Recherche appliquée
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Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur cérébrale humaine implantée dans la boîte crânienne au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie et des transports en voiture entre trois établissements : 307 souris subissent ce protocole, 60 tuées sans réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Cent d'entre elles sont gardées vivantes pour la formation du personnel, les autres tuées aux points limites ou en fin de projet. L'objectif déclaré est de mettre au point un modèle pour tester la réoxygénation des tumeurs et leur sensibilisation à la radiothérapie, bénéfice que le porteur formule au conditionnel en deux lignes. Ce troisième volet reprend le même effectif de 307 souris que le volet précédent, publié le même jour, sans que la répartition entre les deux soit expliquée.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Etablissement d’un modèle d’injection intracérébroventriculaire chez le souriceau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
320 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, 128 anesthésiés puis tués avant tout réveil et 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À deux ou trois jours de vie, chacun reçoit une injection dans les ventricules cérébraux, d'un colorant ou d'un fragment d'ADN ou d'ARN synthétique, sous anesthésie par hypothermie ou par gaz, les deux méthodes étant comparées entre elles. Une partie est suivie jusqu'à trente jours après l'injection, puis autopsiée pour prélever le cerveau, le foie et les reins. Le porteur conclut qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour évaluer une thérapie contre les épilepsies infantiles, au motif que des neurones en culture ne présentent pas de crise spontanée, alors que ce projet ne mesure aucun effet thérapeutique.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie des neurones dont le fonctionnement anormal entraîne des décharges électriques brusques et excessives – la crise épileptique. L’épilepsie infantile est une maladie rare mais sérieuse qui apparaît habituellement entre l’âge de 3 mois et 6 ans. Comme pour les adultes, le traitement des épilepsies chez l’enfant est principalement médicamenteux. Toutefois, plus d’un tiers des épilepsies infantiles sont résistants aux approches médicamenteuses existantes, d’où la nécessité d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques notamment pour éviter le recours à des interventions chirurgicales lourdes et risquées. Dans ce sens, de nombreux essais d'administration intra-cérébrale sont en cours, à la fois au stade préclinique et clinique, et suscitent déjà d'importants espoirs thérapeutiques à long terme. L'objectif de ce projet est de développer et valider un modèle permettant d'administrer un colorant non toxique ou une molécule thérapeutique spécifique (un fragment court d'ADN ou d'ARN synthétique) dans des zones précises du cerveau de souris nouveau-nées. Deux techniques d'anesthésie seront comparées : 1) L'anesthésie par hypothermie et 2) L'anesthésie gazeuse par inhalation. Cette comparaison vise à déterminer la méthode optimale pour anesthésier efficacement des souris nouveau-nées, minimiser la durée de l'anesthésie, l'inconfort de l'animal et le temps de séparation entre le souriceau et sa mère, tout en ciblant efficacement la zone cérébrale d'intérêt. La distribution de la substance injectée sera évaluée immédiatement après l'injection pour vérifier le succès du geste (procédure 1), et 7 jours plus tard pour s'assurer de la bonne récupération des souriceaux et comparer les 2 méthodes d’anesthésie (procédure 2). La validation du modèle sera assurée par l’évaluation d’une injection de la molécule thérapeutique avec la méthode anesthésique la plus appropriée. Les souriceaux seront suivis attentivement pendant 30 jours maximum (procédure 3). Une analyse macroscopique des organes post-mortem sera également réalisée au moment de l’euthanasie et le foie, les reins seront prélevés afin de réaliser des analyses sur ces tissus. La validation du modèle sera fonction de l’ensemble des résultats et des analyses. Le modèle établi servira in fine, au travers d’une demande ultérieure d’autorisation de projet, à évaluer l’effet thérapeutique à plus long terme d’une injection d’oligonucléotides dans le cerveau de souris épileptique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra d’informer sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité de la molécule thérapeutique au niveau du système nerveux central en développement et au niveau périphérique (ii) les modifications physiologiques induites par l’injection intracérébrale de la molécule thérapeutique (iii) le mode d’anesthésie à pratiquer sur des souriceaux afin de minimiser leur inconfort, maximiser leur survie et obtenir des résultats aussi reproductibles que possible.
Procédures
L'injection d'un colorant non toxique ou d’une molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du souriceau sera réalisée sur animal anesthésié et analgésié. L'administration sera unique et durera moins de 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront évalués avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente à la molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) à injecter. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un comportement anormal de l’animal, une perte de poids.
Devenir
Devenir des souriceaux utilisés dans les 3 procédures : A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et minutieusement autopsiés. Les organes d'intérêts, dont les structures cérébrales, seront prélevés. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
Les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels présentent plusieurs limites, p.ex., l’étude de cellules neuronales en culture ne permet pas d’observer de crise épileptique spontanée ; la vascularisation cérébrale et les connexions entre neurones de différentes régions cérébrales étant absentes. De plus, ces études ne renseignent pas sur les effets d’agent thérapeutique sur un ensemble de cellules différentes, en particulier ici dans le cerveau. Le système nerveux central comme celui du nouveau-né est en perpétuel remodelage assuré par des régulations impliquant différents types cellulaires. Le développement cérébral et les mécanismes complexes de communication entre cellules ne peuvent donc être mimés par un simple modèle de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’une thérapie dans le traitement des épilepsies infantiles et ses effets éventuels sur le développement cérébral. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Les souriceaux des deux sexes seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux agents thérapeutiques, 8 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse des premiers résultats avant chaque protocole, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les souriceaux seront stabulés avec leur mère respective. Pour les souriceaux gardés jusqu’à 30 jours après injection, une fois sevrés, ils seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement adapté n’induisant pas de stress et en veillant à séparer les mâles des femelles. Des mesures spécifiques de gestion de la douleur éventuelle occasionnée par l’injection intracérébrale seront prises pour éviter toute souffrance inutile et prolongée des animaux : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilitée d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des protocoles anesthésiques (par hypothermie ou à l’isoflurane) et analgésiques appropriés dès l’apparition de premiers signes cliniques. Une observation minutieuse des souriceaux sera effectuée durant la phase de réveil sur couverture chauffante puis lors du replacement dans la cage avec la mère. Les souriceaux seront également minutieusement observés 10min, 3h et 24h après le réveil puis 2x par semaine jusqu’à la fin des procédures. Ce score a été déterminé spécialement pour ce projet en se basant sur la littérature existante. Les souriceaux seront également pesés le jour de l’injection, puis tous les 2 jours jusqu’à 10 jours post-injection et enfin 2 fois par semaine jusqu’à 30 jours post-injection. