Recherche appliquée

Pour faire franchir à un anticorps anticancéreux la barrière qui protège le cerveau, 60 rats reçoivent un cathéter implanté dans le crâne. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et tous sont tués au bout de quatre semaines, pour l'analyse des tissus cérébraux. Chaque animal subit seize ponctions sous anesthésie générale, huit prélèvements de sang et huit de liquide céphalo-rachidien, étalées sur ces quatre semaines. Le porteur reconnaît que l'acte chirurgical peut léser le cerveau ou la moelle épinière au point d'empêcher l'animal de se nourrir et de boire, et renvoie à des points limites "préalablement définis" sans dire lesquels.

Objectifs

Le cancer du sein métastatique est une cause majeure de mortalité chez les femmes, en particulier un sous type apellé "HER2", est un gros pourvoyeur de métastases cérébrales incurables. Il existe pour ce sous type une thérapie ciblée par anticorps, le trastuzumab. Malheureusement ce traitement, administré ne pénètre pas dans le cerveau en raison d'une barrière protectrice appelée la barrière hémato- encéphalique. Pour la contourner, des injections peuvent être faites directement dans le système nerveux central (SNC) c'est à dire dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Le problème est qu'une fois dans le LCR, les anticorps fuient vers l'extérieur du SNC. Nous avons développé un nouvel anticorps, dont le design permettait d'éviter la fuite du SNC. L’objectif de cette expérience est l’étude pharmacologique de ce composé thérapeutique chez des rats cathéterisés au niveau cérébral, dans l'objectif final de traiter des patientes atteintes de métatastases cérébrales de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Notre projet se positionne dans une démarche translationnelle (objectif d'application clinique). Le cancer du sein métastatique est la cause majeure de mortalité chez les femmes. Les métastases cérébrales sont les localisations les plus graves, survenant dans 15 à 40 pourcent des cancers du sein métastatique, avec une survie très faible. Ces expérimentations vont nous permettre de faire une étude de l’efficacité d’une nouvelle molécule thérapeutique avec différents vehicules (des billes d’alginate de différentes taille) afin d’améliorer la formulation de ce traitement. Cette molécule sera par la suite testée lors d’un essai clinique

Procédures

Pour chaque animal, un premier acte de pose de cathéter au niveau cérébral, suivi d’une injection d’un agent thérapeutique se fait sous anesthésie générale (durée de l’opération : 20 minutes). Une analgésie 30 minutes avant opération est effectué ainsi que post-opératoire pendant 24 heures (jusqu’à 72h si nécéssaire). Les prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien (durée : 5 minutes) qui vont suivre cette opération se feront en même temps et sous anésthésie générale, à différents temps après l’injection de l’agent thérapeutique pour un total de 8 prélèvements sanguins et 8 prélèvements de liquide céphalo-rachidien espacés sur 4 semaines. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Durant la pose du cathéter, un stress thermique peut être observé pendant l’anesthésie de l’animal. L’acte chirugical peut entrainer des douleurs ou lésions au niveau cérébral et/ou de la moelle épinière. Ces lésions peuvent notament entrainer un problème pour l’animal à se nourrir et à s’hydrater. A cela s'ajoute des nuisances possibles durant les prélèvements (sanguin et de liquide céphalo-rachidien) à type de stress ou douleur lors du prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au terme des 4 semaines de traitement pour analyses tissulaires du cerveau ou en amont en cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'étudier la pharmacologie d’un anticorps encapsulé dans des billes d’alginate après leur injection intra-cérébrale sur des modèles de rats. Des modèles in-vitro existent pour modéliser la barrière hémato-encéphalique. Il est également possible d'évaluer la dégradation des billes d’alginate contenant l'anticorps dans des modèles in vitro. Ces méthodologies permettent de répondre à des problématiques précises mais donnent des informations limitées et peu transférables à l'homme. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires (et nous avons par ailleurs fait des expériences in-vitro pour ce sujet), mais ne permettent pas de s’affranchir totalement de l’expérimentation animale, en vue d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires pour ce travail selon plusieurs critères: 1) Un calcul statistique de puissance pour une interprétation fiable des résultats. 2) La prise en compte d'un taux de décès per opératoire (tenant compte de notre expérience passée, ce taux d'échec est grandement limité mais dois toutefois être pris en considération) Nous avons donc fixé à 10 le nombre de rats par bras de traitement. Ce projet prévoit 60 rats.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé (un abri en plastique rouge translucide). Cette procédure expérimentale sera réalisée par une équipe maitrisant parfaitement le geste chirurgical et les mesures d'asepsie règlementaires. Le geste sera réalisé en conditions stériles, dans une pièce opératoire dédiée. Les mesures d'anesthésie/analgésies seront assurées tout au long de la procédure. Avant la réalisation de la chirurgie (pose de cathéter intrathécal) les animaux recevront une injection d'anesthésique et d'analgésique. L'analgésie sera prolongée systématiquement pendant 24h après le geste, et ultérieurement selon le besoin de l'animal. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l’expérimentation l’animal sera euthanasié. Les injections et ponctions de liquide céphalo-rachidien et de sang seront réalisées sur animal anesthésié afin de limiter le stress lié à l’acte.

