Recherche appliquée

Génétiquement modifiées pour être dépourvues de système immunitaire propre, 30 souris reçoivent des cellules de sang de cordon ombilical humain afin de développer un système immunitaire proche de celui d'un humain. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : irradiées aux rayons X entre un et trois jours de vie, injectées le même jour dans le foie, puis soumises à deux prises de sang à la queue et, sous anesthésie, à une ponction de moelle osseuse au fémur. Toutes sont tuées à 25 semaines, pour vérifier comment les cellules humaines se sont réparties dans leurs organes. Le but est d'ajuster ce protocole d'humanisation, les souris ainsi obtenues devant ensuite servir à tester des thérapies cellulaires contre le cancer. L'effectif de 30 souris en six groupes de cinq n'est justifié que par le caractère "exploratoire" de l'étude.

Objectifs

Les souris immunodéficientes sont des souris de laboratoire génétiquement modifiées pour pouvoir accueillir des cellules sanguines humaines. Comme leur propre système immunitaire est très limité, elles peuvent développer un système immunitaire proche de celui de l’être humain. Ce modèle est très utile pour mieux comprendre le fonctionnement de l’immunité humaine et pour tester de nouveaux traitements contre le cancer. Pour obtenir ces souris dites « humanisées », nous leur injectons des cellules de sang de cordon ombilical humain capables de de se transformer dans l’animal en différentes cellules du sang et du système immunitaire humain. Une souris sera considérée comme correctement humanisée lorsque suffisamment de cellules humaines se développent dans son sang ou sa moelle osseuse. Afin de favoriser l’implantation de ces cellules humaines, l’objectif de cette étude est d’optimiser notre protocole en exposant au préalable les souriceaux nouveaux-nés aux rayons X : cette irradiation est couramment utilisée dans ce type d’étude, elle facilite l’installation des cellules humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de créer un modèle expérimental chez l’animal qui servira à tester de nouveaux traitements contre le cancer. Il permettra notamment d’évaluer des cellules du système immunitaire, modifiées en laboratoire pour mieux reconnaître et détruire les cellules cancéreuses grâce à nos thérapies innovantes. À terme, il contribuera à accélérer le développement de thérapies plus efficaces et personnalisées, avant leur évaluation chez l’être humain.

Procédures

Les souriceaux seront irradiés entre 1 et 3 jours de vie à une faible dose puis recevront le même jour, une injection de cellules humaines dans le foie. L'irradiation sera réalisée en une seule séance d'une durée d'environ 40 secondes par carroussel et l'injection hépatique durera environ 1 minute par animal. A l’état adulte, les souris seront soumises à 1 prélèvement à l’âge de 8 semaines de vie, puis un 2° à l’âge de 12 semaines de vie, d'une à deux gouttes de sang à la veine de la queue. Chaque prélèvement aura une durée d'environ 1 minute. A l’âge de 8 semaines, elles seront également soumises à une ponction de moelle osseuse au fémur, sous anesthésie sur des souris endormies, d'une durée d'environ 1 minute par animal.

Impact sur les animaux

Stress de courte durée liée à deux séparations inférieures à 5 minutes chacune de la portée d’avec la mère Douleur légère de courte durée due à la piqûre d'aiguille lors de l'injection dans le foie, Douleur légère de courte durée due à la piqûre d'aiguille lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue, Gêne légère due à la ponction de moelle osseuse mais effectuée sur des souris endormies

Devenir

Les souris à 25 semaines de vie seront mises à mort pour la fin de la procédure afin de vérifier la distribution des cellules humaines dans les différents organes.

