Recherche appliquée

Une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, un jeûne de 24 heures, 48 heures d'hébergement individuel, puis deux séries de tests comportementaux sur deux semaines pour mesurer des troubles moteurs, cognitifs et anxieux. 318 souris passent par ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle porte une modification de la protéine Huntingtine, et le porteur annonce qu'il ne devrait provoquer ni point limite ni mort prématurée, tout en prévoyant la mise à mort de tout animal perdant plus de 20 % de son poids. Une chirurgie terminale clôt le parcours, le temps de prélever le cerveau et d'autres organes conservés pour des expériences ultérieures.

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, un nouveau modèle a été développé afin de pouvoir étudier une modification de la protéine Huntingtine. Cette modification contribue au phénomène de neurodégénérescence et à la mortalité des neurones dans la maladie de Huntington. L'objectif de ce projet est de comprendre pourquoi et par quels moyens cette modification est toxique.

Bénéfices attendus

La technique utilisée dans ce nouveau modèle pour recréer cette modification de la protéine Huntingtine a déjà été validée sur des cellules en culture. Les résultats prometteurs obtenus sur des cellules en culture doivent désormais être testés et adaptés dans une étude animale. Ce projet a pour but de comprendre ce mécanisme de modification de la protéine Huntingtine et permettra à terme de développer des thérapies afin de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes chez les patients atteints par la maladie de Huntington.

Procédures

Au cours de leur vie, les animaux recevront une injection rétro-orbitale sous anesthésie (durée de l'injection = 30 secondes) puis effectueront au maximum deux séries de tests comportementaux pendant une durée maximale de deux semaines. L'objectif de ces tests comportementaux est de comprendre comment la modification de la protéine Huntingtine engendre des problèmes moteurs, cognitif et anxieux. Enfin, une chirurgie terminale sous anesthésie sera pratiquée pour le prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Selon la littérature et des résultats préliminaires, la modification génétique du modèle murin utilisé dans ce projet ne devrait pas entraîner l'apparition de points limites ni de mort prématurée. Cependant, plusieurs effets indésirables peuvent être identifiés : 1) un stress léger lors de la manipulation des animaux afin de les anesthésier une seule fois pendant 5 minutes et de leur administrer un composé permettant de modifier la protéine Huntingtine (durée de l'administration = 30 secondes); 2) un stress modéré lors de la mise à jeun de 24h et 3) un stress modéré lors de l'hébergement individuel des animaux pendant une durée de 48h.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.

Remplacement

Le projet traitant de réseaux neuronaux complets, il est impossible de remplacer le modèle animal vivant par des cultures cellulaires ou des simulations informatiques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe afin d'obtenir des résultats statistiquement analysables et interprétables. Des résultats sur cellules en culture ont déjà validé ce modèle ce qui a permis de réduire le nombre d'animaux testés dans ce projet. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de l'étude, plusieurs organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal et aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. L’état de santé des animaux sera surveillé conformément à la réglementation par l’apparition de stress/douleur selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, arrêt du toilettage). De plus, bien que la procédure soit peu invasive et très rapide (5min), des points limites suffisamment précoces et spécifiquement adaptés à ce projet tels qu'une perte de poids supérieure à 20%, un gonflement de l'oeil suite à l'injection ou tout autres signes de traumatisme seront mis en place. En présence de l'un de ces points limites, nous appliquerons une procédure d'arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de l'anatomie du cerveau avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Le modèle murin utilisé ici permet de comprendre le rôle de la protéine responsable de cette maladie et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les symptômes neurodégénératifs se développant dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme, les tests comportementaux seront réalisés entre 4 et 7 mois une fois que le réseau neuronal des animaux est mature.

Jusqu'à dix prélèvements sanguins en 48 heures, une ponction de liquide céphalo-rachidien, trois heures d'imagerie et une chirurgie intracérébrale de deux à quatre heures : 100 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent aussi jusqu'à six heures en chaise de contention pour la microdialyse et deux séances hebdomadaires de tests comportementaux qui ne sont pas nommés, avec un inconfort attribué à la captivité et au conditionnement, et l'atteinte de seuils douloureux tactiles ou thermiques. Le projet mesure la diffusion de candidats médicaments contre les maladies neurodégénératives et leurs effets sur la sensibilité. Le porteur justifie le recours au primate par sa proximité anatomique avec l'être humain, et présente ce passage avant l'essai clinique comme relevant d'un "principe éthique".