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites à l’appui des grilles du bien-être animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère possède des organes et type cellulaires identiques à ceux de l’homme. De plus, la souris présente un patrimoine génétique et des caractéristiques comportementales, physiopathologiques et réponses tissulaires très proches de celles observables chez l'homme, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les pathologies humaines notamment celles du système nerveux. La souris étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme. Par ailleurs, les structures cérébrales et nerveuses peuvent parfaitement être prélevées à partir de cet animal. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Les souriceaux seront soumis à une injection directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du cerveau à l'âge de 2 ou 3 jours—une période critique du développement cérébral. Ce stade précoce est optimal pour cette procédure, offrant un accès facilité aux ventricules cérébraux. La procédure n°3, en particulier, permettra d’évaluer les conséquences de l'injection d'oligonucléotides sur un cerveau en pleine maturation. À un mois post-injection, le cerveau murin aura atteint environ 90% de sa taille adulte, avec la majorité des neurones déjà formés et en cours de différenciation. Cette approche permettra d'analyser l'impact global de l'intervention sur les structures et fonctions cérébrales, fournissant ainsi des données cruciales sur la sécurité potentielle de l’élément injecté dans le contexte du développement neurologique. Par ailleurs, l'utilisation de la fenêtre 2-3 jours pour les expériences, plutôt qu'un jour fixe, présente plusieurs avantages cruciaux pour l'optimisation du protocole expérimental et le respect des principes éthiques en recherche animale. Cette approche permet une gestion efficace des ressources en s'adaptant aux naissances survenant hors des horaires de travail habituels, réduisant ainsi le gaspillage d'animaux. Elle prend en compte la variabilité biologique naturelle entre les portées, permettant d'ajuster les protocoles d'anesthésie selon le poids et le développement de chaque souriceau.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
La souche de souris retenue est choisie pour accepter l'implantation de lignées de glioblastome humain à l'intérieur de la boîte crânienne. 307 souris y sont utilisées, 60 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Après une chirurgie crânienne de trente minutes, chacune passe par des séances hebdomadaires d'imagerie sous anesthésie générale pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance, la croissance de la tumeur pouvant entraîner une perte de poids marquée et des effets neurologiques. Cent souris sont gardées vivantes au terme du projet, pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) ) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2 (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Gavées quotidiennement pendant toute la durée du protocole, placées en contention pour la mesure de leur composition corporelle puis isolées quarante-huit heures en calorimétrie, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées à l'issue pour étudier la motilité de leur intestin à l'aide de capteurs isotoniques. L'objectif déclaré est d'identifier des molécules contre le diabète de type 2, un diabète que les expérimentateurs induisent eux-mêmes chez des souris saines par des régimes riches en graisses dont ils reconnaissent qu'ils peuvent altérer les fonctions hépatique et rénale. Le porteur indique que dix souris par groupe suffisent à garantir la reproductibilité, sans préciser comment ce chiffre aboutit à 1 200 animaux.
Objectifs
L'objectif central de ce projet est d'identifier et de caractériser des molécules bioactives potentielles pour la prévention et le traitement du diabète de type 2 (DT2). Le DT2 est une maladie métabolique chronique qui affecte des millions de personnes dans le monde et présente une sérieuse menace pour la santé publique. Nos recherches visent à découvrir de nouvelles molécules ou à optimiser celles déjà identifiées, qui pourraient offrir des alternatives thérapeutiques plus efficaces et plus sûres que les traitements actuels, tels que la metformine, le liraglutide, sulfamides... Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La recherche sur le diabète de type 2 (DT2) a un impact direct sur des millions de vies à travers le monde. Ce projet, en se concentrant sur l'identification de nouvelles molécules bioactives, présente plusieurs bénéfices potentiels qui pourraient considérablement améliorer la prise en charge de cette maladie grâce à de nouveaux traitements potentiellement plus efficaces : en identifiant des molécules bioactives inédites, nous pourrions découvrir des traitements qui surpassent en efficacité ceux actuellement disponibles. Ces molécules pourraient cibler la maladie sous des angles différents, offrant des thérapies plus adaptées à divers sous-groupes de patients. Notre recherche pourrait éclairer de nouvelles voies métaboliques ou biologiques associées au DT2, offrant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques pour le futur. Solutions naturelles et durables : Si des molécules bioactives sont identifiées à partir d'extraits naturels, cela pourrait conduire à des thérapies plus durables et éco-responsables, tout en valorisant la biodiversité et les savoirs traditionnels associés. En somme, les retombées de ce projet pourraient transformer la manière dont le DT2 est traité et compris, offrant de l'espoir à des millions de personnes et contribuant à une meilleure santé publique globale.
Procédures
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : - pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Le traitement est administré quotidiennement pendant la durée du protocole (30 secondes par gavage) et une fois pour le test oral de tolérance au glucose. De plus, les prélèvements de glycémie pendant 2 h sont effectués une seule fois en fin de protocole (10 secondes par prélèvement sanguin) pour le test de tolérance orale au glucose ou au xylose. Enfin, les animaux subissent une contention dans un espace restreint (mesure de la composition corporelle pendant 30 secondes) et l’isolement de 48h pour la mesure de la calorimétrie indirecte. Dans ce projet, la procédure 1 est entièrement réalisée au sein de l'établissement EU1. La procédure 2 est en partie réalisée au sein de l'établissement établissement EU1 et ce n'est que la dernière semaine que les animaux sont amenés dans l'établissement EU2 pour la colorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : -Procédures : Pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Ce geste ainsi que la contention des animaux lors du gavage peut induire du stress. De plus ,des prélèvements sang à la veine caudale des animaux sont nécessaires, ce qui pourrait causer du stress aux animaux. -Effets secondaires des molécules : Comme pour tout nouveau composé, il existe un risque d'effets secondaires inattendus qui peuvent affecter le bien-être des animaux. - Risque de maladie : L'induction du diabète de type 2 chez des animaux sains pour les besoins de la recherche pourrait affecter leur état de santé général et leur bien-être. En effet, les régimes riches en graisses peuvent induire des altérations de la fonction hépatique et rénale par exemple. - Transport des animaux : les animaux pourraient être perturbé par ce changement d'environnement.
Devenir
Les souris issues des procédures 1 ou 2 sont ensuite euthanasiées afin de d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques.
Remplacement
Pour identifier des acteurs moléculaires capables de ralentir les contractions duodénales, afin de restaurer l’activité du cerveau et à terme l’utilisation périphérique de glucose, nous avons besoin d'individus vivants sous différents régimes mimant les conditions physiopathologiques (diabète & obésité) où nos molécules pourraient avoir un effet thérapeutique. De plus notre projet implique la communication inter-organes, il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Toutefois, lorsque nous avons de nombreuses molécules à tester, nous avons développé un modèle de test d'efficacité in vitro sur cellules épithéliales intestinales afin de sélectionner un nombre limité de candidats efficaces à tester in vivo pour limiter le recours à l'expériementation animale.
