Recherche appliquée

Soumises à une chirurgie d'une heure au maximum pour déclencher la formation d'un caillot dans une artère, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous la peau et une injection derrière l'œil sous anesthésie, le porteur indiquant que des saignements oculaires peuvent apparaître après l'administration des antiplaquettaires et que le caillot peut migrer et provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris. L'objet du projet est de suivre l'évolution d'un caillot occlusif sur un jour puis sur une semaine et de tester des molécules ciblant les plaquettes. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées au long terme, quand la carotide et le cerveau de chaque souris sont prélevés après sa mise à mort.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui survient dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un agrégat pouvant entrainer des pathologies graves comme un accident vasculaire cérébral (AVC). Dans certains cas, l’agrégat peut boucher le vaisseau ce qui stoppe totalement la circulation sanguine. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’évolution d’un agrégat occlusif au cours du temps, sa sensibilité à des traitements contre les plaquettes ainsi que sa potentielle évolution vers un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre l’évolution d’une thrombose occlusive ainsi que d’étudier l’impact du ciblage de différents récepteurs plaquettaires sur celle-ci. A long terme, cela nous permettra d’améliorer la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle occlusive et de réduire les séquelles à long terme de cette pathologie, comme l’AVC ischémique.

Procédures

Le modèle nécessite une procédure chirurgicale pour induire la thrombose, celle-ci sera de maximum 60 min. Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (maximum 6) et rétro-orbitales (maximum 1) (animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Des saignements pourraient apparaitre au site d’incision ou site chirurgical. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale, notamment au niveau du site chirurgical. On pourrait observer des saignements au niveau de l’œil suite à l’administration des traitements antiplaquettaires. De plus, le thrombus pourrait emboliser et entraîner un accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.

Devenir

Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure afin de récupérer la carotide et le cerveau pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’évolution d’une thrombose occlusive au cours du temps ainsi que le rôle de différents récepteurs plaquettaires. La pathologie étudiée, la thrombose artérielle, étant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus. De plus, nous ne disposons pas à l’heure actuelle de modèle de thrombose occlusive in vitro. Nous souhaitons également évaluer l’évolution du thrombus sur de longue période (1j et 1 semaine), ce qui est impossible in vitro du fait que le sang doit être utilisé dans les 4h suivant son prélèvement.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés, le critère recherché est la comparaison de moyennes.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie ainsi que son réveil en boite thermostatée à 37°C • Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutanée et également appliqué sur l’œil après injection intraveineuse. • Par application de gel ophtalmique sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger, et par injection d’1 mL de sérum physiologique à la fin de la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal en plusieurs points d’injection (au moins 2). Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose artérielle. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant certains récepteurs plaquettaires humains, permettant ainsi de tester de nouveaux traitements de la thrombose artérielle. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Une exception sera faite pour un type de souris car leur carotide est plus grosse à âge égal, elles seront utilisé à 1 mois afin de générer une thrombose suffisante.

Le choix de l'espèce et du modèle dépend des demandes des clients : 3 151 souris et 3 151 rats, soit 6 302 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement des ovaires, du cerveau, du tissu adipeux et de l'utérus. Le syndrome des ovaires polykystiques est induit par létrozole ou par exposition hormonale avant la naissance, avec régime gras jusqu'à dix semaines, ovariectomie de trente minutes, frottis vaginaux quotidiens et administrations deux fois par jour. Les nouveau-nés mâles, écartés du protocole, sont réorientés vers l'apprentissage de gestes techniques. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à dimensionner les groupes, fixés à huit animaux par comparaison avec des publications.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.

Procédures

Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Pour le modèle hormonale, les femelles gestantes recevront des traitements hormonaux pendant 3-5 jours par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les nouveau-nés ne seront manipuler qu’au moment du sevrage pour pouvoir différencier les mâles des femelles. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.

Choix des espèces

Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix du modèle utilisé sera dépendant des demandes clients car les modèles SOPK induits par le létrozole ou par exposition hormonale prénatale sont bien décrits dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des animaux adultes ou prépubères (3 semaines) pour le modèle létrozole. De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé). Pour le modèle d’exposition prénatale aux hormones, nous utiliserons des femelles gestantes de 2-3 mois et les nouveau-nés femelles âgés de 21 jours minimum.