Objectifs

Les maladies neurodégénératives (maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer, …) sont des affections du système nerveux caractérisées par la dégénérescence progressive des neurones, ce qui peut entraîner divers symptômes cognitifs, moteurs et sensoriels. Avant l’entrée des médicaments en phase clinique, il est important d’évaluer leur efficacité dans le traitement mais également l’absence d’effets secondaires chez l’animal. Le présent projet vise à tester pour ces pathologies de nouveaux candidats administrés chez le primate non-humain. Leur validation reposera sur deux approches : premièrement, une analyse permettant d'évaluer l'évolution temporelle de la distribution de ces molécules dans l'organisme; deuxièmement, une approche basée sur les changements entrainés par l’administration de ces agents dans la perception de la douleur (somesthésie), du toucher et de la température corporelle. Ces approches auront recours à des prélèvements biologiques, tissulaire, de l’imagerie et pourront nécessiter une étape chirurgicale.

Bénéfices attendus

Les études précliniques dans le cadre des maladies neurodégénératives permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de ces molécules sur les animaux est fondamental pour confirmer que celles-ci atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus sans effets secondaires notables. En effet certains traitements ont un impact sur la sensibilité générale (thermique, tactile, douleur …) Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’administrer un nouvel agent pharmacologique à l’homme sain ou malade compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils pharmacologiques en évitant toute modification délétère de la somesthésie chez un modèle de grand animal.

Procédures

Les animaux sont soumis aux étapes suivantes : - Prélèvement sanguin (10 min), jusqu'à 10 fois en 48 heures, avec un volume maximum de 5 ml/kg par semaine, sur des animaux anesthésiés ou éveillés. - Prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) (10 min), avec un volume maximum de 1 ml par animal, sur des animaux anesthésiés. - Imagerie (3 heures) sur des animaux anesthésiés. - Chirurgie intracérébrale (2 à 4 heures) sous anesthésie. - Traitement administré par voie générale, jusqu'à 2 fois par jour, sur des animaux éveillés. - Tâches en chaise pour la microdialyse (maximum 6 heures) et tests comportementaux (2 fois par semaine, maximum 60 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie (éventuelle), douleur possible. Pour l’évaluation de la somesthésie : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique de substances, atteinte de seuil douloureux (tactile ou thermique) Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’utilisation exclusive du PNH peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 2) Dans le cadre des modèles du traitement des maladies neurodégénératives, l’objectif à terme est de tester de nouvelles molécules, thérapies innovantes sur un modèle animal ayant des caractéristiques génétiques, immunologiques similaires associes a des comportements moteurs et cognitifs qui ne peuvent être étudiés sur des lignées cellulaires (humaines ou animales) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales, ici la somesthésie, et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques avec un nombre estimé de 4 études par an, comprenant 5 animaux maximum par étude, soit un total de 100 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 5 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Dans le cadre d’une étude de validation de composé innovant, la chirurgie peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Les animaux sont hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.)." Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. L’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assuré par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. Enfin, ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité́ SBEA de l’établissement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le primate non-humain a été retenu. Premièrement les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique. Deuxièmement le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du singe et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure. Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Stade Adulte afin de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Une ou deux injections dans l'abdomen, puis une goutte du même produit déposée dans le nez dix jours plus tard : 84 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. L'inflammation pulmonaire ainsi déclenchée peut s'accompagner de difficultés respiratoires. Le projet cherche à comprendre comment certaines cellules immunitaires pénètrent dans les poumons, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Sur la réduction, le porteur écrit avoir calculé le nombre d'animaux "au plus juste", sans donner ni méthode ni effectif par groupe.

Objectifs

Les pathologies inflammatoires pulmonaires ont pour caractéristique commune une inflammation pulmonaire qui perturbe les échanges gazeux lors de la respiration.Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituer une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet a pour but d'étudier la façon dont certaines de ces cellules immunitaires (les cellules lymphoïdes innées) pénètrent dans les poumons.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur la façon les cellules du système immunitaire infiltrent les poumons. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer comment l'infiltration des cellules lymphoïdes innées participe aux maladies inflammatoires respiratoires. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans ces pathologies.

