Recherche appliquée

Quarante poulets sur les deux cents seront laissés reprendre conscience après étourdissement, jusqu'à quatre minutes, avant d'être ré-étourdis puis saignés. Les 200 poulets sont utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré pour 160 d'entre eux et sévère pour 40, et tous tués par saignée. Deux électrodes sont collées sur la poitrine pour mesurer la fréquence cardiaque, l'animal est isolé de ses congénères dans un prototype de contention, des électrodes sont posées sur sa tête pour l'électronarcose, et la saignée suit immédiatement. Le projet vise à supprimer la suspension par les pattes des volailles conscientes, que le porteur décrit lui-même comme une source de douleur et de stress dans les abattoirs, ce qui conduit ici à infliger ces atteintes à 200 individus pour modifier le sort des autres.

Objectifs

Dans le cadre de l’abattage, sauf dérogation, les animaux doivent être étourdis avant la saignée afin de ne pas ressentir de stress et de douleur au moment de celle-ci. Pour les volailles, l’électronarcose par bain d’eau est la méthode d’étourdissement la plus répandue en France. Elle consiste à immerger la tête des volailles dans un bain d’eau électrifié pour provoquer une perte de conscience. Toutefois, cette méthode présente de nombreuses limites en matière de bien-être animal : - Les volailles encore conscientes sont suspendues par les pattes à un rail les conduisant jusqu’au poste d’abattage, ce qui induit du stress lié à la proximité avec les opérateurs et à la position non naturelle, et de la douleur, le poids des animaux étant supporté par leurs articulations. Il existe également un risque de blessure liés aux battements d’ailes. - Les volailles peuvent subir des pré-chocs électriques lorsqu’une autre partie que la tête de l’animal rentre en contact avec l’eau du bain électrique en premier, qui sont sources de douleur et de stress. - Elle peut présenter des défauts d’efficacité : o Du fait du caractère collectif de cette méthode et d’une résistance aux courants électriques variable d’une volaille à l’autre, il arrive que les paramètres électriques appliqués à certains oiseaux ne soient pas suffisant pour leur garantir un étourdissement efficace ; o Suite aux pré-chocs électriques qui peuvent stimuler des battements d’ailes, certains poulets relèvent leur tête au moment d’être immergés dans le bain d’eau et ne sont donc pas étourdis ; o Enfin, certains paramètres électriques garantissant un étourdissement efficace peuvent altérer la qualité des carcasses.

Bénéfices attendus

Le développement de cette méthode d'abattage innovante présente plusieurs bénéfices potentiels, notamment : 1) L’amélioration du bien-être animal : En évitant la suspension des poulets conscients et en garantissant un étourdissement instantané (limite de l’étourdissement par atmosphère contrôlée), cette méthode réduit considérablement la douleur et le stress ressentis par les animaux pendant le processus d'abattage, ainsi que l’occurrence de pré-chocs électriques, que les oiseaux reçoivent à l’entrée du bain d’électronarcose, également sources de douleur et de stress. Cette méthode est de plus individuelle, et permettra de pallier aux étourdissements altérés ou manqués du fait de la variabilité de l’impédance des animaux, et donc de la quantité et de la qualité du courant reçu par les animaux, plongés collectivement dans les bains d’électronarcoses. 2) Conditions de travail améliorées : En réduisant la nécessité de manipuler des volailles conscientes et en minimisant les procédures stressantes telles que la suspension, cette méthode crée un environnement de travail plus sûr et moins pénible pour les employés des abattoirs. L’accrochage des volailles inconscientes (entre l’étourdissement et la saignée) représente une tâche moins pénible pour les opérateurs. 3) Qualité des produits préservée : Il est connu que la suspension des volailles est source de blessures et de stress, ce qui n’altère pas seulement le bien-être des animaux mais aussi la qualité des viandes et des carcasses. De plus, en garantissant un étourdissement en tête seule, le courant ne traversera plus le corps de l’animal, ce qui pourrait contribuer également à améliorer la qualité des viandes et des carcasses (i.e. moins de convulsions). 4) Avantages sociétaux : Dans le cas de l’abattage rituel, il est nécessaire d’induire un étourdissement réversible des animaux. Ainsi, dans certains cas, les paramètres électriques sélectionnés sont modifiés pour assurer cette réversibilité, ce qui rend l’étourdissement des volailles moins efficace. Dans d’autres cas, les animaux ne sont pas étourdis du tout (sous dérogation). La méthode qui sera développée dans ce projet pourrait donc offrir une solution plus éthique et respectueuse du bien-être animal en rendant son utilisation possible dans le cadre des abattages non pas seulement conventionnels mais également rituels, et limiterait ainsi l’abattage de volaille sans étourdissement dans le cadre de l’abattage religieux.