Remplacement

Nous poursuivons nos expériences in vitro afin de valider la fonctionnalité des cellules humaines et de limiter le nombre d’expériences réalisées sur les animaux. Cependant, à ce jour, malgré nos efforts, nous n’avons pas réussi à établir un modèle reproduisant la moelle osseuse humaine en laboratoire. Pour démontrer l’effet thérapeutique des cellules médicaments que nous développons, il est nécessaire de mettre en place un modèle chez l’animal. Par ailleurs, tous les modèles in vitro disponibles pour l’étude du microenvironnement tumoral humain concernent les tumeurs solides et non les cancers liquides. A ce jour, aucun modèle in vitro (2 ou 3 dimensions) ni in silico (basé sur des simulations informatiques) ne permet de reproduire les interactions complexes entre les cellules de l’immunité humaine, enchâssées dans un système osseux et vascularisé au plus près de l’humain.

Réduction

Cette étude est une étude exploratoire et de validation. Nous utiliserons 30 souris réparties en 6 groupes de 5.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie spécifique. L’eau de boisson et la nourriture sont autoclavée ou irradiée pour éviter une contamination infectieuse chez les souris immunodéprimées. L’irradiation et l’injection sur souriceaux seront réalisées au plus proche de la mère et préservant au plus l’odeur de la litière afin d’éviter tout rejet maternel. Les prélèvements à la veine de la queue et dans l’os du fémur seront réalisés par des expérimentateurs entrainés, sur souris anesthésiées. Nous aurons recours à des anti-douleurs en cas d’observation de douleur. Nous avons mis en place des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente permet l'élaboration d'un modèle humanisé avec développement de cellules sanguines, car cette souris dépourvue de système immunitaire exprime de nombreuses molécules permettant la prise de greffe de tout type de globules blancs. Ainsi ce modèle mimant le système immunitaire humain permettra d'étudier nos thérapies. Les souris sont expérimentées entre 0 et 12 semaines de vie. La procédure des souris dites « humanisées » se fait dès la naissance. Nous suivrons scrupuleusement les souris jusqu’à la 25ème semaine de vie sans procédure pour observer l’humanisation.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une opération de 15 minutes sous anesthésie générale dont le résumé ne précise pas l'objet, puis certaines reçoivent pendant 14 semaines au plus un anticorps injecté trois fois par semaine et un traitement oral quotidien, éveillées et contenues. Le projet teste cet anticorps, déjà en essai clinique pour d'autres pathologies selon le porteur, seul ou combiné à un inhibiteur de RAS contre le cancer du pancréas, dont la progression entraîne selon lui des signes de douleur au-delà d'un certain stade. Pour le choix de l'espèce, il décrit les souris comme "très proches de l'homme notamment du point de vue immunologique".

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 7ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitement ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le pancréas. Par ailleurs, de récents essais cliniques ont montré la capacité de nouveaux traitements à améliorer la survie des patients atteints de cancer du pancréas. Cependant, le taux de réponse reste faible et la survie de ces patients sous traitement ne dépasse pas un an. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers. Nous avons montré dans le cancer du pancréas que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant le système immunitaire chez la souris. L’objectif de notre nouveau projet est de valider ces premiers résultats dans nouveau modèle et de tester l’efficacité de notre traitement en comparaison ou en combinaison avec un nouveau traitement prometteur qui améliore la survie des patients atteint d’un cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas sont un grave problème de santé public. Bien que rare, il est pratiquement incurable en l’état actuel et les patients atteints ont une durée de vie très faible. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et/ou en combinaison avec le nouveau traitement ciblant le cancer du pancréas et ainsi améliorer la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Tous les animaux de l’étude seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Une fois par semaine, une partie des animaux seront anesthésiés afin de réaliser une mesure de taille tumorale par imagerie qui durera au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine par injection, ainsi qu’un traitement oral quotidien. L’administration des traitements sera réalisée sur animaux vigiles, prend environ deux minutes à être réalisée, et dure maximum 14 semaines. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur au niveau des sites d’injection. La contention sur animal vigile peut engendrer un stress. Les traitements peuvent induire des effets secondaires modérés, mais sont globalement bien tolérés et ils devraient avoir un effet bénéfique sur la progression de la maladie et ses effets néfastes. La progression tumorale entraine des signes de douleurs et de stress (perte de poids, modification du comportement, etc.) au-delà d’un certain stade.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés, ce qui les protégera des infections. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Un tapis chauffant ou une cage thermostatée sera utilisée quand nécessaire. Un gel ophtalmique sera appliqué lorsque nécessaire. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d’un analgésique. L’analgésique sera utilisé à nouveau en cas de signes de douleur modérés (perte de poids, modification du comportement, etc.). Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux traitements.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus le cancer du pancréas étant un cancer plus fréquent chez l’adulte (âge moyen au diagnostique 70 ans chez l’homme, 74 ans chez la femme), il est préférable d’utiliser des animaux adultes pour ce projet.

