Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude pharmacocinétique et pharmacodynamique d’un anticorps dirigé contre un récepteur à la parathormone dans un modèle d’hypercalcémie induite chez le primate.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Quinze jours d'acclimatation, deux prélèvements sanguins hebdomadaires, puis l'implantation sous la peau d'une pompe sous anesthésie générale, une heure d'intervention : 8 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pompe diffuse une hormone qui fait monter leur taux de calcium sanguin, avec pour effets attendus apathie, diarrhées et augmentation du volume urinaire, avant l'injection de l'anticorps censé faire redescendre ce taux, dont un surdosage provoquerait contractions musculaires, faiblesse, tétanie et convulsions. Chaque jour à partir de l'implantation, un prélèvement sanguin est réalisé sur animal vigile, la contention durant cinq à dix minutes. La pompe est ensuite retirée sous anesthésie et les huit macaques sont gardés en vie, décision que le porteur présente comme une manière de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l'effet pharmacodynamique et de définir la pharmacocinétique d’un anticorps monoclonal humanisé ciblant le recepteur PTH1R (récepteur à la parathormone) sur deux modèles différents d’hypercalcémie provoquée chez le primate : 1) un modèle d‘hyperparathyroïdie primaire (HPP), induit par la perfusion de parathormone (PTH), une hormone impliquée dans la régulation du calcium 2) un modèle d’hypercalcémie humoral maligne (HHM) induit par une perfusion de peptide lié à la parathormone (PTHrP), une hormone également impliquée dans la régulation du calcium L’augmentation provoquée de la PTH (dans le premier modèle) ou de la PTHrP (dans le second modèle) va induire une augmentation du taux de calcium sanguin. Le but de l’anticorps ciblant le récepteurs PTH1R est de faire diminuer ce taux de calcium dans les deux modèles (modèle HPP et HHM). Le projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins répétés seront réalisés avant et après l’administration de l’anticorps. Différents paramètres physiologiques pertinents seront également relevés (température corporelle, poids). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, toutes les doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement permettant d’agir sur l’hypercalcémie lié à des pathologies comme la HPP (hyperparathyroïdie primaire) et HHM (hypercalcémie humorale maligne). Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.
Procédures
Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de minimum 15 jours. Les animaux recevront deux administrations par voie sous cutané de l’élément à tester. Après les administrations, les prélèvements de sang et un suivi des paramètres physiologiques (poids et/ou température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’évolution du taux de calcium et la pharmacocinétique de l’élément testé (temps contention compris entre 5 et 10 minutes en moyenne). Des mesures basales de ces données seront réalisées pour les comparer avec celles obtenues post-administration dans le but de détecter toute variation physiologique après administration du candidat médicament. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les administrations de l’anticorps et les prélèvements de sang seront moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Les prélèvements sanguins dureront ponction moins de 5 minutes en moyenne. En amont de la pose de la pompe, deux prélèvements quotidien seront réalisés une fois par semaine. A partir de l'implantation de la pompe, un prélèvement sera fait quotidiennement. La pompe permettant l’administration des hormones sera implantée en sous-cutané. Pour le confort et pour le bien-être des animaux, cet acte sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie chimique fixe).L'intervention durera environ une heure. Les animaux devront être mis à jeun avant la réalisation l’implantation (moins de 16h). Les animaux seront gardé en vie à la fin de la procédure ce qui implique l'explantation de la pompe. Cette prodédure ce dérulera de la même façon que l'implantation (anesthésie générale chimique). Cette intervention durera envrion 30 minutes. Enfin les animaux seront récompensés à la fin de toute manipulation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une hypercalcémie peut provoquer des symptômes associés à cette biochimie. On pourrait observer une apathie (baisse d’énergie globale), des diarrhées ou encore une polyurie (augmentation du volume urinaire). A la suite de l’injection de l’anticorps, il pourrait y avoir une hypocalcémie. En effet, l’effet attendu de ce traitement est une diminution du taux de calcium. Une dose trop élevée lors des administrations de l’anticorps pourrait induire des effets indésirables. Les signes cliniques classiquement observés lors d’une hypocalcémie sévère sont : agitation, contractions musculaires faciales ou généralisées, faiblesses, anorexie, tétanie et convulsions. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié : 1) à la mise à jeun, qui peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieure à 16h. 2) à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...); 3) au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de l'étude dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Cette décision sera prise par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Etre Animal)
Remplacement
Cette étude de pharmacocinétique / pharmacodynamique chez l’animal est indispensable au développement d’une nouvelle molécule pharmaceutique. En effet, celle-ci permet de déterminer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de la molécule testée. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet et pour obtenir des résultats interprétables et transportable à l’homme. Pour ce projet 2 lots de 4 animaux (un lot HPP et un lot HHM) seront utilisés. Comme le protocole le permet, les animaux seront gardés en vie à l’issue de l’étude dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques (cette décision sera validée par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Être Animal)).
