Recherche appliquée

Tués pour analyse des tissus dans les études d'efficacité, ou réutilisés après retrait des points de suture pour la moitié des animaux utilisés dans la formation du personnel, 500 lapins et 500 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La paupière d'un œil leur est cousue sous anesthésie générale pendant une vingtaine de minutes, opération qui peut irriter la cornée, déformer ou faire saillir la membrane nictitante, et dont les points peuvent s'arracher au grattage, les griffes étant coupées pour l'éviter. L'objet déclaré est d'améliorer l'absorption de traitements oculaires en empêchant le clignement, une partie des animaux ne servant qu'à entraîner du personnel à ce geste. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de mimer l'œil dans sa globalité fonctionnelle.

Objectifs

La blépharorraphie est une intervention chirurgicale courante en ophtalmologie vétérinaire pour des multiples indications thérapeutiques, notamment : le soin des ulcères de la cornée ou de plaies/érosions cornéennes, le soin des œdèmes cornéens, le soin des kératites. Le but de projet sera donc celui d'effectuer cette pratique chirurgicale dans le cas où cela améliorerait l'absorption de certains traitements oculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'optimiser l'efficacité de certains traitements en utilisant la blépharorraphie, qui permettra une meilleure libération de certains principes actifs en contrant le clignement des yeux.

Procédures

La seule intervention effectuée sera la suture de la paupière (blépharorraphie) d'un seul œil (sauf dans le cas particulier d’études pharmacocinétiques à temps courts si les animaux restent endormis) effectuée sous anesthésie générale avec administration d’anti-douleurs. L'intervention aura lieu une seule fois dans chaque étude et dure environ une vingtaine de minutes. Des prélèvements de sang pourront être effectuée en cours d'étude sur animaux vigiles, en suivant les recommandations scientifiques qui détaillent le volume maximum prélevable selon le poids de l'animal suivant un temps de repos adapté.

Impact sur les animaux

La blépharorraphie est une pratique chirurgicale couramment utilisée en ophtalmologie vétérinaire et humaine, sans difficultés techniques majeures et avec d'excellents résultats. Mis à part les manipulations lors des pesées des animaux et la contention des animaux pour les observations journalières ainsi que la piqûre pour l'injection des produits anesthésiants, cette technique pourrait induire : -irritation de la cornée par contact avec les fils de suture -déformation du cartilage de la membrane nictitante -protrusion de la membrane nictitante (souvent réversible) - infection à la suite de la chirurgie (risque très faible mais présent avec tout acte chirurgical). Ces phénomènes restent rares, réversibles et indolores. La douleur de l'acte chirurgical sera soulagée par injection d'un analgésique en plus de l'anesthésie. De l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, elle sera minimisée par l’utilisation de tapis chauffant (lapin) ou d'armoires chauffantes (rats) selon les espèces. Les points de suture peuvent s’enlever (grattage de l’animal, par exemple) au bout de quelques jours, mais il sera possible de les refaire sous anesthésie et sans douleur. Afin d’éviter que les animaux s’arrachent des points de suture lors d’un éventuel grattage, une coupe des griffes sera effectuée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour analyse des tissus dans le cas des études d'efficacité des traitements. Pour la formation du personnel, la moitié des animaux seront euthanasiés pour analyse des tissus en histologie et l'autre moitié sera reutilisée une fois le retrait des points de suture effectué.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse …) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Compte tenu de la complexité de l’organe et en l’absence de modèle alternatif, le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples suivant le choix du test (paramétrique ou non paramétrique). Chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Afin d’avoir une puissance aux tests au moins égale à 0,80, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien- être. Les animaux auront des enrichissements adaptés. Aucun examen invasif ne sera réalisée sur les animaux à la suite de la suture des paupières. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Des enricchissements supplémentaires (une balle de cellulose en plus, par exemple) sont prévus dans le cas des lapins qui seront hebergés individuellement.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie a une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, cette pratique chirurgicale est largement connue en médecine vétérinaire et s'effectue très bien chez le lapin et chez le rat. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 15 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux.