Six à huit essais de nage d'une minute par jour, pendant dix à douze jours, attendent une partie des 724 souris de ce projet dans la piscine de Morris, en plus de l'open-field, du labyrinthe en croix et d'un test de reconnaissance d'objets. Toutes reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant cinq jours à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis sont tuées pour l'analyse de leur cerveau. Ces souris, privées par invalidation génétique du gène en cause dans le syndrome de Coffin-Lowry, sont utilisées pour tester un traitement des déficits cognitifs, dès 14 jours de vie pour les plus jeunes. Le porteur précise que ce traitement est déjà administré en recherche clinique à des adultes et à des enfants.

Objectifs

Nous étudions une souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Cette pathologie est due à des mutations d'un gène et conduit à une déficience intellectuelle modérée à sévère chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement. Pour ce projet, nous utilisons des souris invalidées pour le gène responsable. Notre projet a pour premier objectif de mettre au point un traitement pharmacologique pour corriger les altérations comportementales et cognitives de la souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Notre second objectif sera de tester si ce traitement pharmacologique délivré au plus tôt au cours de la période postnatale, permet d’éviter le retard de développement cérébral et de prévenir l’apparition des altérations cognitives. Enfin, nous combinerons le traitement pharmacologique à un enrichissement environnemental dans le but de corriger les altérations à plus long terme.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement pour les patients atteints syndrome de Coffin-Lowry. Compte tenu de la sévérité des altérations cognitives, la qualité de vie pour ces patients et leurs familles est profondément impacté. Au niveau expérimental chez la souris modèle, la description des altérations moléculaires nous permet aujourd’hui d’envisager de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la délivrance d’agents pharmacologiques. Les traitements proposés ont déjà été testés chez d'autres souris modèles et s’avèrent bénéfiques sur certains comportements. Pour information, le traitement proposé est déjà utilisé dans la recherche clinique chez des patients, adultes et enfants, c’est pourquoi nous souhaitons commencer nos expérimentations avec ce candidat médicament. Dans ce contexte, notre projet testera pour la 1ère fois si ce traitement permet aussi de réduire, voire restaurer les altérations cognitives chez la souris modèle du Syndrome de Coffin Lowry.

Procédures

Pour le projet, tous les animaux recevront des injections quotidiennes du traitement ou de solution saline en intrapéritonéale. Après différents délais, ces souris seront mises à mort afin d'analyser leurs cerveaux. Une partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée dans une boite appelée open-field (durée 10 minutes) ou dans un labyrinthe en croix ((durée 10 minutes), ce qui ne génère aucune nuisance. La mémoire de reconnaissance s’effectue dans l’openfield préalablement exploré dans lequel on ajoute des objets à explorer. Pour ce test, les souris sont placées dans cet openfield pendant 10 minutes, 1 à 2 fois par jour pendant 5 jours maximum. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un léger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 10-12 jours, à raison de 6-8 essais par jour (2 blocs de 3-4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéale pendant 5 jours à 6 semaines, selon les procédures expérimentales. Les tests comportementaux pourraient générer une légère réactivité émotionnelle chez les animaux en tout début de test.

Devenir

à l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin d'étudier leur cerveau.