Choix des espèces

Choix des espèces: Notre choix des rats est basé sur la faisabilité technique. En effet, compte tenu de la complexité technique à réaliser la cathéterisation intratécale, il n’est pas possible de réaliser ce projet chez la souris (modèle trop petit). Par ailleurs, pour l'analyse des prélèvements, nous avons besoin d’un volume minimum de liquide céphalo-rachidien (LCR) qui est incompatible avec le volume de LCR chez la souris. Stade de développement: Pour le stade de développement de l'animal, deux critères sont pris en compte: 1) D'une part le taux de réussite de l'anesthésie générale. Cette dernière doit être complète tout au long de la procédure chirugicale. L'efficacité des produits anesthésiques, injectés par voie intra péritonéale, est maximale sur de jeunes animaux avec de faibles réserves en graisses (les anesthésiques s'accumulant dans la graisse avec relarguage continu, nous avons identifié que sur des animaux plus vieux, ayant accumulé d'avantage de graisse, l'anesthésie est moins efficace et le reveil plus long à obtenir en fin de procédure) 2) D'autre part une réserve suffisante de liquide céphalo-rachidien pour les prélèvements répétés. Cette réserve étant directement liée au poids et au stade de développement de l'animal En ce sens, nous avons retenus un stade de développement de 6 semaines, meilleur compromis entre les deux critères.

Un client pharmaceutique fait tester son candidat médicament anti-obésité à un stade précoce de développement. 48 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 95 administrations sous-cutanées et 19 injections intrapéritonéales, subit 45 pesées, cinq prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures et deux séjours de 72 heures en mesure de dépenses énergétiques, le tout en cage individuelle. L'étude est limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude sur des femelles n'étant envisagée que si une efficacité est observée chez les mâles.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (45 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (19 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de composé de référence par voie sous-cutanée (95 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (35 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Le protocole, sa fréquence et sa durée dépendent du composé à tester et des recommandations d'une entreprise pharmaceutique partenaire. 960 rats vont être utilisés, tous tués à la fin de l'étude, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur vessie est irritée par instillation d'acide acétique ou chlorhydrique, avec selon les cas l'implantation d'une pompe osmotique, la pose d'un cathéter intravésical et une cystométrie pouvant durer quatre heures. Le tri de molécules candidates contre l'hyperactivité vésicale se fait donc au rythme d'un partenariat industriel, le porteur précisant que les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations formulées dans ce cadre.

Objectifs

L'hyperactivité vésicale (HV) touche 15% de la population et sa fréquence augmente avec l’âge. La compréhension de sa physiopathologie reste partielle, souvent explorée par le prisme des mécanismes de l'hyperactivité détrusorienne. Les traitements de première intention incluent les antimuscariniques, mais leur efficacité est limitée et leurs effets secondaires nuisent à l'observance. Cela souligne l'importance de développer des traitements alternatifs. Pour cela, des modèles précliniques d’hyperactivité vésicale ont été élaborés, notamment des modèles aigus utilisant une irritation chimique de la vessie. L'instillation d’acide acétique (AA) ou acide chlorhydrique (HCl) dilué est la méthode la plus couramment utilisée. Ce projet vise à sélectionner de nouveaux composés thérapeutiques en évaluant leur efficacité dans un modèle d’irritation vésicale induite par l’AA (ou HCl) chez le rat.

