Recherche appliquée

Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.

Objectifs

Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.

Bénéfices attendus

À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.

Remplacement

Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.

Raffinement

Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.

Opérés sous anesthésie pendant trente à quarante-cinq minutes pour retirer la thyroïde et les parathyroïdes, puis pour certains réopérés afin d'implanter une minipompe, des rats reçoivent chaque jour, pendant quinze jours au plus, un candidat-médicament ou un placebo, avec des prises de sang à l'éveil. 345 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'hypocalcémie provoquée pouvant entraîner des tremblements, une baisse d'activité et une perte de poids. Le porteur prévoit cinq rats par groupe pour en inclure trois dans l'étude, sans dire ce qu'il advient des deux autres. Tous sont tués à la fin pour prélever leurs organes, ou plus tôt si l'hypocalcémie produit des "effets marqués".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de candidat-médicaments sur la régulation du calcium chez le rat ayant subi une thyroïdectomie préalable. L'hypoparathyroïdie est un déficit en hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou des suites d'une chirurgie au niveau des glandes thyroïdes ou parathyroïdes. L'hormone parathyroidienne, ou parathormone, est principalement impliquée dans le métabolisme du calcium de l'organisme et dans la régulation de la calcémie. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont liés à une hypocalcémie et comprennent des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement ne répond pas correctement sur tous les patients et ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). Il ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (p. ex., hypercalciurie, diminution de la densité minérale osseuse). Dans ce cas des traitements à base de parathormone recombinée sont nécessaires. Aucun traitement de ce type n'est approuvé à ce jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer les effets bénéfiques de nouveaux médicaments pour traiter l'hypoparathyroïdie, une pathologie humaine touchant 40 personnes pour 100000 et pouvant avoir une application également en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Ce projet nécessite différents types d'interventions. Dans un premier temps, une chirurgie sous anesthésie générale sera pratiquée sur certains animaux afin de réaliser une ablation de la thyroïde et des parathyroïdes (durée: 30-45min). Certains animaux pourront subir une seconde chirurgie afin d'implanter un dispositif (minipompe) permettant la délivrance d'un produit en perfusion continue (durée: 15-20 min). Les animaux opérés seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Après la/les chirurgies, les candidat médicament ou le placebo seront administrés tous les jours aux animaux par voie sous-cutanée (bolus ou perfusion) (durée 1-2minutes) pendant un maximum de 15 jours. Des prélèvements sanguins seront effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile (durée des prélèvements: moins de 3min).

Impact sur les animaux

Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont connus et clairement identifiés chez l'homme, et consistent en des fourmillements dans les extrémités ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Ces effets sont liés à une hypocalcémie et seront maitrisés par des apports quotidiens en calcium ou des traitements à base d'analogue de la parathormone endogène, partiellement ou totalement absente dans ce modèle. Les effets potentiellement indésirables du/des produit(s) font l’objet d’échanges avec les inventeurs du nouveau candidat médicament pour adapter les outils d’observations des animaux afin d’anticiperau mieux de potentiels signes cliniques. Chez le rat, l'hypocalcémie peut entrainer des tremblements, une diminution de l'activité locomotrice et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort en fin de procédure pour la réalisation de prélèvement d'organes ou suite à des effets marqués liés à l'hypocalcémie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteints d'hypoparathyroïdie ou, si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de calcium circulant dans le sang, et d'évaluer les mécanismes de régulation de ce dernier, ce qu'il n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. 5 animaux par groupe seront utilisés pour en inclure 3 par groupe en étude et ce nombre a été montré suffisant pour répondre aux objectifs de l'étude.