Jusqu'à sept prélèvements de sang sous anesthésie générale dans la même journée, puis un tous les deux jours pendant deux semaines : 45 macaques à longue queue âgés de deux à trois ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance impose une mise à jeun la veille, et la tête est fixée par les oreilles dans un cadre stéréotaxique pour l'injection entre les vertèbres. Tous sont tués par thoracotomie et perfusion intracardiaque, pour cartographier la distribution du traitement dans le système nerveux et les organes. Le porteur justifie le passage au macaque en indiquant que les résultats obtenus chez la souris ne prédisent pas la dose efficace chez l'être humain, et retient des animaux jeunes parce que les maladies visées touchent enfants et adolescents.

Objectifs

L’amyotrophie spinale avec épilepsie myoclonique progressive (SMA-PME) et la maladie de Farber sont des maladies ultra-rares liées à des mutations héréditaires qui affectent le fonctionnement d’une enzyme, la céramidase. Le dysfonctionnement de cette enzyme entraine l’accumulation d’un lipide, la céramide dans les cellules de plusieurs organes, provoquant des retards dans le développement psychomoteur, des problèmes de déglutition, une inflammation des articulations, et des problèmes de foie, cœur et reins. L'espérance de vie des patients SMA-PME ne dépasse pas l’adolescence. La maladie de Farber peut soit avoir une progression rapide jusqu’au décès du patient dans les premières années de vie, ou bien, plus rarement, avoir une progression lente jusqu’à l'âge adulte. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour les patients atteints de ces maladies. Ce projet propose de tester chez le modèle animal primate deux approches thérapeutiques pour corriger le dysfonctionnement de l’enzyme : une thérapie génique ou une pharmacothérapie. Des résultats préliminaires ont validé l’innocuité et efficacité du traitement chez des souris transgéniques déficientes pour cette enzyme. Il s’agit maintenant d’évaluer la tolérance et la faisabilité de cette approche chez un modèle animal dont l’anatomie et le système immunitaire se rapprochent au maximum de ceux des patients. Ainsi, nous pourrons déterminer les paramètres d’administration optimales, à savoir la voie d’administration, le volume d’injection et la dose efficace d’agent thérapeutique. La biodistribution de l’agent thérapeutique sera évaluée et quantifiée dans les différents organes affectés. De plus, la comparaison des deux approches vise à déterminer si une seule administration serait suffisante (thérapie génique) ou si au contraire il faut envisager un traitement chronique (pharmacothérapie).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de s’assurer de l’innocuité des agents thérapeutiques dans un modèle plus proche de l’Homme à l’aide de paramètres biochimiques et immunologiques dans le sang et une observation comportementale rapprochée. La comparaison sur ce modèle des traitements et de ses paramètres d’administration permettra de choisir le plus efficace et le moins invasif pour l’homme. Ces données constituent une preuve de concept incontournable avant de démarrer un essai clinique qui est essentiel car aucun traitement est disponible pour les patients atteints de ces maladies à ce jour.

Procédures

Les administrations et prélèvements se font sous anesthésie générale. Si la durée de l’anesthésie est de plus de 30min, les animaux sont intubés pour permettre un accès aux voies aériennes en cas de besoin. En fonction du groupe expérimentale, les animaux recevront une seule administration de thérapie génique ou un maximum de 4 administrations du traitement pharmacologique espacés de 1 semaine au minimum. Des prélèvements de sang sous anesthésie générale seront effectués régulièrement et au maximum 7 fois le jour de l’injection, soit sous anesthésie continue d’une heure, soit ponctuellement et espacés dans la journée (anesthésie 10min) puis une fois tous les deux jours les deux semaines suivantes (anesthésie 10min). Un prélèvement de liquide céphalo rachidien (LCR) sera effectué sous anesthésie générale (10min) avant injection puis avant euthanasie. Ces prélèvements répétés permettront de déterminer la réponse humorale et immunitaire aux traitements, ainsi que la concentration de l’agent thérapeutique dans le sang entre traitements pharmacologiques. Ces données sont essentielles pour interpréter la biodistribution des traitements dans les organes du macaque et leur efficacité thérapeutique. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

