Recherche appliquée

Tués parce que le retrait de la canule implantée dans leur crâne provoquerait des lésions incompatibles avec une vie dans de bonnes conditions, 1 000 rats et 500 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale de une heure à une heure trente pour l'implantation de canules en profondeur, puis six à sept heures relié par des câbles à une seringue et à un collecteur, dans un espace restreint, séance qui peut être répétée une seconde fois à deux ou trois jours d'intervalle. Des candidats médicaments leur sont administrés en bolus, en une fois ou chaque jour pendant une semaine, pour mesurer leur effet sur des neurotransmetteurs. Le porteur indique que les modèles alternatifs développés au laboratoire ne mesurent que certaines molécules sécrétées par des cultures de neurones, et que le choix entre rat et souris dépend aussi de la quantité de molécule disponible.

Objectifs

La concentration de molécules (e.g. neurotransmetteurs) spécifiques dans des régions cérébrales précises est modifiée dans certaines maladies psychiatriques ou neurologiques ; étudier ces facteurs peut informer sur l'efficacité de candidats traitements dans le traitement de ces pathologies, ou sur leur mécanisme d'action. Le projet consiste à évaluer l'effet de nouveaux candidats médicaments sur l'activité métabolique cérébrale chez le rongeur. La méthode de microdialyse cérébrale peut être réalisée sur animal anesthésié ou vigile. Cette méthode consiste à recueillir et à analyser des substances chimiques présentes dans le milieu extra cellulaire interstitiel du parenchyme cérébral. Outre l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapies, la microdialyse cérébrale peut aider à la compréhension d’événements neurologiques.

Bénéfices attendus

La recherche de nouvelles thérapies est indispensable pour améliorer les conditions ou l’espérance de vie des patients atteints de maladies psychiatriques ou neurologiques. La technique de microdialyse est une méthode translationnelle qui permet d'évaluer l'effet de nouvelles substances pharmacologiques sur les concentrations de substrats cérébraux telles que des neurotransmetteurs ou des acides aminés sans avoir recours à une extraction tissulaire. Cette méthode permet de mieux comprendre les relations entre neurotransmission et modifications comportementales chez le rongeur.

Procédures

La collecte de dialysats cérébraux nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (entre 1h et 1h30) afin de placer la ou les canules dans des régions cérébrales situées en profondeur. La phase de collecte des échantillons est en général de l'ordre de 6 à 7 h (animal connecté en permanence pour la collecte de dialysat) et peut être répétée maximum 2 fois à intervalles de 2 à 3 jours. Les animaux recevront des administrations de candidats traitements en général par bolus (durée de l'ordre de la seconde), de manière aigue ou chronique (une administration par jour sur une durée de 7 jours maximum).

Impact sur les animaux

La phase d'anesthésie peut induire un léger stress. Des douleurs peuvent être liées à l'implantation du ou des guides canules au niveau cérébral (ces animaux seront placés sous traitement analgésique qui sera adapté sous contrôle vétérinaire). Des problèmes de cicatrisation peuvent également être observés, notamment si l'animal se gratte. Les phases d'administration et de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, notamment du fait de la contention de ce dernier. Il n'est pas attendu d'effets néfastes suite à l'administration d'un candidat médicament. Pendant le test, les animaux sont reliés à une seringue et un collecteur de fraction par l'intermédiaire de câbles/cathéters en polyéthylène, sur plusieurs heures dans un espace restreint. Les cables sont légers mais limitent le déplacement de l'animal pendant toute la durée du test ce qui peut générer un stress chez l'animal.

Devenir

Les rongeurs seront mis à mort à la fin des expériences car des prélèvements de tissu (cerveau) seront réalisés, pour dosage de biomarqueurs ou pour vérifier le placement de la sonde. De même, le retrait du guide canule implanté pourrait entraîner des lésions non compatibles avec une vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, des modèles alternatifs ont été développés au laboratoire mais ne permettent de mesurer que la présence de certaines molécules secrétées par des cultures primaires de neurones. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi d'évaluer l'effet de substances pharmacologiques sur l'activité métabolique cérébrale.

Réduction

Les analyses statistiques seront affinées pour utiliser le nombre minimum d'animaux. Les tests qui seront appliqués ne sont pas encore complétement définis car la technique d'analyse des dialysats est toujours en cours de développement (bien que la partie in vivo chez le rongeur soit mise en place). Des études de variabilité et d'homogénéité seront réalisées pour déterminer les analyses les plus pertinentes (paramétriques ou non paramétriques). Des essais ont été réalisés pour tester le même animal à deux reprises et limiter le nombre d'animaux utilisés. Cependant, les animaux ne pourront pas être utilisés plus de deux fois pour garantir une diffusion homogène des molécules entre deux tests. Des prélèvements de sang ou d'organes peuvent être également ajoutés à la fin des expériences pour compléter les analyses et éviter l'utilisation d'autres animaux.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Pour la phase chirugicale, une anesthésie sera associée à un protocole d'analgésie. Un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement oculaire. Une solution analgésique est également injectée au niveau de la zone à inciser au niveau du crâne. L’animal sera placé sur une couverture chauffante au début de l’anesthésie jusqu'à reprise de la marche pour maintenir sa température corporelle. Les animaux sont maintenus en 2 par 2 pendant toute la durée de l'étude (excepté la phase de test), avec un environnement enrichi dans les cages d'hébergement. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure.. Dans certains modèles, l'activité métabolique permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle.