Bénéfices attendus

L'hyperactivité vésicale (HV) touche 15% de la population et sa fréquence augmente avec l’âge. Cependant, la compréhension de sa physiopathologie reste partielle, et l’arsenal thérapeutique disponible est resté relativement stable au cours de la dernière décennie, à l'exception de l'introduction de la nouvelle classe d'agonistes des adrénorécepteurs β3. De plus, nombre de ces traitements sont contraignants, provoquent des effets indésirables, et ont une efficacité variable. Il est donc crucial de concevoir de nouvelles molécules et de confirmer leur efficacité dans des modèles précliniques appropriés. Cela implique une recherche approfondie et une expérimentation rigoureuse pour garantir que ces nouvelles molécules sont non seulement efficaces, mais aussi sûres à l’utilisation. Les rats possèdent des similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains, ce qui permet une étude précise des mécanismes sous-jacents de l'hyperactivité vésicale. L'irritation de la vessie par l'acide acétique reproduit des conditions pathologiques semblables à celles observées chez les humains, facilitant l'analyse des voies neuronales et des réponses inflammatoires. À long terme, une meilleure gestion de l'hyperactivité vésicale peut réduire les complications, telles que les infections urinaires récurrentes et les problèmes rénaux. Les avancées dans le traitement de cette condition peuvent significativement améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes gênants et invalidants. Enfin, ces expériences permettront d’enrichir la base des connaissances scientifiques sur cette pathologie encore mal connue, et les découvertes faites grâce à ces modèles peuvent inspirer de nouvelles directions de recherche, stimulant ainsi l'innovation scientifique en général, et thérapeutique en particulier.

Procédures

Les animaux seront traités par le composé à analyser ou ses contrôles, la fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (généralement moins de 6 mois). Tout type d’administration dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min si l'administration nécessite une anesthésie. Une cystométrie peut être faite pour évaluer l'effet du composé administré, l’expérience dure 4 h au maximum, précédée de l’implantation d’un cathéter intravésical. Enfin, des prélèvements de sang, d’urines ou d'organes après sacrifice pourront être envisagés. Chaque prélèvement de sang durera moins de 3 minutes. Une collecte d’urine se fait en cage à métabolisme et en moins de 24h. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induit par l’administration du composé à tester, qui nécessitera une contention, ou bien l’implantation de pompe osmotique si le protocole le requiert. - Stress potentiellement dû à l’isolation pour les prélèvements d’urine en cage à métabolisme (moins de 24 heures) ou dû aux prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront traités en aigu ou en chronique par les composés à évaluer. L’efficacité des nouveaux traitements sera évaluée par analyse de la diurèse sur moins de 24h, par cystométrie, et/ou par l’analyse des différents prélèvements de sang, d’organe ou d’urine. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude. La mise à mort des animaux est réalisée par le personnel compétent, tutoré et habilité.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant l’étude de la vessie hyperactive, qui est une pathologie définie par des symptômes et ainsi, difficile à appréhender hors d’une situation physiologique. De plus, l’étiologie de la vessie hyperactive est encore mal connue, mais pourrait être la résultante de la dérégulation de plusieurs mécanismes physiologiques (système nerveux, métabolisme, hormones…etc). Ainsi, l’interaction entre les différents mécanismes impliqués nécessite un modèle animal.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. De plus, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage quand cela est possible, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - L’implantation d’une pompe osmotique se font sous analgésie et anesthésie générale. Un traitement antibiotique est aussi mis en place pour éviter toute complication infectieuse. - L’implantation d’un cathéter intraveineux, et/ou l’implantation d’un cathéter intravésical pour permettre la cystométrie, ainsi que la cystométrie elle-même, se font sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude d’une fonction physiologique complexe telle que l’hyperactivité vésicale. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitant l’utilisation d’animaux tels que le chien. Le choix des protocoles est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chances d’obtenir des résultats satisfaisants. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

Anesthésiées, greffées avec des cellules cancéreuses humaines sous la peau ou directement dans le poumon, le pancréas, le foie ou le cerveau, 2 000 souris aux défenses immunitaires réduites voient leur tumeur croître pendant huit semaines au maximum. S'ajoutent une séance d'imagerie sous anesthésie par semaine, une injection de nanoparticules, puis une séance de radiothérapie de vingt minutes. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et le porteur note que le modèle de souris immunodéprimée "est une nuisance en soi", tout en écrivant que la radiothérapie ne devrait pas provoquer d'effets indésirables. Elles sont tuées à la fin pour que la tumeur et les organes soient prélevés et analysés.