Procédures

Les souris subiront, selon la procédure, soit une soit deux injections dans l'abdomen des produits les sensibilisant. 10 jours après les souris devront absorber par le nez une goutte des mêmes produits.

Impact sur les animaux

L'injection dans l'abdomen peut causer une douleur légère de courte durée. Le développement de l'inflammation pulmonaire pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Les résultats précédemment publié par la communauté scientifique nous a confirmé qu'il n’existe pas d'autre possibilités que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre dans la réponse immunitaire. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire au plus juste afin de limiter le nombre de souris.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'humain pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait changer nos résultats.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée par excision ou par brûlure sous anesthésie, puis pansée quatre fois en quatorze jours, avec mesure des dimensions et de la température de la plaie, prélèvement des exsudats et trois prises de sang. L'enjeu déclaré est de montrer que des actifs cicatrisants font mieux que le Bepanthen, une crème déjà vendue en pharmacie. Le porteur écrit que le recours à l'animal est "inévitable" et qualifie l'expérimentation animale de "jalon nécessaire" dans la conception de nouveaux médicaments.

Objectifs

Le but de la cicatrisation des plaies à la suite d’une blessure est de former un tissu régénéré dont la fonctionnalité et l’aspect visuel sont aussi proches que possible de la peau d’origine. La cicatrisation des plaies, en tant que processus biologique normal dans le corps humain, est obtenue par le biais de quatre phases précisément et hautement programmées. Pour qu’une plaie guérisse avec succès, les quatre phases doivent se dérouler dans le bon ordre et dans le bon délai. De nombreux facteurs peuvent interférer avec une ou plusieurs phases de ce processus, provoquant ainsi une altération de la cicatrisation des plaies. Pour remédier à l’altération du processus de cicatrisation, des dispositifs médicaux tels que l’application de crèmes cicatrisantes ou de pansements ont été développés. Ces dispositifs accélèrent la cicatrisation, soulagent la douleur induite par l’inflammation, aident à prévenir les infections et améliorent la régénération tissulaire. L’objectif de notre projet est de montrer l’efficacité accrue de nouveau composés, utilisable sous forme de crème ou en association avec un pansement, sur la cicatrisation cutanée suite à des blessures.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité de nos actifs cicatrisants par rapport au contrôle positif (Bepanthen) largement utilisé pour améliorer la cicatrisation.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Génération des plaies : Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. Une chirurgie de 10 minutes pour chaque souris. 2) Administration des dispositifs médicaux : Sous anesthésie générale et locale avec utilisation d’analgésiques. 4 fois car l’expérimentation dure 14 jours (Tous les 3,5 jours). Durée de l’administration des dispositifs médicaux, 10 minutes pour chaque souris. 3) Mesures des dimensions et de la température des plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie, en même temps que l’application des dispositifs médicaux. Durée 2 minutes pour chaque souris. 4) Prélèvements des exsudats de plaies (Tous les 3,5 jours, soit 4 fois) : Sous anesthésie et analgésie. Durée 3 minutes pour chaque souris. 5) Prélèvements sanguins (Tous les 7 jours) : 3 fois, durée 2 min, pour chaque souris sous anesthésie générale. Toutes les souris (120) du projet sont concernés par cette procédure.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de l’application de plaies est la douleur induite par l’inflammation. Ces plaies pourraient aussi induire une déshydratation des animaux. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances telles que l'anémie, l’apparition d’hématomes et une déshydratation des souris.

