Recherche appliquée

Six macaques à longue queue subissent chacun deux opérations du crâne de quatre à cinq heures, onze séances d'imagerie sous anesthésie générale et vingt injections directes dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tests comportementaux occupent une heure trente à deux heures par jour pendant quatre à cinq mois, l'accès à la boisson étant contrôlé pour maintenir la motivation des animaux. L'objectif déclaré consiste à cartographier les circuits cérébraux de la motivation et de l'anticipation d'événements déplaisants, puis à mesurer sur ces circuits l'effet d'antidépresseurs et d'anxiolytiques. Trois macaques doivent partir en centre de retraite à l'issue du protocole, les trois autres étant réutilisés dans d'autres procédures, ce que le porteur présente comme une recherche orientée vers les "4R".

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs, il sera réalisé à l'EU1 et au EU2. Ce projet de recherche sera réalisé sur le Macaque, une espèce animale près de l’être humain, afin de répondre à deux principaux objectifs. Dans un premier temps, nous adopterons une approche innovante qui associe l’imagerie cérébrale multimodale à des injections intracérébrales d’agents pharmacologiques dans des territoires sous-corticaux spécifiques. L’objectif de cette méthode est de mieux comprendre le rôle de ces structures dans diverses fonctions cérébrales, telles que l’adaptation comportementale, l’attention et la motivation. Nous nous intéresserons également à leur implication dans l’anticipation de évènements aversifs ou déplaisants, qui déclenchent le refus d’agir ou l’évitement comportemental. Dans un deuxième temps, nous chercherons à déterminer les territoires cérébraux communs entre ces fonctions précédemment listées et les territoires cérébraux impliqués dans la perception de stimuli nociceptifs à l’origine de la perception et du déclanchement des réactions d’évitement face à des stimuli aversifs. L’espoir de ce travail est de mieux comprendre les processus cérébraux impliqués dans l’anticipation et la perception d’évènement déplaisants. Aussi, nous chercherons à déterminer l’influence d’agents pharmacologiques (Antidépresseur, Anxiolytique), affectant la sensibilité de stimuli déplaisants, qui sont fréquemment donnés en complément d’une rééducation motrice ou cognitive, sans que l’on connaisse leur impact sur l’activités des structures et circuits cérébraux impliqués dans leur action thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a été élaboré pour répondre à des questions touchant à la fois nos connaissances fondamentales sur le fonctionnement cérébral, sur la compréhension de pathologies neuropsychiatriques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques tout en adoptant une stratégie de recherche respectueuse de la règle des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement) préconisée pour une recherche sur l’animal à des fins scientifiques. Ce projet offre aussi la possibilité d’obtenir une meilleure compréhension de l’implication des structures sous-corticales, impliquées dans des circuits cérébraux sous-jacents aux processus décisionnels et motivationnels qui guident les comportements d’approche et d’évitement ainsi que les processus attentionnels. Il permettra finalement de déterminer les bases anatomiques et fonctionnelles des circuits de l’anticipation anxieuse d’évènement déplaisant mis en évidence dans cette procédure sur des animaux réalisant des tâches comportementales. Ce projet qui associe l’approche d’imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon) et par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM fonctionnelle) permet de limiter le nombre d’examens pour chaque animal en ne réalisant qu’une seule séance commune (au lieu de 2 : l’une en imagerie TEP et l’autre en IRM fonctionnelle. L’utilisation de la caméra d’imagerie cérébrale multimodale d’imagerie TEP et IRM fonctionnelle associée à l’activation ou la suppression de réseaux neuronaux spécifiques par l’approche de stimulation pharmacologique ciblée, nous apporte de réels bénéfices expérimentaux ainsi qu’un raffinement expérimental très important pour le bien-être des animaux. En effet, grâce à ces approches, nous pouvons maintenant envisager une sortie de protocole de certains animaux, vers un placement de ceux-ci en centre de Retraite, adoptant une recherche moderne orientée vers les 4Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement et Retraite).