Raffinement

Le raffinement de la procédure expériementale sera obtenu par un protocole anesthésique et analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire et un suivi post opératoire de l'état de santé des animaux (avec grille de scoring) avec des soins adaptés. Les animaux seront manipulés pour diminuer le stress lié aux contentions. Les animaux sont également suivis quotidiennement (suivi pondéral et signes cliniques). Des points limites adpatés sont définis et le recours à une supplémentation orale en calcium + vitamine D en cas d'hypocalcémie associée à des signes cliniques, ou à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets d’un produit sur la calcémie et le métabolisme du calcium dans l'organisme. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

78 des 174 macaques à longue queue de ce projet doivent être gardés en vie puis réutilisés dans d'autres études, les 96 autres tués pour analyser leurs tissus infectés. Dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 144 d'entre eux sont colonisés par des bactéries hospitalières, parfois multirésistantes, et tous subissent jusqu'à sept anesthésies générales et neuf prises de sang par semaine, des lavages rectaux, des traitements et l'implantation d'une puce de télémétrie, certains des biopsies rectales et des gavages d'antibiotiques. Après l'inoculation, chaque macaque est logé seul, face à un congénère à deux mètres. Sur le remplacement, le porteur affirme que l'usage de primates "reste nécessaire", malgré "les efforts pour privilégier ces alternatives", qu'il ne décrit pas.

Objectifs

L’étude des sepsis, c’est-à-dire des réactions anormales et excessives de l’organisme face à une infection, constitue un enjeu majeur de santé publique. Les sepsis engendrent une mortalité élevée, estimée à environ 11 millions de décès par an dans le monde, due à l’absence de traitements réellement efficaces. Les formes les plus sévères de sepsis sont le plus souvent liées à des bactéries retrouvées dans les intestins. Ces bactéries finissent par circuler dans les hôpitaux et représentent aujourd’hui une menace importante pour les systèmes de santé. De plus, la résistance aux antibiotiques développée par ces bactéries constitue un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques rend le traitement des infections graves beaucoup plus difficile et accroît le risque de développer des sepsis sévères. Dans ce contexte, le développement de stratégies visant à prévenir l’infection en réduisant ou en éliminant, au niveau de l’intestin, les bactéries susceptibles de provoquer des infections chez les patients à risque apparaît comme une approche prometteuse contre à la fois le sepsis et la multirésistance aux antibiotiques. L’étude envisagée vise à mettre en place un modèle de colonisation digestive chez des primates non humains par des bactéries pertinentes du contexte hospitalier, multirésistantes ou non, afin d’évaluer, tester et optimiser des stratégies innovantes permettant d’éliminer ces bactéries.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de modèles de colonisation intestinale par différentes bactéries d’intérêt pour tester de nouvelles stratégies de décolonisation intestinale pouvant être utilisées chez des patients à risque avant le développement d’infections sévères.

Procédures

- Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupées pour limiter leur nombre (1 à 7 fois par semaine, 174 animaux, 30-45 minutes). Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 9 fois par semaine, 174 animaux, 5 minutes - Récoltes de fluides rectaux/trachéaux ou nasaux (1 à 5 fois par semaine, 174 animaux 2 minutes). - Biopsies rectales, (2 fois maximum, 30 animaux, 30 minutes). - Lavages rectaux (1 à 2 fois par semaine, 126 animaux, 20 minutes). - Lavages broncho-alvéolaires (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 10 minutes). Interventions - Inoculation bactérienne (1 fois 144 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des molécules thérapeutiques (ou placebo) (jusqu’à 6 fois, 174 animaux, 5 minutes). - Traitements avec des antibiotiques par gavage (4 fois 144 animaux, 5 minutes) - Imageries in vivo (jusqu’à 2 fois si un problème respiratoire est observé, jusqu’à 144 animaux, 45 minutes).