Quarante brebis sont saillies, vingt-cinq gestantes reçoivent huit injections intramusculaires de testostérone sur dix-huit semaines, puis leurs quarante agneaux subissent quatorze prises de sang au cou de la naissance à six mois. À la puberté, seize femelles nées de mères androgénisées passent une anesthésie générale et une IRM, la pose d'un cathéter jugulaire, puis 64 prélèvements de sang et six injections. 80 moutons vont ainsi être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester un anticorps contre l'hormone anti-müllérienne comme traitement possible du syndrome des ovaires polykystiques chez la femme, le porteur affirmant que cet anticorps ne peut être testé que sur un "organisme entier". Dix-neuf retournent à l'élevage, les autres sont tués après l'agnelage ou après la puberté pour prélever leurs tissus reproducteurs.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Pour la procédure 1: sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Pour la procédure 2: sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. Pour limiter les tress lié à la manipulation, Ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) sera suivi avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle le temps des prélèvements, mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénéères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux de l'EU1 vers l'EU2 avant l'opération et leur retour de l'EU2 vers l'EU1 sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est très court (moins de 5 minutes) et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

Élevés par un fournisseur installé sur le même site que le laboratoire, 300 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis restent disponibles pour d'autres expériences après une période de repos. Chacun subit douze à trente prélèvements de sang, quatorze possibles sur les seules 24 premières heures d'après la description des procédures et seize d'après celle des nuisances, l'administration du produit testé, et parfois trois à six ponctions de la vessie à travers la paroi abdominale sous anesthésie locale. Le porteur reconnaît que le stress engendré par ces prélèvements répétés sera "non négligeable" pour l'animal. Aucune analyse statistique n'est prévue, le nombre d'animaux étant ajusté et justifié par le "Donneur d'Ordre" pour chacune des deux à cinq études menées chaque année.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux produits permettant de mieux protéger/traiter les chiens face à différentes maladies canines.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur l'ensemble des chiens : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la procédure (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement éventuel d’urine par ponction de la vessie échoguidée à travers la paroi abdominale sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendus suite à l’administration du produit d’essai dont la non-toxicité et la tolérance locale aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Selon la voie testée (Sous-cutanée, Intra-musculaire), seule l’administration des produits pourra entrainer une nuisance correspondant à l’introduction de l'aiguille pour l’injection entraînera une douleur légère de courte durée . Les prélèvements des animaux peuvent entrainer un stress physique de l’animal lié à sa contention répétée et l’introduction de l’aiguille entraînera une douleur légère et transitoire au point de prélèvement. Jusqu’à 16 prélèvements sanguins pouvant être réalisés les 24 premières heures, le stress engendré par cette action répétée sera non négligeable pour l’animal.

Devenir

A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.

Remplacement

Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du traitement. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes (EMA/CVMP/EWP/133/1999-Rev.1 et EMA/CHMP/CVMP/JEG :450091/2012). Le nombre d’animaux sera ajusté et justifié par le Donneur d’Ordre pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques et des données bibliographiques existantes sur la molécule testée. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études en cross-over après un temps de repos suffisant.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les condition d'alimentation des animaux pourront être standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations internationales de bonnes pratiques. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique inatendu chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale. Ce projet incluant 300 animaux permettra de réaliser 2 à 5 études par an.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du nouveau traitement. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens en bonne santé de plus de 6 mois, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement vétérinaire.