Raffinement
Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (ex : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 15 jours minimum sera mise en place avant le début de l’étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable.
Choix des espèces
Le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. Cette espèce de primates non humains (PNH) partage de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de leurs principales caractéristiques physiologiques. La régulation du calcium par la PTH est connue pour être nettement différente chez les rongeurs et les chiens par rapport à l'homme, rendant ainsi les données obtenues chez ces espèces difficiles à interpréter en ce qui concerne la physiologie humaine. En comparaison, la molécule testée a déjà été testé sur des macaques cynomolgus et a montré un effet pharmacologique prolongé, confirmant ainsi la pertinence de cette espèce. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, à ce stade développement, les animaux disposent d’un système hormonale mature. De plus ce stade de développement a déjà été utilisé pour des études de pharmacodynamique.
Evaluation des paramètres de pharmacocinétique et validation de l’activité thérapeutique de nouvelles molécules candidates pour lutter contre les maladies neurogénétiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 120
8 120 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les molécules candidates leur sont administrées sous la peau, dans la veine, dans l'abdomen ou par gavage, avec des prises de sang à la queue jusqu'à trois fois en deux heures, et pour la dernière expérience un gavage quotidien pendant quatorze jours destiné à trouver la dose maximale supportée. Les souris utilisées portent une maladie neurodégénérative dont les symptômes moteurs et mentaux s'aggravent avec l'âge, et le porteur reconnaît que la toxicité des doses testées peut provoquer des effets secondaires. Rien dans le texte n'explique comment on arrive à 8 240 animaux : le porteur décrit seulement quatre expériences enchaînées, chacune conditionnée aux résultats de la précédente.
Objectifs
Des études in vitro récentes ont permis de découvrir une molécule permettant de retarder l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. Ce projet vise donc à trouver d’autres molécules, dérivées de la molécule initiale, dont les propriétés chimiques auraient des effets optimaux sur le traitement de cette maladie par rapport à la molécule initiale. Nous vérifierons d'abord si ces nouvelles molécules présentent un meilleur potentiel thérapeutique que la molécule initiale. Si c’est le cas, parmi tous les candidats, nous sélectionnerons les 3 meilleurs afin de réaliser une étude d’efficacité sur le long terme. Enfin, nous procéderons à des tests sur les 3 molécules sélectionnées pour déterminer la dose maximale sans danger pour l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à trouver des molécules qui soient aussi efficaces, voire plus, avec de meilleures propriétés chimiques. Une molécule qui se dissout bien et est bien absorbée peut être prise par voie orale, ce qui permet de réduire la dose nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique. Cela diminue également le risque d'effets secondaires indésirables, qui sont souvent la raison pour laquelle les patients arrêtent leur traitement.
Procédures
Quatre voies d’administration différentes seront testées : injection sous-cutanée, injection intra-veineuse, injection intra-péritonéale et gavage oral. Quelle que soit la voie, l’administration du médicament sera réalisée par un geste d’une durée inférieure à 30 secondes pour limiter le possible stress engendré par l’administration du traitement. Dans la 1ère expérience, du sang sera prélevé à la queue à 3 reprises au cours des 2h suivant le traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 2e expérience, du sang sera prélevé à la queue juste avant le traitement, puis 1h, 3h et 6h après. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 3e expérience, du sang sera prélevé à la queue tous les mois (un seul prélèvement/animal/mois) durant toute la durée du traitement. Ce geste sera limité à 30 secondes. Dans la 4e expérience, les animaux seront quotidiennement traités par gavage oral pendant 14 jours. Au 14e jour, du sang sera prélevé à la queue de chaque animal. Ces deux gestes auront une durée inférieure à 30 secondes chacun.