Procédures

Pour les 200 poulets : deux électrodes seront collées sur la poitrine du poulet entre les plumes pour réaliser des mesures de fréquence cardiaque puis l'animal sera placé dans un prototype de contention individuel avec pose d'électrodes sur la tête pour réaliser l'électronarcose. Après étourdissement, le poulet sera saigné immédiatement. La durée entre le début de la manipulation et la fin de la saignée sera de 10 minutes (sachant que la durée d’égouttage, après la saignée, est fixée à 5 minutes). Pour 40 animaux maximum parmi les 200, des « tests de réveil » seront réalisés : attente de la reprise de conscience après étourdissement d’une durée de 4 minutes maximum. Après retour des différents indicateurs de conscience observés, dans la limite des 4 minutes, le cas échéant, ces animaux seront immédiatement ré-étourdis puis saignés. Tout sera prêt et opérationnel avant d’entamer les manipulations sur les animaux afin de leur éviter toute attente inutile, et de réduire à leur minimum la durée des différentes interventions.

Impact sur les animaux

Avant et pendant l’électronarcose : des mesures de fréquence cardiaque pour évaluer le stress de l’animal et pour évaluer l’effet de l’électronarcose sur le fonctionnement du cœur. Ces mesures nécessitent une intervention non invasive (collage de 2 électrodes sur la poitrine des poulets, entre les plumes) quelques minutes avant l’électronarcose. La manipulation se fera avec le moins de contraintes possibles mais peut néanmoins être une source (réduite) de stress. Tests d’électronarcose : les paramètres choisis seront ceux connus pour être efficaces dans d’autres systèmes (Dutch vision solutions, par exemple, qui utilise également des électrodes sèches mais avec des animaux suspendus), pour limiter les risques d’inefficacité d’étourdissement. Les animaux seront saignés immédiatement. Le risque d’éveil pendant la saignée est limité ; sa mesure (vérification de la présence des indicateurs d’inconscience jusqu’à la mort) fait partie des objectifs de l’étude. Pendant l’électronarcose le poulet sera éloigné de ses congénères (pour éviter de stresser ceux-ci), mais cet isolement peut être cause de stress pour le poulet. L’intervalle entre l’éloignement de l’animal de ses congénères et l’étourdissement sera limité au maximum (quelques secondes). Pour un échantillon d’animaux (40 maximum), des « tests de réveil » seront réalisés. Ils impliquent de laisser l’animal reprendre conscience après étourdissement pour garantir la réversibilité du process (nécessaire pour les abattages religieux). Les paramètres électriques utilisés dans cette étude induisent l’inconscience et effacent la mémoire. Néanmoins, un test de réveil peut être désagréable car chez l’humain, il peut être accompagné de maux de tête et de nausées (études médicales dans le cadre de traitements par chocs électriques).