Une ulcération de la peau de 8 à 10 millimètres est provoquée chez 384 souris par l'injection du parasite responsable de la leishmaniose cutanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles recevant en plus un gavage, une injection dans l'abdomen ou une application locale des composés à tester. Le porteur décrit cette ulcération comme survenant "sans douleur ni autre signe local", tout en reconnaissant qu'aucune étude toxicologique n'a été faite sur cette nouvelle famille de molécules et qu'il est donc impossible de prévoir leurs effets indésirables. Toutes sont tuées à l'issue, aucune ne pouvant selon lui être réutilisée ni adoptée puisque rien ne garantit que l'infection soit jugulée.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une étude validée et financée par l’ANR et se déroulant sur 4 ans. Il s’agit de découvrir de nouveaux traitements contre les leishmanioses cutanées. Ces traitements devront avoir une faible toxicité et permettre, en priorité, une administration par voie orale. Les premières étapes ont été de démontrer l’activité sur le parasite en culture et la faible nocivité sur des cellules mammifères. Ces 2 critères ont permis de sélectionner les molécules y répondant. Des critères supplémentaires de sélection ont permis de choisir les composés entrant dans la dernière phase de notre étude, sur la souris. Les procédures décrites dans ce projet ont donc pour but de répondre à un double objectif. Le premier est de confirmer l’efficacité de nouveaux traitements contre les leishmanioses cutanées. Le second est de déterminer la meilleure voie d’administration pour obtenir la meilleure efficacité. Le suivi clinique des animaux permettra de surveiller la survenue d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont de valider l’efficacité de nouveaux traitements contre la leishmaniose cutanée contre laquelle actuellement très peu de médicaments sont efficaces. Cette pathologie atteint les humains mais aussi d’autres espèces animales. L’accès à un nouveau traitement permettrait de lutter plus efficacement contre cette infection parasitaire. Par ailleurs, cette étude finaliserait la validation de la nouvelle cible du médicament.

Procédures

Les animaux sont soumis : - 384, à des injections sous-cutanéees, 5 secondes / - 120, injection intrapéritonéale, 5 secondes / - 120, gavage, 5-10 secondes / - 120, application locale du traitement, 1 minute /- 384, mesure du diamètre de la lésion, 1 minute

Impact sur les animaux

La leishmaniose cutanée provoque une ulcération de la peau (8-10 mm) sans douleur ni autre signe local. Une surveillance quotidienne permettra de vérifier l’état de la lésion pour prévenir toute surinfection bactérienne. L’administration de nouveaux traitements, bien qu’ayant été sélectionnés pour leur faible/absence de toxicité sur des cellules d’origine humaine et de souris, est toujours à risque d’engendrer des effets indésirables. Comme il s'agit d'une nouvelle famille de molécules, aucune étude toxicologique n'a encore été faite. Il est donc impossible de prévoir les effets indésirables et s'il y en aura. C'est pour cela que les animaux seront surveillés quotidiennement pour observer leur comportement individuel et collectif. Tout comportement anormal sera être le signe d'apparition d'un effet indésirable. Au fûr et à mesure de l'avancée de l'étude, les informations glanées sur les effets indésirables rencontrés permettront d'ajuster les doses administrées pour les procédures suivantes, si nécessaire. L'effet attendu est la guérison des ulcérations cutanées ou, à défaut, une diminution de leur diamètre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Ces animaux étant infestés par un parasite pour aucun d'entre-eux il ne peut être garanti que l'infection soit entièrement jugulée. Ils ne peuvent donc pas être réutilisés pour d'autres expériences, ni adoptés.

Remplacement

Les modèles in vitro de peau ne possèdent pas les cellules hôtes du parasite ni les régulations immunitaires associées. Ils ne permettent pas non plus d’évaluer la répartition de traitement administrés. Il n’existe donc pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant d’évaluer l’effet de nouveaux traitements potentiels sur l’évolution de cette pathologie au niveau cutanée.

Réduction

Le nombre d’animaux choisis l’a été en fonction de l’étude de la littérature scientifique, de l’expérience du laboratoire dans l’utilisation de ce modèle. Ce nombre d'animaux a été ajusté en utilisant le logiciel de statistiques. Afin d'améliorer le raffinement, une première expérience sera réalisée pour déterminer le meilleur paramètre d'infestation. Le nombre d'animaux a donc été réduit au strict nécessaire pour conduire à des résultats interprétables. Les données recueillies ont permis de déterminer un nombre d’animaux minimum pour que le test statistique soit interprétable.

Raffinement

Les mesures effectuées sur les animaux (pesée, diamètre de la lésion), analyse des prélèvements de peau permettront d’avoir une étude la plus complète de l’efficacité du traitement. L'expérience a été conçue pour éviter toute souffrance inutile des animaux, en optimisant sa durée (intérêt de l'étude préliminaire, des méthodes d'analyse des prélèvements permettant une meilleure détection de la charge parasitaire) et en suivant ces animaux quotidiennement afin d'intervenir au plus tôt pour les soulager (antalgiques => euthanasie). pour guider notre décisison, des points limites précis ont été définis. En cas d'atteinte de ces points limites, les animaux seront euthanasiés. En cas d'identification de signes de souffrance, en plus de l'administration d'un antalgique, un petit dôme en carton sera inséré dans la boite. Par ailleurs, l'environnement des animaux est enrichi avec des frisottis (quantité suffisamment importante pour qu'ils puissent s'y cacher, créer un nid...), un tube en plastique rouge transparent (pouvant servir de refuge, de jeu, de moyen de transport des animaux pour les expérimentateurs).