Choix des espèces

Les études de mesure de l'activité métabolique cérébrale sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalables réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Les voies métaboliques peuvent également être différentes entre les espèces, les spécificités de chaque candidat médicament peuvent amener à choisir une espèce plutôt que l'autre. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

Pour tester des nanoparticules activées par laser contre le cancer, 7 200 poissons zèbres sont utilisés au stade larvaire dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque larve reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie à deux jours de développement, puis une injection de nanoparticules dans la veine caudale à quatre jours, avant une heure d'anesthésie pour l'observation au microscope confocal et une irradiation laser. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer des œdèmes et modifier la mobilité. Toutes les larves sont tuées à l'issue, les expériences devant être arrêtées avant le stade de larve autonome capable de s'alimenter, et l'effectif de 7 200 individus n'est rapporté à aucun calcul.

Objectifs

Actuellement, les campagnes de dépistage ainsi que les progrès technologiques permettent de détecter des cancers de petite taille. Cependant, les traitements proposés ne sont pas toujours adaptés. Dans ce contexte, la thérapie focalisée utilisant des nanoparticules biodégradables, ciblées et par un laser infrarouge peut répondre à ce besoin médical. En effet cette stratégie thérapeutique peu invasive peut permettre de visualiser et traiter un cancer solide de petite taille tel que le rétinoblastome ou le cancer de la prostate. Ce projet concerne le développement de nanoparticules pour une thérapie combinée anti-cancéreuse. Ces nanoparticules peuvent être activées par illumination laser et libérer des facteurs permettant d’inhiber l’expression de protéines impliquées dans le développement de cancer. L'efficacité de ces nanoparticules sera testée sur le modèle de poisson-zèbre.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous pourrons rapidement définir, grâce à l'utilisation du modèle du poisson-zèbre, les critères nécessaires pour obtenir la meilleure efficacité de ces nanoparticules permettant à la fois le diagnostic et la thérapie: cibler les cellules du cancer et administrer des médicaments anticancéreux. Notre projet pluridisciplinaire correspond à des approches transversales basées sur la synthèse de matériaux et procédés nouveaux et innovants tels que les nanoparticules capables de réaliser de l'imagerie, la thérapie sous irradiation à deux photons et l’inhibition de gène. A long terme, cette première étape préclinique permet de poser les bases pour une application en thérapie humaine.

Procédures

Tout d’abord, des cellules cancéreuses seront injectées sous anesthésie au stade embryonnaire, durée de l'injection 3 minutes. Par la suite, les nanoparticules seront injectées également sous anesthésie chez les mêmes larves à 4 jours de développement par la veine caudale, durée de l'injection 5 minutes. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules sera observé par microscopie confocale, ce qui implique une anesthésie d'une heure pour la prise d'image et un réveil juste après l'observation. L’efficacité sera évaluée par la résorption des cellules cancéreuses après activation des nanoparticules par rayonnement laser. Bien entendu, l’efficacité de ces nanoparticules sera préalablement établie sur des cellules en culture. Aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux vivants.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont liés à une croissance exagérée des cellules tumorales, ce qui pourrait induire des œdèmes et un changement de mobilité. Cependant, le suivi quotidien des animaux entre 2 et 5 jours de développement permettra de stopper les expériences dans ce cas avant le stade de larves autonomes et la prise alimentaire.

Devenir

A la fin de chaque procédure (irradiation biphotonique et observation au microscope), toutes les larves seront mises à mort et utilisées pour l'analyse des cellules tumorales et des tissus.

Remplacement

Les premières expérimentations sur des cellules tumorales en culture ont d’ores et déjà été réalisées. Les nanoparticules activées par rayonnement laser ont montré une efficacité intéressante en thérapie ciblée. Cependant, les expériences sur cellules en culture ne permettent pas de de suivre le devenir des nanoparticules (bio-distribution) et l’efficacité de ciblage tumoral. Pour cela l’expérimentation animale in vivo, en l’occurrence le poisson-zèbre, devient une étape indispensable et non remplaçable.

Réduction

Avant toute expérimentation avec les larves de poisson-zèbre, des mises au point des conditions expérimentales seront réalisées sur des cellules en culture afin de choisir les nanoparticules qui ne présentent pas de toxicité et qui ont une meilleure activité. Ainsi, nous pourrons choisir les nanoparticules les plus efficientes et réduire par conséquent le nombre de larves à utiliser.

