heures dans des chambres en plexiglas après administration d'une substance, 500 souris, 3 000 rats et 2 000 cobayes subissent un enregistrement de leur fonction respiratoire, certains après une heure de chirurgie de cathétérisme. Les 5 500 animaux sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène les effets à un "léger stress" lié à la contention et à l'isolement, tout en énumérant bronchospasmes, bronchoconstrictions, toux, hyperventilation et douleurs après l'opération. Quatre cents cobayes seront réutilisés, les 5 100 autres tués, ces tests servant à établir le profil de sécurité de candidats médicaments avant leur passage chez l'humain, conformément aux exigences réglementaires européennes, américaines et japonaises.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer les effets de substances en cours de développement sur la fonction respiratoire et de collecter des données précises pour répondre à des questions essentielles liées à la sécurité, l'efficacité, et le mécanisme d'action de la substance. Ces tests permettent de vérifier si une substance améliore la fonction respiratoire dans des maladies comme l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive,... et permettent également de déterminer si une substance est en mesure de réduire les symptômes respiratoires tels que la dyspnée ou la toux. Les substances, même non destinées à traiter directement les maladies pulmonaires, peuvent avoir des effets sur le système respiratoire (bronchospasmes, hypoxie, etc.). Tester leur impact est donc crucial pour garantir la sécurité du patient et établir le profil de sécurité du candidat médicament avant son passage chez l’homme, et ce dans le cadre des recommandations européennes, américaines ou japonaises en vue de l’obtention des autorisations de mise sur le marché. Les documents réglementaires (CPMP, FDA et MHW) s’accordent pour considérer le système respiratoire comme une des fonctions vitales à explorer dans le cadre des études de pharmacologie de sécurité (ICH S7A guideline, 2001).

Bénéfices attendus

Ces modèles seront mis en place et utilisés afin de tester l’efficacité des médicaments et de s’assurer qu’ils n’induisent pas d’effets secondaires ou inattendus chez les patients traités pour des affections respiratoires. Ils entrent également comme prérequis règlementaires pour obtenir les autorisations de commercialisation des nouveaux médicaments. La mesure des paramètres ventilatoires (fréquence respiratoire, volume courant, minute volume, temps d’inspiration, d’expiration et de relaxation, débits aux pics d’inspiration et d’expiration) ou dynamiques (résistance ou pause augmentée) permet de différencier les substances affectant le contrôle de la respiration de celles agissant sur la dynamique du poumon (obstruction ou dilatation des voies aériennes, resistance pulmonaire).

Procédures

Les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas pour une période de 30 min à 3 h de stabilisation jusqu’à 24h après l’administration selon le modèle pour évaluer la fonction respiratoire. Le traitement unique avec les candidats médicaments se fait par différentes voies (administration quelques secondes) ou par aérosols (administration pendant quelques minutes). Pour certaines administrations, les animaux subissent une chirurgie de courte durée (1 heure) quelques jours avant le test. A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang (quelques secondes), d’organes ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. La phase d’enregistrement peut engendrer un stress léger chez l’animal dû fait de l'isolement. Certaines conditions d’enregistrement et/ou substances de références peuvent entrainer du bronchospasme, de la bronchoconstriction, de la bronchodilatation, de la toux, de l’hyperventilation. La phase de chirurgie par cathétérisme peut induire une douleur post-opératoire chez l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, s’il y a un prélèvement, les animaux sont tous euthanasiés. S’il n’y a pas de prélèvement, les animaux ayant reçu des substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont euthanasiés. Les animaux n’ayant pas reçu de substances dont l’effet à long terme n’est pas connu sont remis en stock.

Remplacement

Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la fonction respiratoire des animaux vigiles. Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif, et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Si cela est pertinent et afin de réduire le nombre d’animaux, tous les prélèvements d’échantillons biologiques seront réalisées à la fin des évaluations pharmacologiques (et non sur des animaux surnuméraires satellites).