Choix des espèces

La lignée de souris Balb/c a démontré sa réceptivité pour les leishmanies. L’étude de la littérature et l’expérience du laboratoire dans l’utilisation de ce modèle confirment la pertinence de ce choix. Les animaux auront 5 à 6 semaines. L’utilisation de jeunes adultes permet d’avoir une bonne zone d'observation pour mesurer le diamètre des lésions et ils possèdent un système immunitaire fonctionnant normalement.

Une chirurgie de cinq heures au maximum ouvre le crâne pour y implanter des électrodes, puis les souris sont enregistrées pendant leur sommeil 48 heures par mois, de l'âge de deux mois à quinze mois. Certaines parcourent un labyrinthe ou apprennent à associer un indice visuel à une action pour obtenir une récompense, sous contrôle alimentaire. D'autres reçoivent une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois mois. Le porteur présente le maintien des animaux pendant plus d'un an comme un moyen d'obtenir un maximum de données par animal. 220 souris transgéniques mimant la maladie d'Alzheimer vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’évaluer simultanément le décours temporel de l’apparition des altérations du sommeil d’une part et des altérations cognitives d’autre part dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer, 2- de tester si moduler l’activité des neurones du thalamus, une structure profonde du cerveau, en amont de l’apparition des symptômes cognitifs pourrait permettre de retarder l’apparition des symptômes cognitifs et de diminuer la charge d’Amyloïde Béta dans le cerveau des souris, 3- d’évaluer l’évolution de la connexion entre le thalamus et le cortex au cours du vieillissement, 4- d’évaluer le fonctionnement du thalamus et du cortex cours du vieillissement et en relation avec le sommeil, et enfin 5- de tester si activer les neurones du thalamus permet de réduire la charge en Amyloïde Béta chez les souris Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet est un projet de recherche fondamental dont l’impact pour les familles et les patients ne sera pas immédiat. Néanmoins, la recherche fondamentale est indispensable à l’identification de nouvelles pistes de traitement et ce projet pourrait donner des pistes thérapeutiques à relativement brève échéance pour deux raisons : Tout d’abord, ce projet vise à proposer le sommeil comme piste de réflexion dans la prise en charge des patients. Le sommeil est souvent très dégradé chez les patients âgés et ce sommeil est indispensable pour le bon fonctionnement de notre mémoire et pour notre récupération. Améliorer la qualité du sommeil des patients pourrait avoir des conséquences immédiates sur l’amélioration des capacités de consolidation de la mémoire et sur les capacités d’attention. Ceci pourrait être très rapidement mis en place car il existe déjà un arsenal thérapeutique pour le traitement des problèmes de sommeil. D’autre part, ce projet va permettre de chercher à comprendre si la stimulation du thalamus, un ensemble de noyaux profonds du cerveau, pourrait permettre d’améliorer les performances cognitives dans un modèle de souris transgéniques mimant les symptômes de la maladie d’Alzheimer. On sait que la stimulation de ces noyaux permet de diminuer les micro-réveils qui sont très communs chez les patients et qui contribuent à une mauvaise qualité de sommeil. Les neurones qui composent ces noyaux présentent des signatures biochimiques très particulières qui leur permet d’être ciblés par des molécules médicamenteuses. Si les résultats de cette étude sont positifs, il serait alors assez facile et rapide de lancer une étude clinique qui permettrait d’évaluer si les résultats obtenus chez la souris sont aussi prometteurs chez l’homme.