Impact sur les animaux

Les méthodes expérimentales ont été définies de manière à éviter toute souffrance lors des interventions (limitation des volumes sanguins prélevés, expositions et traitements réalisés sous anesthésie générale). Anesthésies, prélèvements de sang Perte d’appétit avec perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection au site d’injection possible dans les jours qui suivent le prélèvement (rare, quelques jours). Traitements Réaction locale, démangeaisons et/ou douleur dans les heures/jours suivant le traitement. Perturbation de la flore intestinale, vomissement et/ou diarrhée transitoire. Colonisation L’étape de colonisation ne s’accompagne souvent d’aucun signe clinique particulier. Cependant, en cas de passage des bactéries dans le sang ou d’infections pulmonaires, des signes cliniques de l’infection bactérienne peuvent apparaitre : fièvre, perte d’appétit, difficultés respiratoires pendant quelques jours. Nuisances liées aux traitements antibiotiques L’altération de la flore intestinale peut causer des diarrhées et entérites (quelques jours) Implantation de puces de télémétrie Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Biopsies rectales : Des signes cliniques liés aux biopsies rectales : réaction inflammatoire au site de la biopsie, perte d’appétit, saignements, pendant quelques heures/jours Nuisances liées à l’hébergement individuel : Les animaux seront hébergés en groupe avant exposition et en hébergements individuels proches, permettant des interactions sociales pendant la phase d’expérimentation. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à quelques minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation de la trachée liée à l’intubation. Toux, difficultés respiratoires légères juste après le geste. Nuisance liée à la mise à jeun (

Devenir

Pour l’étude de mise en place de modèle : les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études compatibles après avis vétérinaire. Cependant, si les animaux montrent des signes d’infection, ils seront euthanasiés afin d’étudier l’infection dans les tissus. Dans l’étude d’évaluation de la sécurité des traitements, les animaux seront gardés en vie et réutilisés dans d’autres études après avis favorable du vétérinaire. Dans les études d’efficacité des traitements, tous les animaux seront euthanasiés, dans le but de faire des analyses des tissus infectés.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en place des modèles de colonisation intestinale par des bactéries souvent retrouvées chez des patients hospitalisés, afin d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques de décolonisation. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire, la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries de l’intestin. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Le primate non-humain, étant proche de l’humain au niveau anatomique, immunitaire et physiologique, permet de reproduire la complexité de ces interactions, nécessaires pour permettre une colonisation intestinale par des bactéries retrouvées chez les patients. Cela permet ainsi d’évaluer de façon fiable tout nouveau traitement avant son utilisation chez l’être humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Dans la phase de mise en place du modèle, les conditions optimales d’inoculation de la bactérie seront déterminées selon un procédé étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Cette méthode permet de réduire le nombre d’animaux, en évitant de multiplier les essais. Dans les études de tolérance et de distribution, seules les stratégies de décolonisation ayant déjà démontré une efficacité chez le petit animal (rongeurs) seront testées dans cette étude chez le primate non humain. Ensuite, pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter des différences statistiques entre les groupes.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire leur nombre. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront hébergés en groupes puis en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales après inoculation bactérienne (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés de 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, et par renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, éviter une contamination croisée, et permettre d’associer le prélèvement d’excréments à l’animal. Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques liés au traitement afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux ainsi que leur alimentation (des points limites sont mis en place). Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, anti-douleurs localement). L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué, qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement anti-douleur sera appliqué avant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans ce projet, le macaque a été sélectionné pour sa proximité génétique, anatomique et physiologique avec l’être humain. Son appareil digestif ressemble beaucoup à celui de l’être humain au niveau anatomique, mais aussi au niveau de l’environnement intestinal incluant le microbiote. Le macaque reproduit la complexité des interactions entre le système immunitaire et les bactéries naturellement présentes dans l’intestin. Cela en fait un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la colonisation bactérienne par des bactéries retrouvées chez l’être humain et l’étude de la tolérance à de nouveaux traitements. Ces bactéries pouvant être retrouvées dans l’intestin de personnes de tout âge, nous envisageons de réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveau-nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature et un microbiote intestinal stable.

Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

Toutes mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour récupérer leurs organes, 172 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une injection unique dont le résumé ne précise pas la nature, elles suivent un régime spécifique pendant 24 à 40 semaines pour développer une maladie chronique du foie, et une partie reçoit chaque jour par voie orale, par gavage ou prise volontaire, un antihistaminique ou un traitement de référence pendant 12 à 20 semaines. Ces antihistaminiques sont déjà autorisés chez l'humain contre l'acidité gastrique, et leur profil, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont, selon le porteur, "déjà bien documentés". Il conclut pourtant que l'utilisation des souris "demeure donc nécessaire".

