Recherche appliquée

Opérées sous anesthésie générale pendant une heure à une heure et demie pour recevoir des vis en titane dans la hanche et dans la mâchoire, 140 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont tuées à la fin du projet pour prélever les os de la mâchoire et de la hanche. Les implants testés sont des produits orthopédiques ou dentaires en cours de développement ou déjà développés mais pas encore commercialisés, et leur nombre est fixé par la norme ISO 10993. Le porteur annonce une intervention unique sans autre nuisance que le stress de contention, puis énumère œdèmes, hématomes, hémorragies mineures, toux d'irritation jusqu'à la pneumonie, douleurs postopératoires avec boiteries ou difficultés à mastiquer, et fractures au niveau des trous de forage.

Objectifs

Le développement de biomatériaux implantables destinés à l’usage médical chez l’Homme passe par une évaluation de leur compatibilité tissulaire conforme à la norme iso 10993 et de leur efficacité. Les matériaux évalués dans ce projet sont des implants osseux à usage orthopédique ou en dentisterie, soit en cours de développement soit déjà développés mais non encore commercialisés. L'objectif primaire du projet est d'évaluer la stabilisation osseuse obtenue suite à l'utilisation de ces implants dans un modèle chirurgical ovin. L'objectif secondaire est de démontrer l'efficacité de la réponse osseuse/tissulaire suite au placement de ces implants dans des os de densités différentes (donc à différentes localisations), à différents temps de la guérison osseuse. Ces implants sont généralement différents types de vis en titane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux implants orthopédiques ou dentaires (ou leur validation pour mise sur le marché) permettant une cicatrisation osseuse plus rapide ou plus efficace chez l'Homme, lors de la prise en charge de fractures par exemple ou de chirurgie maxillo-faciale/dentaire.

Procédures

En dehors du stress lié à la contention, les brebis seront soumises à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale consistant en l'insertion d'implants chirurgicaux (vis) dans la hanche et la machoire. La procédure chirurgicale dure de 1h à 1h30.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent : - le stress lié à la manipulation et la contention, ainsi qu'au réveil de l'anesthésie générale, - des oedèmes, des hématomes ou des hémorragies mineures liés à l'intervention chirugicale (fréquents), - des problèmes respiratoires (de la toux d'irritation-peu fréquent- jusqu'à la pneumonie- rare-) liés à l'intubation et la ventilation lors de l'anesthésie, - des douleurs post-opératoires se manifestant soit par des boiteries, une difficulté à se déplacer (quand intervention sur les membres) ou des difficultés à mastiquer (quand intervention sur la machoire), occasionnellement - des infections de plaies, bien que rares - une fracture à partir des trous de forage des vis ou un bris d'implant bien que très rares.

Devenir

Les brebis sont mises à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus osseux d'intérêt (machoire et hanche) pour analyses.

Remplacement

Les implants ont préalablement subi des tests biomécaniques (comme la résistance à la rupture, la dureté, l'élasticité...) in vitro. Cependant, la résistance à la corrosion et la biocompatibilité ne peuvent être évalués que dans un organisme entier. De plus, même lorsque le risque pour les patients est pressenti comme faible, cette évaluation d'efficacité et de sécurité préalable ne peut pas règlementairement être remplacée par des essais ex vivo.