Procédures

Les animaux subiront des chirurgies invasives pour l'implantation des électrodes d'enregistrement intra-cranienne. Cette chirurgie dure un maximum de 5 heures. Ils seront ensuite enregistrés pendant leur sommeil 48h tous les mois de 2 à 15 mois dans des caissons d’enregistrements spécifiques. Certains animaux effectuerons aussi différentes tâches de comportement comme un labyrinthe et une tâche d’association où l’animal doit associer un indice visuel avec une action à effectuer pour obtenir une récompense. Enfin, certains animaux subiront des injections intra-péritonéales tous les jours pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont un animal modèle transgénique de la maladie d’alzheimer. Ces animaux ont des troubles mnésiques qui se développent progressivement au cours du vieillissement mimant ainsi les troubles cognitifs des humains souffrant de la maladie d’Alzheimer. Toutes les procédures faites sur ces souris seront de degré́ de sévérité modéré du fait de la chirurgie nécessitant l’insertion d’électrodes dans le cerveau. Les douleurs péri- et post-opératoires sont minorées par l’administration d’antalgiques puissants. Les animaux effectueront des tests comportementaux qui impliquent une brève contention pour connecter l'implant au système d’enregistrement et un contrôle alimentaire, qui peuvent provoquer un stress chez l’animal. Ces paramètres sont minorés par une précautionneuse habituation des animaux à la manipulation par l’expérimentateur.

Devenir

Toutes les expériences seront terminées par la mise à mort des animaux pour prélèvement d’organes pour des études post mortem.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude de plusieurs paramètres comportementaux chez la souris et enregistrement de plusieurs aires corticales simultanément pendant le sommeil. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques avancés qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures qui sont prises plusieurs fois sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests permettent d'inclure des animaux qui n’auraient pas faits toutes les étapes du protocole et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées. Enfin cette étude comporte deux procédures pendant lesquelles les animaux seront gardés pendant plus d’un an, permettant d’obtenir un maximum de données par animal et de pouvoir comparer l’évolution chez le même animal de différents paramètres.

Raffinement

Dans ce projet, les enregistrements électrophysiologiques seront combinés à des tâches comportementales ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, les étapes d’habituation et de contention ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Les animaux implantés sont souvent isolés pour protéger les implants. Dans cette étude, les souris seront soit maintenues en groupe soit maintenues dans des cages spécifiques développées qui, grâce à une cloison avec des larges trous, permet aux animaux de se sentir et se côtoyer sans pour autant pouvoir ronger le connecteur de son compagnon de cage. La prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Enfin, un arbre décisionnel d’évaluation du bien-être de chaque souris a été mis en place comportant différents points limites afin d’abréger les souffrances de l’animal en cas de complications post-opératoires et tout au cours du protocole expérimental.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris car nous comparerons ici l’évolution des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez les individus sains et dans un modèle de souris transgénique de la maladie d’Alzheimer. D’autre part, les stratégies de transduction virale sont largement utilisées chez la souris ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec ceux de la littérature. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. Les souris possèdent une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines pour les injections et 8 semaines pour les implantations quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgies seront effectuées à 8 et les enregistrements entre 9 et 60 semaines. En effet, ce projet vise à étudier l’évolution au cours du vieillissement des performances cognitives et de la qualité du sommeil chez des animaux sauvages et modèles murins de la maladie d’Alzheimer.

Fournir un modèle expérimental pour tester des traitements des complications oculaires du diabète : 2 180 souris et 2 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine qui détruit les cellules du pancréas produisant l'insuline, puis une kératopathie leur est provoquée sur un œil après huit à seize semaines de diabète. Le porteur indique qu'au bout d'un mois les rats malades pèsent 50 à 60 % du poids des rats témoins du même âge, et décrit les examens oculaires comme semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet. Les gouttes peuvent être administrées six à huit fois par jour et les injections dans l'œil une à deux fois par semaine, pour des études d'efficacité relevant en partie de l'usage réglementaire.

Objectifs

Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une cascade d’évènements impliquant des médiateurs de l’inflammation qui conduisent à la dégradation des cellules neuronales et des capillaires sanguins de la rétine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritonéale d’une molécule qui rend les animaux diabétiques. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à trois fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal ou au niveau de la mandibule. L'induction de la kératophatie se fera uniquement sur un œil et par un acte unique après une période de 8 et 16 semaines de diabète, la procédure ne durera pas plus de 10 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens au biomicroscope) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de Streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris et serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...).