Devenir

À la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leurs organes à des fins d'analyses d'immunohistochimie, de biochimie et de biologie moléculaire. Ces analyses approfondies sont essentielles pour élucider les mécanismes thérapeutiques de nos agents cicatrisants.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’actifs cicatrisants au niveau systémique. Actuellement, aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Après l’intervention chirurgicale, des mesures seront prises pour éviter un isolement complet, telles que l'utilisation d'adhésifs pour protéger les plaies et maintenir les animaux en groupe. L'anesthésie et l'analgésie seront systématiquement administrées lors de la génération des plaies et tout au long de l'expérimentation. Nous accordons une attention particulière à la gestion de l'inflammation induite par les plaies. En cas de dépassement des critères définis, comme par exemple une perte de poids dépassant 10-15% de leur poids initial, des mesures seront prises pour restaurer leur santé et pour éviter toute souffrance inutile. Pour atténuer l'angoisse des animaux qui seraient isolés en post-opératoire, nous enrichirons leur environnement en leur fournissant davantage de coton, d'igloos et de roues d'exercice, et nous les nourrirons avec une gelée alimentaire enrichie en nutriments. Cette alimentation spécifique sera également distribuée après chaque prise de sang. Un suivi attentif des animaux sera effectué en conformité avec les recommandations du comité de suivi du bien-être animal de notre établissement.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de l’efficacité thérapeutique des produits que nous avons développés. Ce projet a pour but de démontrer que des actifs cicatrisants sont efficaces dans deux modèles de cicatrisation (Excision/Brûlure). Les rongeurs, et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines, ainsi des modèles de cicatrisation utilisant des souris ont été développés. Ces modèles induisent une plaie sur la peau de l’animal. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques des processus de cicatrisation observable chez l’humain (Inflammation, synthèse d’exsudats, ré-épithélialisation des lésions cutanées, etc…). Les animaux seront utilisés à l'âge adulte car nos actifs cicatrisants seront prescrits chez l'adulte et que ce stade de développement est plus stable d'un point de vue physiologique.

Mettre au point un protocole de chirurgie cardiaque que la communauté scientifique pourra réutiliser suppose d'abord de blesser des cœurs. 610 poissons-zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie l'ablation ou la brûlure par le froid d'environ 20 % de l'extrémité du muscle cardiaque, reste deux minutes hors de l'eau, puis récupère six heures en isolement, une partie passant cinq séances d'échographie sous anesthésie jusqu'à soixante jours. Le porteur affirme qu'aucune alternative au poisson-zèbre n'existe pour ce travail, dont le produit final est un protocole standardisé mis à disposition des laboratoires.

Objectifs

Depuis la première démonstration de la capacité de régénération complète du cœur du poisson-zèbre suite à une lésion en 2002, bien que largement utilisé par la communauté scientifique s’intéressant à ce phénomène, le protocole de lésion mis-en œuvre sur le poisson-zèbre n’a que très peu évolué. En parallèle, durant ces 20 dernières années, les connaissances sur la perception de la douleur chez les téléostéens, poissons dits « évolués », ainsi que la prise de conscience éthique de la nécessité de prise en charge de la souffrance animale ont grandement avancé. Il apparaît aujourd’hui impératif d’apporter un protocole robuste, éthiquement compatible avec les obligations réglementaires, apportant une réelle prise en charge de la douleur lors des interventions chirurgicales via l’utilisation systématique d’analgésiques, mais également en apportant un environnement et un contrôle des paramètres post-opératoires efficaces, favorisant une récupération optimale des poissons-zèbres. Il est également essentiel de démontrer que la mise en œuvre de ce protocole amélioré ne rentre pas en interaction avec les mécanismes de la régénération cardiaque déjà démontrés. Enfin, il existe une variabilité potentiellement importante entre les individus d’un même lot expérimental, et également lors de la réalisation des chirurgies, dépendantes du manipulateur. L’utilisation de l’échographie/photo-acoustique à haute résolution, une technique non-invasive de caractérisation de la fonction cardiaque, permettra d’évaluer cette variabilité et d’identifier des individus non-compatibles avec la procédure (par exemple avec un défaut cardiaque), tout en évaluant l’étendue du dommage cardiaque initial. Afin d’avoir accès à un équipement de haute technologie, le projet sera réalisé sur 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Bien que largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre des recherches sur la régénération cardiaque depuis plus de 20 ans, il n’existe pas aujourd’hui de protocole standardisé de chirurgie prenant en compte la gestion de la douleur chez le poisson-zèbre. Notre projet aboutira à la mise à disposition de la communauté d’un protocole standardisé de chirurgie cardiaque, proposant une prise en charge efficace de la douleur via l’utilisation d’un cocktail analgésique / anesthésique, et la mise en place de mesures de raffinement (environnement per- et post-opératoire) adaptée à une récupération optimale des animaux après la chirurgie. En complément, la mise au point du suivi de la régénération cardiaque par échographie permettra de diminuer le nombre de poissons nécessaires dans les protocoles de lésion du myocarde. Chaque poisson pourra être suivi individuellement au cours du temps nécessaire à la régénération et être son propre contrôle, améliorant également la robustesse des résultats.