Objectifs

Les maladies chroniques du foie touchent environ 1,5 milliards de personnes dans le monde. Elles évoluent dans la majorité des cas vers la fibrose du foie, qui peut progresser vers une cirrhose puis un cancer du foie. Malgré les progrès réalisés dans leur prise en charge, les options thérapeutiques permettant de ralentir cette progression restent limitées. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel d'une stratégie thérapeutique reposant sur le repositionnement de médicaments déjà utilisés chez l'Homme pour d'autres indications. Les travaux permettront d'étudier leur capacité à limiter la progression des maladies chroniques du foie et à prévenir le développement du cancer dans un modèle expérimental pertinent. Ces molécules sont déjà autorisées en clinique pour le traitement des pathologies liées à l'hypersécrétion acide gastrique. Leur repositionnement thérapeutique est particulièrement intéressant, car leur profil pharmacologique, leur sécurité d'emploi et leurs effets indésirables sont déjà bien documentés. Le projet vise également à améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l'évolution des maladies hépatiques chroniques chez la Femme. Le CHC présente un dimorphisme sexuel marqué : son incidence est plus élevée chez les hommes que chez les femmes, et des différences liées au sexe influencent également la progression de la fibrose, la carcinogenèse et la réponse aux traitements. Afin de prendre en compte ces différences biologiques et d'améliorer la transposabilité des résultats à l'ensemble de la population de patients, cette étude sera réalisée chez des animaux mâles et femelles. Une étude pilote permettra d'abord de caractériser la cinétique de progression de la maladie chez les femelles afin d'adapter le calendrier expérimental à leur évolution plus lente.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies de traitements des maladies hépatiques chroniques et de prévention du cancer du foie. Si l'efficacité des molécules étudiées est confirmée, leur repositionnement thérapeutique pourrait accélérer leur évaluation clinique dans cette indication, grâce aux données déjà disponibles concernant leur sécurité d'emploi, réduisant ainsi les délais de mise à disposition par rapport au développement d'une nouvelle molécule. Les connaissances acquises sur les différences biologiques liées au sexe pourraient également contribuer au développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux femmes et aux hommes, favorisant à terme une prise en charge plus personnalisée des maladies hépatiques chroniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure expérimentale visant à reproduire une maladie chronique du foie observée chez l'Homme. Cette procédure comprend une injection unique réalisée en début d'étude, réalisé en moins d’une minute, ainsi que la mise en place d'un régime alimentaire spécifique pendant 24 à 40 semaines, selon le sexe. Une partie des animaux recevra un traitement expérimental ou un traitement de référence administré par voie orale, une fois par jour, pendant une durée de 12 à 20 semaines selon le sexe. Les administrations seront réalisées sur des animaux vigiles et dureront moins d'une minute. Les animaux seront surveillés après chaque administration afin de détecter précocement toute complication liée au gavage ou à l'administration volontaire, selon la modalité retenue. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite mis à mort et les organes d'intérêt seront prélevés afin d'évaluer l'évolution de la maladie et les effets des traitements étudiés.

Impact sur les animaux

Les principaux effets attendus sont liés au développement progressif de la maladie hépatique induite expérimentalement. Cette maladie est généralement asymptomatique tout au long de son évolution. Une légère perte de poids transitoire peut être observée au début du régime alimentaire spécifique, avant une compensation progressive. Dans de rares cas, au cours de la progression de la maladie, certains animaux pourront présenter une altération modérée de leur état général, se traduisant notamment par une diminution de l'activité, un pelage moins soigné, une modification de la posture ou une diminution de la prise alimentaire. Les manipulations répétées nécessaires à l'administration quotidienne des traitements peuvent entraîner un stress léger et transitoire. Ils seront surveillés après chaque administration afin de détecter rapidement toute complication éventuelle liée à la procédure. Les traitements évalués pourraient avoir un effet bénéfique en ralentissant la progression de la fibrose hépatique et en limitant le développement des lésions tumorales. Toutefois, ces effets constituent précisément l'objet de cette étude.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les organes et tissues nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Avant la mise en place de cette étude, des travaux ont été réalisés sur des modèles expérimentaux cellulaire. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les maladies chroniques du foie, notamment leur progression et le développement du cancer. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet et évaluer le potentiel de notre stratégie thérapeutique à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé à l'aide d'une analyse statistique réalisée à partir de données préliminaires et de résultats déjà obtenus dans ce modèle expérimental. Cette approche permet d'utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement fiables et répondre aux objectifs du projet.