Devenir

Pour tous les animaux (200 au maximum), le projet implique la mort. En effet, pour la procédure 1 (160 animaux au maximum), l’euthanasie par saignée est réalisée immédiatement après étourdissement pour éviter le réveil et donc les effets indésirables qui y seraient associés. Pour les animaux de la procédure 2 (40 au maximum), les animaux sont ré-étourdis après reprise de conscience et saignés immédiatement afin de raccourcir la période de reprise de conscience qui peut être associée à une sensation désagréable (comme expliqué précédemment, bien que les paramètres électriques induisent l’inconscience et effacent la mémoire, il est possible que l'animal, une fois réveillé, éprouve des sensations désagréables. Par analogie avec les humains, cela pourrait inclure des maux de tête ou des nausées (selon des études médicales sur les chocs électriques)).

Remplacement

Les premiers tests relatifs au placement des électrodes sur la tête et l’application des paramètres électriques se feront sur des têtes de poulets récupérées dans un abattoir. L’utilisation de poulets vivants ne se fera que lorsque le protoype sera stabilisé ; les tests sur les poulets vivants sont nécessaires pour les mesures de l’efficacité de l’électronarcose, l’efficacité de la saignée et a posteriori les qualités des viandes.

Réduction

Pour les deux procédures, chaque session comprendra 20 poulets vivants (nombre maximal d’animaux pouvant être traités sur une journée). Il est estimé (basé sur des études existantes) qu’au maximum 8 sessions seront nécessaires pour tester les effets des différents paramétrages électriques et le prototype de contention. Si des résultats probants (contention satisfaisante et tous les animaux étourdis sur une période suffisamment longue, mouvements cloniques limitées, qualité des carcasses et des viandes non altérée) sont atteints avant, les tests seront arrêtés. Les résultats seront analysés au fur et à mesure des sessions. Les choix exacts des paramètres seront optimisés à partir des connaissances existantes et des résultats de nos tests.

Raffinement

- La durée de l’isolement des animaux entre l’installation dans le prototype de contention et l’application de l’électricité sera réduite au minimum. - Chaque animal sera saigné rapidement après l’électronarcose pour limiter les risques de reprise de conscience, tout en se rapprochant des conditions d’abattage réelles (délai de quelques secondes entre la fin de l’étourdissement et le début de la saignée). - En cas de constat de reprise de conscience avant la saignée, l’animal sera immédiatement ré-étourdi. L’éventualité que l’animal se réveille pendant la saignée sera surveillé également et fera immédiatement l’objet d’un nouvel étourdissement. Ce risque est limité, et fait partie des objectifs de mesure de l’étude. - Le nombre de « tests de réveil » sera limité au stricte nécessaire (40 animaux maximum). Après reprise de conscience, le cas échéant, ces animaux seront immédiatement ré-étourdis puis saignés.

Choix des espèces

Les problèmes de l’étourdissement électrique par bain d’eau sont spécifiques à la volaille, dont les poulets de chair représentent 66 % du volume d’abattage (ITAVI, 2021). A l’âge de l’abattage habituel (environ 2kg poids vif) afin d’obtenir des résultats représentatifs pour le terrain.

Jusqu'à deux heures d'anesthésie par séance de tomographie, répétées quatre fois au maximum, s'ajoutent aux prélèvements sanguins hebdomadaires subis par 121 macaques à longue queue, utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré pour 97 d'entre eux et sévère pour 24. Les animaux sont infectés par Trypanosoma cruzi, le parasite de la maladie de Chagas, qui peut provoquer fièvre, œdème cutané, difficultés respiratoires et épanchements pendant deux mois, période durant laquelle ils sont hébergés seuls. Le porteur retient le macaque parce que sa réponse vaccinale ressemble à celle de l'humain et parce que l'espèce est naturellement sensible au parasite. Tous les macaques infectés seront tués pour analyse histopathologique, 22 individus non infectés pouvant être versés à d'autres procédures après avis vétérinaire.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer un candidat vaccin contre Trypanosoma cruzi, responsable de la maladie de Chagas, une maladie chronique négligée endémique en Amérique latine. 30 à 40% des individus infectés développent des problèmes cardiaques ou digestifs, parfois plusieurs dizaines d’années après leur infestation, causant environ 10600 morts par an. Les traitements antiparasitaires existants présentent de nombreux effets secondaires et ne sont efficaces qu’au début de l’infestation. Or, la première phase de la maladie étant souvent asymptomatique, la majorité des patients sont diagnostiqués trop tard pour bénéficier de ces traitements. Le développement d’un vaccin ou d’un traitement efficace en phase chronique sont donc cruciaux pour combattre cette maladie. Le candidat vaccin testé ici se base sur un antigène chimérique, combinant des domaines de trois protéines de T. cruzi. Lors de tests préliminaires chez la souris, ce vaccin a démontré une efficacité protectrice. Il sera évalué chez le modèle primate non humain avant de mettre en place un essai clinique de phase 1.