Impact sur les animaux
Le modèle animal de cette maladie présente des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Un stress lié à l’administration du traitement est possible. Le prélèvement sanguin peut aboutir à une légère baisse du volume sanguin. Des effets secondaires dus à une toxicité des doses testées peuvent être observés.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de la maladie sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec nos médicaments sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisée que si l’expérience 1 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de la maladie. Enfin, l’utilisation du rat adulte, en parallèle de la souris, pour l’étude de toxicité se justifie par le fait qu’elle prépare aux futures études de toxicité exigées par la réglementation et qui doivent être réalisées chez le rat.
Rôle du microbiote cutané dans la transmission précoce de la borréliose de Lyme
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dix tiques déposées sur chaque souris, un repas sanguin de cinq à sept jours, et pendant ce temps un isolement en cage privée de litière : 175 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dès le cinquième jour de vie, les souriceaux reçoivent au coton-tige des bactéries de la flore cutanée, en trois applications, en présence de leur mère. L'objet est de savoir si ce microbiote cutané bloque la transmission de la borréliose de Lyme au moment de la piqûre, une question que le porteur juge inaccessible aux organoïdes et aux explants de peau, où une tique ne peut pas se nourrir. Le choix de la souris tient à son rôle d'hôte naturel des larves et des nymphes de tiques, et celui de nouveau-nés au fait que la colonisation par le microbiote commence dès la naissance.
Objectifs
Des travaux préliminaires in vitro réalisés dans notre laboratoire ont montré que des espèces bactériennes appartenant à la flore cutanée normale possèdent un effet immunomodulateur sur les cellules résidentes (fibroblastes et kératinocytes) et initient une réponse inée rapide en présence de Borrelia. L’objectif principal de ce projet de recherche est désormais d’analyser in vivo le rôle du microbiote cutané dans la transmission précoce de la borréliose de Lyme.
Bénéfices attendus
La borréliose de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue de l’hémisphère Nord. En France, l’incidence annuelle est de 30 à 90 cas/100 00 habitants. Lors de la piqûre d’une tique infectée par Borrelia, l’infection est avortée dans environ 90% des cas. Le microbiote cutané, par la production de bactériocines ou par immunomodulation cutanée, est suspecté d’être un acteur majeur de ce processus. Des intéractions de ce type ont été décrites chez le phlebotome et le parasite Leishmania mais à l’heure actuelle, aucune étude ne s’est intéressée à ces interactions dans les maladies transmises par les tiques. La compréhension des bactéries impliquées et des mécanismes sous jacents peut permettre la production à terme de composés à visée protective par modulation transitoire du microbiote cutané lors de piqûres de tiques, ou à l’utilisation de molécules sécrétées par les bactéries elles mêmes.
Procédures
Souris nouveau nés : manipulation pour application de bactéries (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables concomitants au repas sanguin correspondent à des réactions locales inflammatoires à la piqûre des tiques. A noter que lors des repas sanguin (5-7 jours), les souris seront isolées avec un enrichissement apauvri (absence de litière). La manipulation des souriceaux nouveau nés sera le plus rapide possible (
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure. La réalisation de prélèvements multi-organes étant incompatible avec la survie de l'animal.