Raffinement

Un suivi quotidien est réalisé dès le début de la procédure et les points limites surveillés plusieurs fois par jour. Dès l'apparition de ces points limites, l'expérience sera interrompue et les larves seront mises à mort avec une surdose d'anesthésique pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle poisson zèbre présente des avantages en cancérologie ; robustes, reproductibles, faciles d’utilisation et peu coûteux. Il constitue un modèle de choix puisqu’il offre la possibilité de criblage de composés dans un organisme vertébré entier, dont la pertinence est incomparable avec des modèles in vitro de cultures cellulaires. Les animaux utilisés pour ces travaux seront des embryons de poisson-zèbre au cours des premiers stades de leur développement (2 jours post-fécondation) afin de permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans impliquer de phénomène de rejet et suivre la formation des tumeurs et leur traitement après injection des nanoparticules ciblant les cellules tumorales. Ces expérimentations peuvent être menées jusqu'à 15 jours post-fécondation. La procédure décrite implique des stades précoces de larves de poisson-zèbre, permettant ainsi de faire des premières expérimentations précliniques.

Injectées de cellules cancéreuses sous la peau puis laissées sans aucun traitement antalgique, 520 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en plus une injection intraveineuse de lymphocytes et sept injections dans l'abdomen sur trois semaines, sur animal vigile, et sont tuées quand la tumeur atteint le volume limite fixé. L'objet est de savoir si le métabolisme des lipides modifie les propriétés antitumorales de certains lymphocytes. Le porteur détaille par ailleurs le transfert des souris par tunnel plutôt que par la queue et l'enrichissement des cages, tout en écrivant que l'analgésie est écartée pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire.

Objectifs

Le projet vise à déterminer l’importance des lipides dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse conduite par les lymphocytes CD4+. Ces cellules immunitaires ont des singularités permettant de les classer en différents sous-types de lymphocytes CD4+ avec des fonctions favorisant ou prévenant la progression tumorale. Les signaux environnementaux comme la disponibilité de nutriments conditionnent la présence d’un sous-type de lymphocytes plutôt qu’un autre modulant le devenir de la tumeur. Dans ce projet, nous souhaitons caractériser le rôle des lipides dans l’engagement des lymphocytes CD4+ vers un sous-type particulier et dans l’amélioration de ses propriétés anti-tumorales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait de comprendre le rôle des lipides dans l’induction d’un sous-type de lymphocytes CD4+ particulier et dans la régulation de la croissance tumorale. La thérapie cellulaire par transfert adoptif de lymphocytes T est une approche prometteuse dans la lutte contre le cancer et manipuler le métabolisme des lipides pourrait améliorer les performances anti-tumorales de ces cellules. Par ailleurs, le développement d’agents anti-cancéreux modulant l’action de ces lipides pourrait être également bénéfique aux patients atteints de cancer.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection rapide (moins de 20 secondes) en sous-cutanée de cellules cancéreuses sous anesthésie et une unique injection intraveineuse sur souris vigiles d’une durée inférieure à 20 secondes. Les injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront réalisées tous les 3 jours pendant 3 semaines (7 injections par souris).

Impact sur les animaux

La transplantation en sous-cutanée des cellules cancéreuses se fera sur souris anesthésiée pour prévenir toute douleur. Pour éviter une accumulation d’anesthésie, les injections IP répétées (avec au maximum 7 injections sur 20 jours) et intraveineuse des lymphocytes sont réalisées sur souris vigiles entrainant une douleur modérée de courte durée ; un stress léger chez les souris vigiles peut également apparaître au moment de la contention. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée sans incidence douloureuse.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront et traitées pendant deux semaines. Elles seront suivies quotidiennement et maintenues en cage à l’animalerie. Elles seront ensuite mises à mort car le volume tumoral aura atteint le point limite.

Remplacement

L’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet du métabolisme des acides gras sur les propriétés anti-tumorales de lymphocytes. Les données in vitro suggèrent des modifications phénotypiques partielles et incertaines sur une action anti-tumorale amplifiée. Ces lymphocytes ont la capacité d’interagir avec différents acteurs cellulaires intra-tumoraux et d’autres tissus pouvant moduler la croissance tumorale. Les modèles actuels d’organoïdes ne miment que partiellement l’ensemble de ces interactions cellulaires et les caractéristiques physico-chimiques du microenvironnement tumoral. L'utilisation de modèles murins de cancer est donc nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal vivant pour suivre la progression tumorale. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer. Enfin, le modèle animal d’invalidation du gène d’intérêt n’est disponible que chez la souris.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages contiennent un enrichissement structural du milieu permettant la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les souris seront soumises à une habituation à la contention pour minimiser le stress lors de l’injection intraveineuse. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui réduit le stress des animaux. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront néanmoins anesthésiées pour la transplantation sous-cutanée des cellules cancéreuses pour éviter toute douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 520 souris femelles seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettra la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Des souris âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.