Bénéfices attendus

La maladie de Chagas sévit essentiellement en Amérique latine, où on recense plus de 10 millions d’individus infectés, mais des cas se sont déclarés récemment dans d’autres pays, plusieurs pays européens, les Etats-Unis, le Canada, le Japon et l’Australie. Parmi les individus infectés, 30 à 40% développent des problèmes cardiaques ou digestifs pouvant être fatals, causant environ 10600 morts par an. Ils existent des traitements antiparasitaires, mais ceux-ci présentent de nombreux effets secondaires et ne sont efficaces que s’ils sont administrés au début de l’infection. Or, la première phase de la maladie étant souvent asymptomatique, la majorité des patients sont diagnostiqués trop tard pour bénéficier de ces traitements. Un vaccin constituerait une approche particulièrement efficace pour de prévenir les infections à T. cruzi et possiblement offrir une alternative thérapeutique aux traitements existants, efficace même à des temps plus tardifs de la maladie et/ou présentant moins d’effets secondaires.

Procédures

Toutes les interventions et prélèvements sur animaux seront réalisés sous anesthésie. Les animaux seront infectés par Trypanosoma cruzi par différentes voies. L’anesthésie durera 30-45 min. Sur les premiers animaux, du sang sera prélevé 1 à 2 fois par semaine autour du pic de parasitémie puis toutes les 2 semaines afin de mieux caractériser la maladie. Pour chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés 10-15 min. La température des animaux sera enregistrée grâce à l’implantation de puces en sous-cutané. Des imageries seront réalisées au plus toutes les 2 semaines, en même temps que les prélèvements, rajoutant 30-45 min d’anesthésie. Des séances de tomographie par émission de positron (PET-CT) seront réalisés maximum 4 fois au cours de l’étude, et rajouteront environ 2h d’anesthésie. Pour les animaux suivants, la fréquence des prélèvements sera ajustée grâce aux données obtenues sur les premiers animaux, afin de limiter les interventions tout en assurant un bon suivi de l’infection. Certains animaux recevront au maximum 4 injections de vaccin . L’anesthésie durera 10-15 min. Du sang sera prélevé jusqu’à 4 fois après chaque immunisation. Pour chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés 10-15 min. Certains animaux recevront un traitement antiparasitaire administré par voie orale à la dose recommandée chez l’homme pendant une durée de 30 jours. Sur les premiers animaux, jusqu’à 6 prélèvements de sang seront effectués après la première et la dernière administration pour déterminer la pharmaco-cinétique du traitement Pour chaque prélèvement, les animaux seront anesthésiés 10-15 min. En cas de résultats inattendus lors des premières infections, des biopsies tissulaires (ganglions, moelle osseuse, biopsie pulmonaire) pourront être mise en place pour approfondir l’étude de la réponse immunitaire. Dans ce cas, chaque type de biopsie sera réalisée deux fois . Ces interventions rajouteront 30 min à 1h d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les anesthésies et prélèvements sanguins peuvent induire un hématome au site de prélèvement, une perte d’appétit menant à une perte de poids mineure et une anémie légère. Les injections et biopsies peuvent causer une réaction locale, des démangeaisons ou des douleurs passagères. L’infection par Trypanosoma cruzi peut causer lors de la phase aigüe (max 2 mois) de la fièvre et de l’œdème cutané, et plus rarement des difficultés à s’alimenter, une diminution de mobilité, des difficultés respiratoires, épanchements, et augmentations de taille des organes digestifs. Ces symptômes disparaissent à la fin de la phase aigüe. Le traitement antiparasitaire peut causer plusieurs effets secondaires, surtout cutanés (rougeurs, éruptions cutanées) ou digestifs (vomissements, perte d’appétit). Ils sont réversibles à l’arrêt du traitement. Lors de la phase aiguë de la maladie (2 mois), les animaux seront hébergés en individuel, ce qui peut entraîner du stress.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser une analyse histopathologique et des dosages sur les tissus. Les animaux non-infectés pourront être inclus dans d’autres procédures compatibles avec l’historique de l’animal, après récupération complète de l’animal et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

