Recherche appliquée

Les souris de ce projet subissent une biopsie du bout de la queue pour le génotypage, jusqu'à cinq ponctions de sang dans la joue sur animal vigile et, pour une partie d'entre elles, une injection de cellules leucémiques dans la veine caudale. 8 570 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles qui développent la leucémie montrant fatigue et perte de poids quand les cellules cancéreuses dépassent 80 % des cellules du sang. Le porteur écrit qu'une partie des souris issues des croisements sera replacée dans l'élevage pour réduire le nombre d'animaux utilisés, et écrit aussi que tout animal inclus dans l'étude sera mis à mort. Les souris immunodéprimées, précise-t-il, "ne pourraient être remises en liberté" à l'issue du projet.

Objectifs

Les leucémies aiguës sont des cancers du sang très agressifs qui affectent principalement les enfants et les jeunes adultes. Ces cancers ont souvent un mauvais pronostic. Une des causes fréquentes de cette maladie est l'expression anormale d'une protéine spécifique, trouvée dans 25 à 50 % des cas. Cette protéine collabore avec une autre pour contrôler de nombreux gènes, mais son rôle exact dans la leucémie reste inconnu. Pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouveaux traitements, des souris portant une combinaison de ces deux facteurs seront générées. De plus, le rôle d'un élément régulateur sera recherché grâce au croisement avec un autre modèle de souris transgénique. Dans ces deux modèles l'apparition de la leucémie sera suivie, les cellules et processus impliqués seront recherchés. Enfin, dans un troisième modèle, nous injecterons des cellules contrôles ou leucémiques chez des souris immunodéficientes pour étudier les mécanismes d'émergence de la leucémie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de recréer chez la souris un type de leucémie très fréquent chez les patients. Il nous aidera à mieux comprendre les mécanismes biologiques à l'origine de cette leucémie spécifique et à voir comment les changements moléculaires se développent dans cette maladie. En comprenant mieux ces processus, nous pourrons identifier les partenaires de la protéine clé impliquée et proposer des traitements ciblés pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.

Procédures

- Prélèvement caudal pour génotypage dans les dix jours suivant la naissance des animaux transgéniques : biopsie de la pointe extrême de la queue, 1 fois par animal, dure 2 à 3 secondes. - Prélèvements sanguins dans la veine de la joue sur souris vigile, uniquement pour une partie des animaux, de façon mensuel, hebdomadaire ou bi-hebdomadaire; maximum 5 fois/animaux; prélèvement dure moins d'une minute. - Injection de cellules dans la veine de la queue d'une partie des animaux, 1 fois/animal. L'injection dure entre 30 secondes et 1 minute.

Impact sur les animaux

La biopsie caudale et l'injection de cellules dans la veine caudale peuvent entraîner un léger saignement et une douleur légère. Les animaux au phénotype dommageable peuvent développer des signes cliniques dus à la progression de la leucémie lorsque les cellules cancéreuses représentent plus de 80% des cellules sanguines, principalement fatigue et perte de poids. Les prélèvements sanguins induisent une douleur de courte durée. La contention afin de réaliser les prélèvements sanguins et injections caudales de cellules peut entrainer un stress momentané chez les animaux. Les souris immunodéficientes présentent des altérations génétiques les rendant particulièrement vulnérables aux infections microbiennes.

Devenir

Afin de récupérer les cellules leucémiques toute souris transgénique ou ayant été injectée avec des cellules leucémiques sera mise à mort. Par ailleurs, les souris présentant une immunodepression ne pourraient être remises en liberté à l'issue du projet. Par conséquent, tout animal inclu dans cette étude sera mis à mort l'issue de cette dernière.