2 304 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection de cellules tumorales dans le crâne, puis deux injections par jour pendant trois jours, une irradiation de la tête de cinq minutes, deux injections par jour pendant cinq jours encore, une résection de tumeur de vingt minutes et un gavage cinq fois par semaine pendant trois semaines. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que la croissance de la tumeur cérébrale finit par provoquer une perte de poids et une dégradation de l'état général, et que les gestes sur animal vigile causent du stress. Toutes sont tuées pour le prélèvement du cerveau, le bénéfice annoncé se limitant à "mieux comprendre" comment les cellules tumorales utilisent l'énergie environnante.

Objectifs

Chez l’Homme, le glioblastome est un cancer décelé tardivement et de ce fait nécessite une résection du centre de la tumeur solide, suivie d'une chimiothérapie couplée à de la radiothérapie. Cependant ces traitements induisent une résistance des cellules tumorales restantes, entrainant dans 90 pour cent des cas une récidive du cancer et la mort du patient. Nous cherchons à savoir quels sont les facteurs impliqués dans l’évolution de cette pathologie afin de développer de nouvelles thérapies qui vont prolonger la vie des patients. Pour celà, nous allons mettre en place une procédure expérimentale à partir des premières cibles identifiées dans nos précédentes études sur modèles cellulaires.

Bénéfices attendus

Ces études vont permettre de mieux comprendre les processus par lesquels les cellules tumorales utilisent l’énergie environnante pour proliférer et ainsi pouvoir agir sur ce levier afin d’inhiber la croissance de la tumeur.

Procédures

- Injection intra-craniale de cellules tumorales : 1 fois, environ 10 minutes. - Traitements par chimio- et radiothérapie : 2 injections par jour pendant 3 jours puis une irradiation de la tête (5 minutes) puis 2 injections par jour pendant 5 jours. - Résection de la tumeur : 1 fois, environ 20 minutes. - Prélèvements sanguins (2 à 3 fois au total) : 10 secondes sur animal endormi. - Gavage : 10 secondes, 5 fois par semaine pendant 3 semaines, -injection du substrat pour imagerie : 1 injection intra-péritonéale sur animal vigile, chaque semaine, 5 secondes.

Impact sur les animaux

Les actes de chirurgie et les prélèvements induisent du stress et de la douleur pour l’animal. La croissance de la tumeur induit à terme une perte de poids et une dégradation de l’état général de l’animal. Les traitements par gavage ou injection sur souris vigiles induisent du stress.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à l'issue de l'expérience, les cerveaux seront prélevés afin d’étudier les effets des traitements. L’analyse des tissus cérébraux est nécessaire pour étudier l’implication des potentielles cibles thérapeutiques identifiées pendant nos études.

Remplacement

Nos recherches sont basées sur des résultats validés sur modèles cellulaires mais les hypothèses doivent être vérifiées sur l’animal car le cerveau est un organe très complexe et aucun modèle non-animal n’est suffisamment représentatif pour être complet.

Réduction

Des analyses multiples sur les mêmes échantillons seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux. Plusieurs paramètres seront analysés sur le même animal. Le suivi longitudinal de la croissance tumorale sur l’ensemble des animaux permet également de réduire le nombre total utilisé. Le nombre d’animaux par groupe expérimental est calculé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons un modèle de souris où les tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cages collectives avec enrichissement pour améliorer leur bien-être. Une anesthésie et des analgésiques adaptés seront utilisés pour minimiser la douleur (avant, pendant et après des procédures invasives). Les conditions d'hébergement seront vérifiées quotidiennement ; une grille de score et des points limites adaptés sont mis en place pour évaluer la douleur des animaux et les réponses à y apporter.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines (jeunes adultes) pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

4 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements plusieurs fois par semaine pendant une à douze semaines selon les groupes, avec des prélèvements de sang répétés, dans des modèles d'hépatite auto-immune. Les effets décrits incluent une perte de poids, un pelage très sale, une peau froide au toucher, des muqueuses pâles, des plaies suintantes, des lésions d'automutilation et des masses ulcérées, description qui s'accorde mal avec la souffrance seulement modérée déclarée. Le porteur ajoute que ce passage par la souris sert à réduire le nombre de formats d'anticorps, de doses et de voies d'injection qui seront ensuite testés sur des primates.