Réduction
Le modèle utilisé dans ce protocole est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres métaboliques. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris sur ce modèle depuis plus de 5 ans ainsi que nos études bibliographiques minutieuses, nous permettent de limiter le nombre d’animaux. Par groupe, 10 souris sont nécessaires afin de garantir la reproductibilité des résultats tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Nous mettons mis en oeuvre diverses stratégies : - Formation et suivi des compétences de notre équipe afin de s'assurer que tous ceux qui s'occupent des animaux ou effectuent des expérimentations soient correctement formés pour le faire de manière éthique et humaine. - Hébergement enrichi : toutes les cages ont un igloo et 2 carrés de ouates pour fournir un environnement qui encourage les comportements naturels et permet aux animaux de vivre dans un environnement aussi proche que possible de leur habitat naturel. - Surveillance régulière : le bien-être et le comportement des animaux est vérifé quotidiennement (observation des animaux, de leur comportement, du pelage, de leur déplacement et comportement exploratoire, verification des croquettes et du biberon) et les souris sont pesées une à 2 fois par semaine pour vérifier que les points limite ne sont pas atteints. La surveillance et l'observation quotidienne minutieuse des animaux est effectuée avec une grille de scoring avec des critères précis et une fiche de suivi du bien-être animal à remplir par l'expérimentateur dès qu'une anomalie est observée. Les animaux sont hébergés dans une zootechnie agréée dans laquelle une structure du Suivi du Bien-Etre Animal est mis en place. Pour le transport entre les 2 établissements, une procédure décrit précisément toute la marche à suivre et les précautions à prendre pour limiter au maximum le stress des animaux. Les points limites de ce projet sont : Perte de poids atteignant 20%, altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), vocalisation, tremblements…, posture anormale (voûté ou déséquilibré pour soulager une zone douloureuse, démarche anormale, diminution des mouvements, prostration), troubles urinaires ou hyperglycémie trop importante qui engendredrait une souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris réagit très bien aux régimes alimentaires déséquilibrés, modèle expérimental de référence dans l'étude du métabolisme glucidique. De plus notre équipe maîtrise l’utilisation de ces différents modèles chez la souris, nous permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux et d’assurer le suivi des souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.
Etude du devenir plasmatique de la mycotoxine Enniatine B1 chez le rat
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
13 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue au motif qu'une exposition à la toxine les rendrait inutilisables ailleurs. Chacun reçoit la mycotoxine Enniatine B1 une fois par gavage et une à deux fois par voie intraveineuse, puis subit quatorze prélèvements sanguins à l'état vigile, répartis sur deux journées séparées par une période de récupération. Les rats arrivent déjà cathétérisés par le fournisseur, ce que le porteur compte au titre du raffinement, et leurs concentrations plasmatiques doivent alimenter un modèle mathématique censé prédire l'exposition humaine à cette toxine des céréales. Le porteur annonce vouloir "établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale", et écrit dans le même document que l'étude chez le rat reste "indispensable" pour extrapoler des cellules à un "organisme entier".
Objectifs
L’Enniatine B1 est une mycotoxine émergente secrétée par les microchampignons du genre Fusarium. La toxicité potentielle a été étudiée mais il n’a pas été reporté de cas d’intoxication humaine cependant, du fait de son activité ionophorique, elle interagit avec plusieurs composants cellulaires avec des effets notamment au niveau du foie, estomac, intestin et reins, en cas d'exposition chronique. Elle fait partie des enniatines les plus prévalentes dans les céréales et les produits céréaliers. Ainsi, cette prévalence implique une exposition, aussi bien des humains que des animaux se nourrissant de céréales, de manière quotidienne à de faible doses. Par ailleurs, le manque de données sur la toxicologie de l’Enniatine B1 entraine l'impossibilité de fixer des seuils de sécurité pour la santé. Le projet vise à combler certaines lacunes sur ces données et à établir pour cette toxine des méthodes alternatives à l'expérimentation animale. Il s’articule autour de plusieurs axes, tout d’abord des expérimentations sur des cellules hépatiques humaines et de rats, dans le but d’étudier le devenir de la toxine. La seconde étape consiste en l’extrapolation par modélisation mathématique pour passer de l’échelle cellulaire à l’animal. Les données de cette extrapolation requièrent une validation par une étude des concentrations sanguines de l’Enniatine B1 chez le rat, sachant qu’on ne peut envisager des études chez l’humain dans un contexte toxicologique. Les données sanguines chez le rat serviront au développement d’un modèle mathématique qui reflète le fonctionnement de l’organisme chez le rat. La comparaison des concentrations toxiques pour les cellules hépatiques et les concentrations sanguines prédites par le modèle mathématique permettra de déterminer les seuils toxiques pour l’humain.
Bénéfices attendus
Le projet vise à combler les lacunes sur le devenir et la toxicité de l’Enniatine B1 pour le foie. Les données serviront au développement d’un modèle mathématique validé par l'étude chez le rat pour comparaison avec les études sur cellules. Ce modèle servira d’outil de prédiction de l’exposition humaine par estimation des concentrations plasmatiques et permettra de simuler des scenarios d’exposition. Les concentrations plasmatiques prédites par le modèle, comparées aux concentrations toxiques pour le foie permettront de déterminer le risque pour la santé humaine à long terme.
Procédures
Chaque rat, recevra l’Enniatine B1 une fois par voie orale et une ou deux fois par voie intraveineuse. Le gavage réalisé une fois pour chaque rat dure moins de 2 minutes. L’injection en intra veineuse se fait en 15 secondes. Chaque rat à l’état vigile subira au total 14 prélèvements de 0.1 mL de sang et durant moins de 30 s. Les échéances pour chaque rat seront réparties sur 2 jours séparés par une période de récupération comme suit : - 7 prélèvements à 0 min (avant l’injection), 10 min, 20 min, 45 min, 2h, 6h et 24h ou bien 5 min, 15 min, 30 min, 1h, 4h, 8h et 24h après injection intraveineuse. - 7 prélèvements à 0 h (avant gavage), 1h, 4h, 7h, 9h, 11 h et 24h ou bien 15 min, 2h, 6h, 8h, 10h, 12h et 24h après administration par voie orale. A noter que l’injection intraveineuse et les prélèvements ne sont pas invasifs, car effectués via un cathéter préalablement installé par notre fournisseur agrée avant l'arrivée des animaux au sein de nos locaux. Un contrôle quotidien préventif est toutefois nécessaire pour s'assurer de la pérénité des cathéters.
Impact sur les animaux
Le cathéter posé pour réduire la douleur et l’inconfort des prélèvements peut être sujet à une infection ou une inflammation induisant une douleur ou une souffrance chez le rat. Par ailleurs, le gavage qui pourrait constituer une source de stress pour les animaux, sera réalisé par un opérateur expérimenté, afin de s’assurer de la sécurité des animaux et de réduire l’inconfort lors de la contention.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ce projet, seront mis à mort après le dernier prélèvement de la dernière séquence de chacune des procédures (pilote et principale). Ayant été exposés à une toxine, les rats pourraient développer une toxicité retardée ou des effets pouvant changer le fonctionnement de leur organisme, notamment au niveau du foie ou la toxine est métabolisée. De ce fait, ils ne peuvent être réutilisés dans d'autres projets.
Remplacement
Cette étude est indispensable pour valider les résultats des expérimentations de la cinétique de l'Enniatine B1 obtenus sur des modèles cellulaires. Les études sur des cellules isolées ne reflètent pas le fonctionnement d’un organe ou d’un organisme entier, qui ne peut s’apprécier que par des études chez l’animal. Ces études restent indispensables pour pouvoir extrapoler les données sur cellules à un organisme entier. Les méthodes alternatives comme les expérimentations in vitro ou la modélisation permettent de réduire le recours à l’expérimentation animale ou le nombre d’animaux utilisés mais aucun modèle expérimental ne permet dans l’état actuel d’avancement de la science de s’affranchir complètement des études sur animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux par procédure, un design expérimental spécifique sera appliqué, permettant d’utiliser les mêmes animaux pour deux administrations avec une période de récupération suffisante à l’excrétion totale de l’Enniatine B1 avant la seconde administration. Ce design permet de couvrir un nombre suffisant de prélèvements sanguins, tout en respectant le volume sanguin maximal à prélever par rat. De plus, en réutilisant les rats dans une seconde séquence, le nombre d’animaux par temps de prélèvement garantira des données pouvant être exploitées dans un modèle mathématiques avec ses variations (grâce à l'augmentation du nombre d'animaux par temps de prélèvement en réutilisant les animaux dans une seconde séquence).