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’oeil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.Le projet nécessitera donc d’avoir recours à des animaux compte tenu des particularités de l’organe concerné par le projet et l’absence de modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal. L'analyse des deux yeux sera effectuée chaque fois que possible afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la cornée diabétique est bien documentée chez la souris pigmentée (Young L, et al 2014) ou le rat albinos. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabète conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Infectées par Helicobacter pylori, elles subissent un gavage par jour pendant trois jours puis deux par jour pendant sept jours, sur animal vigile. Le porteur annonce une possible perte de poids liée au stress du gavage et à l'infection, et ne décrit aucun autre effet. Il indique que l'activité antibactérienne du composé a déjà été montrée en culture, et juge les expériences chez la souris "indispensables" pour confirmer sa biodisponibilité dans la muqueuse gastrique.

Objectifs

Le cancer gastrique est actuellement la 4e cause de mortalité par cancer dans le monde. L’infection chronique par Helicobacter pylori est considérée comme étant responsable d'une grande majorité des cancers de l'estomac. L’objectif est de montrer l’efficacité anti bactérienne contre Helicobacter pylori du composé développé par notre collaborateur.

Bénéfices attendus

L’objectif à terme est de développer un nouveau médicament pour le traitement de l’infection à H. pylori.

Procédures

Gavage : animaux vigiles, 1 fois par jour pendant 3 jours puis 2 fois par jour pendant 7 jours. Le gavage dure moins d'une 1 minute.

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au stress du gavage 2 fois par jour et à l’infection à H. pylori.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin que leurs organes soient prélevés et analysés.

Remplacement

L’effet antibactérien du composé sur Helicobacter pylori a été montré in vitro par nos collaborateurs. Des expérimentations chez la souris avec ce composé sont indispensables afin de confirmer sa biodisponibilité et son activité in vivo dans la muqueuse gastrique, éléments qui ne peuvent pas être modélisés in vitro.

Réduction

Le modèle d’infection à H. pylori est connu et maitrisé. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. pylori qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis. Une application permettant de déterminer le nombre d’animaux optimal a été utilisé.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de litière et maisonnettes en polycarbonate). Les souris seront suivies quotidiennement par le personnel de l’animalerie ainsi que par les expérimentateurs en suivant des critères bien définis. En cas de souffrance des mesures conservatoires seront mises en place pour soulager l'animal. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas alors il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle d’infection à H. pylori a été mis au point chez la souris et est parfaitement maitrisé. Les souris seront utilisées à un âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. pylori. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.

900 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, chacune passant trois heures immobilisée dans un tube de contention pour un test de tolérance au glucose et 72 heures isolée en cage de calorimétrie, série de tests répétée jusqu'à trois fois sur les 20 à 30 semaines du protocole. Elles reçoivent un gavage de sucrose, des injections d'insuline, cinq gouttes de sang prélevées à la queue par test, et un régime enrichi en graisses et en sucre qui les fait grossir et provoque des lésions cutanées d'hypertoilettage. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour analyser leurs organes. Le porteur renvoie à "plus long terme" le développement de médicaments contre le diabète et l'obésité, pour un projet qui compare des groupes de neuf animaux par gène étudié, à raison de cinq gènes par an pendant cinq ans.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée. Amendement 2: 2 injections intrapéritonéales.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique. Amendement 2: une anesthésie peut induire un inconfort lors du reveil des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Une dissection de la sous-muqueuse de l'œsophage provoque une sténose, donc une gêne à avaler et un risque de vomissements, auxquels s'ajoutent la perforation et la péritonite liées à la pose d'une prothèse. 40 cochons vont être utilisés dans ces procédures classées à un niveau de souffrance modéré, chacun subissant de deux à cinq interventions sous anesthésie générale, de vingt minutes à deux heures, suivies chaque fois de 24 heures à jeun. Le porteur écarte l'idée de pratiquer deux procédures sur le même animal, au motif que la sévérité serait alors "trop importante" pour maintenir un niveau de bien-être suffisant. Tous sont tués en fin de protocole pour examiner à l'œil nu les zones traitées.