Objectifs

Les maladies auto-immunes dont les maladies inflammatoires n’ayant pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester des nouvelles cibles thérapeutiques et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies auto-immunes sont caractérisées par une activation exacerbée des cellules T, des cellules B et des myeloïdes ainsi que la production d’anticorps auto-réactifs, donc d’anticorps dirigés contre le soi. Les traitements actuellement utilisés tels que les anti-inflammatoires stéroïdien ou non stéroïdien, ainsi que les anti-TNF induisent des effets secondaires. L’utilisation par exemple du rituximab qui est un anticorps anti-CD20 induit une élimination des cellules B de façon transitoire. Ce traitement ne cible pas les cellules plasmatiques sécréteurs d’auto-anticorps à l’origine en partie des maladies auto-immunes. L’objectif étant de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait les cellules T/B et les myeloides impliquées la chronicité de l’inflammation. Le traitement habituel de l'hépatite auto-immune consiste à administrer des corticoïdes et des immunosuppresseurs. Mais cela entraine de nombreux effets secondaires d'ou la nécessité de trouver des alternatives.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements pour les patients atteints de maladies inflammatoires sont des corticoïdes, des immunosuppresseurs ou, depuis quelques années, de l’immunothérapie utilisant principalement les anti-TNFa. Les corticoïdes induisent néanmoins de nombreux effets secondaires surtout sur le long terme tels qu’une prise de poids, de l’hypertension, une intolérance aux sucres, des troubles endocrinien entre autres. Les immunosuppresseurs, eux, inhibent totalement le système immunitaire et rendent sensibles les patients à de nombreuses maladies virales ou autres. Pour finir, les immunothérapies sont utilisées lorsque les patients ne répondent pas/plus aux immunosuppresseurs ou corticoïdes. Elles utilisent principalement des anti-TNFa mais aussi des anti-intégrines et permettent de ralentir l’évolution de la pathologie. Néanmoins, environ 60% des patients échappent de façon primaire ou secondaire à ces traitements. Cela a aussi été observé chez l’animal avec environ 50% d’échappement primaire ou secondaire chez la souris. De plus, ils induisent eux aussi quelques effets secondaires puisqu’ils inhibent une partie du système immunitaire, rendant le sujet fragile aux maladies du quotidien. L’utilisation par exemple du rituximab qui est un anticorps anti-CD20 induit une élimination des cellules B de façon transitoire. Ce traitement ne cible pas les cellules plasmatiques sécréteurs d’auto-anticorps à l’origine en partie des maladies auto-immunes. L’objectif étant de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait les B et/ou les cellules T pathogéniques. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou réduction des cellules pathogéniques. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.

Procédures

Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés plusieurs fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (X semaine) seront variables en nombre de semaines (Procédure 1 : 3 semaines, Procédure 2: 5 semaines ; Procédure 3 ; 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.

Impact sur les animaux

Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important c'est à dire une modification du comportement et de l'apparence physique. Lorsque le score clinique est elevée, il y a une apparence physique altérée (poils très sales, coloration anormale de la peau, froid au toucher, pâleur des muqueuses, plaie de l’œil, lésion sévère (automutilation, plaie suintante, masse ulcérée…) et un comportement modifié (agitation/torpeur, impossibilité de mouvement, dos cambré/voussure du dos).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés une fois l'expérience terminée ou les points limites atteints. L'injection peut entrainer une perte de poids, un changement dans le comportement chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même euthanasiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat.

Remplacement

Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. En effet, les molécules sont testées in vitro afin de déterminer si elles ont la capacité d'induire l'effet attendue c'est à dire, la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, le blocage de molécules activatrices sur différents types cellulaires, ou l'activation de molécules inhibitrices afin de réguler l'inhibition des cellules cibles. Les modèles d'hépatites qui reproduisent au mieux ce qui se produit chez l'homme ont été décrit chez la souris.

Réduction

Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests non paramétriques pour comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible.

Raffinement

Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux seront manipulés pour s’habituer aux expérimentateurs mais le protocole ne commencera qu’une semaine après l’arrivée. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des molécules leur permettant d’atténuer la douleur et elles seront mélangés dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.

Choix des espèces

Des formats d’anticorps ont été validés in vitro. Les animaux sont indispensables car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 8 semaines.

Porteuses de la même mutation du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne qu'un enfant diagnostiqué en 2022, 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse du foie, du cœur, du tissu adipeux et du cerveau. Les mesures in vivo se limitent à un électrocardiogramme sans pose d'électrode et à une prise de tension à la queue, vingt-cinq minutes par animal et par jour pendant trois jours, la contention se faisant dans l'obscurité à 30 degrés. Les études in vitro et in silico de cette mutation montrent un effet modéré, ce qui fait douter, de l'aveu du porteur, que les troubles du patient lui soient imputables, et il conclut pourtant que l'analyse in vivo est "irremplaçable". Quarante souris sont ainsi tuées pour éclairer le cas d'un seul patient, avec un bénéfice annoncé au conditionnel, orienter son traitement et anticiper d'éventuels troubles futurs.