Raffinement
Dans le respect des normes du bien-être animal, les rats seront hébergés dans des cages en polypropylène, aux bonnes dimensions, sur litière. Les rats seront au minimum deux par cages. Par ailleurs, les cages seront équipées d’enrichissements comme : briquettes, balles, billes…etc, et seront en étroite proximité pour favoriser le contact visuel et sonore entre les rats des autres cages. De même, les cages à métabolisme seront également équipées d’enrichissements comme les balles. Le design expérimental est conçu pour réduire autant que possible l’inconfort des animaux en limitant au strict nécessaire leur manipulation. Ainsi, l’utilisation d’animaux cathétérisés, permet de réduire l’inconfort et la douleur lors des prélèvements sanguins et de faciliter l’administration par voie intraveineuse. De plus, Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avec une solution de chlorhexidine avant fermeture, et surveillés régulièrement pour détecter d’éventuels signes d’infection. L’expérimentation sera effectuée par des opérateurs formés, maitrisant les gestes de contention afin de limiter l’inconfort et la souffrance des rats. De même, la surveillance des signes limites déterminés au préalable permet d'intervenir rapidement sur les animaux. Des méthodes et des médications appropriées sont prévues pour réduire le stress, l’inconfort ou la douleur. L’administration d’analgésiques (Anti-Inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou bien des dérivés morphiniques) est prévue si nécessaire.
Choix des espèces
Les rats ont été choisis pour l’expérimentation animale car le laboratoire dispose déjà de données sur des cellules isolées de foie de rats Sprague-Dawley. Les rats utilisés pour cette étude sont au stade de développement entre 6-8 semaines, pour permettre la pose chirurgicale des cathéters. Ce choix est également justifié par le fait de réduire la quantité de toxine (Enniatine B1) utilisée, et pour répondre aux besoins en terme de prélèvements sanguins.
Evaluation de la tolérabilité et de l’efficacité de candidats-médicament administrés par voie intrathécale chez le primate non-humain
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Ces injections intrathécales servent à caler les doses et le calendrier des études réglementaires obligatoires qui suivront. 116 macaques à longue queue y sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 50 tués pour l'analyse post-mortem des tissus et 66 gardés en vie pour d'autres études. Chacun peut recevoir jusqu'à six injections dans le liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale, avec ponction du même liquide, jusqu'à dix prélèvements sanguins par semaine sur animal vigile, six IRM de trois heures maximum et vingt-quatre heures en module de collecte d'urine. Le porteur anticipe une baisse transitoire des réponses des membres inférieurs, des contractions musculaires et de rares fuites urinaires, et présente ces essais comme un moyen de réduire les contraintes des études réglementaires à venir.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement l’efficacité et la toxicité éventuelle de candidats-médicaments administrés par voie intrathécale afin de pouvoir proposer le meilleur traitement aux patients atteints de troubles neurologiques graves tels que par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson…) ou des atteintes neuropsychiatriques (épilepsie, …). Les études dans ce projet permettront d’ajuster au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal).
Bénéfices attendus
Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients. Ce projet nous permettra également de comprendre l’impact du geste de l’administration spinale (voie intrathécale) répétée d’un traitement et à terme d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour rendre plus sûre l’administration du traitement chez les patients et améliorer ainsi leur prise en charge.
Procédures
•Injections intrathécales réalisées sous anesthésie générale : jusqu’à 6 injections maximum avec un délai minimum de 7 jours entre les 2 injections (durée acte : 15min maximum) •Prélèvements de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale juste avant les injections intrathécales et plus rarement entre 2 injections intrathécales. (durée : 2 à 3 min en fonction de la vitesse d’écoulement) •Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (au maximum 10 par semaine ou dans la limite de 7,5% du volume total circulant ; quelques secondes •Prélèvements urinaires en hébergeant l’animal dans un module d’hébergement adapté pendant 24 heures maximum pour collecter les urines. •Examen des yeux sous anesthésie générale (utilisation d’une lampe à fente) : 30 à 40 min • Examen du système cardiovasculaire (port gilet pour monitoring sur 12h) par électroencéphalogramme et prise de la tension artérielle (brassard pour les mesures : 10min max). • Imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie générale : 6 sessions au maximum, espacées de 15 jours minimum, seront réalisées par animal (durée acte : 3h maximum)
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les effets indésirables anticipés concernent ceux inhérents à la voie d’administration intrathécale et pourrait inclure : une diminution transitoire (jusqu’à 24-48 heures après injection) des réponses des membres inférieurs pouvant induire ou non une perturbation de la démarche et la posture de 30 minutes à 4 heures après le réveil, contractions musculaires durant la procédure ou juste après injection, de rare troubles neurologiques tel que des fuites urinaires (jusque 4 heures après injection). Ces effets potentiels seront gérés par l’utilisation de points limites adaptés afin de limiter au maximum l’apparition et la durée des effets décrits ci-dessus. La douleur et la souffrance potentiellement présentes sont liées aux administrations et aux prélèvements de sang et de liquide cérébrospinal. Ces désagréments sont gérés sous anesthésie générale excepté dans le cas des prélèvements de sang où l’anesthésie provoquerait plus de souffrance et de stress que l’acte en lui-même pour lesquels les animaux sont habitué par renforcement positif. Concernant l’IRM, il s’agit d’un examen de nature non-invasive mais des nuisances liées à l’anesthésie et son caractère répétitif (troubles respiratoires/embolie pulmonaire, fausse déglutition) ou une perte de poids peuvent subvenir. Un inconfort des voies aériennes suite à l’intubation endotrachéale (max 3h) peut être attendu
Devenir
66 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés dans d’autres études, après accord vétérinaire. 50 animaux seront euthanasiés pour procéder à l’analyse post-mortem des tissus (immunohistochimie/biochimie).
Remplacement
Les progrès scientifiques ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés en privilégiant les tests in silico et in vitro pour la sélection précoce des molécules. Cependant, les progrès réalisés n’ont pas permis la substitution complète des tests in vivo qui demeurent un requis réglementaire. Comme les études envisagées dans le cadre de ce projet permettent de choisir les doses des études réglementaires obligatoires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires, elles doivent être réalisées sur le même modèle animal que celui des études réglementaires.Cependant, des études préliminaires réalisées en amont chez le rongeur (rat/souris) auront déjà permis de bien définir les doses à administrer et à limiter le nombre de produits à tester chez le primate non humain..
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son minimum afin d’atteindre l’objectif du projet. Pour ces études, en tenant compte de la disponibilité de la bibliographie existante et des données générées en interne,, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Ces études préliminaires permettront de limiter le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques dans les études réglementaires.