Objectifs

La cicatrisation après une résection endoscopique peut aboutir à la formation d’une sténose dans environ 15% des cas et jusqu’à 90% lorsque la dissection fait plus des ¾ de la circonférence le risque de sténose est de 90%. Pour prévenir cette sténose, l’application de corticoïdes locaux afin de diminuer le processus inflammatoire est utilisée et diminue le risque de sténose entre 12-30% en cas de dissection de plus de 75%. Des dilatations endoscopiques peuvent également être effectuées avec néanmoins un risque de sténose dans les suites de la dissection estimé à 59% des cas. En cas de sténose des dilatations itératives sont nécessaires (jusqu’à 30 séances) et non dénuées de risque (perforation). La mise en place systématique d’un stent dans la sous muqueuse pour créer une nouvelle lumière digestive est une technique encore non évaluée mais qui pourrait permettre d’éviter une sténose en créant un nouveau chenal. Enfin, ce processus sténosant pourrait être détourné pour traiter des fistules ou encore fermer des orifices naturels pour modifier l’anatomie notamment à des fins bariatriques. Nous souhaitons donc évaluer plusieurs nouvelles procédures utilisant ce processus de cicatrisation excessive entrainant une sténose après dissection circonférentielle de la sous-muqueuse sur des modèles animaux. Nous proposons ainsi 3 procédures : 1) En créant une sténose par dissection sous muqueuse endoscopique puis en traitant ces sténoses en évaluant si la sous-muqueuse profonde de l'œsophage pourrait être utilisée comme tunnel pour placer un stent sous-muqueux afin de créer une nouvelle lumière œsophagienne qui permettrait le passage de l’endoscope. 2) Pour fermer le pylore en même temps que l'anastomose guidée simulant ainsi un by-pass gastrique 3) Pour fermer les fistules recto-vésicales Ce projet permettra également une évaluation à court terme de l’efficacité des techniques sus-cité par la possibilité d’une reprise alimentaire des porcs après la réalisation du tunnel oesophagien et de la gastroentéroanastomose , et par l’absence de récidive de fistule qui se manifesterait par la présence d’une fécalurie au décours de l’intervention numéro 3.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des preuves sur l’efficacité d’un traitement endoscopique pour : 1) La prévention des sténoses œsophagiennes post dissection sous muqueuse. En effet, actuellement les dissections cicronférentielles de l’œsophage entrainent de nombreuses complications et sont un frein à cette technique endoscopique en faveur d’une chirurgie plus morbide. La preuve d’une prévention de la sténose par pose d’une prothèse oesophagienne systématique sur modèle animal permettra de proposer une étude de faisabilité chez l’homme. 2) La réalisation de By-pass par voie endoscopique. En cas de succès de la technique sur modèle animal, une étude pilote chez l’homme pourra être proposé au patient souffrant d’obésité morbide et ne pouvant subir une intervention chirurgicale lourde du fait de leur trop nombreuses co-morbidités. 3) La fermeture des fistules par technique endoscopique combinée (dissection et clip). Nous avons déjà apporté quelques cas humain de l’efficacité de la technique, néanmoins des données plus robuste sont nécessaire. Une validation préalable sur animal est nécessaire avant de pouvoir diffuser la technique sur le sujet humain

Procédures

Procédure 1 : les animaux auront de 3 à 5 interventions, sous anesthésie générale, dont procédure chirurgicale de dissection sous muqueuse (durée : 1-2h) , avec pour la moitié une pose de prothèse lors de cette intervention. La pose de prothèse peut également être faite en cas d’apparition d’une sténose avec nouvelle anesthésie générale pour les animaux n’ayant pas eu de prothèse initiale. Les autres interventions sont des évaluations endoscopiques (durée : 30-45min). La dernière anesthésie générale est celle pour l’euthanasie(durée : 30-45min). Procédure 2 : les animaux qui suivent cette procédure auront 1 intervention sous anesthésie générale par voie endoscopique (durée : 1-2h) et une réévaluation endoscopie avant mise à mort (durée 30-45min). Procédure 3 : Les animaux subiront 4 interventions sous anesthésie générale : 1 création de fistule (durée 45min-1h30), 1 intervention pour le retrait de la prothèse (45min-1h), un procédure de dissection sous-muqueuse (durée 1-2h) et une réévaluation endoscopique avant mise à mort (durée 30-45min)