Réduction

Le nombre d’implants à placer est défini par la norme ISO 10993 ou sa version américaine intitulée "FDAGLP biomaterials testing". Afin de répondre à cette norme tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires, nous nous sommes basés sur la littérature et des tests statistiques. Ces éléments nous ont conduit à considérer le nombre maximal de 7 individus par temps d'étude pour obtenir des résultats exploitables tout en prenant en compte le risque d'exclusion de certains animaux en raison de variations anatomiques ou de descellement d'implant.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les standards de leur espèce dans une animalerie dont les paramètres d'ambiance sont contrôlés. Les brebis sont hébergées en groupes sociaux de 7 à 10 individus sur litière de copeaux de pin avec distribution de foin à volonté et pierres à sel à disposition. Une période d'acclimatation de minimum 7 jours est respectée et mise à contribution pour l'habituation des animaux à la présence et au contat de l'Homme lors du change des animaux et par la distirbution de granulés. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale volatile (dont les paramètres sont surveillés pendant toute la durée de la chirurgie), avec administration d'un antalgique de niveau 3. Cet antalgique est associé à un anti-inflammatoire. Les animaux sont installés sur un tapis chauffant tout au long de la procédure chirurgicale. Un traitement antibiotique est également effectué afin de limiter les risques d'infection aux sites chirurgicaux. Les animaux font l'objet d'une évaluation de leur comportement, de leur confort et des sites chirurgicaux a minima deux fois par jour pendant la période post-opératoire. Des points-limites précoces et adaptés ont été définis à la fois pour la période per-opératoire (suivi anesthésique et des événements chirurgicaux) et pour la période post-opératoire (état général, activité, éventuelle boiterie ou difficulté à s'alimenter ou à se déplacer) et seront appliqués.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est celle recommandée par la norme iso 10-993 et les critères de choix des espèces sont les suivants : les ovins sont utilisés dans de nombreuses procédures impliquant une cicatrisation très longue ou des techniques chirurgicales identiques à celles utilisées chez l’Homme lorsque ces dernières ne peuvent être mises en œuvre chez le lapin. Les brebis utilisées doivent avoir un poids d'environ 70 kg pour mimer les contraintes rencontrées chez l'Homme, pour un âge moyen de 3-4 ans (adulte). Les brebis âgées de plus de 7 ans sont exclues afin d'éviter la variabilité/le biais d'une cicatrisation retardée en raison de l'âge.

Une plaie nécrosée, purulente ou suintante déclenche la mise à mort immédiate, tout comme une perte de plus de 20 % du poids maintenue trois jours ou une hypothermie persistante. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis elles reçoivent une à deux administrations par jour pendant seize jours, avec des mesures d'épaisseur de peau tous les deux jours et une prise de sang hebdomadaire. Les molécules testées appartiennent à des clients de l'établissement, dont le porteur écrit ne pas connaître la composition, et le choix de la souris tient notamment à ses "faibles coûts", à sa croissance rapide et à sa facilité de transport.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'excipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.

Des aiguilles plantées dans le muscle, suivies d'une décharge électrique qui perce la membrane des cellules : 433 souris Swiss femelles subissent une électroporation intramusculaire dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des muscles injectés. Chaque animal peut recevoir jusqu'à huit anesthésies et sept injections intrapéritonéales, et passe chaque jour un test de réflexe, le "Digit Abduction Score". Le projet compare dix candidats myorelaxants à ARN messager destinés à traiter la dystonie et la spasticité chez l'humain. Le porteur classe le stress lié à ce test quotidien parmi les seules nuisances attendues, et le décrit ailleurs comme bref, indolore et peu stressant.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle d’administration par électroporation (une brève impulsion électrique perce la membrane, permettant ainsi la délivrance de substances thérapeutiques à l'intérieur des cellules) de nos candidats médicaments pour le traitement des maladies la contraction musculaire, puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse pour le traitement des maladies la contraction musculaire. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques (ayant un effet sur tout l'organisme) comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après administration, et dont les effets seraient durables. Ainsi, ce projet apportera les bénéfices suivants : - Traitement efficace plus rapidement. - Traitement efficace sur du long terme.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesie de 10-15 min. 1 injection intramusuclaire (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intramusculaire, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie. Mesure du "Digit Abduction Score" tous les jours, 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les seules nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intra-musculaire puis maximum 7 intrapéritonéal) - Stress associé au test du « Digit Abduction Score» - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront mis à mort. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. De plus, dans ce projet, les muscles injectés seront prélevés pour des analyses ultérieurs.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (processus par lequel un médicament ou une substance active se déplace à travers les différentes phases du corps qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés. Le test "Digit Abduction Score" nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 5 animaux par groupe. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle "Digit Abduction Score" chez la souris : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné, et les mesures de "Digit Abduction Score" sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La souris à été choisi dans ce projet car elles expriment les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire il existe une limite de diffusion dans les tissus. Le test du "digit abduction score" chez la souris, déjà éprouvé lors d'études précédentes, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests "Digit Abduction Score". Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.