Remplacement

Les cellules utilisées en laboratoire pour étudier les leucémies sont différentes de celles trouvées dans le corps humain. Reproduire exactement la manière dont la leucémie se développe en laboratoire est difficile. De plus, il est compliqué d'obtenir suffisamment de cellules leucémiques directement des patients pour les études. Elles sont fragiles et ne peuvent pas survivre très longtemps en dehors du corps. Notre projet vise à comprendre comment la leucémie progresse dans différents organes comme le thymus ou la rate. Puisque nous ne pouvons pas obtenir ces échantillons directement des patients, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour simuler la maladie. C'est la meilleure façon de comprendre les leucémies avant de tester des traitements chez les humains.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaires au projet a été fait en tenant compte des statistiques de transmission de chacun des transgènes. Une partie des animaux issus des croisements n'auront pas le génotype souhaité et seront utilisés comme contrôle ou replacés dans l'élevage dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les effectifs ont été determinés afin d'être analysés avec des tests statistiques adaptés et permettre d'obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis et seront attentivement suivis. Pour prendre soin des souris, elles auront du coton, des bâtonnets de bois et des tunnels rouges pour jouer et construire des nids. Elles vivront en petits groupes pour éviter les disputes et le stress. Quand nous ferons des biopsies pour vérifier leurs gènes, nous désinfecterons leur queue pour éviter les infections et surveillerons la guérison. Les injections seront faites sous anesthésie locale avec des aiguilles très fines pour limiter la douleur. Les souris ayant un risque de développer une maladie seront suivies par ponction sanguine jugale afin d'anticiper et de prévenir l'apparition du phénotype dommageable induit par la leucémie. Si une souris perd trop de poids, nous lui donnerons de la nourriture spéciale. Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et au moins une fois par semaine par les responsables du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix validé scientifiquement par la littérature pour étudier la leucémie. Nous ne pouvons pas utiliser d’autres espèces animales pour mimer la leucémie. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet.

Pour montrer qu'un implant posé sur les bulbes olfactifs peut restaurer des sensations d'odeur, 20 brebis vont être rendues anosmiques puis utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Dix subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt sessions d'apprentissage associant une odeur à une récompense sur quatre à huit semaines, avant une chirurgie de deux heures puis deux autres d'une heure. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif, annonce des douleurs post-opératoires, des saignements de nez et des fuites de liquide céphalo-rachidien possibles, et prévoit de tuer les brebis dont les complications seraient sévères.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4). 10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2).• 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection,. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Deux séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse de trente minutes par semaine pendant trois semaines, une injection hebdomadaire dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, neuf pesées et neuf mesures de tumeur au pied à coulisse : 248 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau du flanc gauche. Le projet met au point cinq modèles de cancer rendus luminescents, pour des études d'efficacité qui viendront ensuite. Le porteur explique avoir besoin d'animaux au système immunitaire fortement déprimé pour éviter le rejet des cellules humaines, et retient des souris de cinq à six semaines pour favoriser la prise tumorale.

Objectifs

La dissémination métastatique est une cause majeure de mortalité chez les sujets atteints de cancer. C’est un processus séquentiel dont les principales étapes comprennent le détachement de cellules cancéreuses de la tumeur primaire et l’invasion du tissu de l’hôte, leur pénétration et leur transport dans la circulation, puis leur adhérence à la paroi vasculaire de l’organe cible, leur extravasation et leur prolifération. Un cancer disséminé est le plus souvent résistant aux thérapies anti-cancéreuses actuellement disponibles car le processus métastatique est détecté tardivement et le microenvironnement des métastases renforce la résistance aux médicaments. Afin d’établir de nouveaux traitements efficaces chez les patients atteints de ces cancers,il est nécessaire de disposer de modèles animaux permettant de localiser précocement les métastases afin de pouvoir par la suite évaluer l’efficacité in vivo des différents traitements anti-cancéreux. L’imagerie du petit animal, désormais reconnue internationalement comme stratégique pour l’innovation comme pour le développement pharmaceutique, est une technologie en pleine expansion. Elle présente de nombreux intérêts, comme la détection précoce des tumeurs et des foyers métastatiques dans l’ensemble de l’animal, évitant le biais des mesures au pied à coulisse où il faut attendre que la tumeur fasse une certaine taille et qui ne permet pas le suivi des métastases.L’imagerie par bioluminescence est une approche basée sur la détection de lumière visible émise par des cellules ou des tissus exprimant la luciférase et peut être utilisée dans des études de croissance tumorale et d’études de la dissémination de métastases. Ce projet vise à développer et évaluer en suivi par imagerie par bioluminescence 5 modèles tumoraux d’indications différentes, métastatiques ou non, modifiés génétiquement afin d’exprimer le gène de la Luciférase puis injectés en sous-cutané dans des souris immunodéprimées. Les données issues de ce travail préliminaire offriront une plus grande précision sur leur localisation, la mesure uniquement des cellules tumorales vivantes (et non du tissu conjonctif) et l’identification des zones de nécrose au sein de la tumeur, procurant des informations précieuses sur la dynamique de progression de la tumeur,l'efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques et une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’œuvre dans chaque type tumoral

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de stratégie de développement préclinique. Ce projet permettra par la suite que de nombreux traitements soient testés en clinique.