Remplacement
Nous avons déjà réalisé les expérimentations in vitro sur ce qui était faisable. L’utilisation d’organoides ou d’explants de peau n’est pas réalisable car la piqure de tique et son maintien y sont impossibles. Concernant les systèmes de gorgement artificiel pour tiques, ils ne permettent ni de répondre scientifiquement à la question posée, ni à l’étude de la dissémination du pathogène sur organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce protocole à été calculé au minimum des exigences de publications internationales, à savoir 5 souris par point de cinétique
Raffinement
Durant la procédure du repas sanguin des tiques, les souris sont isolées pour un maximum de 7 jours, avec des contrôles réguliers pour évaluer leur état et collecter les tiques gorgées, tout en maintenant un contact olfactif avec leurs congénères. Les souris sont obligatoirement séparées pour éviter le toilettage mutuel ne permettant pas un gorgement complet des tiques. Elles disposent d'un tunnel, d'un barreau à ronger et de coton. L'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être oberservée à la suite de celle-ci . Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Les souris sont euthanasiées après la collecte des tiques, sans dépasser 15 jours. Concernant l’application des bactéries sur souris nouveau nées, celle-ci se fait à l’aide d’un écouvillon doux non abrasif en coton et la manipulaton sera la plus rapide possible (
Choix des espèces
Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. La souris est sensible à l’infection par Borrelia et est classiquement utilisée en recherche scientifique sur ce sujet. Colonisation par S. epidermidis ou C. acnes ou C. striatum : Nouveau nés (J5 de vie). La colonisation par le microbiote se réalise dès la naissance, il est donc important de respecter le même mode opératoire que dans la nature. Repas sanguin de tiques infectées ou non : Animal sevré (taille suffisante pour manipulation)
COVIDentification : étude de la réponse immunitaire mise en jeu lors de l’infection au SARS-CoV-2 sur un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, 2 327 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles développent une inflammation et une atteinte pulmonaire qui tue 30 à 50 % d'entre elles en sept à dix jours, celles qui survivent recevant jusqu'à dix administrations intrapéritonéales d'anticorps ou d'inhibiteurs avant leur mise à mort. L'objectif déclaré est d'identifier une signature immunitaire précoce de la gravité de la COVID-19 et de tester des traitements. Le porteur détaille l'enrichissement des cages en papier kraft et le suivi journalier de l'état de santé, et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera appliqué aux souris infectées, au motif qu'il fausserait l'étude de la réponse inflammatoire.
Objectifs
Depuis les premiers rapports indiquant l'apparition d'un syndrome respiratoire aiguë sévère (SRAS) induit par le coronavirus-2 (SARS-CoV-2) en Chine en 2019, la COVID-19 a déjà infecté plus de 700 millions de personnes à travers le monde et a causé près de 7 millions de décès. L'infection à la COVID-19 constitue donc un réel problème de santé publique impliquant des enjeux économiques et sociétaux forts pour les années à venir.
Bénéfices attendus
L'ensemble de nos investigations vise à apporter des pistes pour répondre aux questions rencontrées en clinique chez les patients infectés par le SARS-CoV-2. Nous espérons identifier une signature immunitaire spécifique et précoce de la sévérité de la maladie. Nous souhaitons contribuer à une meilleure compréhension de l'impact de comorbidités sur la réponse immunitaire mise en place lors d'une infection. Et enfin tenter de trouver différents traitements permettant de lutter contre l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
Les animaux seront soumis aux actes suivants: Une infection en intra-nasale avec le SARS-CoV-2 (ou une solution contrôle) sur animal anesthésié : une seule fois (une à deux minutes). Ensuite, pour les animaux traités avec un anticorps ou un inhibiteur : une administration thérapeutique en intra-péritonéale sur animal vigile (quelques secondes, 1 à 10 fois maximum). Puis, avant l'euthanasie, une injection intra-veineuse d'une solution permettant de réaliser un suivi des cellules immunitaires sur animal anesthésié : quelques secondes, une seule fois. Puis, un prélèvement de sang sur animal anesthésié : 30 secondes, 1 seule fois. Et enfin, l'euthanasie des animaux par méthode réglementaire, quelques secondes, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les animaux impliqués dans ces expérimentations seront tous soumis à un suivi régulier (pesée, suivis journaliers) pouvant induire un stress chez les animaux. Les animaux infectés par le SARS-CoV-2 développeront une inflammation et une atteinte pulmonaire pouvant conduire dans 30 à 50 pourcent des cas au décès de l’animal sous 7 à 10 jours post-infection. Les animaux seront anesthésiés afin de pouvoir procéder aux infections par le SARS-CoV-2 par voie intranasale, cette anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire.. Plusieurs approches thérapeutiques susceptibles de réduire les symptômes de l’infection par le SARS-CoV-2 (administration de traitements anticorps, administration de traitement inhibiteur) seront testées afin d'entraver le développement de l’infection, toutefois l'administration des traitements pourra induire du stress et de la douleur légère chez les animaux.