Procédures

Les interventions chirurgicales seront réalisées dans l'EU1 : une simulation d’infarctus cardiaque sera réalisée chirurgicalement sur les poissons, en effectuant une lésion mécanique ou par le froid d'une petite partie de l'extrémité du muscle cardiaque.; une chirurgie sous anesthésie générale de 2 minutes sera réalisée. Au sein de l'EU2, une partie des poissons-zèbres passera en échographie cardiaque sous anesthésie générale : 5 séances de 5 à 10 minutes maximum maintenus immobiles dans un bain d’anesthésique.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie, le poissons seront maintenus hors de l’eau pour une durée de 2 minutes. Une ablation de l’extrémité du muscle du cœur de l’ordre de 20% ou bien une lésion par le froid de cette même zone sera réalisée. La zone d’incision présentant une implantation musculaire faible chez le poisson et une absence de plexus osseux, la douleur perçue pendant et après la procédure chirurgicale est estimée modérée. La faible hémorragie consécutive à la résection peut entrainer une légère hypoxie durant les quelques minutes suivant le réveil. Les animaux seront socialement isolés durant la période de récupération (6 heures). Les animaux suivis par échographie seront anesthésiés 5 fois à J-1, J7, J15, J30 et J60 afin suivre la régénération du cœur.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des histologies et evaluer la régénaration cardiaque.

Remplacement

Les mécanismes de régénération du myocarde sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles s’attache aux modèles mammifères qui ne présentent malheureusement pas cette capacité régénérative. Il n’y a pas aujourd’hui à notre connaissance d’alternative à l’utilisation de poisson-zèbre pour la mise en œuvre de ce projet.

Réduction

L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédents travaux publiés qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d’animaux nécessaires. La procédure « échographie » au cours de laquelle chaque individu sera son propre contrôle permet d’autant plus la réduction du nombre d’animaux nécessaires au projet. Les études longitudinales en échographie vont permettre de s'assurer de la qualité des interventions chirurgicales, la dynamique de régénération de chaque poisson pouvant être évaluée avec des tests paramétriques aux différents étapes des procédures.

Raffinement

L’objectif principal de notre projet est d’apporter des éléments majeurs de raffinement au protocole de chirurgie cardiaque communément mis-en-œuvre chez le poisson-zèbre, et au suivi post-opératoire. Une attention maximale sera portée aux conditions environnementales (maitrise de l’asepsie, des paramètres physico-chimique), à la prise en charge efficace de la douleur post-opératoire, et l’observation des animaux avec la mise en place d’une grille de score étudiée spécifiquement pour ce projet, nous permettant d’estimer l’atteinte d’un point limite de manière précoce, et nous permettant de mettre en œuvre les mesures adaptées à la prise en charge de la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress au maximum, le transport des animaux entre les 2 sites sera réalisé dans une boite en polystyrène afin de maintenir une température optimale pendant les 450m séparant les 2 établissements. Les poissons seront placés individuellement dans des contenants hermétiques et adaptés au transport. Le transport n’excédera pas 10min.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre est devenu au cours des dernières décennies l’espèce-modèle aquatique de prédilection en recherche scientifique, représentant désormais plus 5% des animaux utilisés à des fins scientifique en Europe. Le génome du poisson-zèbre présente 70% d’homologie avec le génome humain (estimé à 85% pour les gènes impliqué dans des pathologies), le poisson-zèbre dispose également d’une capacité originale de régénération cardiaque, ces éléments en font un modèle idéal pour la compréhension des mécanismes à l’œuvre dans la régénération cardiaque, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Les poissons utilisés seront tous des adultes matures sexuellement, âgés de 6 à 18 mois. Les mécanismes de régénération ne peuvent être étudiés que sur des animaux ayant terminé leur développement.

Une dissection sous-muqueuse étendue de l'œsophage, d'une à deux heures sous anesthésie générale, provoque chez chaque animal le rétrécissement que l'étude veut ensuite prévenir. 12 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des points limites destinés à "éviter toute douleur", tout en décrivant des perforations et des hémorragies possibles jusqu'à trois jours après l'intervention, des douleurs, des saignements digestifs, de l'apathie et de la fièvre, puis entre le dixième et le vingtième jour une sténose entraînant vomissements et réduction de l'ingestion. Avant la mise à mort, justifiée par le prélèvement de l'œsophage et par le soulagement des souffrances liées à la sténose, l'animal encore anesthésié pourra servir à la formation d'internes en chirurgie dans le cadre d'un autre projet.