Procédures

Une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 1 injection intraveineuse à raison d’une par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale à raison d’une par semaine, 30 secondes ou 1 injection intrapéritonéale unique, 30 secondes. Au maximum 9 pesées et 9 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine. Une anesthésie gazeuse d'une durée de 30min pour les séances d'imagerie à raison de 2 par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de la tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intrapéritonéal et en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les traitements de référence sont très bien connus dans notre laboratoire et aucun des traitements n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies. Les anesthésies liées à l'imagerie peuvent éventuellement entrainer une hypoventilation,une hypotension ou une baisse de température.

Devenir

L'ensemble des animaux des procédures 1 et 2 seront mis à mort afin de prélever les tumeurs pour analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis de confirmer la bonne croissance des cellules et l’expression suffisante du gène permettant la bioluminescence des cellules tumorales, mais nous avons à présent besoin de tester notre suivi en imagerie sur un animal vivant et entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion de la luciférine dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessite de travailler sur un organisme entier et vivant. Pour cette raison nous devons effectuer ces études chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé de la façon suivante : il s'agit d'une étude préliminaire afin de déterminer la faisabilité et la pertinence du suivi ainsi que le nombre d’animaux minimum nécessaire à la réalisation de tests statistiques dans le cadre de nos futures études d’imagerie par bioluminescence. Nous estimons d’après notre connaissance des modèles et la littérature que nous aurons besoin de 8 souris par groupe pour la première procédure, et de 12 animaux par groupe pour la 2e procédure afin de pouvoir comparer l’efficacité du traitement de référence au groupe non traité et ainsi montrer que cette méthode est fiable pour un suivi d’efficacité. Nous utiliserons une analyse statistique afin de déterminer si une différence entre les deux groupes traité et non traité existe. Nous aurons donc besoin selon nos estimations de 248 animaux au total.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs ont été formés à l’utilisation de l’imager et possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi des modèles utilisés ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse et intrapéritonéale. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique ou anti-inflammatoire sera immédiatement mis en place . Il sera mis à la disposition des souris des cotons pour faire leur nid et des tunnels.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, la souche que nous utiliserons est un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale. Nous priviligierons des souris femelles, mais dans un souci de comparaison de prise tumorale, nous souhaitons inclure, pour 3 lignées de tumeurs non spécifiques des femelles, et des mâles, ainsi nous pourrons complétement exclure ce sexe si pas de résultats comparables avec celui des femelles.

Une partie des souris viendra d'autres protocoles de l'animalerie, où elles étaient déjà vouées à la mise à mort. 336 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ trente minutes pendant laquelle des particules chargées de médicaments et libérables par la lumière sont injectées dans une zone précise du cerveau, puis elle est suivie jusqu'à 28 jours avant d'être tuée. Le porteur affirme que la biocompatibilité de ces particules "ne peut être vérifiée que chez l'animal entier", tout en indiquant n'avoir jamais observé d'effet indésirable sur le comportement ou le tissu cérébral en plusieurs années.

Objectifs

Le projet de recherche dans lequel s'insère le présent projet consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de molécules dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif à long terme de ce projet est de proposer une nouvelle approche thérapeutique pour plusieurs maladies du cerveau. De nombreuses étapes du projet sont réalisées sans le recours à l'expérimentation animale, en vue de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cependant, la validation de la sécurité biologique de notre technologie nécessite l'utilisation de souris, d'où la présente demande.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, la mise au point de cette technologie permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales de type stéréotaxique (à l'aide d'un atlas anatomique), visant à injecter des médicaments encapsulés dans des zones précises du cerveau. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies à réaliser présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.

Devenir

Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier la biocompatibilité des médicaments encapsulés injectés dans le tissu nerveux, jusqu'à 28 jours après injection. L'issue de la procédure est la mise à mort de l'animal.

Remplacement

Le projet scientifique dans lequel s'insère ce projet prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences du projet ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser les propriétés des particules développées pour le projet, sans avoir recours à l'expérimentation animale. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. A chaque fois que ce sera possible, nous utiliserons pour nos expériences des animaux déjà présents à l'animalerie, issus d'un autre protocole, et qui ne peuvent plus être utilisés différemment (donc destinés à l'euthanasie). Par ailleurs, des expériences de biocompatiblité ont déjà été réalisées avec un suivi longitudinal, chez des animaux suivis pendant une longue période avec de l'imagerie in vivo. Même si cette approche apporte des réponses essentielles, elle n'est pas suffisante pour quantifier avec précision le devenir des particules dans le cerveau, d'où la nécessité du présent projet.