Devenir
L'infection au SARS-CoV-2 est une infection évolutive au cours du temps et multi-systémique. Ainsi, pour comprendre au mieux les réponses immunitaires et inflammatoires mises en place par l'animal (sang moelle osseuse), celles spécifiques de certains organes (poumons, rein, rate, cerveau) il nous est nécessaire d'avoir accès à un maximum de prélèvements afin de mieux appréhender l'ensemble des modifications survenues au cours de l'infection. L'euthanasie de tous les animaux est donc requise pour répondre aux enjeux scientifiques de ce projet.
Remplacement
Le développement d’une infection par le SARS-CoV-2 fait intervenir une réponse immunitaire de l’hôte qui est évolutive au cours du temps. Nous infecterons les animaux par voie intranasale, ainsi, la fonction pulmonaire sera la première atteinte. Cependant, dans ce type de modèle infectieux, les animaux montrent également à minima des atteintes rénales et cérébrales ce qui impliquent que plusieurs organes et grandes fonctions physiologiques soient mises en jeu. L’étude des mécanismes impliqués dans la mise en place de la réponse immunitaire dans ce contexte pathologique rend l’étude in vivo indispensable. Toutefois, nous développons en parallèle, un maximum d’approches in vitro (mesures de paramètres biochimiques sur du sang de patients, extraction de cellules du sang périphérique de sang de patients atteints du virus de la COVID pour mise en culture puis stimulation-inhibition) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche.
Réduction
Nous utiliserons un total de 2327 animaux. Nous avons limité au maximum nos groupes d’animaux. Pour exemple : un seul groupe contrôle pour l’ensemble de chacune des cinétiques. Nos études portent sur l’analyse de différents paramètres (réponse immune dans différents organes, histologie, dosage protéique). Ainsi pour chaque animal euthanasié, nous prélèverons un maximum d’organes afin de collecter les données pour l’ensemble des tissus. Nous nous organiserons afin d’appliquer une multi-approche expérimentale en utilisant un même organe pour différentes techniques d'évaluations cellulaires. Nous utilisons maintenant des approches d'analyse à haute dimension permettant d'obtenir un très grand nombre d'informations sur un seul animal, et pouvant même ne pas avoir été anticipées à l'avance. L'utilisation de ces technologies innovantes nous a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nos animaux seront placés en acclimatation pendant un minimum de 7 jours avant d'entrer en procédure expérimentale. Les souris seront stabulées en portoirs avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. La température et l'hygrométrie seront contrôlées. Le cycle d’éclairage sera de 12h par jour. Afin de stimuler les activités cognitives et exploratrices des animaux tout en satisfaisant leurs instincts naturels, le milieu des cages sera enrichi avec des nidifications biodégradables en papier kraft. Un suivi journalier de l’état de santé des animaux sera réalisé par du personnel compétent. Une pesée des animaux sera réalisée 3 fois par semaine dès que la procédure expérimentale sera engagée. Nous réaliserons les infections de nos animaux par voie intranasale sous anesthésie générale. Les animaux auront alors subi une infection au SARS-Cov-2, malgré tout, aucun traitement anti-douleur ne leur sera appliqué car celui-ci risquerait d'interférer avec les mécanismes biologiques que cette procédure vise à révéler (étude de la réponse immunitaire et inflammatoire mises en place).