Objectifs

Des cliniciens ont découvert en 2022, chez un enfant de sexe masculin montrant un fort retard de croissance, une mutation génétique altérant le récepteur alpha de l’hormone thyroïdienne. Il s’agit du cinquantième cas décrit pour cette maladie génétique rare encore mal connue. Etant donné son jeune âge, on peut anticiper la survenue future chez ce patient de troubles typiques des autres patients atteints de cette maladie : difficultés cognitives, troubles cardiovasculaires, désordres métaboliques, malformations du squelette. Toutefois, des études in silico et in vitro de cette mutation particulière montrent qu’elle a un effet modéré sur la réponse des cellules à l’hormone thyroïdienne. On peut donc douter du fait que les troubles pathologiques observés soient imputables à la mutation découverte chez ce patient. Ce projet vise à analyser les fonctions physiologiques d’une souche de souris porteuse de la même mutation génétique. L’objectif du projet est de définir en quoi les souris porteuses de la mutation diffèrent des souris témoins. En substituant à un seul patient un groupe de souris porteur de la même mutation, nous pourrons établir un lien de cause à effet entre la présence de la mutation génétique et les pathologies observées. Une grande partie de l’analyse sera effectuée post mortem et consistera à analyser l’expression des gènes dans les organes sensibles à la maladie génétique en question : foie, cœur, tissu adipeux, cerveau. Une partie de l’analyse sera consacrée à l’évaluation de possibles troubles du système cardiovasculaire chez les mêmes souris, qui ne peuvent être analysés qu’in vivo. Cette dernière partie fait l’objet de la présente demande.

Bénéfices attendus

- Si la présence de la mutation découverte chez le patient humain a des conséquences pathologiques chez la souris, on pourra en déduire que la mutation est bien à l’origine des symptomes observés chez le patient étudié. Cette information sera utile pour orienter le traitement de ce patient. - L’analyse des souris inclut une analyse post mortem approfondie des organes connus pour être sensibles à cette maladie génétique. Elle renseignera sur les mécanismes pathologiques impliqués, et permettra d’anticiper l’apparition future de troubles physiologiques chez le patient d’origine. Elle fournira éventuellement des données immédiatement transposables pour le traitement du patient, en particulier en cas d’apparition d’altérations du système cardiovasculaire. - Une fois validée en tant que modèle pertinent de la maladie génétique, la souche de souris porteuse de la mutation permettra de tester des approches thérapeutiques innovantes immédiatement transposables aux patients porteurs de mutations identiques ou similaires.

Procédures

Un électrocardiogramme non invasif (souris vigile se déplaçant librement, sans pose d'électrode) et une mesure de la tension artérielle de la queue seront effectuées à l’age adulte pendant 3 jours consécutifs (25 minutes/souris et par jour).

Impact sur les animaux

Les souris subiront un stress mineur lié à un environnement nouveau (nouvelle animalerie, placement dans le dispositif de mesure de l'électrocardiogramme). Elles subiront également un stress aigu temporaire lié à la contention, dans l'obscurité et à 30°C, nécessaire à la mesure de la tension artérielle.

Devenir

Les animaux seront tous utilisés pour des analyses post mortem, ciblées sur des organes connus pour être sensibles aux mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne.

Remplacement

Les études in vitro déjà réalisées ne permettent pas de prédire les conséquences de la mutation sur le système cardiovasculaire, mais l’étude de la littérature sur le sujet laisse présager d’un effet modéré. D’une manière plus générale, la complexité du système cardiovasculaire n’est actuellement pas modélisée de manière satisfaisante dans des systèmes de culture cellulaire ou in silico. Par ailleurs, l’observation isolée des rares cas humains ne permet pas d'identifier la cause des symptômes observés. Pour ces raisons, l’analyse in vivo est donc irremplaçable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé par comparaison avec des études préalables, effectuées sur des modèles proches. Le nombre de 10 animaux par groupe permet d’effectuer une analyse statistique dont la puissance est compatible avec la détection d’un effet mineur de la mutation.

Raffinement

Les souris seront introduites dans l’animalerie trois semaines avant l’analyse, pour leur donner le temps de s’habituer à leur environnement et réduire leur stress. Elles seront également soumises à deux séances d’habituation aux dispositifs expérimentaux, afin de réduire le niveau de stress associé aux mesures. La méthode d’analyse des fonctions cardiovasculaires prévue est non invasive et ne nécessite pas d’anesthésie. Elle est la plus pertinente par rapport à la pratique clinique humaine.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifères chez laquelle nous sommes capables de réaliser aisément des modifications génétiques. La pertinence des modèles non mammifères pour l’étude des mutations des récepteurs de l'hormone thyroïdienne est incertaine. L'étude sera réalisée sur des adultes âgés de 12-15 semaines. Le système cardiovasculaire évolue lentement au cours de la croissance post-natale. A l’âge choisi, les paramètres sont stabilisés. Les mesures publiées pour d’autres mutations du récepteur alpha de l'hormone thyroïdienne ont été effectuées à cet âge, ce qui favorisera les comparaisons.