L’administration de produit thérapeutique et anesthésique nécessite l’utilisation d’une aiguille, ce qui entraine une douleur locale, légère et de courte durée. Le caractère répétitif de l’anesthésie et la mise à jeun la veille de chaque séance de traitement ou prélèvement de sang entrainent un stress physique pour l’animal modéré jusqu’au réveil, nourrissage et remise en groupe social (moins de 24h). La durée des examens sous anesthésie est limitée à 1h max pour minimiser le jeûne et une potentielle perte de poids ou déshydratation. Malgré sa courte durée, il y a un risque de stress thermique (hypothermie) sous anesthésie générale jusqu’au réveil. L’irritation locale au niveau des oreilles pour fixation de la tête dans le cadre stéréotaxique (utilisé dans une voie d’administration uniquement pour fixer la tête dans une position précise qui donne accès à l’espace entre les vertèbres où l’injection a lieu) et de la gorge suite à l’intubation sont locales, légères et de courte durée (

Devenir

Il est nécessaire d’analyser les tissus des modèles animaux utilisés après euthanasie pour obtenir des mesures concrètes et reproductibles. En effet, pour transposer une thérapie en clinique chez l’humain, le cadre règlementaire impose une vérification directe de la distribution de l’agent thérapeutique dans l’organisme, de l’évaluation de son efficacité (correction de l’activité enzymatique) et de l’absence de réponse immunitaire au traitement. Ces données sont inaccessibles chez le patient et le recours à l’animal reste nécessaire pour prédire l’efficacité du traitement. Ainsi, la présence du vecteur viral et de la protéine surexprimée, la céramidase, seront mesurées et cartographiées dans le système nerveux central et les organes périphériques à l’aide de techniques biochimiques (sur tissu frais) ou histopathologiques (sur tissu fixé).

Remplacement

Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux central et périphérique au point de prédire la biodistribution d’un agent thérapeutique délivré par surexpression virale. Le modèle rongeur, aux vues de sa petite taille et de son anatomie, n’est pas en mesure d’informer correctement le design clinique de l’administration de cette approche, c’est-à-dire, le titre et la voie d’administration. La taille et la structure du système nerveux central et périphérique du modèle primate permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées chez les patients. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une céramidase exogène doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive. Il est possible de dépister ces effets uniquement in vivo (présence d’anticorps neutralisants dans le sérum) et post-mortem (par analyse immunohistochimique avec des marqueurs d’inflammation).

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même type d’étude qui ont été concluants sur l’innocuité et efficacité thérapeutique et donné lieu à des essais cliniques. Le suivi longitudinal/répété chez le même individu pour monitorer la réponse immunitaire, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour observer un effet significatif dans le temps entre les groupes. Le nombre d’animaux par groupe a ainsi été réduit au minimum (n=3) afin de pouvoir exploiter correctement les résultats d’un point de vue statistique. Une veille de la littérature a été faite pour éviter de répéter des expériences.

Raffinement

Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite à l’administration des produits ou à l’anesthésie, l’évaluation du comportement à l’aide d’une grille tout le long de l’expérience, un suivi du poids hebdomadaire, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre et le volume des prélèvements ainsi que la durée de l’anesthésie sont réduits au maximum. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour les prélèvements et l’administration des traitements, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir); alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets); auditif (musique). L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.

Choix des espèces

Le modèle primate se justifie par la nécessité de reproduire des résultats obtenus chez des espèces murines mais qui ne sont pas totalement prédictives de la dose à injecter pour obtenir un effet chez l’Homme (en termes de mise à l’échelle de la dose par rapport à la surface à transduire) et sans « réveiller » le système immunitaire. D’ailleurs, le suivi comportemental chez le macaque reste le plus comparable à celui fait chez le patient en clinique. L’étude chez le modèle animal primate permettra d’évaluer la faisabilité et l’efficacité potentielle des différents sérotypes de vecteur viral, paramètres d’administration (voie, volume, titre) et tolérance dans un cerveau animal de taille moyenne avec des connections anatomiques et fonctionnelles se rapprochant au maximum de celles des patients. Nous utiliserons des animaux jeunes (entre 2 et 3 ans) car les maladies étudiées touchent les jeunes enfants/adolescents.

Du sang est injecté sous les méninges de rats anesthésiés pour reproduire une hémorragie cérébrale, avec pose d'une mini-pompe sous la peau du dos et d'une canule dans le ventricule cérébral droit, trente-cinq à quarante-cinq minutes de chirurgie. 112 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des céphalées, des douleurs faciales et oculaires et des troubles de la vision, qui "peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l'animal voire à un coma". Au quatorzième jour, tous les rats sont tués pour prélèvement du sang et du cerveau après fixation des tissus.