Procédures

Les animaux seront soumis à deux séances d’intervention chirurgicale (EU1). Dans les deux cas, l’intervention sera faite sous anesthésie générale et sera d’une durée de 4 à 5 heures. Les animaux auront des examens d’imageries cérébrales, qui nécessiteront une anesthésie générale d’une durée de 2 à 3 heures, représentant une demi-journée par imagerie (EU2). En résumé, sur chaque animal sera réalisé 11 examens d’imageries dont 6 avec injection pharmacologique (durée: 1 munute), sous anesthésie (EU2). Chacun de ces examens étant séparés d’aux moins deux semaines pour ne pas perturber les animaux avec des anesthésies trop fréquentes et rapprochées. Les séances comportementales sur animal vigile et la tâches utilisée permettent d’étudier les effets des injections sur les processus décisionnels, motivationnels et attentionnels (EU1). Pour cela, ces tests comportementaux qui dureront environ 1h30 à 2h quotidiennement, se dérouleront sur une période de 4 à 5 mois, 20 séances d'injections (durée: 1 minute). Un maximum de 2 injections par semaine sera réalisé, en s’assurant à un retour des performances durant les séances contrôle entre chaque jour d’injection.

Impact sur les animaux

La partie habituation/entraînement des animaux peut induire un léger stress au tout début du protocole mais ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes, La seule étape expérimentale pouvant potentiellement être une source de nuisances pour les animaux est l’étape d’intervention chirurgicale lors de l’implantation du système des injections, de par la longueur de l’intervention sous-anesthésie (environ 4 heures). Le risque infectieux est également présent pouvant survenir après quelques jours/semaines. La douleur au réveil peut également être présente. Les injections peuvent être une source de stress et entrainer des petits accidents vasculaires si un vaisseau est atteint.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie. 3 animaux pourront être replacés après avis de bonne santé certifié par notre vétérinaire référent et 3 autres pourront être réutilisés.

Remplacement

Il est judicieux d’utiliser un modèle animal qui mime les mécanismes neurobiologiques et comportementaux observables chez l’être humain. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait donc essentiel pour la réalisation de cette étude préclinique, combinant des approches d’imagerie avec des analyses comportementales. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude préclinique est le plus proche de l’humain. Enfin, le macaque est l’espèce primate la plus souvent utilisée en recherche biomédicale et celle sur laquelle, nous avons réalisé nos études précédentes nous permettant de rester dans les mêmes conditions expérimentales que l’on a déjà validées.

Réduction

On a réduit au maximum le nombre d’animaux en se basant sur des études précédentes. Pour l’imagerie, il faut au moins 6 animaux pour observer une différence significative. Les tests comportementaux sont aussi essentiels. En s’appuyant sur des résultats passés, on vise à détecter une augmentation significative du taux d’essais réalisés. Les logiciels d’analyse montrent qu’avec des injections répétables, 5 injections par molécule sur 6 animaux suffisent. Conclusion : un groupe de 6 animaux permet d’obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Nous utilisons l’IRM anatomique ainsi que l’imagerie TEP pour localiser l’emplacement des structures étudiées ainsi que les sites d’actions des substances utilisées, ce qui nous permet de rapidement cibler et réaliser nos investigations sur les territoires cérébraux les plus pertinents pour notre étude. L’ensemble des procédures invasives sont réalisées avec un contrôle de la douleur et du bien-être. Les chirurgies réalisées mettent en place une anesthésie et des traitements pré et post opératoires adaptés. Les observations et tests comportementaux sont réalisés grâce à des récompenses hydriques qui motivent l’animal. Un contrôle de la prise de boisson est réalisé de sorte que l’animal soit motivé par les tâches comportementales, sans affecter sa santé ou son bien-être. Par exemple, l’utilisation de jus de fruit, plus motivant permet d’alléger, voire complètement supprimer la restriction hydrique en donnant un accès libre à une source d’eau. Des points limites seront définis et appliqués concernant le contrôle hydrique et la douleur de l’animal. Finalement, la philosophie de notre laboratoire est de pratiquer un raffinement continu des pratiques d'expérimentation ainsi que d’améliorer le bien-être animal dans leur environnement d'hébergement. Ainsi les animaux sont hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d'enrichissement. Concernant le transport jusqu’à l'EU2, Les animaux seront anesthésiés dans la pièce d’hébergement puis transportés en rapidement en véhicule (10min) jusqu’au centre d’imagerie. Les constantes physiologiques seront surveillées durant le transport. Des bouillottes et des couvertures seront installées.