Choix des espèces
Le modèle murin pour l’infection par le SARS-CoV-2 est un modèle d’étude largement utilisé et décrit comme présentant une physiopathologie proche de celle observée en clinique chez le patient (symptômes cliniques, atteintes pulmonaire, rénale et cérébrale). De plus, la souris représente le modèle animal le plus riche en outils pour l’étude du système immunitaire : nombreux anticorps de cytométrie, modèles murins génétiquement modifiés (porteurs de fluorescences endogènes). Cela nous permettra d’étudier la réponse immune induite après l’infection par le SARS-CoV-2 via différentes techniques. Les animaux seront utilisés entre 3 et 24 mois afin d'étudier l’impact de facteurs de comorbidités tels que l’âge.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique dans un contexte pathologique (diabète)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un accident vasculaire cérébral provoqué par occlusion au chlorure d'aluminium, une intervention d'une heure et demie, précédé d'un diabète de type 1 induit par injections de streptozotocine : 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. S'y ajoutent la pose d'un cathéter intraveineux, quatre séances d'imagerie par résonance magnétique étalées jusqu'à soixante jours après l'AVC, et un à sept tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels dont la durée va de dix minutes à vingt-quatre heures. Le porteur écrit n'avoir observé, lors de projets antérieurs aux procédures identiques, aucun signe de douleur ni de souffrance après la chirurgie, tout en classant une partie des procédures au niveau de souffrance sévère. Toutes les souris sont tuées par perfusion intracardiaque, leurs organes étant destinés à des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients tels que la présence de divers facteurs de risque comme l’hyperglycémie sévère retrouvée chez les diabétiques de type 1. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique lors de la présence d’une comorbidité : le diabète. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques, afin d’améliorer de manière optimale la récupération de ces patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une induction de diabète de type 1 par injections de streptozotocine. Une goutte de sang sera prélevée chaque semaine pour le contrôle de la glycémie. Tous les animaux auront une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitement et/ou agent de contraste (15minutes). Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure d'aluminium sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30minutes) 24 heures après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions. Chaque animal effectuera de 1 à 7 tests regroupant des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels; la durée des différents tests allant de 10 minutes à 24 heures sur une période de 10 jours. La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Afin de limiter toute douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons des anesthésiques et analgésiques (isoflurane, lidocaine, buprénorphine) lors du protocole chirurgical. Lors de projets précédents au laboratoire utilisant des procédures identiques ou similaires, nous n’avons pas observé de signe de douleur ni de souffrance des animaux à la suite de la chirurgie. Néanmoins, une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance consisteront en un suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) dans des cages filtrantes avec un enrichissement du milieu (coton, paillettes, petites maisons), et la manipulation des souris uniquement par des personnels expérimentés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post-mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro de cultures cellulaires ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux et de l’organisme entier. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne). Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Malgré tout, si un point limite est observé, les animaux concernés seront mis à mort. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines pour les groupes « contrôles ».
Évaluation de l’efficacité et de la sécurité de trois ARN (acide ribonucléique) interférents conjugués à un même anticorps ciblant le système nerveux central chez le primate non humain.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Quarante minutes de contention sur chaise à chaque administration, treize prélèvements sanguins par animal, et pour trois d'entre eux deux ponctions de liquide cérébrospinal sous anesthésie : 12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois fois par voie intraveineuse des ARN interférents couplés à un anticorps censé leur faire franchir la barrière hématoencéphalique, pour un développement industriel de transport de médicaments vers le cerveau. Le porteur reconnaît que les ponctions peuvent provoquer une infection post-opératoire, de la fièvre ou un œdème au point de piqûre, et annonce dans le même temps n'attendre aucun effet indésirable lié au produit testé. Le choix du macaque tient selon lui à sa proximité phylogénétique avec l'être humain, et celui de jeunes adultes au fait que des animaux plus âgés présenteraient des anomalies susceptibles d'altérer la qualité des échantillons prélevés après leur mise à mort.