Remplacement

Notre projet de recherche consiste à évaluer les bénéfices d’un traitement visant à réduire / compenser les altérations comportementales et cognitives associées à la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certaines cascades moléculaires peuvent être décrites sur des cultures neuronales en conditions basales, il est ensuite absolument nécessaire de valider les bénéfices du traitement sur les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 4-8 souris par groupe expérimental pour les analyses biochimiques et analyses cérébrales, et 8-15 souris par groupe pour les études de comportement sont nécessaires. Des tests de puissance de nos analyses statistiques seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=4), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé. Si cette valeur est atteinte, il ne sera pas nécessaire d’augmenter les effectifs jusqu'a à 8 pour les analyses cérébrales ou jusqu'à 15 pour les analyses comportementales. De plus, afin de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, les mêmes souris seront réutilisées dans plusieurs tests successifs, les premiers tests d’exploration ne durant que 10 minutes par jour et par souris.

Raffinement

Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études, et la fiabilité de nos résultats. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre aux premières injections ou aux tâches comportementales, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et les habituer à sa présence. Afin de s’assurer que l’administration du traitement n’altère en rien la santé et le bien-être des souris, la mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela, une grille d’évaluation sera utilisée.

Choix des espèces

Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Dans notre projet, une partie des expérimentations seront effectuées à l’âge adulte (>56 jours) afin de montrer les effets potentiellement bénéfiques de notre traitement sur des fonctions cognitives altérées. L’autre partie des expérimentations sera effectuée chez des souris juvéniles (de 14 à 35 jours). En agissant au cours de cette période de développement, nous souhaitons corriger au plus tôt le retard de développement cérébral et éventuellement éviter les altérations cognitives à plus long terme.

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés d'après le porteur, sauf ceux qui atteignent un point limite et sont alors tués. Pendant 314 jours, chaque lapin subit jusqu'à onze interventions : cinq séances d'injections sous la peau en dix points, parfois avec de l'adjuvant complet de Freund qui peut laisser des nodules inflammatoires et un œdème plusieurs jours, et six prises de sang de 2 à 5 mL. Les anticorps obtenus doivent servir à des tests rapides de détection de résidus d'antibiotiques, de toxines ou de polluants. Le porteur reconnaît l'existence de bibliothèques d'anticorps produites en laboratoire, qu'il juge "inadaptées aux contraintes de notre projet".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux de lapin à des fins diagnostiques et scientifiques, en réponse à des besoins environnementaux, en santé publique et en recherche. Ces anticorps constituent des outils essentiels pour la détection de petites molécules d’intérêt, telles que des contaminants environnementaux, des résidus de médicaments ou des toxines bactériennes, et permettent le développement de tests immunologiques sensibles et spécifiques, notamment sous forme de tests rapides ou de dosages de type ELISA. Les anticorps produits dans ce cadre présentent des caractéristiques d’affinité et de spécificité adaptées à leur utilisation dans des dispositifs de diagnostic à grande échelle. En l’état actuel des connaissances, la phase initiale d’immunisation chez l’animal reste nécessaire pour générer une réponse immunitaire polyclonale diversifiée et de haute affinité. Cette étape permet la production de lymphocytes B spécifiques qui ne peuvent pas encore être reproduits de manière équivalente par des approches entièrement in vitro ou synthétiques. Le recours aux animaux est donc strictement limité à cette phase d’immunisation. Les étapes ultérieures de caractérisation et de sélection des anticorps sont réalisées à partir de techniques in vitro, sans réutilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à lever un verrou technologique majeur pour la santé publique, l'environnement et la sécurité sanitaire : la détection ultra-sensible et rapide de petites molécules d'intérêt (toxines, polluants, résidus médicamenteux). Ces cibles sont historiquement très difficiles à identifier avec des anticorps murins (souris), qui manquent d'affinité pour de si petits motifs. Le recours au modèle lapin est scientifiquement indispensable car la diversité de son répertoire immunitaire permet d'obtenir des anticorps à très haute affinité, garantissant des seuils de détection jusqu'alors inaccessibles. Les bénéfices socio-économiques et sanitaires se traduiront par le développement de tests rapides sur le terrain (bandelettes, dosages ELISA) répondant à deux enjeux critiques. D'une part, dans le cadre de la lutte contre l'antibiorésistance et les urgences infectieuses, la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques de dernier recours (comme les carbapénèmes) constitue une menace sanitaire mondiale. Les anticorps générés permettront de concevoir des tests de détection rapide utilisables au chevet du patient (sur urines, sang ou colonies) afin d'identifier les mécanismes de résistance en quelques minutes et d'adapter immédiatement le traitement. D'autre part, en matière de surveillance environnementale et de sécurité sanitaire, ces outils permettront le suivi d'ultra-traces de micropolluants et de toxines dans des matrices complexes comme l'eau potable ou les fluides biologiques, assurant ainsi une prévention sanitaire efficace et accessible. Enfin, ce projet s'inscrit pleinement dans une démarche éthique et d'application stricte des 3R. Les procédures sur les lapins se limitent exclusivement à des étapes d'immunisation et de prélèvements sanguins légers sous anesthésie, sans aucune mise à mort requise dans le cadre du protocole. La phase animale est par ailleurs restreinte à la réponse immunitaire initiale, car les gènes codant les anticorps d'intérêt seront directement isolés par clonage pour assurer l'ensemble de la production ultérieure exclusivement in vitro sous forme recombinante. Cela garantit la pérennité de ces outils de diagnostic sans aucun recours ultérieur à l'animal.