Choix des espèces

Le macaque est le modèle animal préclinique le plus près de l’être humain dans l’expression des comportements, de son anatomie cérébrale et des modèles de pathologies neuropsychiatriques déjà produits sur cette espèce. D’autres parties de ces travaux ont déjà été réalisées chez le rongeur rendant inutile un retour à cette espèce. Il est cependant nécessaire pour une transposition à l’être humain que ce projet soit réalisé sur une espèce animale plus près de l’être humain. Ceci est particulièrement important puisque les différentes structures internes du cerveau qui sont étudiés dans ce projet ont pris énormément d’expansion et se sont spécialisés, ce qui peut entraîner de grandes différences dans les troubles pouvant être générés entre ces espèces. La spécialisation de certaines structures dans le contrôle du regard chez les primates, est un exemple d’habilitée propre au primate, que l’on ne retrouve pas chez les rongeurs. Pour maximiser la qualité des enregistrements d’imagerie cérébrale, nous sélectionnerons les animaux ayant la masse musculaire au-dessus du crâne la moins importante, ce qui correspond à des animaux de moins de 6 ans.

972 souris vont être utilisées, chacune pouvant passer jusqu'à trois séjours de 96 heures isolée en cage métabolique sur trois mois, à jeun seize heures avant chaque expérimentation. Elles reçoivent quinze administrations par voie orale en un mois, jusqu'à six anesthésies et jusqu'à trois prises de sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Les animaux homozygotes développent l'hypercalcémie recherchée, et le porteur affirme sur la base d'expériences antérieures qu'aucune nuisance n'est attendue, ne retenant comme stress que l'isolement en cage métabolique. Les points limites prévus décrivent pourtant une absence de gain de poids à la puberté, une incapacité à s'alimenter, un poids inférieur de plus de 15 % et des poils hérissés, autant de signes qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois), mise à jeun 16H avant l’expérimentation, administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise). Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule. Amendement : Mise à jeun (sans restriction hydrique) la veille des expériences de cages métaboliques afin d’éviter les fluctuations des résultats

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient etre administres selon les recommendations veterinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques avec mise à jeun, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée. Le jeûne (mise à jeun) avant la récolte d'urine et de sang est nécessaire pour garantir des résultats précis. Il permet d'éviter les fluctuations biochimiques sanguins tel que glycémie, des lipides et des hormones causées par l'alimentation, qui pourraient fausser les analyses. Cela assure une meilleure interprétation des résultats et une reproductibilité.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

Légèrement immunodéficientes pour tolérer des neurones d'une autre espèce, les souris de ce projet reçoivent des greffes de neurones de cervelet humains, de primates non-humains et de souris. 985 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par chirurgie terminale sous anesthésie pour prélever leur cerveau. La greffe se fait soit in utero, la mère gestante étant opérée sous anesthésie générale pendant moins de quinze minutes avec injection dans le cerveau des fœtus, soit par injection dans le ventricule cérébral du souriceau nouveau-né. Le porteur revendique une approche qui évite l'expérimentation sur des primates non-humains et sur des humains, et annonce 985 animaux au maximum sans détailler le calcul qui aboutit à ce chiffre.