Impact sur les animaux

Les animaux devront rester à jeun les 24 heures qui suivent les différentes interventions. Procédure 1 : Du fait de la dissection sous muqueuse de l’œsophage, les animaux vont développer une sténose œsophagienne qui va entrainer une dysphagie avec un risque de diminution de la prise alimentaire voir de vomissement en cas de sténose complète (occlusion haute). Les complications inhérentes au geste sont dominées par la perforation œsophagienne per endoscopique, et la migration de la prothèse œsophagienne pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Ils pourront avoir une alimentation liquide après 24 heures de jeune, en l’absence de vomissement après 24 heures d’alimentation liquide, une alimentation moulinée pourra être proposée progressivement sur 48 heures. Procédure 2 : Les nuisances peuvent être la perforation, la migration de la prothèse d’apposition pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Après les 24 heures de jeun, une reprise alimentaire progressive sera entreprise, avec à J1 une alimentation liquide, puis à J2 une alimentation mixée et à J3 une alimentation normale. Procédure 3 : Les complications de cette technique sont : la perforation, la migration de la prothèse d’apposition pouvant entrainer une perforation et une péritonite. Il existe également un risque d’infection urinaire. Après les 24 heures de jeun, une alimentation normale pourra être reprise.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d’analyse macroscopique des zones traitées

Remplacement

l’utilisation de l’animal est indispensable car aucun modèle n’est en mesure de reproduire les difficultés techniques retrouvées in vivo (mouvements de l’intestin, de l’anse jéjunale par rapport à l’estomac, mouvements respiratoires) dont la maîtrise est primordiale dans la réussite de ces techniques. Par ailleurs, le processus sténotique/fibrosant ne peut être évalué sur simulateur virtuels /mécanique ou modèle ex vivo puisque ce phénomène nécessite l’activation d’un processus cellulaire inflammatoire non reproductible en laboratoire à l’heure actuelle.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe pour chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux. Chaque procédure pourra être répétée au besoin une fois. Dans l'objectif de réduire le nombre d'animaux, la possibilité d'effectuer plusieurs procédures différentes sur le même animal a été étudiée. Cependant, le fait de pratiquer 2 procédures ou plus sur le même animal serait selon nous d'un niveau de sévérité trop important pour maintenir un niveau de bien-être suffisant de l'animal.

Raffinement

Les animaux seront récupérés a minima 5 jours avant l’intervention et logés dans une animalerie adaptée avec enrichissement du milieu permettant une prise en charge adéquate avec les règles du bien-être animal. La procédure est réalisée sous anesthésie générale ; des règles d’euthanasie strictes en cas de signe de souffrance identifiée pendant la procédure ont été stipulées. Une surveillance particulière sera effectuée sur les animaux en post-opératoire avec le suivi notamment de l’alimentation pour être en mesure de détecter au plus tôt la présence de sténose œsophagienne (surveillance toutes les 6-8 heures sur la période à risque). Le risque d’infection urinaire était présent dans les procédures de fistules, ce point sera particulièrement suivi, et un traitement antibiotique sera mise en place de manière préventive.

Choix des espèces

Les simulateurs virtuels et mécaniques ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal pour l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré eux leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieures et antérieures de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. A l’heure actuelle, aucun modèle n’existe permettant de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo combinant l’estomac et l’intestin grêle jusqu’à l’angle de TREITZ n’est disponible et de plus la difficulté technique est basée sur une combinaison des mouvements péristaltiques de l’intestin grêle, une mobilité de l’anse jéjunale par rapport à l’estomac et les mouvements digestifs liés aux mouvements respiratoires. Ces difficultés techniques ne peuvent à l’heure actuelle être appréhendées uniquement sur un modèle animal vivant anesthésié. Par ailleurs le processus sténotique/fibrosant ne peut être évalué sur simulateur virtuels /mécanique ou modèle ex vivo puisque ce phénomène nécessite l’activation d’un processus cellulaire inflammatoire non reproductible en laboratoire à l’heure actuelle.