Raffinement
Une procédure d’analgésie et d’anesthésie sera appliquée au moment des administrations intrathécales. Une anesthésie sera également effectuée pour l’examen IRM. Un délai d’au moins 48h sera respecté entre les IT et IRM. Une observation accrue et adaptée du comportement de l’animal sera faite suite à l’administration afin de s’assurer qu’il ne présente pas de signe défavorable ou que l’apparition d’éventuels signes liés à la procédure ne soit que transitoire (ex : démarche anormale). Concernant le reste des examens pratiqués, afin de ne pas interférer sur les paramètres étudiés, les animaux ne seront pas anesthésiés mais ils seront habitués par renforcement positif. Une grille de point limite adaptée est mise en place pour prise de décision rapide. En cas de nécessité, le vétérinaire pourra intervenir et décider de la mise en place de soin spécifique. Tous les animaux sont mis en groupes, sauf cas occasionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie , prélèvements sanguins ou signes nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.
Choix des espèces
Les études de ce projet ont pour but de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicaments chez l’Homme ainsi que son efficacité sur l’engagement de la cible associée à la distribution du médicament dans l’organisme humain. Dans ce contexte, le modèle primate non-humain peut être sélectionné à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proches de l’humain notamment sur la totalité des paramètres suivants : • Sur le plan pharmacologique et toxicocinétique : exposition au médicament, élimination, fraction libre du médicament… • D’un point de vue du métabolisme : le type et la quantité relative de métabolites produits suite à l’administration d’un médicament en se basant sur des études préliminaires • D’un point de vue physiologique : réactions physiologiques similaires (exemple : engagement de la cible) et pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme • Sur le plan expérimental : évaluation des formulations et excipients tolérés, voies d’administration possibles • Données historiques : expérience avec des médicaments compétiteurs de la même catégorie Ces études étant préliminaires aux études réglementaires qui utilisent principalement des adultes et de jeunes adultes, il est donc prévu d’utiliser des animaux du même stade de développement.
Évaluation de l’importance du tissu adipeux médullaire dans l’homéostasie osseuse au cours de l’arthrose et la régénération après fracture dans un modèle murin transgénique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées sous anesthésie en moins de quinze minutes pour installer une arthrose ou une ostéoporose, 440 souris transgéniques dépourvues de tissu adipeux subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 400 d'entre elles et léger pour les 40 autres. Leur glycémie est contrôlée tous les quinze jours par une piqûre à la queue, et une partie passe par des tests de douleur et d'activité physique, deux fois avant l'induction du modèle et deux fois après, sur animal vigile et pendant une demi-heure. Sept jours puis deux jours avant leur mise à mort, elles reçoivent deux injections intrapéritonéales. Toutes sont tuées pour prélever des tissus, une partie sans jamais être analysée puisqu'elle est mise à mort au titre de l'entretien de la lignée.
Objectifs
L’ostéoporose et l’arthrose sont deux maladies osseuses liées au vieillissement. L’ostéoporose se caractérise par une diminution de la qualité et de la quantité d’os qui entraîne un risque élevé de fracture et une faible capacité de régénération osseuse. L’arthrose inclut une disparition du cartilage et une modification de l’os sur lequel il repose. Ces dernières peuvent précéder les lésions du cartilage, suggérant que le contrôle de l’intégrité osseuse est important pour la physiologie des articulations. Un symptôme majeur des patients souffrant d'arthrose est la douleur qui est déclenchée par des changements périphériques et centraux dans les voies de la douleur. Cependant, les mécanismes impliqués dans la douleur aiguë et chronique ne sont pas encore bien compris dans l'arthrose. Le tissu adipeux de la moelle osseuse a peu été étudié jusqu’à présent et ses fonctions demeurent très mal connues. Des données récentes suggèrent qu’il contribue à réguler l’intégrité de l’os. Toutefois, son rôle dans la régénération osseuse en cas de fracture et celui dans l’arthrose n’ont jamais été investigués. Nous pensons que le tissu adipeux de la moelle osseuse pourrait jouer un rôle dans les altérations de l’os associées à l’arthrose et à la régénération osseuse après fracture. Les souris transgéniques que nous souhaitons étudier présentent une absence de tissu adipeux, notamment celui de la moelle osseuse. Nous voulons déterminer si cette absence est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture. Nous voulons déterminer si l’absence d’une protéine spécifique jouant un rôle clef dans la fabrication du tissu adipeux et le stockage de lipides chez la souris est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture.
Bénéfices attendus
Grâce à cette étude nous pourrons déterminer les conséquences de l’absence de tissu adipeux de la moelle osseuse sur l’homéostasie et la vascularisation osseuses au cours du vieillissement et dans deux contextes de pathologies osseuses : l’arthrose et l’ostéoporose. D’un part l'ostéoporose est la maladie osseuse la plus courante, touchant une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde. D’autre part l'arthrose est la maladie inflammatoire et dégénérative des articulations la plus courante, touchant près de 528 millions de personnes en 2019. La majorité des personnes touchées ont plus de 55 ans, et environ 60 pourcents d'entre elles sont des femmes. Par ailleurs, la lipodystrophie congénitale généralisée (absence de tissu adipeux, notamment dans la moelle osseuse) est une maladie rare, dont la prévalence est estimée à 1-10 cas pour 10 millions. Les patients qui présentent une lipodystrophie congénitale généralisée ont des problèmes osseux. Le modèle utilisé récapitule le phénotype observé chez l'homme, ce qui permettrait de poursuivre les recherches sur l’arthrose et la régénération osseuse post-fracture chez ces patients. Enfin, tester l'effet de l'absence de tissu adipeux de la moelle osseuse au cours du vieillissement ouvrirait les possibilités de traitements thérapeutiques et/ou pharmacologiques visant à moduler ce tissu chez les patients à haut risque de fracture et d’arthrose.
Procédures
Le modèle murin transgénique utilisé présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. Nous mettrons en œuvre deux modèles expérimentaux : un modèle d’arthrose et un modèle d’ostéoporose. Les procédures opératoires seront effectuées sous anesthésie et analgésie (pré- et post-opératoire) pour une durée inférieure à 15 minutes en incluant toute la préparation. Pour ces animaux, un suivi de la glycémie sera mis en œuvre tous les 15 jours par un prélèvement d’une goutte de sang (très faible volume) au niveau de la veine caudale (quelques secondes par animal). Nous réaliserons une évaluation de la douleur et de l’activité physique sur une partie des animaux avant l’induction des modèles d’arthrose (2 fois) et après (2 fois). Ces évaluations seront effectuées sur animal vigile non contraint pour une durée d’environ 30 minutes (temps de préparation/nettoyage compris). Les animaux recevront également deux injections intrapéritonéales d’une solution 7 jours et 2 jours avant l’euthanasie sur animal vigile (quelques secondes par animal). A l’issue de la période de maintien les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisée présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. La mise en œuvre des modèles d’arthrose et d’ostéoporose pourront entrainer des douleurs post-opératoires, une altération de la locomotion et une perte de poids associé. L’anesthésie nécessaire à la mise en place des modèles représente un risque de complication possible mais faible (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.). Le suivi de la glycémie au cours du temps par un prélèvement d’une goutte de sang (faible volume) de manière régulière ainsi que les injections intrapéritonéales de solution pourront entrainer une douleur et un stress de courte durée. Enfin, l’évaluation de la douleur et de l’activité physique peuvent provoquer un stress et un inconfort de courte durée.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de l’arthrose et de l’ostéoporose nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans ces pathologies complexes et multifactorielles. Notre projet se concentre sur le rôle du tissu adipeux de la moelle osseuse dans les altérations de l’os et de l’articulation au cours de ces maladies osseuses liées au vieillissement. Nous pensons qu’il joue un rôle essentiel dans le contrôle du microenvironnement osseux ce qui implique des interactions fonctionnelles étroites entre les cellules du tissue adipeux de la moelle osseuse et celles de son microenvironnement. Certains aspects de ces interactions peuvent être mimés par des co-cultures. Néanmoins dans une vision plus intégrée de ces maladies et dans un souci de comprendre leur développement et leur progression, aucun modèle cellulaire ou moléculaire actuel ne peut remplacer l’approche in vivo.