Objectifs

Le développement des neurones du cervelet des espèces de primates, dont l’espèce humaine, reste largement inexploré, malgré l’implication du cervelet dans des troubles cognitifs (autisme), du langage (dyslexie), et moteurs (ataxies). En particulier, se pose la question de propriétés propres aux neurones humains et de primates comparés aux autres espèces animales, dont la souris. Pour répondre à cette question, des protocoles de différentiation in vitro de cellules souches humaines en neurones du cervelet ont été publiés. Cependant, ces approches ne récapitulent pas le développement et l’anatomie normales du cervelet (mauvaise organisation ou absence de certaines structures anatomiques, croissance des neurones limitée, absence de stimulations sensorielles). C’est pourquoi nous proposons de créer un modèle de greffe de ces neurones humains, primates et de souris dans le cervelet de souris. Cette approche permettra d’étudier les propriétés propres aux neurones de cervelet de ces différentes espèces, sans expérimentation sur des individus humains et primates non-humains. Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous dans l'arbre de parenté entre espèces. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les propriétés propres aux neurones cérébélleux humains. Le développement de notre modèle de greffe permettra d’étudier in vivo des neurones d'espèces variées dont de primates non-humains et humains dans un contexte pathologique (spectre autistique, ataxie cérébelleuse, dyslexie). Il pourrait ainsi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles. La greffe elle-même pourrait aussi être envisagé comme approche thérapeutique pour les troubles du cervelet humain et des autres espèces de Mammifères.

Procédures

Procédure 1: greffe in utero sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection cérébrale sur foetus (

Impact sur les animaux

La greffe in utero est une technique chirurgicale qui peut entrainer une douleur et un stress modérés pendant l’opération (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et utilisés dans les procédures décrites pour analyses histologiques.

Remplacement

Les modèles in vitro différentiés à partir de cellules souches humaines sont encore trop immatures, manquent certaines structures anatomiques, et de stimulation sensorielle, ce qui ne sera pas le cas in vivo. De plus, notre étude in vivo pourrait permettre d’augmenter nos connaissances pour améliorer les protocoles de différentiation in vitro.

Réduction

Ce projet nécessitera au maximum 985 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. De plus, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans des cages ventilées d'une surface adéquate, dans un environnement enrichi, et changés sous flux d'air. Soins spécifiques apportés à la mère gestante. La greffe in utero est effectuée dans une pièce dédiée, après désinfection de la mère, sous analgésie locale et générale, et anesthésie, en température contrôlée (

Choix des espèces

Notre approche permet d’étudier les propriétés propres aux neurones du cervelet d’espèces de primates non-humains et humains sans avoir recours à l’expérimentation sur des animaux primates. Une option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré telle que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-mammifères est trop divergente comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences et envisager une bonne intégration dans des réseaux différents de ceux des Mammifères. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et au stade postnatals critiques dans le développement des neurones du cervelet de souris et humain.

Tués à cinq jours de vie pour prélever leurs tissus, 42 rats nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque raton reçoit quatre administrations de bixafen, un fongicide agricole, directement dans la cavité abdominale sous anesthésie générale, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer une douleur légère. L'étude est présentée comme exploratoire, destinée à récolter des résultats préliminaires pour de futures études, le bénéfice pour les populations exposées aux pesticides étant renvoyé au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme que les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales, ce qui "implique donc le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides utilisés contre des champignons, largement utilisés actuellement en agriculture, impactent également des cellules humaines. Ce manque de spécificité d’espèces pourrait poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, le bixafen réduit fortement la consommation d’oxygène des cellules. Dans le contexte du cerveau en développement, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la consommation en oxygène des barrières protectrices du cerveau, provoquée par une exposition au Bixafen, est un facteur de risque méconnu de maladies du développement cérébral. Le premier objectif de cette étude exploratoire est de récolter des résultats préliminaires pour de futures études sur les effets toxiques pour le cerveau en développement des expositions à ces pesticides utilisés contre des champignons.

Bénéfices attendus

Le projet permettra l'acquisition de connaissances inédites concernant l'impact d'une famille de pesticide sur le développement du cerveau humain. A terme, ces connaissances permettront le développement de politique de santé publique qui bénéficieront aux professionnels et aux populations exposés à ces pesticides.