Objectifs

Selon les données récentes de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 19,3 millions de nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués en 2020, et les projections estiment que ce nombre atteindra près de 30 millions d'ici 2040. La radiothérapie est un traitement clé dans la prise en charge du cancer, utilisée chez environ 50 à 60 % des patients à un moment de leur parcours thérapeutique. Elle consiste à utiliser des rayons pour détruire les cellules cancéreuses tout en préservant au maximum les tissus sains. La radiothérapie est particulièrement efficace dans le traitement des cancers du sein, de la prostate, du poumon et des cancers de la tête et du cou. Elle reste donc un pilier essentiel des stratégies thérapeutiques, notamment pour les cancers localisés ou en complément d'autres traitements comme la chirurgie et la chimiothérapie. Un développement prometteur pour renforcer l'efficacité de la radiothérapie est l'utilisation de de deux types de particules de très petite taille appelées nanoparticules : 1) des nanoparticules en métal qui permettrait d'augmenter localement la dose de radiation absorbée par les cellules cancéreuses et d’amplifier les dommages infligés aux cellules tumorales lors de l'exposition aux rayonnement, ou 2) des nanoparticules remplies avec une drogue anticancéreuse qui peuvent s'ouvrir avec la radiothérapie permettant de libérer la drogue anticancéreuse localement dans la tumeur. L'intégration des nanoparticules dans les traitements de radiothérapie pourrait ainsi représenter une avancée majeure dans l'optimisation des thérapies contre le cancer, permettant d’améliorer la précision des traitements, et de réduire les effets secondaires. L’objectif de ce projet est de tester l’utilisation de nanoparticules, soit métalliques soit chargées en drogue anticancéreuse, améliorant la radiothérapie dans différents types de cancer. Ce projet se déroulera sur deux sites. Sur le premier (EU1), auront lieu : l’implantation des cellules cancéreuses et le suivi de croissance tumorale. Sur le deuxième (EU2), auront lieu les radiothérapies.

Bénéfices attendus

L'objectif du projet est de développer de nouvelles particules pour pouvoir proposer un schéma de traitement optimal avec une bonne efficacité thérapeutique pour un transfert vers un essai clinique chez l’homme.

Procédures

Interventions sur les animaux : anesthésie générale (EU1, entre 5 et 25 minutes), implantation sous cutanée et croissance de tumeur sous-cutanée (EU1, durée environ 10 minutes, 1 fois, suivi sur 8 semaine maximum), chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses (EU1, durée environ 20 minutes, 1 fois), croissance de tumeur dans leurs sites d'origine (poumons, pancréas, foie, cerveau , 8 semaines maximum), anesthésie pour imagerie médicale (EU1, durée environ 15 minutes, 1 fois/semaine, 8 semaines maximum), injection de produit de contraste et/ou de particules (EU2, 1 fois), radiothérapie (EU2, durée environ 20 mimnutes,1 fois). Le modèle de souris avec des défenses immunitaires réduites est une nuisance en soi.

