Recherche appliquée

La douleur est évaluée une fois par semaine, des points limites devant entraîner la mise à mort des souris qui se dégradent. 1 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Une chirurgie sous anesthésie générale implante des cellules tumorales dans le pancréas, puis viennent des échographies hebdomadaires sous anesthésie, une à deux séances de champs électriques pulsés par semaine et des injections dans la tumeur ou dans l'abdomen, chaque animal portant une électrode et son connecteur. L'objectif déclaré est de rendre l'environnement dense de la tumeur perméable à la chimiothérapie, les essais chez des personnes atteintes d'un cancer du pancréas étant renvoyés à plus tard.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic à cause d’un environnement tumoral dense empêchant la chimiothérapie d’atteindre sa cible, et d’une résistance à l’action du système immunitaire. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie et aux autres traitements d’être plus efficace. L’objectif de l’étude est d’observer si l’utilisation d’une thérapie par champ électrique pulsé permet de modifier l'environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains, en rendant les cellules tumorales plus perméables à la chimiothérapie et plus sensible à l’action du système immunitaire et ainsi améliorer l’efficacité des traitements existants. Ce projet est multi-site, l'implantation de tumeurs dans le pancréas se faisant dans l'animalerie 1, les examens et la suite du projet sont réalisés dans l'animalerie 2.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le traitement par champ électrique pulsé et réversible ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais thérapeutiques ultérieurs chez des patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Intervention chirurgicale sous anesthésie générale (15 min maximum/souris) pour l’implantation des cellules tumorales. Alternativement, injection sous-cutanée de cellules tumorales (15 sec/souris). Suivi hebdomadaire de croissance tumorale par échographie sous anesthésie (8 min/souris). 1 à 2 traitements par champs électrique pulsé et réversible une fois par semaine (3 min/souris). Pour certains animaux, injection intrapéritonéale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine) ou injection intratumorale de traitement (10 sec/souris, 1 à 2 fois par semaine). Mesures de certains paramètres par injection intra-abdominale ou injection intraveineuse (20 min/souris, sous anesthésie générale), suite à une injection sous-cutanée d’antalgique 30 min avant (10 sec/souris).

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer une perte de poids et des signes de souffrance. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical. L’injection sous-cutanée de cellules tumorales cause une douleur modérée et un stress. Le suivi de la croissance tumorale hebdomadaire sous anesthésie peut causer du stress chez la souris. Les traitements par champs électrique peuvent causer un stress chez les animaux et des douleurs modérées. Les injections sous-cutanées pour soulager la douleur ou intrapéritonéales et intratumorales pour le traitement peuvent causer une douleur légère chez la souris. Les injections intrapéritonéales pour la réalisation de mesures invasives peuvent causer des douleurs et un stress pour les animaux. Le transport entre les animaleries 1 et 2 peut provoquer un stress léger. La présence de l'électrode et connecteur peuvent causer un inconfort léger chez la spuris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, pour analyses ex vivo des organes.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer les réglages à utiliser pour les champs électriques pulsés et réversibles et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral permise par un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentielles et limitant le degré de souffrance des souris, les tumeurs étant détectées très tôt.

Raffinement

Le suivi de la douleur sera réalisé une fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort de l’animal si nécessaire. Un suivi est prévu toutes les semaines en post opératoire et après injection des traitements. L’échographie sera réalisée sous anesthésie générale, à celle-ci on ajoutera une analgésie adaptée lors de la chirurgie et des traitements et mesures. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages disposant d’enrichissement. Le transfert des souris de deux établissements est réalisé dans des boites de transport simples car ces deux animaleries étant localisées dans le même bâtiment au même étage. Les animaux ne restent pas plus de 30 minutes en boites de transport et ne sortent pas à l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle permettant de mimer les tumeurs du pancréas humaines. Les souris seront utilisées à partir de l’âge adulte (8 à 10 semaines) afin de documenter l’impact des traitements sur un organisme mature.