120 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et pour 96 d'entre eux le protocole prévoit une quarantaine d'anesthésies par animal. S'y ajoutent, toujours par individu, une quarantaine de prises de sang, sept ponctions de moelle osseuse, neuf biopsies, vingt-huit écouvillonnages, douze lavages broncho-alvéolaires et l'implantation d'une puce de télémétrie. Infectés par la grippe une ou deux fois, ils sont isolés en cage individuelle jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress et d'ennui. 38 macaques sont tués pour le prélèvement de leurs organes, les 82 autres restent en vie afin d'être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

La grippe est une maladie infectieuse et contagieuse causée par un virus influenza, affectant principalement le système respiratoire. La transmission interhumaine du virus se fait majoritairement par voie aéroportée par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration). Il existe 3 catégories de virus influenza infectant l’Homme : A, B et C. Les classes A et B du virus sont responsables des épidémies saisonnières. Les infections causées par un virus de la classe C induisent des symptômes plus faibles, s’apparentant à un rhume. Lors de la pandémie de 2009, le virus H1N1 a infecté entre 700 millions et 1,9 milliard d’individus dont environ 300 000 n’ont pas survécu. A ce jour, des traitements antiviraux administrés en prophylaxie ou en thérapeutique permettent de diminuer la sévérité des symptômes et la durée de la maladie. De plus, des campagnes de vaccination, fortement recommandée chez les personnes à risque, sont mises en place chaque année afin de limiter la propagation du virus et les formes graves de l’infection en réduisant les complications et leur incidence. En France, on estime sauver en moyenne 2 000 personnes âgées de 65 ans et plus par an grâce à la vaccination. Malgré l’application de traitements antiviraux et la vaccination, qui reste le moyen le plus efficace de se prémunir de la maladie, les épidémies saisonnières actuelles touchent encore 2 à 6 millions de personnes en France chaque année et sont responsables d’environ 10 000 décès. La constante évolution du virus rend, certaines années, l’efficacité de la vaccination insuffisante et nous oblige à ajuster la composition du vaccin en fonction des modifications génétiques identifiées. L’amélioration des vaccins, notamment en ciblant les parties conservées du virus, permettrait de cibler un spectre plus large de virus et de protéger contre les différents variants. Dans ce projet, nous prévoyons d’établir de nouveaux modèles de primates non humains d’infection pour tester de nouvelles stratégies vaccinales, .