Réduction
Le projet impliquera un total de 440 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Compte-tenu que les caractéristiques du tissu adipeux de la moelle osseuse sont différentes selon le sexe, les expériences seront réalisées sur des animaux des deux sexes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, la définition des groupes/temps choisis sont basés sur les résultats d’études antérieures permettant connaître la cinétique d’apparition de l’arthrose. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en utilisant de l’analgésie pré et post opératoire et de l’anesthésie. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Par exemple dans ce projet, le choix de la litière est adapté au modèle mis en œuvre afin que celle-ci soit la moins désagréable possible et n’augmente pas les potentiels douleurs liées au développement de l’arthrose. De même l’accès à l’alimentation sera facilité et son appétence améliorée notamment durant les phases post-opératoires. Le traitement analgésique sera prolongé au-delà de la période de couverture standard en cas de signe de douleur ou de difficulté dans les déplacements des animaux.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Le projet est mis en œuvre sur un modèle murin transgénique présentant une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), et pouvant développer une insulinorésistance. Une telle déficience n’est disponible que chez la souris. De plus, les modèles d’arthrose et d’ostéoporose sont développés chez la souris. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Le modèle d’arthrose utilisé est le modèle expérimental le plus fréquemment utilisé pour étudier la physiopathologie de l'arthrose et l'efficacité des médicaments contre cette maladie. La chirurgie sera réalisée sur des souris de 12 semaines matures sur le plan squelettique. Le modèle d’ostéoporose sera mis en œuvre sur des souris de 6 à 7 semaines. Il permet de récapituler certains aspects du développement et de la croissance du squelette et de s’affranchir afin des problèmes associés au syndrome métabolique.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, chacune recevant une puce électronique sous la peau avant le sevrage et une biopsie d'un fragment de queue dès deux à trois semaines d'âge. 250 d'entre elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales d'un agent chimique mutagène à quatre, cinq et six semaines, qui peut rendre stériles 70 % des mâles, les autres naissant, étant génotypées et maintenues pour l'entretien de la lignée. Toutes seront tuées dès les premiers signes biologiques de la maladie auto-immune, ce que le porteur présente comme un moyen d'éviter toute souffrance. Il annonce un effectif établi sur des études statistiques permettant d'utiliser "le moins d'animaux possible", sans expliquer comment ce calcul aboutit à 153 850 souris.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique et sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes). Toutes les interventions citées précédement seront réalisées dans un seul établissement utilisateur. Une puce électronique sera implantée à tous les animaux avant le sevrage par voie sous cutanée et des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à partir de 2-3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Ces deux interventions pourront être réalisées dans les deux établissements utilisateurs
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal. Quand des livraisons d’un établissement à l’autre seront réalisées, les animaux aptes au transport seront livrés via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux (colis comprenant alimentation, gel d'hydratation et enrichissement). Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.
Cathétérisme Vasculaire chez les rongeurs et administration par voie parentérale. Application à des études d’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles d’inflammation aigue, ou de défaillance hépatique aigue ou chroniques (ALF et ACLF)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 4140
Le choc, la détresse cardio-respiratoire et les troubles de la thermorégulation servent ici de critères de point limite, et une partie des animaux les atteindra assez tôt pour être tuée avant terme. 4 440 souris et 4 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 2 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 220 un niveau sévère. Un cathéter veineux leur est posé sous anesthésie, puis vient un gavage d'un agent toxique pour le foie deux à trois fois par semaine pendant dix semaines pour installer une cirrhose, avant une injection qui déclenche la défaillance hépatique aiguë. Le porteur écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère" tout en maintenant les animaux dans un état qu'il estime acceptable, et renvoie au conditionnel les solutions thérapeutiques qu'il espère proposer aux patients.
Objectifs
La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui survient de manière aiguë, chez des patients qui souffrent d'une maladie hépatique chronique qui peut avoir différentes origines (virales,métabolique, ou médicamenteuse). La défaillance aigue généralement en raison d'un événement précipitant, et qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes Elle survient chez environ 30% des patients hospitalisés atteints de cirrhose et est associée à un taux de mortalité à 28 jours qui varie entre 20% et 70% selon le grade de l’ACLF. L'objectif de ce projet est d'instrumentaliser des voies veineuses chez le rongeur et de les utiliser dans nos modèles pré établis pour évaluer l'efficacité de produits nouveaux. Nous sommes effectivement contraints à effctuer des administrations soit en bolus unique, en admnistration répétées ou perfusions lentes, des composés que nous étudions. Les modèles intrumentés par un cathéter posé en voie veineuse ( dits cathétérisés) seront employés dans des modèles que nous avons déjà développés (modèles d'infammation aigue au LPS, de stress oxydatif à l'acétaminophène ou au pyrazole, ou d'alcoolisation massive produisant une translocation bactérienne ) sur des animaux sains,ou dejà atteints d'une maladie hépatique. dans le traitement des patients qui subissent cet évènement aigu.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second épisode d’ACLF Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme). A ces bénéfices attendus lors du déroulement de nos projets, nous avons ajouté la voie veineuse d’administration des composé étudiés qui reflète davantage la situation majoritairement vécue en clinique humaine
Procédures
Selon les procédures concernées, les gestes techniques pratiqués pourront être un peu différents : • Pour les opérations chirurgicales de pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés au masque (anesthésie volatile au gaz) et ils recevront successivement : • 1 injection unique avant l’opération d’un médicament anti-douleur (=analgésique) • 1 injection de solution physiologique qui prévient la déshydratation fréquente lors de la chirurgie • 1 aspersion locale de médicament anti-douleur à l’emplacement de l’incision. • 3 injections par jour d’un médicament anti-douleur au cours des 3 jours qui suivent l’opération. • Pour les phases d’induction de la cirrhose hépatique Les animaux qui recevront par gavages un agent chimique toxique pour le foie (2 fois par semaine à 2mL/kg pour les rats et 3 fois par semaine pour les souris), pendant 10 semaines successives. Chaque manipulation de l’animal dure environ 15 secondes. Les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie volatile (prélèvement intermédiaire et final ; la durée totale de chaque prélèvement dure environ 2 minutes. • Pour la phase de déclenchement de la défaillance hépatique Les animaux recevront une injection intrapéritonéale à 5mL/kg pour les rats et 10mL/kg pour les souris. Durée du geste y compris contention est de15 secondes • Pour les études pharmacocinétiques Les animaux subiront des micro-prélèvements intermédiaires au niveau du cathéter sans introduction d’aiguille en conditions vigiles au nombre de 6 pour les rats et 3 pour les souris. Durée y compris la contention de l’animal 15 secondes Les animaux subiront des prélèvements terminaux sous anesthésie gazeuse. Durée y compris l’anesthésie : 2 minutes
Impact sur les animaux
La défaillance hépatique aigue du patient cirrhotique représente un évènement grave, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris ou le rat présente manifestement des signes cliniques d’inconfort. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car il est indispensable de recueillir les organes en vue d'analyses d'expression de gènes ( transcriptomique) , ou de proteine ( histologie)
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être pertinents. Nous écartons les paramètres peu représentatifs et peu discriminants statistiquement qui nécessiteraient des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". Des approches statistiques permettent d'affiner les effectifs et donc de réduire les nombres d'animaux.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paires ou trios, les souris peuvent être gardées en groupes sociaux plus importants (5 ou 6 par cage). L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les espèces employées à ce stade de la recherche sont les rongeurs qui sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, et constituent modèles et des moyens vivants de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de la pathologie étudiée. Les méthodes chirurgicales de pose de cathéters chez les souris et rats sont parfaitement décrites et idéalement adaptées à l'utilisation de ces espèces dans ce projet. Les rats sont de jeunes adultes de 6 à 7 semaines d’âge, les souris sont-elles âgées de 8 à 10 semaines , elle ont alors un poids qui permettent une manipulation plus aisée ( environ 25gr)
Mise au point d’une méthode de perfusion d’adénovirus à visée de thérapie génique dans le rein de porc.