1 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales leur sont injectées sous anesthésie, elles passent trois séances d'imagerie par semaine, subissent une irradiation localisée de la tumeur et, pour certaines, l'ablation chirurgicale de la tumeur primaire. Le porteur reconnaît que la croissance tumorale et les traitements réduisent la mobilité et affaiblissent les animaux, et espère montrer que des modulateurs du système immunitaire rendent le cancer du sein triple négatif sensible à la radiothérapie. Cet effectif de 1 660 souris n'est adossé à aucune donnée publique, le porteur indiquant qu'un "outil informatique" a servi à le calculer.

Objectifs

Le cancer du sein est la principale cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde. En raison du manque de cibles thérapeutiques, le cancer du sein triple négatif (TNBC) est le sous-type le plus agressif et résistant aux thérapies standard. L'un des traitements courants du TNBC est la radiothérapie, mais la radiorésistance est un obstacle majeur dans cette malignité. Parmi tous les composants du microenvironnement tumoral, les cellules du système immunitaire sont hautement recrutés lors de la radiothérapie et des données antérieures suggèrent qu'ils sont associés à la résistance des cellules tumorales. Ici, nous prévoyons de comprendre le rôle des cellules du système immunitaire dans la modulation de la radiorésistance du cancer du sein et de valider les mécanismes associés. L'objectif principal de ce projet est donc d'identifier de nouvelles cibles (comme récepteurs sur les cellules) pour le développement de thérapies de sensibilisation à la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Dans ce projet et à court terme, nous évaluerons l'efficacité antitumorale des modulateurs du système immunitaire dans la sensibilisation à la radiothérapie. Nous espérons démontrer la bonne efficacité de l'association de modulateurs du système immunitaire et de la radiothérapie pour obtenir des effets antitumoraux. À long terme, cette combinaison représente un modèle original et novateur de coopération thérapeutique dans la lutte contre le cancer du sein.

Procédures

Les animaux auront une injection de cellules tumorales (durée 1 minute, sous anesthésie générale). Les animaux auront 3 séances d'imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée 10 minutes) par semaine. Les animaux subiront une irradiation localisée sur la tumeur par animal sous anesthésie générale (durée 10 minutes). Au cours de chaque injection de cellules et radiotherapie, les souris seront anesthésiées (anesthésie générale). Certaines souris auront des injections de médicament (n=2, anesthésie locale, durée 1 minute). Les tumeurs primaires seront retirées de certains animaux sous anesthésie générale (n=1, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement ainsi que la façon dont croît la tumeur peuvent réduire la mobilité de la souris et affaiblir la souris, avec des retentissements locaux ou systémiques modérés. Les animaux subiront aussi du stress lors des préhensions pour examen, des injections sous anesthésie générale et des séances d'imagerie, qui leur occasionneront un stress ou une douleur légers et temporaires.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem pour étudier les modifications/mécanismes biologiques induits par les différents traitements.

Remplacement

Les modèles animaux sont également necessaires pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte incluant le environnement tumoral, permettant aux cellules tumorales d'interagir avec l'environnement (incluant les cellules immunitaires dépendantes des médiateurs de type cytokine ou les cellules du reste de l'organisme). Ceci est important dans le contexte de la radiothérapie (par exemple, l'effet « bystander » de l'irradiation, c'est-à-dire les effets que les cellules irradiées peuvent exercer sur les cellules non irradiées à proximité ou à distance). Il n'existe pas de modèles de remplacement pour une telle étude.

Réduction

Les effectifs sont ramenés au minimum tout en gardant un effet statistique significatif. Un outil informatique a été utilisé pour calculer le nombre d'animaux nécessaires tout en prenant en compte des données préliminaires.