Raffinement

Afin de limiter au maximum les nuisances subies par les animaux, les procédures expérimentales ont été optimisées et les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi comprenant du matériel pour nidifier, pour ronger et des abris pour se cacher. Une période d'acclimatation et d’habituation à la méthode de traitement sera respectée avant le début des expérimentations. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques de l'étude, une administration volontaire sera privilégiée afin de limiter le stress lié aux manipulations. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière de leur état général et de leur poids. Des points limites prédéfinis seront appliqués afin de mettre fin à la procédure si un animal présente des signes de souffrance ou d'altération importante de son état de santé. Les procédures terminales seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour étudier les maladies chroniques du foie. Les mécanismes responsables de l'accumulation de graisse dans le foie, de l'inflammation, de la fibrose et du développement du cancer du foie sont largement similaires entre les deux espèces. Les modèles murins ont ainsi permis de mieux comprendre ces maladies et de développer de nouveaux traitements, dont certains sont aujourd'hui utilisés chez les patients. Les animaux seront inclus dans l'étude à partir de l'âge de 8 semaines, correspondant à un jeune âge adulte chez la souris, afin de reproduire les premières étapes de développement de la maladie hépatique.

36 souris diabétiques db/db vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sous anesthésie deux prélèvements de peau au dos, trois injections sous-cutanées, six anesthésies avec pesée et deux prises de sang pour la glycémie, les plaies pouvant s'enflammer et entraîner perte d'appétit, déshydratation et perte de poids. L'objet est une preuve de concept pour trois principes actifs naturels destinés à un futur pansement, présentée comme la "première étape" d'un développement. Le porteur écrit que l'utilisation de ces souris est "indispensable" et affirme que les résultats "garantiront le développement d'outils thérapeutiques applicables en médecine humaine".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objet principal d’évaluer le potentiel cicatrisant de principes actifs naturels ayant présenté des propriétés intéressantes durant les phases de tests in vitro. Ce test in vivo représente une preuve de concept, première étape d’uné étude globale visant la validation d’un pansement actif, constitué d’un subsitut dermique évolutif libérant progressivement des principes actifs naturels dans la plaie.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 2 est une maladie métabolique chronique associée à une altération des mécanismes de réparation tissulaire, entraînant un retard de cicatrisation et une dégradation de la qualité de vie des patients. À ce jour, les options thérapeutiques visant à améliorer efficacement la cicatrisation des plaies chez les personnes diabétiques demeurent limitées. La présente étude a pour objectif de caractériser les effets cicatrisants de 3 éléments d’essai en contexte diabétique. Les résultats obtenus permettront d’évaluer leur potentiel respectif, et d’apporter une preuve de concept à la suite du développement d’une solution innovante de pansement, combiné à l’un de ces éléments d’origine naturelle, afin d’améliorer la prise en charge des plaies chroniques.

Procédures

- Suivi de la glycémie : 2 fois par souris - Procédure chirurgicale (récupération d'une zone de peau d'une circonférence de 6mm) : 2 par souris - Injections sous-cutanées : 3 injections par souris - Anesthésie volatile et pesée : 6 par souris - Suivi journalier des souris : une fois par jour - Mise à mort et récupération des échantillons cutanés : Une fois à la fin de l'étude pour chaque souris