Procédures

Les animaux seront immunisés sous contention douce et sous anesthésie locale topique (crème EMLA appliquée 30 à 45min avant le geste), par des injections sous-cutanées multipoints brèves (durée de 2 à 3 minutes par animal pour répartir le volume en 10 points d’injection) d’une molécule appelée immunogène qui correspond à la cible d’intérêt. Chaque animal recevra au total un nombre maximal strict de 5 sessions d'injections dans le cadre du protocole : une injection initiale à J+1 suivie de quatre rappels répartis sur l'étude. Des prélèvements sanguins de 2 à 5mL chacun, également réalisés sous anesthésie locale, seront effectués à intervalles réguliers (8 à 10 jours après chaque injection ainsi qu’un prélèvement final à J+314) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux. Ces prélèvements représentent un nombre exact de 6 interventions sur la durée globale du protocole, avec une durée très brève de 1 à 2 minutes par prélèvement. Au total, chaque animal sera soumis à un nombre maximal absolu de 11 interventions sur l'ensemble des 314 jours de l'étude.

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injection sont susceptibles de survenir, bien que limitée par l’application d’une anesthésie locale (lidocaïne) au point d’injection ou de prélèvement. En cas d'utilisation d'adjuvant complet de Freund pour l'immunisation primaire, une réaction inflammatoire nodulaire locale ou un œdème peut persister plusieurs jours sur les sites d'injection, générant une sensibilité prolongée qui fera l'objet d'un suivi quotidien strict. La douleur aiguë liée à la piqûre est donc très brève, mais une gêne locale d'intensité légère à modérée peut être ressentie les jours suivants selon l'adjuvant employé. Une douleur légère peut toutefois être ressentie lors des prélèvements sanguins. Les manipulations nécessaires peuvent entraîner un stress transitoire chez certains animaux, de l’ordre de quelques minutes, qui sera minimisé par une habituation préalable à la manipulation et à la contention douce.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront replacés, sauf avis contraire du vétérinaire ou en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole, auquel cas ils seront mis à mort.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes alternatives permettant de générer ou de sélectionner des anticorps sans recourir directement à l’immunisation d’animaux, (notamment l’utilisation de bibliothèques d’anticorps produites en laboratoire), mais elles restent inadaptées aux contraintes de notre projet pour trois raisons principales. En premier lieu, notre objectif est de détecter des molécules d'intérêt extrêmement petites (comme les carbapénèmes). Pour ces petites cibles, les banques d'anticorps artificielles manquent de sensibilité et échouent à fournir des seuils de détection suffisamment fins dans des échantillons complexes (sang, eau). En second lieu, le lapin possède un système immunitaire unique. Contrairement à d'autres espèces comme la souris, son organisme est capable d'adapter et de perfectionner naturellement la structure de ses anticorps pour épouser la forme de ces très petites molécules. Les technologies actuelles ne parviennent pas à reproduire cette maturation naturelle avec le même niveau de précision. Enfin, notre protocole repose sur l'isolement de ces cellules d'intérêt. L'immunisation initiale de l'animal est indispensable pour stimuler la production de ces lymphocytes B. Une fois ces cellules sélectionnées, nous récupérons leur matériel génétique pour produire définitivement les anticorps en laboratoire, de manière recombinante. Toutes les étapes ultérieures de sélection, de caractérisation et de production à grande échelle des anticorps sont ensuite réalisées exclusivement in vitro, sans recours supplémentaire à l’animal.