L’étude de candidats vaccins demande d’évaluer les différentes composantes de la réponse immunitaire induites par la vaccination et la réaction de l’organisme intégré vis-à-vis du vaccin. A ce jour, ces différents éléments ne peuvent pas être étudiés in vitro puisque la mise en place de la réponse immunitaire se fait dans différents organes (ganglions, organes lymphoïde secondaire) et son évaluation se fait à la fois au niveau systémique et au niveau local (muqueuse).

Réduction

Lors de la mise au point du modèle d’infection, les différents paramètres seront testés sur des groupes de 5 animaux. Le raffinement de la dose se fera selon un procédé itératif publié, ce qui nous permettra d’optimiser l’utilisation des animaux et donc de réduire les effectifs. Sur les deux doses les plus intéressantes, cette méthode permet d’atteindre un total de 5 animaux. Pour la mise au point du traitement anti parasitaire, les différents schémas de traitement seront testés sur des groupes de 2 animaux. En effet, il s’agit d’une étape de mise au point nécessitant de petits nombres d’animaux pour faire des comparaisons qualitatives. Pour les tests d’efficacité du candidat vaccin utilisé comme prophylaxie ou comme traitement, le nombre d’animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique des résultats (cliniques, hématologiques, réponse humorale, réponse cellulaire). La taille des groupes (6 animaux) a été choisie de façon à pouvoir réaliser des analyses statistiques avec une puissance suffisante. Si la physiopathologie du modèle présente une variabilité plus forte qu’attendu, jusqu’à 2 animaux supplémentaires par groupe pourront être ajoutés, pour un total de 8 animaux.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux seront effectués sous anesthésie pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs. L’état général des animaux sera observé quotidiennement, les signes cliniques seront suivis à chaque intervention grâce à une grille de scoring, et le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Un suivi soutenu sera mis en place lors des premières infections et les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la procédure de mise en place du modèle (procédure 1).

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est retenu pour ce projet pour plusieurs raisons : - Ce modèle réunit les éléments nécessaires à l’évaluation de candidats vaccins : réponse immunitaire et vaccinale similaire à celle de l’homme, et évaluation de la réponse immune possible dans les tissus. - Le macaque est naturellement susceptible à l’infestation par T. cruzi. Le déroulement de la maladie est similaire chez le singe et chez l’homme : phase aigüe présentant une mortalité faible, phase chronique restant asymptomatique pendant plusieurs années. Nous utiliserons des animaux adultes d'environ 2.5 à 8 kg. En effet, ce projet a pour objectif d’étudier les réponses immunitaires lors de l'administration de vaccins. Le système immunitaire évolue en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Il est donc nécessaire de réaliser ces études chez un animal adulte (système immunitaire « mature »).