Objectifs

Le but de l'expérience est de déterminer si la molécule à tester peut réduire l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux) chez le rat Sprague Dawley.

Bénéfices attendus

L'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un type d'accident vasculaire cérébral causé par un saignement dans l'espace sous-arachnoïdien situé entre le cerveau et les méninges. Les lésions cérébrales précoces consécutives à une HSA sont responsables d'une grande partie des handicaps à long terme chez les patients atteints d'HSA. En outre, ils sont plus susceptibles de souffrir de troubles neurodégénératifs et cérébrovasculaires plus tard dans leur vie. Les mécanismes des lésions cérébrales précoces comprennent l'inflammation, la mort cellulaire, l'accumulation de liquide cérébral et la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Les traitements actuels sont chirurgicaux et empêchent les saignements ou réduisent la pression cérébrale (insertion d'une dérivation pour drainer le liquide du cerveau), il est donc nécessaire de développer des thérapeutiques alternatifs pour cibler les mécanismes de lésions cérébrales précoces de l'HSA. Cette étude pourrait mettre en évidence un effet via un thérapeutique sur la réduction de l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux). Cela permettrait ainsi de développer une stratégie thérapeutique moins lourde des hémorragies sous-arachnoïdiennes car sans intervention chirurgicale ni dispositif implanté à subir par le patient.

Procédures

Les animaux réaliseront un test comportemental (répété à J-1, J+1, J+7 et J+14 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par le modèle de chirurgie d’hémorragie sous-arachnoïdienne. Un prélèvement de sang au niveau de la queue sera réalisé ces mêmes jours. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du sang sous les méninges, simulant ainsi une hémorragie sous arachnoïdienne. Une pose de cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour récupérer le sang à injecter. Cette chirurgie sera suivie de la pose d’une mini-pompe osmotique en sous-cutané dans le dos ainsi que de la pose d’une canule par stéréotaxie dans le ventricule cérébral droit. Une injection sous-cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour contrer la déshydratation subie suite à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Cette phase de chirurgie prendra entre 35 et 45 minutes. A J1 et J14, les animaux anesthésiés seront placés au sein d’un IRM pour imagerie. Cette phase d’imagerie sera réalisée en 10 minutes. A J1, une analgésie complémentaire sera réalisée après le 1er test comportemental et en fin de journée. A J14, Une injection d’un traceur fluorescent sous les méninges sera réalisée. Pour se faire le même protocole que pour l’injection de sang sera réalisé (aucune pose de cathéter ne sera nécessaire pendant cette étape). Enfin, à la fin du projet a J14, les animaux seront mis à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé avant fixation des tissus puis prélèvement.

Impact sur les animaux

Suite au modèle d’hémorragie méningée, les rats pourront présenter des déficits neurologiques (moteurs et cognitifs) susceptibles d'induire des céphalées, des douleurs faciales et occulaires ainsi que potentiellement des troubles de la vision, accompagnées donc d’un stress de l’animal. Ces symptômes peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l’animal voire à un coma. À cette fin, une surveillance sera mise en place pour contrôler la douleur et le stress afin d'adapter la couverture analgésique. Une coupelle de granulés humidifiés pour offrir une meilleure transition vers l’alimentation solide sera disposée dans la cage suite à la chirurgie.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Les alternatives n’utilisant pas d’animaux ne peuvent être utilisées en raison de la complexité clinique de l'HSA et des interactions des systèmes du corps intervenant, y compris les systèmes immunitaire et nerveux, qui ne peuvent pas tous être modélisés actuellement dans des modèles de culture cellulaire ou informatiques. La voie des fluides cérébraux, en particulier, est étroitement régulée pour maintenir la pression cérébrale, les fluides étant produits par les plexus choroïdes et évacués par le système glymphatique dans une autre partie du cerveau, c'est pourquoi la structure entière du cerveau dans une cavité fermée (crâne) est nécessaire pour évaluer la dynamique des fluides et le système glymphatique.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.

Raffinement

Les rats seront 2 par cage, isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Une injection sous-cutanée de sérum physiologie sera réalisée après la chirurgie. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. A J1, un analgésique sera administré en début et fin de journée. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera soit soigné jusqu’à amélioration ou mis à mort. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivant l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites (2 fois par jour). Avant la mise à mort, les animaux seront mis sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat (Rattus norvegicus) est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les animaux utilisés seront âgés de 3 mois soit un poids d’environ 500g pour les mâles et 300g pour les femelles. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’HSA.