Procédures

Les animaux seront exposés à un pesticide par administration directe dans la cavité abdominale. Cette administration dure 5 secondes et est réalisée sous anesthésie générale. Chaque animal sera soumis à 4 administrations sur l'ensemble de la procédure.

Impact sur les animaux

L'administration directe dans la cavité abdominale est susceptible de provoquer une douleur légère chez les ratons, anticipée par une anesthésie générale. La manipulation des animaux est suscpetible d'engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux des portées sont mis à mort à 5 jours post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi. Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites concernant la perte de poids ont été définis et seront appliqués. L’administration directe dans la cavité abdominale est réalisée sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement qui requiert une optimisation de la gestation. Cette lignée a des portées nombreuses et récurrentes. Le projet prévoit d’utiliser des ratons entre 1 et 5 jours afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Une société agroalimentaire cofinance ce projet pour développer un complément alimentaire réduisant la fatigue cognitive liée au sport intensif. 1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles courent une heure sur tapis cinq jours par semaine pendant huit semaines, puis passent six tests comportementaux de deux à dix minutes étalés sur deux semaines, censés mesurer leur état émotionnel et leur mémoire. Le porteur indique que ces tests induisent des stress modérés et que l'entraînement provoque une fatigue, sans nommer aucun des six tests, et rattache le tout à des extraits d'algues destinés à des sportifs adultes.

Objectifs

L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs d'une société agroalimentaire qui cofinance ce projet est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, l'objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un extrait végétal sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Le milieu marin constitue la plus grande partie de la biosphère et contient les formes les plus anciennes et variées de la vie. Cette diversité de vie et d'environnements atypiques ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles molécules bio-actives. Les organismes marins, et notamment les algues marines possèdent un immense potentiel de molécules originales d'intérêt biologique. Ainsi, les extraits d’algues, qui contiennent des molécules aux potentiels bioactifs représentent une stratégie nouvelle. Ainsi, l'objectif de ce nouveau projet sera de tester si l'alimentation de souris avec ces extraits d'algues incorporés dans les croquettes permet de prévenir les troubles émotionnels et mnésiques associés au surentrainement sportif.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que ce projet permette de mettre en évidence un effet protecteur d'un ou plusieurs extraits d'algue sur les troubles de la santé cérébrale assiciés au surentrainement physique.

Procédures

Les animaux seront entrainés à courir sur des tapis de course pendant 1h 5 jours par semaine pendant 8 semaines avant de réaliser 6 tests comportementaux durant chacun entre 2 et 10 minutes, étalés sur 2 semaines (3 tests par semaine), permettant d'étudier leur état émotionnel et leur mémoire.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests. L'entrainement physique des animaux induira une fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biochimiques qui permettront d'étudier les mécanismes neurobiologiques des extraits d'algue.

Remplacement

Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et de résignation, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires ne peut pas non-plus être modélisé in vitro

Réduction

Le nombre d'animaux sera reduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des differences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien-être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la cellule SBEA. La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et du bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois). Les expérimentations seront réalisées sur des animaux adultes, la finalité du projet étant d'étudier l'impact des extraits d'algues sur des sportifs adultes.

Tester pour des industriels des stents, guides, cathéters et coils sur des artères saines, avant leur usage chez l'être humain : 50 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit au moins deux anesthésies générales, l'implantation du dispositif par un abord vasculaire à l'aine qui peut être douloureux, et un ou plusieurs contrôles d'imagerie de quarante-cinq minutes, jusqu'à quatre dispositifs pouvant être posés dans un même animal. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou ex vivo ne reproduit l'endothélialisation, la coagulation et la pression sanguine réelles, et conclut que l'utilisation d'animaux est "indispensable". Tous sont tués pour prélever les vaisseaux porteurs des dispositifs, mais avant la mise à mort, toujours sous anesthésie, l'animal peut servir jusqu'à quatre heures à la formation d'internes en chirurgie au titre d'un autre projet.