Impact sur les animaux

L’inoculation de tumeur peut induire des douleurs que ce soit en sous-cutanée ou en sur le site de la tumeur originelle. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Les procédures d'imagerie sont indolores. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Nous aurons, par une série de tests sur cellules en culture in vitro, sélectionné les particules d’intérêt. Grace à des tests complémentaires sur des tumeurs en culture 3D, nous nous focaliserons sur environ 20 particules différentes, constituant les candidates les plus prometteuses. Les paramètres d'efficacité thérapeutique sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Cela nous permettra d’éviter de tester toutes les particules candidates sur animal. Concernant les tests sur animaux, nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employé autant que possible tout en obtenant des informations scientifiques avec une validité statistique suffisante. Les particules qui seront validées après cette première étape seront injectées chez des souris porteuses de tumeurs afin de tester leur efficacité thérapeutique. Dans chaque procédure le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats statistiquement fiables avec la première moitié d’animaux ou si les données se révèlent non pertinentes (arrêt alors des expérimentations). Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin de ne pas compromettre la validité des expériences. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet ont des caractéristiques nuisibles pour leur santé, des mesures compensatoires de raffinement ont donc été prises pour leur hébergement : mesures d’hygiène supplémentaires, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux avec des défenses immunitaires réduites, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Les chirurgies se feront sous anesthésie générale et la douleur sera gérée par une analgésie adaptée. Le transport entre les EU s’effectuera dans des boites de transport avec enrichissement, boisson et nourriture. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Toute forme de nuisance ou effets indésirables des procédures expérimentales seront attentivement surveillées lors de l'observation des animaux. Ces effets indésirables sont listés parmi les points limites de chaque procédure. L’utilisation de souris avec des défenses immunitaires réduites permet l'étude de lignées cancéreuses humaines sans phénomène de rejet. La croissance des tumeurs sera suivie régulièrement au pied à coulisse et par imagerie médicale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées de 5 semaines permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. À ce stade de développement, on obtient des souris adultes avec des tumeurs bien installées, juste avant que leur système immunitaire, en particulier les cellules qui combattent les infections et les tumeurs, n'atteigne son niveau maximal de production à 8 semaines. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues.

Une plaie carrée de vingt millimètres de côté, sur toute l'épaisseur de la peau du dos, est pratiquée sous anesthésie sur chacune des 1 080 souris immunodéficientes du projet, puis recouverte d'un substitut cutané et de leur propre peau dévitalisée suturée. Toutes sont tuées 15, 30 ou 90 jours après la greffe pour prélever la zone greffée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les greffons testés sont des produits de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines, destinés au traitement de maladies génétiques de la peau. Le porteur compte six souris par temps de prélèvement et trente substituts évalués au maximum, sans expliquer comment il parvient à 1 080 animaux. Il présente l'usage de la peau dévitalisée comme un progrès pour le bien-être des animaux non-humains, tout en isolant chaque souris en cage individuelle pendant trois à quatre semaines.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés et utilisés suivant différentes modalités. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué les premiers substituts cutanés de thérapie cellulaire préparés à partir de cellules souches humaines. Ces substituts cutanés sont destinés au traitement de maladies génétiques. Les substituts cutanés seront préparés suivant les normes concernant les exigences techniques relatives aux produits pharmaceutiques à usage humain. Un maximum de 30 substituts cutanés, sélectionnées sur la base d’essais préalables in vitro de stabilité et de fonctionnalité, seront transportés et utilisés dès réception ou conservés jusqu’à 5 jours dans l’attente de réalisation de greffes, afin de mimer au plus près les conditions cliniques qui seront utilisées chez l’Homme. Les greffes seront effectuées sur des souris avec un système immunitaire déficient afin d’éviter leur rejet, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes afin d’étudier la fonctionnalité des greffons et les interactions se mettant progressivement en place entre greffon et hôte. Des analyses seront effectuées sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des greffons et d’appréhender les interactions se mettant en place entre le greffon et l’hôte. Les résultats obtenus permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Certaines greffes peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autre greffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés sont aujourd’hui disponibles, constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de composés nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité, et des substituts cutanés à partir de cellules humaines sont produits par ingénierie tissulaire. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre le traitement de maladies génétiques de la peau. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de ces substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées. Les différentes conditions expérimentales qui seront utilisées permettront de définir les conditions optimales pour garantir les meilleures conditions de préparation, de transport et de stockage des substituts cutanés et de réalisation des greffes cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et le carré de peau prélevé, dévitalisé, sera suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par un pansement et la peau dévitalisée suturée permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané. Après cicatrisation complète, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles la peau dévitalisée servant de pansement de couverture, le pansement et surtout le greffon cutané, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 1080 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des Unités Thérapeutiques Cliniques sélectionnées sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes effectuées suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière. L’utilisation de la peau excisée dévitalisée, suturée au-dessus de la greffe de substitut cutané, comme pansement de couverture, évitera l’utilisation d’un système de maintien avec des bandes de sparadrap, favorisant le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.