Raffinement

Un soin particulier dans le raffinement des méthodes est assuré et garantit l’utilisation systématique du modèle apportant le maximum de réponses scientifiques et le minimum de souffrance pour l’animal. La pléthysmographie corps entier permet de suivre les paramètres respiratoires sur l’animal vigile en leur laissant une liberté de mouvements. Dans le cas de mesures sur plusieurs heures ou jours, les animaux sont regroupés dans leur cage d'hébergement suite aux premières mesures et seront remis dans les chambres de pléthysmographie pour effectuer la mesure. De l'eau de boisson est à disposition et une poche de complément alimentaire est mis à disposition pour des mesures dépassant 12h. Les animaux peuvent se voir d’une chambre à l’autre. Dès la fin de l’expérience, les animaux sont regroupés ou immédiatement euthanasiés. Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant d'euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, des yeux, la posture, les réactions de l'animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l'appétit, l'état d'hydratation, les tremblements ou convulsions), afin d’assurer d’une part, un bon suivi des animaux et d’autre part, une fin sans souffrance ou angoisse lorsque nécessaire. De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints (détresse respiratoire). Par ailleurs et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement litiére, objets de nidification et à ronger, présence de congénéres. Losque nécéssaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. le progarme d'anesthésie et d'analgésie est défini par un vétériniare afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, température corporelle, appétit). Les méthodes d’euthanasie choisies, le cas échéant, sont sélectionnées pour supprimer toute forme d’angoisse, de stress ou de douleur).

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres respiratoires des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. La substance est généralement administrée à dose unique. Les études des effets de substances sur la fonction respiratoire sont réalisées par pléthysmographie, principalement chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Les tests décrits dans l’ensemble des procédures utilisées dans ce projet ont été caractérisés de façon extensive dans la littérature scientifique et sont mis en oeuvre au sein du laboratoire. Par ailleurs, la méthode de pléthysmographie peut également être un outil de choix pour l’étude de la fonction respiratoire sur des modèles animaux physiopathologiques tels que les souris transgéniques ou des modèles de bronchoconstriction ou d'asthme chez le Rat, le Cobaye ou la Souris. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique

Injectées de toxines bactériennes qui font chuter leur pression artérielle puis les plongent dans le coma, 810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi une IRM de trente minutes sous anesthésie générale. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre la fuite capillaire du choc septique, à partir de protéines repérées chez dix-neuf patients. Le porteur présente le coma comme une limitation de l'inconfort, tout en indiquant que les doses plus importantes retenues ici peuvent engendrer des douleurs physiques et psychologiques avant qu'il ne survienne.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Le projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (EU1). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute) (EU1). Les animaux subiront une IRM d'une durée totale de 30 minutes sous anesthésie générale (EU2). Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). L'imagerie IRM sera réalisée sous anesthésie générale uniquement pour éviter les mouvements de l'animal, et ne sont pas une source de douleur pour la souris. Tout au long du protocole, une administration d’analgésique pourra être réalisée en cas de signes de douleur.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrôme de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection toxines bactériennes. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer ce syndrôme L’injection entraine une baisse de pression artérielle puis une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma). Ce modèle a déjà été testé et mis au point précédemment au laboratoire. Les examens d'imagerie réalisés, quant à eux, sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique.

Devenir

Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.

Raffinement

À la dose utilisée, le choc septique induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation, une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort. Enfin, le transport entre sites sera assuré par un prestataire agréé et durera environ 30 minutes. Les animaux auront accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages seront ventilées et enrichies avec du coton. Un délai entre le transport et l'imagerie sur site sera mis en place pour diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car le protocole précis de syndrome de réponse inflammatoire systémique induit par des sucres mimant des toxines bactériennes est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de cette protéine d'intérêt dans ce modèle de sepsis. Ce projet permettra de visualiser les effets protecteurs de cette protéine sur la fuite capillaire associée au choc septique. Ces expériences permettront de définir si cette protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du syndrome de réponse inflammatoire systémique chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de syndrome de réponse inflammatoire systémique étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.