Raffinement

Toutes les interventions seront menées sous anesthésie locale ou générale. Un suivi quotidien clinique sera effectué. Des points limites précoces et précis ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi. De plus, en cas de perte de poids ou de sign d'affaiblissement, les animaux auront un aliment énergétique adapté, plus préhensile.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques: -La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. -Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue -Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. -Les modèles de tumeur étudiés sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité. Les souris seront âgées de 6 à 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature. En effet, le cancer du sein apparaisse durant l'age adulte, l'utilisation de souris adulte permet donc de mimer au mieux l'environnement dans lequel se développe le cancer.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection et un prélèvement de sang sous anesthésie locale, puis une irradiation sous anesthésie générale, à des doses variables, pour comparer la radiothérapie flash à la radiothérapie conventionnelle sur trois tissus sains : poumon, intestin, peau. Les atteintes annoncées vont de la perte d'appétit à une perte de poids "légère à sévère", avec difficultés respiratoires, isolement, diarrhée et lésions cutanées inflammées. Le porteur présente la technique testée comme "l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie" et une "véritable révolution", et juge "urgent" de lancer ces programmes précliniques.

Objectifs

Les traitements par radiothérapie conventionnelle ont la difficulté d'arriver à délivrer une irradiation localisée avec une dose suffisante pour l’éradication de la tumeur tout en préservant les tissus sains environnants. Actuellement, les techniques d’irradiation médicale permettent de limiter l’atteinte des tissus sains sans toutefois l’éviter et les combinaisons de r&diothérapie avec les médicaments de chimiothérapie tendent à exacerber les effets secondaires. La raduithérapie flash est une nouvelle technique qui consiste à délivrer une forte dose à un très haut débit de dose (4500 à 9000 fois plus élevé, et beaucoup plus rapide) permettant une réponse anti-tumorale efficace tout en épargnant les tissus sains, limitant ainsi les toxicités liées à l’irradiation. À l'heure actuelle, elle est reconnue comme l'une des avancées les plus prometteuses en radio-oncologie, à la croisée des chemins entre technologie, physique, chimie et biologie, et considérée comme une véritable révolution dans le domaine de l’oncologie. Cette nouvelle modalité d’irradiation prévoit de remplacer d’ici à 4-5 ans les séances de radiothérapieconventionnelles par un ou quelques séances d’irradiations flashs de moins d’une seconde, beaucoup plus précises et efficaces mais surtout avec une moindre toxicité sur le tissu sain. Cependant, les mécanismes biologiques restent mal compris et les limites de l’effet flash (en dose par séance, en débit de dose…) mal définis et il devient donc urgent de lancer des programmes de recherche pré-clinique et translationnelle visant à mieux comprendre et optimiser le transfert en clinique de cette nouvelle technique. Dans ce projet nous avons fixé deux objectifs: 1-Valider l'effet flash sur plusieurs modèles de toxicité radio-induite, à savoir, la toxicité pulmonaire, la toxicités intestinale et la toxicité cutanée. 2-Etudier les mécanismes biologiques impliqués dans cet effet flash.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme consistent à fournir un rationnel préclinique et une preuve de concept pour la validation de l'utilisation de la radiothérapie flash en clinique. A travers ce projet nous visons à assurer un meilleur transfert en clinique de la radiothérapie flash et en toute sécurité pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une injection (durée 1 minute, anesthésie locale) et un prélèvement de sang (durée 1 minutes, anesthésie locale). Ils auront aussi des irradiations à des doses différentes (une fois par animal, durée de 1 à 10 minutes, sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort et ou un stress léger lié à la manipulation des animaux pour les préparer au traitement de radiothérapie. En raison des effets secondaires de la radiothérapie, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social. De plus une perte de poids légère à sévère peut être observée chez les animaux ayant reçu le traitement de radiothérapie. Les nuisances induites peuvent être différentes en fonction de l’organe/tissu irradié. Certains animaux pourront perdre présenter une perte de poids modérée après irradiation. De plus, une difficulté respiratoire peut être observée chez ces animaux, associée à un comportement d’isolement. Une diarrhée peut (rarement) survenir chez les animaux irradiés. Certains animaux pourront développer une toxicité cutanée qui se manifeste sous forme de lésions inflammées de garde léger à modéré comme celles observées chez les patients.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour analyses des effets de la radiothérapie flash sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer les effets de la radiothérapie flash sur les tumeurs et sur les tissus sains, en comparaison avec la radiothérapie conventionnelle. Ceci exige donc un système biologique dynamique complet en interaction direct avec le microenvironnement de la tumeur. L’étude du recrutement des cellules immunitaires dans le site irradié ainsi que leurs interactions complexes nécessitent le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être modélisé in vitro ni in silico