Raffinement

Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les animaux, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les souris seront hébergées par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage. Dans le cas d'un score préoccupant (>9), l'animal sera euthanasié dans les 48h au plus tard si son état ne s'améliore pas malgré les soins délivrés.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, elles peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les outils utilisés (anticorps, microscopes etc.) sont les plus développés (et donc les plus efficients) pour la souris. En outre, nous sommes dans une démarche de ré-utilisation d'animaux déjà présents à l'animalerie pour nos expériences, or l'animal le plus présent dans notre animalerie est de loin la souris (pas de rats ou d'autres animaux actuellement pour notre laboratoire). Nous utiliserons des animaux adultes, car les chirurgies stéréotaxiques sont plus faciles à réaliser chez des animaux déjà adultes. Ainsi, nous utiliserons les animaux entre 8 semaines et 8 mois d'âge.

Anesthésiés, entaillés au dos pour y créer une plaie en dix minutes environ, puis traités par injections intradermiques selon trois calendriers différents, 60 rats passent ensuite trois semaines seuls en cage pour éviter qu'ils ne s'arrachent les pansements. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le projet sert à choisir le rythme d'administration d'un traitement régénératif pour les études d'efficacité qui suivront, chez le rat sain puis chez le rat diabétique. À la fin des trois semaines, le sang est prélevé dans le cœur sous anesthésie profonde, puis les 60 rats sont tués pour prélever la peau et un ensemble d'organes.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants liés à la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. L’objectif de cette étude préliminaire est d’évaluer in vivo chez le rat le schéma de traitement optimal d’un nouveau traitement régénératif sur la cicatrisation de plaies cutanées. Des études in vitro sur des modèles cellulaires, cultures de fibroblastes et de kératinocytes, ont permis de démontrer une activité hyperproliférative cellulaire laissant envisager une régénération accélérée et donc une cicatrisation plus rapide de plaies cutanées, ainsi qu’une activité anti-inflammatoire associée. Ce projet constituera la toute première évaluation in vivo sur un modèle de plaie cutanée chez le rat de ce nouveau traitement régénératif, en comparaison avec un placebo. Les traitements débuteront dès la fin d’induction des plaies cutanées et seront effectués selon 3 schémas de traitement différents afin de déterminer le schéma de traitement optimal pour les études d’efficacité qui seront menées à la suite chez le rat sain puis chez le rat diabétique, avec différentes doses de ce nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif. A l’issue des 3 semaines de l’étude, des dosages hématologiques et biochimiques seront effectués sur un prélèvement de sang effectué en intracardiaque après placement des animaux sous anesthésie générale gazeuse, suivi après leur euthanasie du prélèvement de peau au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’organes pour la réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques. Les résultats de ce projet permettront de sélectionner le schéma de traitement du nouveau traitement régénératif montrant la meilleure efficacité sur la cicatrisation pour en poursuivre son développement préclinique et envisager par la suite un développement clinique afin de proposer une nouvelle thérapie pour le traitement de plaies cutanées chroniques.

Bénéfices attendus

L’induction d’une plaie cutanée, effectuée sous couverture analgésique et anesthésie générale en 10 minutes environ, peut induire une souffrance mais limitée dans le temps. Les traitements par injections intradermiques, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, engendreront une douleur très localisée au niveau de chaque site d’injection. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats, pendant une durée de 3 semaines, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Procédures