Objectifs

Le traitement endovasculaire de pathologies cardio-vasculaires (anévrismes, sténoses, dissection) nécessite souvent le recours à des dispositifs endovasculaires (stents, guides, cathéters, coils....). Cependant, l’utilisation de ces dispositifs n’est pas sans risque notamment de lésion artérielle lors de leur navigation ou d’efficacité modérée à long terme due à un défaut d’endothélialisation des dispositifs médicaux implantables. Afin d’optimiser les stratégies endovasculaires, les industriels et notre laboratoire développent de nouvelles technologies de ces dispositifs afin d’améliorer leur sécurité et la cicatrisation biologique. La composition et/ou la conformation de ces dispositifs sont améliorés afin d’optimiser leurs performances, ou de nouveaux dispositifs sont développés afin de s’affranchir de la double anti-agrégation plaquettaire. L’adjonction d’un traitement médicamenteux pourrait également permettre de favoriser cette cicatrisation. Le projet consiste à étudier la sécurité, la conformabilité, la biocompatibilité et/ou l’endothélialisation de dispositifs endovasculaires (implantables ou non) sur artères saines (accompagné ou non par l’adjonction d’un traitement médicamenteux). Ce projet, qui sera scindé en plusieurs études, utilisera des contrôles par artériographie, OCT, dynaCT et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien. L’analyse sur artères saines permettra d’analyser les lésions ou cicatrisations endothéliales en rapport avec l’utilisation des dispositifs.. Cela permettra, au sein d’un même animal, de comparer plusieurs (1 à 4) dispositifs à la suite l’un de l’autre (sans chevauchement) et dans différents vaisseaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’effectuer des analyses non réalisables chez l’être humain afin évaluer la faisabilité de navigation ou d'implantation, sécurité et/ou réponse biologique in vivo liés à l’utilisation de dispositifs endovasculaires. Il permettra notamment d’évaluer l’efficacité et la sécurité du dispositif dans des conditions proches de l’humain. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa thrombogénicité, apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les indications du dispositif avant de l’utiliser chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à au moins 2 procédures sous anesthésie générale : l’implantation du dispositif et le contrôle avant la mise à mort. Un ou plusieurs contrôles intermédiaires (imagerie à rayons X avec possibilité d'imagerie optique nécessitant un abord artériel et/ou prélèvement sanguin) pourront être effectués d’une durée attendue de 45 min.

Impact sur les animaux

L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. L'implantation du dispositif (intravasculaire) nécessite un abord vasculaire au niveau de l'aine pouvant entrainer des douleurs à l'animal. Le dispositif, une fois implanté, est indolore pour l'animal. Le risque post-implantation est la formation de caillots sanguins sur le dispositif, pouvant entrainer des effets adverses..

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour le prélèvement des vaisseaux portant les dispositifs. Néanmoins, avant la mise à mort, l’animal toujours sous anesthésie générale et analgésie, pourra être utilisé à des fins de formation d’internes de chirurgie dans le cadre d’un autre projet autorisé (pour une durée inférieure à 4 heures). L’animal est ensuite mis à mort.

Remplacement

Le projet consiste à étudier la conformabilité, la biocompatibilité et/ou l’endothélialisation de dispositifs endovasculaires sur artères saines (accompagné ou non par l’adjonction d’un traitement médicamenteux) dans des conditions in vivo. Aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet de reconstruire un modèle proche de ces conditions en ce qui concerne l’endothélialisation, la coagulation, la pression sanguine, les contraintes liées au déploiement du dispositif ou le suivi après ces laps de temps. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est ainsi indispensable.