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Une intervention unique de quatre-vingt-dix minutes, une exsanguination et le prélèvement des deux reins : 30 porcs sont opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Leurs reins sont ensuite perfusés sur machine pour comparer des souches de virus adéno-associés destinées à la thérapie génique de maladies rénales héréditaires. Le porteur écarte tout effet indésirable au motif que l'animal ne sera jamais conscient, et présente le recours au porc comme une alternative aux modèles primates qu'il qualifie de coûteux et éthiquement complexes. Il retient des porcs charcutiers de 50 kg, environ 90 jours, pour disposer d'un gabarit et d'une anatomie rénale proches de ceux de l'être humain.
Objectifs
Les podocytopathies héréditaires sont des maladies ayant pour origine une altération du fonctionnement du podocyte, structures particulières du rein, qui sont chargées de la filtration et de l'épuration du sang. Les patients atteints de podocytopathies héréditaires présentent tous une protéinurie (présence anormale de protéines dans l'urine), qui évolue le plus fréquemment vers l’insuffisance rénale terminale dans les premières décennies de vie. Aucune solution thérapeutique n'est disponible actuellement et la greffe rénale reste la seule solution thérapeutique. Ces maladies sont dues à des mutations dans une cinquantaine de gènes. La réexpression de la forme normale du gène muté par thérapie génique pourrait corriger le défaut à l'origine du trouble et ainsi empêcher le développement d'une insuffisance rénale. Les traitements par thérapie génique manquent de sélectivité et d’efficacité, nécessitant la production et l’injection de doses importantes pour pouvoir modifier efficacement les cellules malades chez le patient, ce qui peut entrainer des effets indésirables, parfois délétères. C'est pourquoi nous souhaitons tester plusieurs souches de vecteur viral (virus adéno-associés - AAV) afin d'identifier celles(s) qui permet(tent) d'obtenir la plus grande efficacité de transduction des podocytes (la transduction étant l'entrée du virus dans la cellule).
Bénéfices attendus
Impacts et valorisation scientifique : Le projet permettra de démontrer le potentiel des modèles porcins pour les études de thérapie génique en néphrologie, offrant ainsi une alternative aux modèles primates souvent coûteux et éthiquement complexes. Impacts sociétaux et médico-économique : Aujourd’hui, les podocytopathies héréditaires ont des impacts significatifs sur les patients et sur la société en général. Elles entraînent des complications graves, telles que l'insuffisance rénale terminale, ce qui nécessite la mise en place de programmes de dialyse très contraignants et de transplantation rénale dont on connait les difficultés du fait du manque de donneurs et le caractère malheureusement souvent transitoire, nécessitant le retour à la dialyse. En outre, ces maladies vont restreindre les possibilités de travail pour certains patients, avec des conséquences sur leur niveau de vie et sur leur capacité à subvenir à leurs besoins financiers, en plus du coût important lié au traitement de celles-ci. Le développement de thérapies géniques plus performantes pour des maladies rares et fréquentes, à travers ce projet qui vise à apporter des avancées majeures et des réponses concrètes, va permettre l’amélioration de l’accès aux soins et de la qualité de vie des patients traités. En effet, ce projet vise finalement à améliorer considérablement la vie des patients atteints de maladies chroniques (spécifiquement les podocytopathies héréditaires), handicapantes et progressives, qui impactent fortement les malades, leur entourage, et requièrent un parcours de soin long et cher pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitement. Cela permettra non seulement d'améliorer la qualité de vie, mais aussi de réduire le nombre de décès
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 90 minutes, réalisée sous anesthésie générale, à savoir une exsanguination et un prélèvement des reins. Aucun animal ne sera par définition réveillé à l'issue de de ces procédures. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux conscient.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement hypnotique et analgésique. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal puisqu’il s’agira de procédures sans réveil avec euthanasie de l’animal en fin de procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de chaque procédure, le sang et les reins étant prélevés pour être utilisés durant une perfusion d’organe ex vivo. La finalité de ces protocoles est l’étude de l’impact de vecteurs viraux utilisés dans des approches sélectives de thérapie génique ciblant les maladies rénales héréditaires.
Remplacement
Il ne peut s’agir que d’un rein provenant d’un système vivant reproduisant des conditions anatomiques et physiologiques proches de celles d’un rein humain. Enfin seul un modèle sur gros animal permettra une instrumentation chirurgicale adaptée pour réaliser la perfusion rénale isolée ex vivo sur machine. Des essais préliminaires sur des cultures cellulaires de cellules rénales et des organoïdes rénaux ont été réalisés pour vérifier la bonne expression des gènes dans les vecteurs (AAV) séléctionnés.
Réduction
Une échographie rénale sera réalisée chez tous les animaux au moment de leur inclusion dans l’étude afin de dépister une éventuelle malformation rénale qui pourrait compromettre le bon déroulement du protocole expérimental. En cas d’anomalie anatomique, l’animal sera sorti de l’étude et ne sera donc pas mis à mort pour les fins de ce protocole dans un principe de réduction du nombre des animaux. Nous avons choisi de mettre au point les conditions de perfusion des virus adéno-associés sur rein isolé et perfusé pour limiter le nombre d'animaux utilisés (réduction) et leur souffrance (raffinement). En effet, les deux reins de l'animal seront utilisés pour cette mise au point, ce qui aurait été impossible sur animal entier.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, nous appliquerons les points suivants : - Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum.