Objectifs

La dissection sous-muqueuse endoscopique (DSM) est une technique largement utilisée pour le traitement des lésions précancéreuses et des cancers superficiels de l'œsophage. Grâce à cette technique, il est possible de traiter ces lésions de manière peu invasive, ce qui permet de préserver l'organe. Ces dernières années, des lésions de plus en plus étendues, , peuvent être enlevées de manière curative par DSM. Cependant, après la DSM, le rétrécissement de l'œsophage (sténose) est une complication majeure (jusqu’à 90 % des cas). Les sténoses post-DSM sont connues pour être complexes et sont plus difficiles à traiter. Cela entraîne une diminution de la qualité de vie pour les patients. Compte tenu de l'utilisation croissante de la DSM, y compris pour les grandes lésions complexes de l'œsophage, la sténose après la DSM est un problème de plus en plus important, avec un impact social et sociétal significatif. Ces dernières années, de nombreuses techniques de prévention et de traitement ont été étudiées, allant de la dilatation répétée à l'utilisation d'endoprothèses métalliques auto-expansives, en passant par l'injection locale de diverses substances médicamenteuses. À ce jour, aucun traitement efficace et durable n'a été identifié pour ce problème important. Nous pensons que l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) après une DSM œsophagienne extensive peut prévenir la sténose. Le plasma riche en plaquettes est préparé à partir d’un prélèvement sanguin du patient, centrifugé, ce qui permet d’augmenter sa concentration en plaquettes. Le PRP est connu pour son effet de stimulation tissulaire et peuvent permettre une cicatrisation plus efficace et plus rapide de la muqueuse, tout en réduisant l'inflammation, empêchant le développement de la fibrose et donc de la sténose. Cette étude préliminaire de faisabilité sera faite sur 12 animaux, qui seront tirés au sort avec un groupe qui sera traité préventivement avec du PRP et un groupe de contrôle.

Bénéfices attendus

Avec cette étude de preuve de concept, nous souhaitons démontrer l'efficacité de l'utilisation du PRP dans la prévention primaire de la formation de sténoses iatrogènes après une DSM oesophagienne extensive. En outre, nous voulons étudier la sécurité associée à l'utilisation du PRP. Nous utilisons également cette étude pour étudier l'application de la PRP dans le traitement secondaire de la sténose de l'oesophage après une DSM extensive. Enfin, cette étude nous permet de mieux comprendre le processus cellulaire/biologique de la cicatrisation et l'effet du PRP sur celui-ci grâce à l'évaluation histopathologique, afin d'identifier éventuellement d'autres objectifs de traitement. L'application ultérieure de ces connaissances à l'homme aura un impact considérable sur l'amélioration du traitement des patients souffrant de maladies de l'oesophage (sténoses peptiques, sténoses anastomotiques).

Procédures

1 dissection sous muqueuse sous anesthésie générale : 1 à 2 h + Deux contrôles par gastroscopie et radiographie : 30 à 60 min

Impact sur les animaux

Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront nourris avec un régime liquide dès le début de l'étude (nuisance légère) avec une habituation préalable 3 jours avant. Les jours -1, +13 et +27 (24 heures avant la procédure endoscopique), ils seront maintenus à jeûn pour la nourriture, ayant uniquement de l'eau enrichie de miel (nuisance modérée). Les animaux peuvent être stressés (nuisance légère) pendant l’induction d’anesthésie liée à chaque phase opératoire. Après la dissection de l'œsophage, le cochon peut ressentir un frottement ou une légère sensation de brûlure dans l'œsophage lorsqu'il mange (nuisance modérée). Une complication inattendue telle qu'une perforation (tardive) ou une hémorragie tardive peut survenir jusqu'à trois jours après l'intervention. L'animal peut présenter des douleurs, des saignements digestifs, une apathie et de la fièvre (nuisance modérée-sévère en fonction de la gravité de la complication). Entre le 10e et le 20e jour, il est possible qu'un animal développe une sténose de l'œsophage. Cela peut entraîner une réduction de l'ingestion et des vomissements (nuisance modérée pouvant devenir sévère sans prise en charge/action). Les complications possibles du traitement par dilatation et injection du PRP sont une perforation/inflammation locale ; ce risque est estimé faible (nuisance modérée). L'animal pourra alors montrer de l'apathie, de la douleur et de la fièvre.