Réduction

Chaque production d’anticorps polyclonaux sera réalisée à partir de deux lapins par immunogène. Ce choix tient au fait que les animaux peuvent répondre différemment à une même substance injectée. Certains développent une réponse immunitaire plus forte ou plus adaptée que d’autres. L’utilisation de deux animaux permet donc d’identifier celui qui présente la meilleure réponse immunitaire grâce à une analyse réalisée sur des prélèvements sanguins, sans procédure supplémentaire sur l’animal. Le lapin présentant la réponse la plus adaptée est ensuite utilisé pour la production des anticorps. Le second animal permet de sécuriser la production : il peut être utilisé uniquement si la réponse du premier animal s’avère insuffisante en termes de qualité ou de performance des anticorps obtenus.

Raffinement

Les lapins seront hébergés par paire dans des cages communicantes afin de limiter l’isolement social tout en permettant le suivi individuel des animaux. Les cages seront aménagées pour favoriser le bien-être des animaux : elles comprendront un milieu enrichi avec une tablette, des haltères, des balles, des bâtonnets en bois à ronger et du foin. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Afin de réduire le stress et la douleur liés aux expérimentations, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane et/ou avec anesthésie locale lorsque cela est compatible avec les procédures. Le niveau de douleur attendu ne doit pas dépasser celui ressenti lors d’une injection chez l’humain. Tout animal présentant des signes de souffrance ne pouvant être atténués par des mesures compensatoires (surveillance rapprochée, enrichissement, ajout de nourriture liquide, etc.) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le lapin (Oryctolagus cuniculus) a été choisi comme modèle pour la production d’anticorps polyclonaux, en raison de son répertoire immunitaire diversifié et de sa capacité à générer des anticorps de haute affinité et spécificité, particulièrement adaptés à des cibles difficiles à adresser avec les anticorps murins, notamment les petites molécules. Les animaux utilisés seront des lapins adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour obtenir une réponse immunitaire robuste et reproductible, garantissant la qualité et la diversité des anticorps produits. De plus, les lapins sont des animaux de taille moyenne permettant de réaliser les injections multiples et prélèvements sanguins répétés dans des conditions de confort et de sécurité optimales, tout en limitant le stress et l’inconfort. Leur utilisation répond ainsi à des critères éthiques et pratiques, tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats. Nous utiliserons des lapins âgés de minimum 12 semaines au démarrage des immunisations. Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses humorales lors des immunisations successives.