Impact sur les animaux

Au cours de cette étude, les souris seront maintenues sous anesthésied volatile, au moyen d’un système dédié. Afin d’assurer une prise en charge adéquate de la douleur liée à la procédure expérimentale, une injection sous-cutanée d'analgésique sera également administrée. Celle-ci pourra être renouvelée à 6h ou 24h post-chirurgie selon l’état de douleur de l’animal. L’anesthésie générale ainsi que les manipulations associées sont susceptibles d’induire une hypothermie transitoire et un état de stress chez les animaux. Les deux plaies qui vont être réalisées au dos des souris vont inévitablement conduire à une inflammatioin (douleur, rougeur, chaleur, gonflement) que nous allons minitieusement suivre à l’aide d’une grille de scoring. Ces premières nuisances peuvent conduire à une diminution de la prise alimentaire menant alors à une deshydration, une perte de poids et un possible changement de comportement envers congénères ou manipulateurs. Enfin, deux mesures de la glycémie seront réalisées sur chaque souris, nécessitant la récupération d’une goutte de sang à chaque mesure et entrainant ainsi une douleur localisée au site de prélèvement.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort en fin d'étude pour la récupération des échantillons à traiter en histologie.

Remplacement

Cette étude s’articule autour des effets cicatrisants de 3 éléments d’essai en conditions diabétiques. Les premiers tests in vitro ont permis de valider l’intérêt de ces éléments sur la cicatrisation cutanée. Cependent, nos résultats comme ceux de la littérature scientifique restent limités. En effet, ces études ne permettent pas d’étudier le recouvrement tri-dimentionnel de la lésion et ne reproduisent pas les tensions mécaniques qui s’exercent sur les plaies cutanées au cours de la cicatrisation. Par ailleurs, ces études in vitro présentent des limites intrinséques et ne reflètent qu’imparfaitement la complexité des processus inflammatoires se déroulant dans un organisme vivant. Ainsi, l’utilisation des souris diabétiques db/db comme modèle animal est alors indispensable dans l’étude des effets cicatrisants dans un contexte hyperglycémique. La robustesse et la transposabilité des résultats attendus garantiront le développement d’outils thérapeutiques applicables en médecine humaine.

Réduction

Le design expérimental de cette étude in vivo a été raffinée afin d’utiliser le minimum de souris pour déterminer les effets thérapeutiques de nos traitements sur la cicatrisation cutanée. Cette optimisation a été confirmée par l'utilisation d'outils statistiques.

Raffinement

Les chirurgies à réaliser sont maîtrisées par le personnel de l’animalerie, permettant de réduire au maximum leurs durées et donc les temps d'anesthésie. Les souris seront maintenus sous anesthésie volatiledurant toute la chirurgie, sur un plateau chauffant permettant de limiter leur hypothermie. Afin d’assurer une prise en charge adéquate de la douleur liée aux procédures expérimentales, une injection sous-cutanée d'analgésique sera également administrée, associée à l’application d'un analgésique local aux zones de biopsie. Le réveil et retour à l’état vigil des souris après chirurgie sera réalisé dans une chambre de réveil. Post-chirurgie, de l’hydrogel sera présent dans chacune des cages dans le but de faciliter l’hydratation des rongeurs. Dans les premières heures qui suivront la chirurgie, une surveillance accrue de chacun des rongeurs sera réalisée. Cette surveillance sera renforcée au cours des premiers jours post-opératoirs par notre zootéchnicienne afin de permettre une prise en charge rapide et adaptée dès les premiers signes de souffrance. Nous prévoyons une administration supplémentaire d'analgésique en cas de souffrance avérée. A cela, s’ajoutera la réalisation d’un scoring pour aider à la détection des signes de douleur. L’ensemble des changements de pansements seront réalisés sous anesthésie et analgésie. La mise à mort sera également réalisée sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

Les souris génétiquements diabétiques db/db sont classiquement utilisées dans la littérature scientifique en raison des grandes similitudes dans le développement de la pathologie du diabète de type II chez l’Homme. Elles nous permettront ici d’apporter des éléments de réponse à l’intérêt thérapeutique de ces 3 éléments d’essai, sur un modèle pathologique. Les études in vivo seront réalisées avec des souris mâles âgées de 8 semaines.