Les 60 rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Un traitement analgésique sera administré avant l’induction de la plaie cutanée puis éventuellement 6 heures, 12 voire 24 heures après celle-ci si nécessaire. Les plaies cutanées, protégées par un pansement de couverture, seront observées, photographiées et traitées suivant 3 schémas de traitement différents : 1 seule fois, 1 fois par semaine ou 2 fois par semaine après induction de la plaie cutanée, sous anesthésie générale, en 8 minutes environ. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire après induction des plaies cutanées et traitement de celles-ci, pendant 3 semaines, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées, mais avec un enrichissement de leur milieu pour assurer leur bien-être. Des cages transparentes ouvertes seront utilisées pour maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous traitement analgésique et anesthésie générale profonde à la fin de l’étude et avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements seront effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 6-8 minutes, et engendreront une douleur très localisée et transitoire. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire après induction et traitement des plaies cutanées pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux l’ensemble compresse/pansement de couverture/sparadrap protégeant les plaies cutanées. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes ouvertes, permettant à chaque rat de voir, sentir et entendre au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 60 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés et des prélèvements de peau, au large de la région d’induction de la plaie cutanée et des traitements, et d’un ensemble d’organes, seront effectués pour réaliser des analyses biologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’effectuer l’ensemble des analyses envisagées et d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études in vitro sur cultures cellulaires et à partir des résultats d’études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle de plaie cutanée chez le rat mâle ayant montré des effets importants de traitements sur la cicatrisation (surface des plaies cutanées notamment). Des analyses statistiques des résultats obtenus seront réalisées à la fin de l’étude.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire), ainsi que lors de chaque traitement effectué. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré 3 fois par semaine lors de chaque observation des plaies cutanées et lors de chaque traitement lorsqu’il aura lieu. Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de plus de 10% entre 2 prises de poids est observée, ou si des signes d’infection ou d’ulcération de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront hébergés dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des briques en bois et un tunnel en carton de large diamètre seront placés dans chaque cage de rat comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière (2 fois par semaine). L’utilisation de cages transparentes ouvertes permettra de maintenir un contact social visuel, olfactif et auditif entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet, en raison de sa taille, de sa facilité de manipulation, et du modèle de plaie cutanée validé dans cette espèce qui pourra être utilisé pour la poursuite de ce projet avec des études d’efficacité avec différentes doses du nouveau traitement régénératif ou avec des fractions actives isolées à partir de ce nouveau traitement régénératif, chez le rat sain puis diabétique. Les animaux seront de jeunes rats mâles et femelles âgés de 8-10 semaines et d’un poids de 225-250 g à l’arrivée au laboratoire et de 9-11 semaines et d’un poids de 250-275 g pour la réalisation des expérimentations. Cela correspond à l’âge et au poids de rats mâles utilisés lors de précédentes études sur ce modèle de plaie cutanée ayant donné des résultats significatifs.

Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.

Objectifs

La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.

Procédures

Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.

Des rats sains, retenus comme le modèle rongeur "le plus prédictif" en toxicologie, sont les premiers à recevoir les candidats médicaments de ce laboratoire. 2 700 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 pouvant être réutilisés dans un autre projet, les autres tués pour le prélèvement du sang, du liquide céphalorachidien et des organes. Ils reçoivent le composé jusqu'à trois fois par jour pendant quatre semaines, par gavage ou par injection, subissent jusqu'à six prises de sang en 24 heures, un recueil urinaire de dix-sept heures en cage à métabolisme et des examens ophtalmologiques et cardiologiques. Le porteur présente ce projet comme un moyen de réduire le nombre d'animaux des études réglementaires ultérieures, en écartant plus tôt les candidats les moins prometteurs.

Objectifs

Il reste encore de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. L’objectif de la recherche et du développement (R&D) de nouveaux candidats médicaments est de développer de nouvelles entités chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. Pour un candidat médicament, la R&D pharmaceutique in vivo se doit de déterminer la fenêtre thérapeutique pour l’administration chez l’Homme, c’est-à-dire l’intervalle de doses entre lequel le candidat est à la fois actif et efficace (pharmacologie) et engendre le moins de toxicité possible (sécurité non clinique). Pour cela, des études de toxicologie (incluses dans cette demande d’autorisation de projet) ainsi que des études de pharmacologie (efficacité, mode d’action du candidat médicament) doivent être mises en place préalablement à tout essai clinique chez l’Homme. Lors du développement d’un médicament, il est nécessaire d’évaluer en parallèle : - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres projets) - et la sécurité : à l’aide d’études de toxicologie sur le rat sain (forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et modèle rongeur considéré comme le plus prédictif en toxicologie) (procédures encadrées par la présente DAP). Les études préliminaires in vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet permettent de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître la fenêtre thérapeutique (gradient pour lequel des doses sont à la fois efficaces et non toxiques). Les données d’efficacité et de sécurité permettent ainsi conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament. Les études de ce projet interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études in vivo réglementaires) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après une première étape de caractérisation et de sélection des molécules in vitro (tests de neurotoxicité ou d’hépatotoxicité sur des cellules) et in silico (analyse informatique de la toxicité d’un composé pour le génome). Elles sont réalisées chez le rat uniquement pour les candidats médicaments les plus prometteurs qui seront utilisés pour la suite du développement afin de déterminer en parallèle leurs profils de sécurité, s’ils n’étaient pas encore établis.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisé pour un projet) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ains le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisé pour un projet.