Devenir

À la fin de la période d'étude, tous les cochons seront euthanasiés. Premièrement, pour les soulager des éventuelles souffrances dues au développement de la sténose ; deuxièmement, pour pouvoir prélever l'oesophage en vue d'un examen histopathologique. Néanmoins, avant l'euthanasie, et si cela est possible, l'animal toujours sous analgésie et anesthésie générale, pourra être utilisé à des fins de formation des internes de chirurgie dans le cadre d'un autre projet autorisé. L'animal est ensuite euthanasié.

Remplacement

L'effet du PRP est médié par la libération de multiples facteurs de croissance anabolisants, de protéines bioactives et de molécules d'adhésion cellulaire, qui sont libérées dans la circulation sanguine. L'effet de ce processus après une DSM extensive ne peut être reproduit et étudié dans des modèles ex vivo ou des invertébrés. Le porc étant le plus semblable à l'homme, il constitue le modèle approprié pour ce type d'étude.

Réduction

Sur la base d'un calcul de puissance statistique, un minimum de 10 animaux testés est nécessaire pour évaluer le résultat avec une certitude statistique. Si un animal d'étude est exclu de l'étude en raison d'une circonstance imprévue, il sera remplacé par un autre animal d'étude afin de garantir la puissance du résultat de l'étude. Pour cette raison, nous fournirons 2 cochons supplémentaires qui pourront servir de remplaçants. L'étude était puissante sur le critère d'évaluation principal, à savoir la prévention des sténoses. Étant donné que nous croyons fermement au pouvoir du PRP, les animaux qui développent une sténose au cours de l'étude sont également traités secondairement avec du PRP, ce que nous décrirons comme un résultat secondaire. De cette manière, cette étude nous permet d'explorer deux indications et de maximiser l'utilisation des animaux de laboratoire.

Raffinement

Les cochons sont gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum. De l’enrichissement est mis à leur disposition dans leur enclos afin qu'ils puissent s'exprimer et se comporter normalement. Les cochons ne restent pas seuls dans leur enclos, ce qui permet de ne pas les isoler et d'avoir des interactions normales avec les autres animaux. Au cours de notre étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress des animaux et veiller à ce que leur bien-être soit préservé autant que possible. Toutes les interventions seront effectuées sous anesthésie générale, leur apport nutritionnel sera contrôlé et les animaux seront suivis de près du début à la fin par le personnel soignant, le vétérinaire et l'équipe de recherche. Pour anticiper les nuisances liées à une éventuelle sténose, et assurer une bonne ingestion le plus longtemps possible, une attention particulière sera portée au niveau de la nourriture : les animaux seront nourris avec un régime liquide dès le début de l'étude et pendant toute sa durée. Pour éviter le stress lié à cette alimentation liquide, trois jours sont prévus pour établir une transition progressive vers l'alimentation liquide, de J-4 à J-2. Si nécessaire, un plan d'analgésie est mis en place. Après l'intervention, les cochons se réveilleront dans un environnement calme pour éviter toute agitation. Un traitement par inhibiteur de la pompe à protons sera mis en place comme chez l'homme pour limiter la gêne éventuelle liée à l'intervention. Au vu de la surveillance pluriquotidienne, le développement d'une sténose sera remarqué à un stade précoce et nous nous attendons à une présentation avec des symptômes modérés. Si une sténose est présente, elle sera traitée comme décrit dans le protocole. Un protocole de suivi et de prise en charge de la douleur par un système de scoring et des traitements analgésiques systématiques et symptomatiques sera mis en place. Des points limites avec évaluation des paramètres de suivi seront utilisés afin d’éviter toute douleur.

Choix des espèces

Les porcs sont considérés comme le meilleur modèle d'étude car ils sont connus pour avoir des dimensions similaires à celles des humains. De plus, nous pouvons nous appuyer sur des recherches antérieures menées sur le développement de la formation de sténoses après la DSM dans l'oesophage chez le porc. Un poids d’au moins 45 kg est nécessaire pour avoir un diamètre oesophagien suffisant pour pouvoir réaliser la procédure de DSM qui aboutira au processus de sténose. À l'âge de 4 à 6 mois, ils devraient peser entre 40 et 50 kg. À ce stade de développement le diamètre oesophagien est suffisant pour pouvoir réaliser la procédure de DSM qui aboutira au processus de sténose.