Réduction

Ce projet est à visée exploratoire et a pour objectif l'obtention de résultats préliminaires au cours d'études de faisabilité et de sécurité. Pour chaque étude, le nombre minimal de cochon sera utilisé. Ainsi, pour chaque dispositif testé, de 1 cochon à 10 cochons seront utilisés par condition. Par ailleurs, l’implantation chez le même cochon de plusieurs dispositifs pourra éventuellement servir de contrôle et diminuer le nombre de cochons nécessaires. En fin de procédure, et si l’état de l’animal le permet, et tout en conservant l’animal sous anesthésie générale, il peut être prévu d’effectuer d’autres manipulations dans le cadre de formations de chirurgie, encadrées par une autorisation de projet distincte de celle-ci

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La biologie de la néoendothélialisation des dispositifs implantables est bien étudiée chez le cochon et similaire aux mécanismes humains. Par ailleurs, la taille des vaisseaux du cochon est similaire à celle des vaisseaux humains, où sont navigués et ou implantés les dispositifs étudiés. Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg)..

Pour renforcer des lymphocytes T et NK contre la leucémie aiguë myéloblastique, 144 souris NSG immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de procédure pour l'étude du sang, de la rate et de la moelle osseuse. Chacune subit une irradiation corporelle totale sous anesthésie générale, deux à cinq injections intraveineuses de cellules leucémiques ou effectrices, sept injections de luciférine, sept séances de bioluminescence et sept prises de sang par voie rétro-orbitale. La xénogreffe de cellules souches humaines peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte atteignant la peau, le foie et l'intestin, et une leucémie très avancée peut provoquer des douleurs osseuses. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré, puisqu'il interférerait avec le système immunitaire étudié, et que si des morphiniques devenaient discutables, l'animal serait tué plutôt que soulagé.

Objectifs

Ce projet vise à développer de nouvelles approches pour renforcer l’efficacité des cellules immunitaires contre les cancers du sang, en particulier la leucémie aiguë myéloblastique. Cette maladie est agressive et présente un fort risque de rechute après une greffe de moelle osseuse. Nous explorons deux stratégies complémentaires : (1) Une modification génétique : Nous modifions les cellules immunitaires pour leur faire exprimer des récepteurs spécifiques leur permettant de reconnaître et d’attaquer plus efficacement les cellules cancéreuses. (2) Une approche biochimique innovante permettant fixer chimiquement des molécules à la surface de cellules immunitaires, afin d’améliorer leur capacité à repérer et détruire les tumeurs. Avant d’envisager une application clinique, il est indispensable de valider ces stratégies dans un modèle préclinique. In vitro, ces deux stratégies se sont déjà révélées hautement efficaces. L’expérimentation animale, en particulier sur des souris immunodéficientes, est essentielle pour évaluer leur efficacité et leur sécurité dans un organisme vivant. Cette étape permettra de mieux comprendre comment ces cellules modifiées interagissent avec leur environnement et d’identifier d’éventuels verrous empêchant nos stratégies de fonctionner in vivo.

Bénéfices attendus

Les approches développées dans ce projet pourraient améliorer les traitements des cancers du sang en rendant les cellules immunitaires plus efficaces et mieux ciblées. Les bénéfices attendus incluent : (1) Une meilleure efficacité des thérapies cellulaires : Grâce aux modifications génétiques et biochimiques, les cellules immunes seront capables de reconnaître et d’éliminer plus efficacement les cellules cancéreuses, réduisant ainsi le risque de rechute. (2) Des alternatives aux traitements actuels (3) Un impact potentiel au-delà des cancers du sang : Ces innovations pourraient être adaptées à d’autres types de cancers, comme les lymphomes B ou les tumeurs solides, en ciblant des récepteurs spécifiques. (4) Des avancées pour les greffes de moelle osseuse : En exploitant les différences génétiques entre donneur et receveur, il serait possible d’optimiser l’effet anti-leucémique. Si ces stratégies se révèlent efficaces et sûres, elles pourraient être testées dans des essais cliniques chez l’homme, avec pour objectif final d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteints de cancers hématologiques agressifs.