Procédures

- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 4 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : • Administration orale : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). • Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une intrapéritonéale unique ou modéré si l’administration intrapéritonéale est réitérée. Pour les autres types d’administration degré léger. • Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) • Recueil urinaire (cages à métabolisme) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (inférieure à 17h) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). • Administration sous-cutanée (analgésique) : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur (Degré de sévérité léger). Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet couvre l’ensemble des études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. En effet, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes. L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études. S’ajoutent à cela des informations des études de pharmacologie sur l’efficacité des candidats médicaments, permettant de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo

Réduction

Une sélection des molécules les plus prometteuses est réalisée à l’aide de tests vitro / silico avant la mise en œuvre de ce projet. Le nombre habituel d’animaux (4 à 8 animaux/dose avec une mixité conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Il permet d’intégrer de la mixité (nécessaire pour évaluer la toxicité d’un composé sur l’appareil reproducteur mâle et femelle) dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Ces études permettent de confirmer les données obtenues grâce aux méthodes alternatives Elles sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (développement de modèle et de recherche de mode d’action du candidat médicament). Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études de pharmacologie, le développement de la molécule peut être arrêté évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Elles permettent aussi de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque et l’impact sur le bien-être des animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, etc…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. En cas de protocole particulier (exemple : nouveau schéma d’administration ou suivi d’un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être impliqué pour définir un design expérimental optimal. Enfin, la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les volémies physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision rapide est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou non, une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de doses ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique au rat mise en place avant l’apparition des points limites. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (exemple : contention pour administration par injection). L’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Les groupes peuvent être mixtes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire par exemple), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). La durée du recueil urinaire sera limitée à son strict minimum (maximum de 17h). Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les 2 procédures de ce projet sont réalisées sur l’espèce rat car elles interviennent en amont des études réglementaires réalisées sur ce modèle. Comme ces études permettent, en particulier, de choisir les doses et le schéma d’administration des études réglementaires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires obligatoires, elles doivent être réalisées sur le même modèle expérimental que celui des études réglementaires. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. Lorsque cela est possible, l’espèce rat doit répondre aux effets pharmacodynamiques du candidat médicament. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en parallèle chez la souris. Les animaux sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Tester des molécules antiépileptiques pour le compte de clients suppose une lignée de rats sélectionnés de génération en génération pour faire des crises d'absence. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers d'entre eux subit une neurochirurgie d'une heure doublée d'une chirurgie abdominale pour la pose de capteurs, puis des enregistrements cérébraux de deux à quatre heures une à deux fois par semaine, des injections pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant 28 jours, et un hébergement en cage individuelle après l'implantation. Le porteur chiffre les effectifs d'après "l'activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années", l'utilisation réelle dépendant de "la demande".

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantesdans le monde. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, une forme généralisée d’épilepsie sera étudiée : l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requière tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes. Puis ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif ; Une étude pharmacologique sur ce modèle a montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients ainsi qu’une aggravation des crises chez le rat avec les mêmes antiépileptiques. Ce modèle, au cours des années, est devenu un modèle de référence pour évaluer les effets soignants et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Le but de se projet est d'identifier les nouvelles molécules pouvant soigner l'épilepsie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l'épilepsie et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Procédures

Environ 1/3 des animaux de ce projet vont subir : - une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. - une chirurgie abdominale (en simultané avec la neurochirugie) pour le placement de capteur - la pose de dispositif sous cutané sous anesthésie générale (1/4 heure) - des enregistrements une à deux fois par semaine pendant 2 à 4 heures. - Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. - des prélèvements sanguins pourront être faits.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Pour se faire la mise à mort des animaux en fin de chaque porcédure est nécessaire

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle vise à étudier des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. De plus, les animaux sont traités en plan d'étude croisé (tous les animaux reçoivent toutes les molécules avec à chaque fois une vérification de l’EEG avant une nouvelle administration - chaque animal est son propre contrôle). Chaque animal possède deux voies d’enregistrements permettant ainsi de réaliser les enregistrements même si un canal d’enregistrement devient inexploitable. Pour la procédure 1, nous pouvons l’estimer à 60 lots sur 5 ans (1 lot par mois). Un maximum de 14 rats par lot est prévu. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 120 lots (2x60) de 20 rats sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisé. Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’etude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 2400 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection d’analgésique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 heures après la première injection (0.05 mg/kg, i.p). Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements (= cours de récréation). Les animaux sont rassemblés dans une enceinte fermée avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. La lignée de rats utilisée a été développée en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et cérébrale que l’humain. Les activités neurologiques, visibles lors des enregistrements cérébraux ont des similitudes avec ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fasse sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises apparaissent à partir de l’âge de 30 jours post-natal et sont stables et bien établies à partir de 2 mois d’âge.