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire et suffisant.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux principes éthiques les plus stricts pour minimiser la douleur, l'angoisse et le stress chez les animaux. Une anesthésie locale ou générale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement, au minimum de façon hebdomadaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont adultes. Les études des mécanismes biologiques, impliquant des voies de signalisation moléculaires et cellulaires différentes, nécessite d’avoir recours à un organisme adulte présentant des tissus/organes matures.

L'abdomen de chaque souris est ouvert sous anesthésie pour implanter des cellules tumorales dans la paroi du cæcum ou dans le foie, en quinze minutes. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des traitements injectés trois fois par semaine pendant trois semaines et deux séances d'imagerie hebdomadaires. Toutes sont tuées à la fin, y compris celles dont la tumeur régresse totalement et qui sont alors gardées deux mois de plus sous surveillance par imagerie. Le porteur range ces injections répétées et les anesthésies parmi les nuisances "fugaces" et "passagères", tout en reconnaissant que la croissance des tumeurs et l'apparition des métastases sont elles-mêmes sources de souffrance.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des systèmes de blocage pour inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale (ex : anti-PD1). Des thérapies ciblant l’inactivation de PD1 ont été développées pour rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements. Notre projet a pour but de démontrer que la déplétion des cellules CD4 de la souris permet à cette thérapie anti-PD1 d’être efficace contre les tumeurs implantés dans leur organe d’origine. En effet, la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 a déjà été montrée efficace dans des tumeurs implantées en sous-cutanée dans la souris. Le microenvironnement jouant un rôle important dans la réponse anti-tumorale, nous nous proposons ici d’évaluer l’efficacité thérapeutique de la déplétion des cellules CD4 associée à la thérapie anti-PD1 dans un modèle de cancer du côlon et dans un modèle de métastase hépatique d’origine colique.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses anti-tumorales grâce au blocage des « immune checkpoints » a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré dû à la présence de résistances à ces thérapies. Ce projet permettra donc de montrer l’implication des lymphocytes T CD4 dans la résistance aux traitements anti-PD1 et ainsi de confirmer l’intérêt de trouver et de tester des molécules bloquant ces cellules chez l’Homme afin d’améliorer les thérapies anti-cancéreuses.

Procédures

Les modèles nécessiteront l’utilisation d’une procédure chirurgicale (sous anesthésie gazeuse) afin d’implanter les cellules tumorales. Cet acte (15 min/souris) implique l’ouverture de la cavité abdominale, l’implantation des tumeurs (cellules) la fermeture de la cavité abdominale. Ce développement de modèles tumoraux aura lieu dans l’établissement utilisateur 1. Les souris seront alors transférées dans l’établissement utilisateur 2 pour réaliser les traitements en intrapéritonéale 3 fois par semaine 7 jours après la chirurgie et pendant 3 semaines. La progression tumorale sera alors suivie par imagerie (sous anesthésie gazeuse) après injection intrapéritonéale de l’agent imageant (1-2 min/souris) deux fois par semaine. Les souris seront conservées encore 2 mois si régression totale de la tumeur qui sera vérifiée 1X par semaine par imagerie.