Une partie des souris de ce projet est nourrie d'un régime riche en gras pour reproduire obésité et dyslipidémie, avant des infections pulmonaires bactériennes ou virales. 3 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, de l'âge de 8 semaines à environ 8 mois. Toutes subissent sept prises de sang par incision au bout de la queue, et jusqu'à quatre administrations par voie respiratoire, le porteur annonçant sous régime gras des "effets négatifs plus marqués" qu'il ne détaille pas. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Objectifs

L’obésité et la dyslipidémie (c’est-à-dire un taux de lipides inhabituellement élevé dans le sang) sont décrits comme des facteurs de risque de développement de maladies cardiovasculaires. Ils sont également associés avec une sensibilité accrue aux infections bactériennes ou virales, et une augmentation des risques de maladies inflammatoires. Ils sont aussi décrits comme des facteurs de risque pour des formes sévères d’infections pulmonaires virales, notamment liées au virus de la grippe. Nous souhaitons approfondir la compréhension des mécanismes impliqués lors d’une infection pulmonaire dans un contexte de dyslipidémie et d’obésité. Au cours de nos précédentes recherches, nous avons mis en évidence l’augmentation d’une population de cellules immunitaires, les neutrophiles, dans les poumons de souris nourries avec un régime riche en gras par rapport à des souris sous régime alimentaire normal. Un apport plus important de lipides dans l’alimentation entrainerait donc une inflammation globale, même sans infection bactérienne. Lors d’une pneumonie, l’augmentation de la population de neutrophiles est encore plus marquée, surtout lors des premières phases de l’infection. L’objectif de notre projet est de déterminer l’origine de cette population de neutrophiles, et leur rôle dans les infections pulmonaires dans un contexte d’obésité et de dyslipidémie.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre comment la dyslipidémie influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie et le rôle des neutrophiles dans ce contexte spécifique, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant d’obésité et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, il mettra en lumière les interactions complexes entre les troubles métaboliques et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à 7 prélèvements de sang après anesthésie locale. Un lot de souris recevra 3 injections, réalisées sur animaux vigiles. Un autre lot recevra 6 injections sur animaux vigiles puis sous anesthésie générale : 1 injection et 1 administration par voie respiratoire. Pour tous les animaux restants, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. Une partie des animaux recevra une à plusieurs administrations par voie respiratoire (4 au maximum), le reste des animaux recevront une à plusieurs injections (4 au maximum) et une à plusieurs administrations par voie respiratoire (4 au maximum). Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et les souris sont anesthésiées pendant 1 à 5 minutes maximum. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs administrations d’analgésiques peuvent être réalisées.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe induisent des effets indésirables transitoires 2-3 jours après une infection bactérienne ou 8-9 jours après une infection virale, dans le cadre d’un régime normal. Des effets négatifs plus marqués peuvent être observés dans le cadre d’un régime riche en gras. Les différentes administrations peuvent entraîner une légère gêne aux animaux. Une petite douleur peut survenir lors des prélèvements de sang, suite à l’incision minime à l’extrémité de la queue. Le geste de contention peut entrainer un léger stress aux animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'obésité nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnée aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages de taille normalisée, enrichies en frisottis, avec un tunnel et un dôme, et en carrés de cellulose suivant leur nombre. Le nombre de souris par cage est adapté à leur poids, et les souris isolées sont évitées autant que possible. Dans l’éventualité où une souris est seule, sa cage sera placée au milieu des autres cages de façon à lui permettre de voir et d’entendre ses congénères. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections d’analgésiants seront réalisées. De façon à limiter les gênes consécutives aux administrations et aux prélèvements de sang, des analgésiques locaux seront utilisés. Dans ces conditions, les gestes réalisés n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 8 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Soumises à des régimes enrichis en éthanol et à des administrations orales d'éthanol jusqu'à douze semaines, avec un effet sédatif et une "potentielle perte de conscience transitoire", 3 225 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent aussi un régime gras qui les rend obèses et limite leurs mouvements, pour tester des traitements des maladies du foie liées à l'alcool au fil de 45 projets. La description des procédures annonce 15 jours de cage individuelle pour le régime liquide, celle des effets néfastes en compte 25. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur foie et d'autres organes.