Opérés du fémur pendant une trentaine de minutes pour qu'un trou soit percé dans le condyle puis comblé par un matériau à tester, 20 rats passent ensuite au scanner sous anesthésie à trois, quinze, trente et soixante jours, dans un établissement différent de celui de la chirurgie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. Le porteur indique que l'opération provoque de la douleur et des difficultés à se déplacer pendant les premiers jours, avec un risque de rupture des sutures, et que les anesthésies répétées causent des désagréments. Au soixantième jour, tous sont tués pour que l'os régénéré et ses vaisseaux soient prélevés et analysés.

Objectifs

Les pertes d'os sont un problème en chirurgie dentaire et orthopédique. Souvent, on utilise des morceaux d'os du patient pour réparer ces pertes, mais cela nécessite une autre opération et peut causer des problèmes à l'endroit où on a pris l'os. C'est pourquoi il est important de développer de nouveaux matériaux (biomatériaux) pour aider à régénérer les os. Pour tester ces nouveaux matériaux, nous utilisons un modèle animal que nous maitrisons bien. On crée un petit trou dans l'os de la patte d'un rat pour voir si le matériau implanté peut aider l'os à se régénérer. Les animaux auront la chirurgie dans un premier établissement et le suivi de la régénération par imagerie sera fait dans un autre établissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement pour la régénération osseuse) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vu d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les rats subiront une opération chirurgicale au niveau de l'os de la patte arrière (condyle fémoral), où nous créerons un petit trou et celui-ci sera comblé avec un nouveau matériau à tester. Chaque opération prend environ 30 minutes par rat (la chirurgie sera faite dans un premier établissement). Après l'opération, nous utiliserons un scanner pour suivre la régénération de l'os à différents moments : après 3, 15, 30, et 60 jours. Pendant les scanners, les rats seront anesthésiés, pour qu'ils restent endormis et immobiles. Chaque séance de scanner dure entre 20 et 30 minutes (les imageries scanner seront fait dans un deuxième établissement).

Impact sur les animaux

Les rats auront une opération sur un os de la patte (avec un petit trou) qui ne nécessitera pas de fixer l'os avec des outils internes. Cependant, cette opération causera de la douleur et les rats auront du mal à bouger pendant les premiers jours après l'opération. Il y a aussi un risque que les points de suture se rompent. De plus, les anesthésies répétées lors des scanners peuvent causer des désagréments.

Devenir

Les rats seront euthanasiés 60 jours après l'implantation pour qu'on puisse prélever et analyser leurs os régénéré. Cela nous permettra de vérifier la qualité de la régénération osseuse, notamment la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans l'os régénéré.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche en laboratoire (in vitro) permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent être d'abord testés chez le petit animal (modèle du rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants, ils devront être testés sur un plus gros animal, permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi par imagerie scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur le processus de régénération osseuse, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Le nombre d'animaux nécessaire a été determiné en utilisant un outils statistique.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'antalgique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite endormis. Après la chirurgie, chaque rat se réveille sur un tapis chauffant, dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur 5 jours après opération pour surveiller les points limite (vérification de la démarche de l'animal, infection du site opératoire, comportement...). Un seul des points limites terminaux suivants entrainera un euthanasie de l'animal: L'animal ne se déplace pas, présence de rougeurs et de pus au niveau du site opéré ainsi qu'une réaction violente ou très faible réaction. Les expérimentateurs maîtrisent la manipulation et les injections nécessaires. Le personnel de l'animalerie est compétent pour assurer le bien-être et le suivi des rats au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de la litière en copeaux de peupliers et des jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant au niveau du condyle fémoral. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. Des rats adultes de 10 semaines et d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

Une chirurgie de vingt minutes pour injecter un composé entre les méninges, puis jusqu'à six prélèvements de sang en vingt-quatre heures : 3 480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque tous tués à l'issue pour prélever sang, liquide céphalorachidien et organes. L'objet réel est d'évaluer où se distribuent des nanoparticules lipidiques et des exosomes chargés de candidats médicaments neurologiques, dans le cadre de la recherche pharmaceutique. Seuls 174 rats, ceux qui n'auront finalement reçu aucun produit, pourront être réutilisés dans un autre projet. Le porteur retient le rat parce que la voie intrathécale employée en clinique humaine y est praticable et parce que les études réglementaires ultérieures utilisent la même espèce, et affirme qu'un modèle animal reste "nécessaire" pour juger l'interaction avec l'"organisme entier".