Procédures

Irradiation corporelle totale sous anesthésie générale : 1 fois ; Injection intraveineuse de cellules génétiquement modifiées, sous anesthésie générale (lignées leucémiques, effecteurs) : 2 à 5 injections selon les procédures ; Injection intrapéritonéale de luciférine : hebdomadaire, 7 fois ; Bioluminescence : hebdomadaire, non invasif, sous anesthésie générale, 7 fois ; prise de sang sous anesthésie générale + locale: hebdomadaire, 7 fois

Impact sur les animaux

La gravité attendue des diverses procédures est faible à modérée (irradiation, injection intraveineuse (IV) de cellules leucémiques / lymphomateuses / ou de cellules souches hématopoïétiques, injection IV des cellules effectrices, bioluminescence et prise de sang hebdomadaire sous anesthésie par voie retro-orbitale). Nuisances prévues : - le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress modéré et transitoire - l’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux - les injections intraveineuses (cellules) et intrapéritonéales (luciférine) peuvent provoquer un stress transitoire - l’enregistrement de la bioluminescence peut provoquer un stress - les prélèvements sanguins peuvent provoquer un stress et une douleur - le développement de cancer du sang (leucémie et lymphome) chez la souris peut entrainer, dans de rares cas de maladie très avancée, des douleurs osseuses - la xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut entrainer une réaction de type maladie du greffon contre l’hôte avec atteinte cutanée, hépatique et intestinale

Devenir

La totalité des animaux ayant reçu l’injection d’une lignée leucémique ou une xénogreffe de CSH seront euthanasiés en fin de procédure, pour étude tissulaire (sang total / rate / moelle osseuse).

Remplacement

Nos travaux de recherche s’inscrivent dans une dynamique de transfert des connaissances vers la clinique avec le développement de nouvelles immunothérapies basées sur les lymphocytes pour soigner des hémopathies. La validation de nos modèles nécessite d’être éprouvée dans un modèle animal. La souris NSG immuno-déprimée est un modèle adapté qui permettra de répondre sur le gain en efficacité anti-tumorale de ces immunothérapies. Nous avons déjà validé l’efficacité de ces immunothérapies contre de nombreuses lignées leucémiques et des bastes primaires in vitro. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de leur efficacité une fois injectées dans un organisme.

Réduction

Dans le cadre de notre engagement éthique à réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales, la détermination a priori de l'effectif des lots n'est pas réalisable compte tenu du caractère novateur et exploratoire de notre étude pilote. L'effectif des groupes sera déterminé de manière à maintenir une puissance statistique suffisante tout en minimisant strictement le nombre d'animaux utilisés. Des analyses statistiques seront effectuées a posteriori, en privilégiant des méthodes adaptées aux très petits échantillons.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Par ailleurs, chez l’humain, le développement d’une leucémie aiguë n’est généralement pas source de douleur, sauf en cas de maladie très avancée où des douleurs osseuses peuvent apparaitre. La xénogreffe de cellules souches hématopoïétiques humaines peut se compliquer de maladie du greffon contre l’hôte, avec une atteinte possible cutanée, digestive ou hépatique. Enfin, la transplantation de cellules NK humaines ne se complique pas de maladie du greffon contre l’hôte. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. L’échelle de points limite utilisée sera une échelle habituellement utilisée dans les modèles de xénogreffes. En cas d’atteinte d’un signe clinique sévère, ou de deux signes cliniques notables, l’animal sera euthanasié. L’administration d’anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce protocole car ce traitement interagirait avec le système immunitaire des souris, qui est l’objet de la présente étude. Si l’administration d’antalgiques morphiniques était amenée à être discutée (douleur forte sur leucémie aiguë avancée sans possibilité d’amélioration, signifiant l’échec du traitement), l’animal serait euthanasié.

Choix des espèces

L’objectif étant de cibler un antigène humain, l’utilisation de souris immuno-déficientes permettant l’implantation de cellules tumorales humaines est essentielle. Nous avons donc choisi de travailler sur des souris NSG. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines. Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes afin de se placer au plus près des conditions du développement tumoral chez l’humain.