Objectifs

Les maladies hépatiques liées à l’alcool constituent un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Elles représentent l’une des principales causes de cirrhose, d’insuffisance hépatique et de cancer du foie, entraînant une morbidité et une mortalité importantes. Selon l’Organisation mondiale de la Santé, la consommation nocive d’alcool est responsable de plusieurs millions de décès chaque année dans le monde et contribue de manière significative à la charge globale des maladies chroniques. En outre, l’augmentation de la prévalence de l’obésité, du diabète de type 2 et du syndrome métabolique a conduit à l’émergence d’un nouveau profil de maladie hépatique. Cette maladie associe une consommation d’alcool excessive associée à une disfonction du foie lié à des problèmes métaboliques, souvent observée chez les patients souffrant d’obésité. Dans ce contexte, le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à prévenir ou limiter les lésions hépatiques induites par l’alcool constitue un enjeu médical majeur. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies dans deux modèles murins de consommation excessive d’alcool afin de proposer de nouvelles thérapies pour les patients (nous réaliserons 45 projets sur 5 ans) .

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est la maîtrise des deux modèles de maladies hépatiques liées à l’alcool. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces maladies métaboliques associée à la consommation excessive d’alcool et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies qui pourront être utilisés pour traiter les maladies hépatiques chez l'homme. Cette étude aura ainsi des bénéfices pour l'homme à long terme en extrapolant les résultats.

Procédures

Pour induire des complications hépatiques liées à l’alcool, des régimes enrichis en éthanol et une administration orale d’éthanol seront appliquées aux animaux pendant toute la durée du projet (jusqu’à 12 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). Jusqu’à 6 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement (retrait de l’aliment mais libre accès à l’eau). Dans le cadre du modèle sous régime liquide, nous hébergerons les animaux en cage individuelle avec un sur-enrichissement pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

- L’administration d’éthanol par voie orale induit des effets similaires à une alcoolisation chez l’homme, avec un effet sédatif et une potentielle perte de conscience transitoire. - Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. - Les prélèvements de sang réalisés et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal soit stressé par certains gestes techniques (contentions pour administration ou prélèvement). - L’utilisation du régime liquide nécessite un hébergement individuel pendant 25 jours ( jusqu'à 10 jours d'acclimatation, 5 jours d’habituation au régime liquide et 10 jours avec l’ajout de l’éthanol au régime). Cela peut induire un stress. - La mise à jeun de 6h peut induire un stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes cibles (le foie notamment).

Remplacement

Les complications hépatiques liées à l’alcool et l’obésité sont des dérèglements multi organes, qui se passent de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant les comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organe et l'évolution de la pathologie au cours du temps.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans l'étude. Quand plusieurs groupes de traitement sont étudiés, des tests statistiques sont réalisés.

Raffinement

L’état physique des souris est observé quotidiennement, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est réalisée. En cas d’hypothermie, l’animal sera placé en armoire chauffante. Pour limiter le stress lié à l’hébergement individuel dans le premier modèle, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. De plus nous ajouterons du sur-enrichissement (tunnel suspendu, igloo, cocoon...). Une habituation au régime liquide sera réalisée pendant 5 jours. Une habituation progressive à la contention sera prévue avant le début des traitements et/ou les prélèvements de sang (2 à 5 sessions). Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés. L'utilisation des antibiotiques sera validé avec le vétérinaire désigné. Les prélèvements terminaux seront réalisés sous couverture anesthésique et analgésique adaptée.

Choix des espèces

Les deux modèles de souris utilisés dans le présent projet sont connus pour l'étude des complications hépatiques liées à l’alcool car suffisamment caractérisés et publiés. En conséquence la connaissance acquise sur ces deux modèles permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 10 semaines d’âge en référence à des publications qui recommandent de ne pas utiliser des souris plus jeunes car plus sensibles à l’éthanol.