3 660 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir une chirurgie du dos de trente minutes pour une injection entre les méninges, six prélèvements de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à dix-sept heures en cage à métabolisme. Avant la mise à mort, une aiguille traverse la peau à la base du crâne pour ponctionner le liquide céphalorachidien. L'objet est de mesurer la toxicité de candidats médicaments administrés par voie intrathécale, en amont d'études réglementaires qui utiliseront davantage d'animaux non-humains. Le porteur indique que 183 rats pourront être réutilisés dans un autre projet, ceux ayant subi un premier geste invasif sans avoir reçu de traitement, les 3 477 autres étant tués pour prélèvement de sang, de liquide céphalorachidien et d'organes.

Objectifs

De nos jours, une proportion très importante des pathologies pouvant être décrites atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, difficiles à traiter, sont très invalidantes, voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En effet, en 2021, il était estimé que près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. De même, le nombre de cancers atteignant le système nerveux représente une proportion non négligeable du nombre total de cancers, avec de même une difficulté de traitement du fait de leur localisation. Dans ce contexte, l’objectif principal de la R&D (recherche et développement) pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques afin de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies touchant le système nerveux. Pour beaucoup de ces maladies, un dérèglement de la production de protéines ou une accumulation de celles-ci au niveau cérébral est en cause. Il est possible aujourd’hui de cibler l’ARN d’une protéine du cerveau au fonctionnement anormal pour l’éliminer. Cela nécessite la mise en œuvre de candidats médicaments qui doivent atteindre les cellules du système nerveux. Le passage de la barrière hématoencéphalique (BHE) étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par administration dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité puis le profil de sécurité complet de candidats médicaments et/ou véhicules (agents de transport du principe actif) administrés par voie IT chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme.. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Ainsi, après sélection par screening in vitro puis in vivo des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, les études préliminaires vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet vont permettre de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (en comparant la dose toxique à la dose efficace). Les données d’efficacité et de sécurité permettent conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament.

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies affectant le système nerveux et notamment neurodégénératives est administré par voie intrathécale, permettant le passage de la barrière hémato-encephalique et l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient et le candidat médicament peut, au cours de son développement, être confronté à des problèmes de tolérabilité, de distribution et de dégradation précoce. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet également de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés au total pour un projet thérapeutique.

Procédures

- A l’administration (unique à 1 fois toutes les 3 semaines maximum) de composés par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique – durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling sur animal vigile (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude – contention de 30 secondes environ et prélèvement durant 10 secondes environ - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien réalisé par voie transcutanée (ponction avec une aiguille au travers de la peau) via la cisterna magna (cavité située en bas de la boîte crânienne) sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère de 2 minutes environ au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’administration (moins de 10s) de la douleur (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité léger) • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de sang ou autre liquide biologique, liquide céphalo-rachidien (LCR), préalable à l’euthanasie etc) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques (modifications de la prise de poids, baisse d’activité locomotrice par exemple) et peut provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide cephalo-rachidien (LCR) pour analyse (biologie clinique, biomarqueurs) et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer la tolérabilité puis d’établir un profil de sécurité de candidats médicaments à visée neurologique. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet pour juger du passage de la barrière hématoencéphalique ainsi que la tolérabilité et le profil de sécurité de ces candidats médicaments. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les candidats médicaments ou véhicules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.

Réduction

Une sélection des candidats médicaments les plus prometteurs est réalisée à l’aide de screening vitro et/ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 8 animaux/dose avec une mixité selon la procédure conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures, pour générer de la donnée consolidée pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible Le choix de ce nombre est basé sur la littérature (recommandations sur les bonnes pratiques d’études de sécurité non clinique) et sur l’expérience interne. Les études de ce projet sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (efficacité, engagement de la cible) avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études d’efficacité pharmacologique, le développement de la molécule peut être arrêtée évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Selon la procédure, les études permettent de mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire dans ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal et sans chauffage préalable pour provoquer la dilatation des vaisseaux. En cas de protocole particulier (exemple : besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être mis à contribution pour définir le design expérimental le plus optimal.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peuvent être mis en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont régulièrement manipulés et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures, recueil urinaire n’excédant pas 17 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.