23 porcelets âgés de quatre semaines vont être utilisés, 15 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 8 un niveau modéré, tous tués pour des lavages broncho-alvéolaires et des prélèvements de poumons. Ils subissent une intubation pour une administration intratrachéale sous anesthésie, une nébulisation, jusqu'à quatre prises de sang et quatre écouvillons sous sédation, et une inoculation du virus de la grippe porcine qui provoque fièvre, toux et écoulement nasal. Le porteur décrit l'infection grippale du porc comme "pas très grave" et prévoit un renforcement positif à base de fraises tagada ou de pop-corn. Les bénéfices annoncés visent d'abord la filière, avec une production de viande qualifiée de "responsable, durable et rentable", la protection de la santé humaine venant ensuite.

Objectifs

La filière porcine est confrontée à un nombre croissant de défis, dans la perspective d'une production alimentaire durable et sûre. La lutte contre la grippe porcine est très difficile car les vaccins contre la grippe ne parviennent pas à conférer une immunité protectrice. La stimulation par la flagelline, un agoniste spécifique du système immunitaire inné respiratoire, est apparue comme une stratégie alternative pour favoriser la résistance aux maladies. Nous avons précédemment montré que l'administration de flagelline par voie systémique stimule les défenses immunitaires innées antibactériennes et antivirales de l'hôte dans les voies respiratoires. De plus, nous avons montré un effet protecteur de la flagelline dans un modèle d'infection de la grippe chez la souris, ce qui suggère que la flagelline pourrait également être efficace contre la grippe chez le porc. Cet effet bénéfique pourrait être attribué à son activité pro-inflammatoire et à un effet positif sur la maturation des cellules immunitaires résidentes. Nous proposons une approche de biologie systémique dans laquelle nous combinerons plusieurs nouvelles techniques (séquençage, imagerie confocale...) pour déchiffrer la complexité des réponses du porc aux infections par la grippe et les mécanismes de protection induits par la flagelline. Nous apporterons d'abord la preuve de concept que l'administration de flagelline protège contre la grippe porcine. Ensuite, nous identifierons les déterminants génétiques impliqués dans la réponse de l'hôte à la grippe et responsables de l’effet de la flagelline, et nous utiliserons des approches de machine learning pour produire un algorithme prédisant la susceptibilité des cellules à l'infection. Cette approche servira à développer des thérapies plus sûres et plus efficaces pour combattre la grippe porcine. Les résultats seront partagés avec les acteurs industriels pour assurer un transfert efficace.

Bénéfices attendus

Notre projet utilise une nouvelle stratégie pour stimuler le système immunitaire des porcs afin de lutter contre la grippe porcine. Cela répond aux besoins de la société en terme d'avoir une production de viande responsable, durable et rentable. Nous allons: • Montrer que la flagelline peut protéger les porcs contre la grippe porcine. • Étudier comment la grippe porcine affecte les cellules des poumons des porcs et comment la flagelline peut aider à renforcer leur immunité. • Trouver de nouvelles façons de combattre la grippe porcine en identifiant des voies moléculaires qui pourraient être ciblées par de nouveaux médicaments. • Développer des outils informatiques pour mieux comprendre comment les porcs réagissent à la grippe porcine et pour prédire leur susceptibilité à l'infection. Cette approche permettra de mieux prévenir la propagation de la grippe porcine et d'améliorer la santé des porcs, ce qui est important pour une production de viande durable et responsable. De plus, il est important de noter que la grippe porcine est une maladie zoonotique, ce qui signifie qu'elle peut se transmettre des animaux aux humains. En étudiant la grippe porcine et en développant de nouvelles méthodes pour la combattre, nous serons mieux préparés à faire face à une éventuelle vague de grippe porcine. Cela peut aider à prévenir une épidémie et à protéger la santé publique. En fin de compte, en améliorant la santé des porcs, nous améliorons également la santé des humains.