Bénéfices attendus

Les nouveaux modèles d’infection qui auront été développés permettront d’avoir un modèle plus proche de l’infection humaine. Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez les modèles primates non-humains pourront à court terme être utilisés lors d’essai cliniques chez l’Homme. Ils pourront, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre la grippe saisonnière.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont : - Anesthésie des animaux (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Immunisation avec des candidats vaccins (3 fois environ, 5 minutes, 96 animaux) - Infection par le virus influenza (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 15 minutes, 112 animaux) - Prélèvement de sang (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 5 minutes) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois environ (24 animaux) ; 7 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Biopsie (5 fois environ (24 animaux) ; 9 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Ecouvillonnage mucosal (19 fois environ (24 animaux) ; 28 fois environ (96 animaux), 2 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (7 fois environ (24 animaux) ; 12 fois environ (96 animaux), 20 minutes) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, 120 animaux) - Imagerie in vivo (7 fois environ (24 animaux) ; 22 fois environ (96 animaux), 45 minutes) - Pléthysmographie (7 fois environ (24 animaux) ; 19 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Hébergement individuel (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 8 semaines maximum, 112 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux injections de vaccin (peu attendues) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, (dysorexie) troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux vaccinés. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site de prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible en clinique. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire la physiopathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par le virus influenza, notamment la réponse à l’infection et l’immunité induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Enfin, le primate non humain étant proche physiologiquement de l’Homme, son utilisation permet une transposition plus optimale des résultats, ce qui serait moins adapté avec une autre espèce animale.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de sélectionner le meilleur modèle d’infection, des groupes de 2 individus seront utilisés. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits effectifs. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, les animaux utilisés dans les groupes non exposés permettant l’analyse métrologique du système d’inoculation, pourront être réutilisés dans les groupes exposés au pathogène. De même que les animaux convalescents pourront provenir des groupes déjà exposés dans le projet.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation pourra être instaurée par l’apport de fruits secs, fruits frais additionnels, compléments nutritionnels Une grille de scoring a été mise au point pour évaluation de l’état de santé. Des points limites ont été définis afin de limiter l’angoisse et la souffrance. Si ces points limites sont atteints, un traitement symptomatique pourra être administré et une euthanasie sera envisagée. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de paramètres physiologiques peut induire une réaction au site d’incision (gonflement, suintement de la plaie). Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés individuellement suite à l’exposition virale pour empêcher une surinfection liée à une contamination croisée, ce qui peut générer un stress ou de l’ennui. Le programme d’enrichissement pourra être étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement individuel, validée par la structure chargée du bien-être des animaux, pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans les fluides mucosaux. L’injection des vaccins pouvant entrainer une réaction locale (démangeaisons, douleurs) une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Si la réaction locale est exacerbée (nécrose, suppuration) (pas attendu dans ce projet), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. L’exposition au virus influenza peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. En cas d’apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé. En cas d’aggravation de l’état de santé des animaux (léthargie sévère, état moribond), l’euthanasie de l’animal sera envisagée.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus a été particulièrement choisi pour sa proximité phylogénétique de l’Homme, rendant la transposition des résultats plus optimale. En effet, les symptômes induits par l’infection influenza et les réponses immunitaires induites par la vaccination sont similaires à ceux qui sont observés chez l’Homme. Enfin, les outils permettant les analyses immunologiques sont développés et éprouvés. La grippe infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveaux nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum âgés de 2 ans. Enfin, les candidats vaccins pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques, donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit deux perfusions d'un anticorps couplé à un agent cytotoxique, sanglé quarante minutes sur une chaise de contention, et subit quinze prélèvements sanguins avant un prélèvement de moelle osseuse dont il ne se réveillera pas. Le porteur attend des diarrhées, des hématomes et des poussées de fièvre, et prévoit de projeter aux animaux un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions. Le projet sert à choisir laquelle de deux formulations passera l'étude réglementaire suivante, étape qualifiée d'"indispensable" dans le développement du candidat médicament.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de deux formulations composés d’anticorps conjugués à des agents toxiques administrées à deux doses différentes de manière répétée (x2) en intra-veineux chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation et la dose maximale tolérée pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de selection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un anticorps capable de cibler les tumeurs de manière très spécifique, couplé à un agent cytotoxique capable d’éliminer les cellules tumorales. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de deux semaines entre les 2 administrations. Quinze prélèvements sanguins de 1 à 5ml par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Un prélèvement de moelle osseuse par animal sera réalisé (sous anesthésie générale et analgésie). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Les animaux ne seront pas réveillés après le prélèvement. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur possible cible gastro-intestinale, des selles molles et/ou des diarrhée pourront être observées. Aussi, des réactions locales du type hématomes léger au niveau des sites d'administration et une réaction de type fièvre peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 27 jours sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle du système immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cette molécule d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.