Choix des espèces
Nous utilisons des porcs de type charcutier (Large White / Landrace) qui possèdent des caractéristiques anatomiques et physiologiques correspondant aux besoins de nos procédures. Il n'existe pas de numéro d'agrément spécifique pour ce type de porc, dont l'espèce n'appartient pas à la liste fixée réglementairement. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie rénale semblable à l’Homme avec une structure et une vascularisation rénale compatible avec l’instrumentation du rein sur module de perfusion isolé ex vivo (PerLife).
Evaluation des effets anti-allodyniques/hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules injectée(s) en intrathécale ou intraveineux à l’aide d’un cathéter dans différents tests de douleur chez le rat .
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Trois cents rats sont réutilisés pour entraîner du personnel à des gestes techniques, les autres tués dès la fin de la phase expérimentale parce que les composés testés ont pu modifier leurs structures et leur immunité. 2 750 rats juvéniles à adolescents vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des candidats médicaments contre la douleur. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter intrathécal ou intraveineux, jusqu'à six stimulations mécaniques ou thermiques par jour répétées sur plusieurs jours, des administrations par une dizaine de voies différentes, des prélèvements sanguins et jusqu'à vingt-quatre heures de mise à jeun. Le porteur affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut pas être étudiée in vitro et que l'évaluation chez l'animal vigile "reste la seule option" avant le passage chez l'être humain.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, les Gabapentinoides provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de composés administrés en perfusion ou de manière répétée. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour l’implantation de cathéters. Lors des tests ils pourront être exposés à une stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. Les animaux seront soumis à un anesthésiant gazeux durant quelques minutes pour l'implantation du cathéter qui nécessite une micro-chirurgie (10minutes). De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère < 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle :, nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Le port d'un adaptateur au système de de perfusion dans la nuque peut etre une nuisance légère (légère gène,) Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Certains animaux subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée maximum 24h). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie. La nuisance liée aux perfusions est l’anesthésie gazeuse qui peut-être répétée.
Devenir
Le test de composé pharmacologique en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour tester de nouveaux composés car un impact des composés pharmacologique sur les structures, l’immunité, etc… n’est pas exclu. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas des procédures n'impliquant pas la mise à mort immédiate des animaux, les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces tests sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclus ou limités à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse si certains groupes contrôles ne sont pas nécessaires. En fonction du design de chaque étude de tests statistiques appropriés seront effectués.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de certains tests, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection sous cutanée de solution hydratante en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. La pose d’un système de perfusion est un raffinement en soi car il permet d’éviter les injections répétées en intraveineux et réduit les temps d’anesthésie pour injection.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car ilpermet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Mesure du pH tumoral à l’aide de nouveaux agents de contraste: application aux modèles murins MDA-MB231 et 4T1 de cancer du sein 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux heures d'IRM sous anesthésie générale et jusqu'à deux injections d'agents de contraste radiomarqués à vingt-quatre heures d'intervalle: 920 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées, dont 100 tuées sans reprendre conscience et 790 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de cellules cancéreuses dans la mamelle pour induire une tumeur du sein triple négatif, puis passe d'un établissement à l'autre en véhicule climatisé entre l'imagerie et les études de biodistribution. Le porteur écrit que les acquisitions IRM sont indolores et atraumatiques et qu'aucun antalgique n'est utilisé pour les injections d'agents de contraste, les nuisances déclarées se limitant au développement des tumeurs. Toutes sont tuées sous anesthésie, par ponction cardiaque pour certaines, afin de récupérer la tumeur et de mesurer la radioactivité retenue par chaque organe.
Objectifs
Malgré les avancées dans le dépistage et le développement de thérapies, le cancer du sein reste un problème de santé public majeur. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez la femme. L’incidence du cancer du sein est en constante augmentation dans la plupart des pays malgré les efforts fournis pour la prévention de cette maladie. Une caractérisation tissulaire du cancer du sein est indispensable pour une détection plus précoce, ce qui permettra d’augmenter les chances de réussite du traitement, mais aussi de minimiser les séquelles. Il Il est connu que le pH extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui du tissu sain . Ceci est dû à une augmentation de la production d’acide lactique. Nos collaborateurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au pH. L’objectif de ce projet est dans un 1er temps d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur. Une fois injectés par voie intraveineuse, l’intensité du signal de la tumeur sur l’image IRM va varier en fonction de la valeur de son pH. Ceci permet de calculer le pH tumoral et d’étudier sa variation tout au long du développement de la tumeur mammaire. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. Dans un 2nd temps, nous allons étudier la biodistribution ex vivo (prélèvements d'organes post mortem à des temps précis) de ces même agents de contraste, sur souris saines et souris modèle de cancer du sein triple négatif à l'aide des analogues marqués soit à l'111In soit avec un autre radiométal. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs et donc plus difficile à soigner. Ce projet se fera donc sur 2 EU
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste sensibles au pH pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur et de quantifier la biodistribution de ces agents de contraste dans les différents organes. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement du cancer triple négatif puisque le pH est directement lié à l’agressivité tumorale et au développement de métastases.
Procédures
Dans l'EU1 (IRM), certaines souris vont recevoir une injection intra mammaire unique pour l’induction des tumeurs (durée moins de 2 minutes). Tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en imagerie par résonnance magnétique (IRM). Dans l'EU2, tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en biodistribution. Certaines souris venant de l'EU1 serviront pour les études de biodistribution dans l'EU2 et recevront au maximum 2 injections à 24h d'intervalle. Le temps d'injection est de 5 secondes environs. L’induction tumorale et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale. Le temps total d'examen d'imagerie est de 2 heures maximum. Certaines souris vont avoir un prélèvement de sang qui se fera juste avant la mise à mort de l’animal sous anesthésie générale (Dans l'EU1 ou l'EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont liées au développement des tumeurs mammaires. Si des signes de souffrance apparaissent, ils feront l'objet de points limites. L’injection IV de agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste. Les acquisitions IRM sont totalement indolores et atraumatiques. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM et durant la ponction cardiaque. Les souris immunodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficience.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris anesthésiées à l'isoflurane seront mises à mort pour pouvoir récupérer la tumeur et les organes d'intérêt.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs et la distribution des agents de contrastes in vivo. Pour ces raisons, l’étude préclinique de biodistribution des agents de contraste et l’induction de tumeurs mammaires ne peuvent se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM (imagerie par résonance magnétique) pour le suivi du développement des tumeurs mammaires ainsi que la SRM (spectroscopie par résonance magnétique) permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Toutes les tumeurs seront induites dans l'établissement 1. Après l'imagerie RM, les souris seront transportées à l'établissement 2 (situé sur le même campus) dans un véhicule climatisé. Les animaux sont transportés dans des cages à couvercle filtrant et des procédures strictes sont appliquées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…) évitant la contamination des animaux durant les séances d'imagerie.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. On utilisera des souris femelles adultes de 8 à 10 semaines; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation, ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).