Procédures

Pendant la première expérimentation, nous utiliserons 8 animaux qui subiront : 2 prélèvements sanguins, sur animaux vigiles sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes. Dans la deuxième expérience, nous utiliserons un total de 15 animaux qui subiront : Une intubation pour réaliser une administration en intratrachéale sur animaux anesthésiés puis une nébulisation 1 heure après, 1h30 ; 4 prélèvements sanguins sur animaux sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 4 Ecouvillons sur animaux sédatés, 2 min.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures suggèrent que les animaux peuvent avoir une légère baisse de température après avoir récupéré de l'anesthésie et de la nébulisation de flagelline. Pour les animaux inoculés avec de la grippe ; on s'attend à ce que les animaux développent de la fièvre (mais pas trop sévère) pendant quelques jours, elle peut persister jusqu'à la fin de l'expérience (3 jours). Les symptômes typiques de la grippe porcine sont de la fièvre, de la toux, de l'écoulement nasal et des éternuements.

Devenir

Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser des lavages broncho-alvéolaires et différents prélèvements des poumons.

Remplacement

L'étude de l'effet de la flagelline comme thérapie dans le cas d’une infection grippale ne peut être effectuée en utilisant uniquement des lignées cellulaires in vitro. La réponse immunitaire présente un comportement complexe et dynamique qui dépend non seulement de la réponse des cellules épithéliales des voies aériennes, mais aussi de son interaction avec un grand nombre de cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, cellules T ...). En outre, la clairance de l'agent pathogène dans les voies aériennes dépend de cette réponse immunitaire, mais aussi du transport mucociliaire. Cette complexité rend presque impossible d'imiter la réponse à la flagelline in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation des lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire la complexité de la réponse immunitaire in vivo qu’implique une interaction entre différents types de cellules.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimum d'animaux qui peut nous donner un résultat scientifiquement valable. Pour la première expérimentation qui implique l'étude de l'effet pro-inflammatoire de la flagelline dans les poumons, nous utiliserons 4 porcs pour le groupe traité et 4 porcs pour le groupe de contrôle. Bien que le nombre d'animaux ne soit pas très élevé pour montrer l'effet de la flagelline, nous utiliserons une technologie qui peut être utilisée pour étudier la réponse immunitaire des cellules des voies respiratoires des porcs à l'infection par la grippe, en analysant l'expression de gènes dans chaque cellule individuelle. Cette technique permet de recueillir une grande quantité de données à partir d'un seul porc, ce qui peut réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour la deuxième expérimentation, des expériences précédentes réalisées chez les souris ont montré que 6 animaux par groupe expérimental suffisent pour observer un effet significatif de la flagelline sur la charge virale. Pour cette raison, nous utiliserons 6 porcs par groupe.

Raffinement

Des expériences et des publications antérieures utilisant des modèles expérimentaux porcins d'infection grippale montrent que l'infection grippale chez le porc n'est pas très grave. On s'attend à une légère hyperthermie quipeut être ou non associée à une toux et à des éternuements. La stimulation de la flagelline provoque une réaction inflammatoire transitoire dans les poumons (moins de 24 heures). Les porcelets seront sédatés ou sous anesthésie pour tous les actes techniques ; sous la supervision de personnel qualifié et formé. Les 8 animaux de la première expérimentation seront hébergés en groupe de 4 dans une cage de 2 m². Les 12 animaux de la seconde seront hébergés en groupe de 6 dans une cage de 4 m². Ils seront hébergés en groupe tout au long des 2 procédures. Dans chaque cage, il y aura un ballon, un nunchaku ou/et chaînes. Ils auront accès à la nourriture à volonté. Les 3 porcs témoins seront hébergés ensemble également. Une semaine d’acclimatation est prévue dans chaque expérimentation pour que les porcelets s’habituent à leur nouvel environnement. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn. Toutes les prises de sang et écouvillons seront réalisés sur animaux sédatés.

Choix des espèces

La grippe porcine est un pathogène du porc, ce qui fait du porc l'espèce animale la plus pertinente. D'autres modèles animaux existent, comme les souris, mais pourraient produire des réponses immunitaires différentes. Les porcs seront âgés de 4 semaines à l’arrivée. A ce stade, les animaux pèsent entre 8 à 10 kg, ce qui facilite la manipulation et les anesthésies.