Objectifs

Il existe de nombreuses pathologies pour lesquelles les besoins thérapeutiques ne sont pas satisfaits. Une proportion très importante de ces pathologies atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, souvent rares, sont très invalidantes voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En 2021, près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. L’objectif principal de la R&D Pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies neurologiques. Il est nécessaire que les candidats médicaments atteignent les cellules du système nerveux en passant la barrière hématoencéphalique Ce passage étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par injection dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. De nouvelles formulations utilisant des nanoparticules lipidiques (LNP) ou des exosomes (vésicules protéiques naturellement excrétées par les cellules qui constituent une voie de communication intercellulaire) ont été développées pour améliorer la biodistribution dans les structures cérébrales, l’activité et/ou la tolérabilité de ces candidats médicaments. A terme, il pourrait même être possible d’administrer les candidats médicaments dans ces formulations par d’autres voies d’administration (intraveineuse ou intranasale), moins contraignantes que la voie IT utilisée en clinique pour l’administration de candidats médicaments seuls. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité et la biodistribution de différents LNP et exosomes dans un premier temps seuls, puis chargés avec le candidat médicament, après administration intrathécale, intraveineuse ou intranasale chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Après sélection par screening in vitro des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, l’utilisation du rat est nécessaire afin d’évaluer la distribution, l’activité et la tolérabilité du candidat médicament dans la formulation sur un organisme complet et des structures cérébrales plus faciles à discerner

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies neurologiques et notamment neurodégénératives sont administrés par voie intrathécale, permettant de s’affranchir du passage de la barrière hémato-encéphalique et ainsi permettre l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient notamment dans le cadre d’administrations répétées Le bénéfice apporté par ce projet est ainsi d’optimiser les formulations de ces candidats médicaments pour améliorer leur activité, leur distribution et de diminuer leur toxicité. Le fait de charger ces candidats médicaments dans des nanoparticules lipidiques ou des exosomes peut aussi permettre de protéger la molécule de la dégradation (permettant de réduire le nombre d’administrations et donc la contrainte à la fois pour l’animal mais aussi pour l’Homme) et d’évaluer l’utilisation de voies d’administration autres que la voie intrathécale (moins de contraintes pour l’animal et pour l’Homme dans les études ultérieures).

Procédures

- A l’administration (unique) sur tous les animaux de composés par voie parentérale nécessitant une contention courte ou le passage préalable dans une enceinte thermorégulée ou par abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique ; - A l’administration sous cutanée d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 1 fois maximum dans l’étude - A un prélèvement unique de sang réalisés sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale (unique dans l’étude) : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (Degré de sévérité modéré) • Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection (moins de 10sec) de la douleur (degré de sévérité modéré) • Administrations des formulations ou d’analgésique par voie intranasale intrapéritonéale, intramusculaire, ou sous-cutanée : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10s) de la douleur. (Degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modéré) - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalorachidien pour analyse et d’organes pour lecture de distribution ou d’activité. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple -ou s’il s’agissait d’animaux finalement non inclus.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer de nouvelles formulations innovantes pour l’administration de composés à visée neurologique. Si les modèles in vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont de plus en plus prometteurs, ils restent incomplets pour juger de la distribution, de l’activité et de la tolérabilité des candidats médicaments ainsi que de l’interaction avec l’organisme entier, le système immunitaire ainsi qu’avec les éléments figurés du sang. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les formulations à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.

Réduction

Une sélection des formulations les plus prometteuses est réalisée à l’aide de screening vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 5 individus/groupe selon la procédure) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Ces études permettent d’évaluer l’activité et la distribution du candidat médicament dans ces formulations et ainsi d’affiner le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Selon la procédure, un nombre important d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire à chaque procédure de ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte 40µL minimum) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volume sanguin (volémie) physiologiques et le bien-être animal.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Selon la clinique observée, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peut être mise en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’injection par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire. Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont manipulés et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’isolement), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision, une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse).

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle - La voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des formulations et des futures candidats médicaments sont plus faciles à étudier chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Des molécules fournies par des clients, dont le porteur écrit ignorer la nature et les effets secondaires possibles, sont testées ici sur un modèle de règles douloureuses. 500 souris et 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des hormones pendant dix jours et jusqu'à vingt administrations de composés, puis une injection d'ocytocine qui provoque des crampes abdominales, avant d'être placés seuls en cage pendant une heure pour que ces crampes soient comptées. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer les dix animaux par groupe et s'en remet à son expérience du modèle.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des rongeurs dans un modèle de dysménorrhée primaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysménorrhée.

Procédures

Les animaux vont avoir des administrations d’hormones et de candidats médicaments pendant 10 jours maximum. Ces gestes sont très rapides (moins d’une minute, 10 administrations pour les hormones et jusqu’à 20 administrations pour les composés médicaments) et seront réalisés par du personnel qualifié pour diminuer le stress des animaux. Une administration d’ocytocine (30 sec, 1 fois) provoquera des crampes abdominales et les animaux seront observés dans des cages individuelles pendant 1 heure pour compter ces dernières et observer le comportement de l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, les animaux vont ressentir les mêmes symptômes que la pathologie induite à savoir des crampes abdominales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des tissus seront prélevés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysménorrhées. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe au début de l’expérimentation mais de par notre forte expérience en expérimentation animale et dans ce modèle, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. A la fin de l’expérience, des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence statistique entre les groupes.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, nestlet…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure…Pour les procédures sous anesthésie, l’animal sera placé sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un symptôme d’un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez le rat et la souris. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.