Impact sur les animaux

Les modèles animaux mimant la formation de tumeurs primaires coliques et métastatiques d’origine colique nécessitent un acte chirurgical. L’ouverture de la cavité abdominale des souris, l’injection des cellules tumorales dans la paroi du caecum et dans le foie sont des interventions pouvant entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par les interventions chirurgicales. Le développement des tumeurs primaires, ainsi que l’apparition des métastases peuvent également être à l’origine de souffrance et de gênes. Les injections intrapéritonéales de traitements, de luciférase et d’antibiotiques, ainsi que les injections sous-cutanées de buprénoprhines sont une source de nuisances fugaces La manipulation des souris lors des injections des traitements et lors des imageries est une nuisance. Les infections liées à la chirurgie sont un risque de fréquence rare vue les mesures mises en place (stérilité, antibiothérapie). Les anesthésies mises en place lors de la chirurgie et des imageries sont également une source de nuisance passagère.

Devenir

Les souris ayant été porteuses de tumeurs, elles seront toutes mises à mort à la fin de l’expérience

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictif, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie nécessite de pouvoir se rapprocher le plus possible de ce qui est retrouvé chez l’Homme et donc d’avoir les tumeurs primaires sur les organes d’origine et les métastases se disséminant.

Réduction

Pour chaque traitement à tester Control, a-CD4, a-PD1 et a-CD4+ a-PD1 (4), 4 groupes de 5 souris seront constitués afin de générer des groupes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer l’efficacité du traitement tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées (formation de niveau concepteur de projet avec soit une formation chirurgie du petit animal soit être chirurgien) afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les prises tumorales peuvent être différentes d’une chirurgie à l’autre, nous répèterons les expériences 4 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon en raison de la taille des groupes.

Raffinement

Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Toutes les séances d’imagerie seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Les souris recevant une chirurgie nécessitant l’ouverture de la cavité abdominale, recevront une antibiothérapie préventive avant chaque chirurgie. Les procédures telles que l’imagerie et la chirurgie abdominale sont réalisées sous anesthésie à l’isoflurane suivie d’un réveil sous lampe chauffante (EU2) ou couveuse (EU1), réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Tout au long des opérations, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être en permanence contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tous le long de l’expérimentation. Les animaux bénéficieront d’une réhydratation per- et post-opératoire ainsi qu’une prise en charge antalgique adaptée : 0.1 mg/kg de buprénorphine en pré-opératoire, de la lidocaïne en application locale sous forme de gel lors de la chirurgie et 0.1 mg/kg de buprénorphine seront injectées en sous-cutanée 2X par jour pendant 3 jours. Un système facilitant la prise alimentaire ainsi que la prise de boisson sera mis en place (nourriture gélifiée). Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Le développement des tumeurs (taille et nombre) sera estimé de manière non-invasive par imagerie de la bioluminescence après injection de luciférine. Les animaux seront transférés de l’EU1 à l’E2 (bâtiments situés proches l’un de l’autre) dans un sac de transport et le plus rapidement possible pour ne pas engendrer de stress.

Choix des espèces

Les souris sont les modèles utilisés pour faire de la chirurgie. Nous utiliserons des souris immunocompétentes C57Bl/6, nous permettant d’implanter des cellules tumorales murines possédant le même fond génétique. Ces souris sont largement utilisées lors de la greffe sous-cutanée ou orthotopique de ces cellules cancéreuses. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).

Faire pousser sur un animal vivant des cellules tumorales de patientes, pour ensuite les cultiver en laboratoire : 75 souris immunodéficientes sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau un fragment de tumeur mammaire triple négative au cours d'une intervention de dix minutes sous anesthésie générale, puis sa tumeur est mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que la greffe peut devenir assez volumineuse pour limiter les déplacements de la souris, réduire son appétit et lui faire perdre du poids. Il affirme que l'établissement d'une lignée cellulaire à partir de tumeurs de patientes passe nécessairement par cette amplification sur des animaux "réceptifs", c'est-à-dire dépourvus de défenses immunitaires.

Objectifs

Parmi les différents types de cancer du sein, les tumeurs triple négatives ne peuvent bénéficier de thérapie ciblée et ont le plus mauvais pronostic, de plus la chimiothérapie a une efficacité limitée. Les dérèglements d'une voie de signalisation sont fréquents mais les thérapies ciblant cette voie sont peu efficaces et donc peu utilisées. Nous proposons de dériver des organoïdes à partir de tumeurs de patients déjà établies afin de mener des recherches in vitro. Dans une étude déjà publiée, il a été mis en évidence que certaines tumeurs triple négatives hébergent des mutations provoquant une perte de fonction dans un gène suppresseur de tumeurs . Cette découverte suggère que ce sous-ensemble de patients pourrait potentiellement bénéficier d'une thérapie ciblée sur cette voie.

Bénéfices attendus

Il existe plusieurs options thérapeutiques permettant d’inhiber l’activation aberrante d'une voie de signalisation et certaines sont déjà utilisées en clinique. Cela ouvre donc de nouvelles pistes pour le traitement des patientes atteintes d’un cancer ayant une mutation dans cette voie. La création et l’étude de ces modèles aideront à la compréhension du rôle de de la voie impliquée dans le cancer du sein triple-négatif et à l’identification de thérapie ciblant sa fonction aberrante.

Procédures

Implantation d'un petit morceau de tumeur de patiente, une fois par animal, sous anesthésie générale, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeurs de patients nécessite la réalisation de procédures qui peuvent entraîner des nuisances pour les souris. Implantation de la tumeur : La greffe, peut engendrer du stress et de une douleur légère et temporaire chez l'animal. La mesure de la croissance tumorale s'effectue deux fois par semaine, lors desquels nous examinons individuellement les souris (observation du comportement et mesure de la taille tumorale). Cette observation peut entraîner un stress lors de l'intervention, mais celui-ci diminue avec le temps à mesure que nous observons une habituation chez nos souris. Si la tumeur greffée en sous-cutanée devient trop volumineuse, elle peut limiter la mobilité de la souris, affectant ainsi son comportement et son bien-être général, ceci peut aboutir à une diminution de l'appétit pouvant aller jusqu'à une perte de poids modéré.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

L’objectif de ce projet étant la mise en place de modèles cellulaires permettant par la suite d’évaluer l’effet de nouvelles stratégies thérapeutiques, cela ne peut pas être remplacé par des modèles in vitro ou in silico. En effet, l'établissement d'une nouvelle lignée cellulaire tumorale à partir de cellules de cancer de patientes passe nécessairement, au moins dans un premier temps, par une amplification des cellules tumorales sur animaux réceptifs (immunodéficients). Ceci permet de conserver les interactions entre cellules, l’architecture tissulaire de la tumeur d'origine, et d'approcher au mieux microenvironnement de la tumeur. La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé par calcul de puissance de manière à en utiliser le moins possible tout en conservant une puissance statistique satisfaisante. Les résultats obtenus seront exploités par des études statistiques.

Raffinement

Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Les animaux seront surveillés quotidiennement et font l’objet d’une observation clinique individuelle afin d’évaluer leur état de santé. Cette observation permettra de vérifier si l’animal se nourrit et s’hydrate bien mais aussi permet de voir l’aspect général de l’animal, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. En cas de besoin, ils reçoivent une médication contre la douleur et une surveillance renforcée afin de vérifier sa bonne alimentation et hydratation. Les animaux bénéficient d’enrichissement environnemental dans les cages d’hébergement des animaux avec la mise place de jouets, de cachettes et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant occupés durant leur période de captivité. Ce projet fait l'objet de procédures rigoureuses réalisées par un personnel formé et vigilant quant au suivi régulier de l’état de santé des animaux. Des points limites précoes ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris qui sont le meilleur modèle en oncologie préclnique. Des souches immunodéficientes existe dans cette espèce et peuvent être greffées avec des tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines, jeunes adultes, seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.