Objectifs
Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de trois molécules d'intérêts, conjugués à un même transporteur, passant la barrière hématoencéphalique chez le primate non humain dans le but de transporter des médicaments dans le système nerveux central. Le premier objectif est d’évaluer les structures qui sont ciblées dans le système nerveux central par les trois molécules d'intérêts. Le deuxième objectif est d’évaluer le devenir dans le sang des trois molécules d'intérêts couplées au transporteur avec deux méthodes différentes afin d’évaluer leur stabilité dans le sang. Le troisième objectif sera d’évaluer les concentrations dans le cerveau des trois molécules d'intérêts à la fin du projet. Enfin, le quatrième objectif sera d’évaluer le profil général de sécurité des molécules d'intérêts testées. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une molécule permettant le passage de médicaments directement dans le système nerveux central via une simple administration intraveineuse. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse (sédation en cas de besoin). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre chaque administration. Treize prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Deux prélèvements de liquide cérébrospinal par animal seront réalisés sur 3 animaux (sous anesthésie générale et analgésie). La chirurgie durera environ 1 heure (anesthésie et réveil compris) Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’environ 5 semaines entre les deux prélèvements. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront tout de même accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. D’après des études préliminaires réalisées sur le primate, nous n’attendons pas d’effet indésirable lié à l’élément d’essai sur ce projet. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de liquide cérébrospinal pourront provoquer des réactions locales au niveau des sites de ponction, une infection post-opératoire et/ou une réaction systémique de type fièvre. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort liés la mise à jeun, à l'induction et au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Enfin, le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) pourra provoquer un stress léger sur une courte période.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candidats médicaments.
Remplacement
Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.
Réduction
Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 12 primates réparties en 4 lots de 3. 4 lots car nous testons trois molécules différentes (une molécule par lot) et un lot contrôle en plus pour pouvoir comparer les résultats selon une base. Le fait d'avoir 3 animaux par lot permet d'avoir plus d'assurance en cas de résultats variables au sein d'un groupe. En effet, des résultats divergeant sur deux animaux sont difficiles à interpréter, trois animaux par groupe est donc le plus petit nombre possible qui permet cette approche de détermination égalitaire des résultats.
Raffinement
Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement.Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (exemple : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises (exemple : céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude.
Choix des espèces
La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces molécules d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.
Etude de l’efficacité anti-tumorale des ligands des prohibitines dans le cancer du rein humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Évaluer si des ligands de deux protéines membranaires, les prohibitines, freinent le cancer du rein humain : 440 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, les expérimentateurs greffent en haut du dos de chaque souris des cellules tumorales humaines, puis injectent le composé à tester deux fois par semaine pendant trois semaines, la tumeur étant mesurée chaque semaine au pied à coulisse. Le porteur affirme que le développement tumoral n'est pas douloureux pour les animaux et présente l'absence d'incision comme une garantie de confort. La perte de poids liée aux composés injectés figure parmi les points limites qui mettront fin à l'expérience pour les souris concernées.
Objectifs
Le cancer du rein (CaR) de l’adulte représente 431 000 nouveaux cas et 179 000 décès par an dans le monde (14 000 cas, 5000 décès en France). Dans 85% des cas, il s’agit d’un carcinome à cellules rénales (CCR) se développant à partir des structures tubulaires matures. Le carcinome à cellules claires (CCC, issu des tubules contournés proximaux) constitue 75% des CCR et est caractérisé, notamment, par une inactivation du gène suppresseur von Hippel-Lindau. Dans 15% des cas de CCR il s’agit d’un carcinome rénal papillaire (CP, issu des tubules contournés distaux) qui peut être de bon ou mauvais pronostique. Comme le CCC, ils sont caractérisés par une très forte hétérogénéité (histopathologique, moléculaire, génétique), qui participe à la résistance aux thérapies. Au diagnostic 50% des CCC sont ou seront métastatiques. Après exérèse, si non métastatique, une thérapie adjuvante est proposée. Dans les cas métastatiques, ce sont des associations thérapeutiques qui sont utilisées. Cependant, malgré un gain dans la survie sans progression, et la survie globale, ces traitements restent non curatifs. En outre, aucun biomarqueur moléculaire prédictifs de réponse ou de résistance n’a été validé. De nouvelles cibles thérapeutiques sont activement recherchées pour le CaR. Les PHB1 et 2 eucaryotes humaines sont des protéines membranaires très conservées impliquées notamment dans le métabolisme énergétique, la prolifération, l’apoptose et la sénescence. Des données montrent une expression altérée des PHBs dans certains types de cancer (pancréas, vessie…), et une seule publication dans le CaR pour la PHB2. Des données préliminaires non publiées in vitro sur des ligands suggéraient la possibilité que ce système puisse être impliqué dans la viabilité cellulaire dans le CaR. C’est dans ce but que nous allons évaluer l’oncogénicité des PHBs dans ce cancer, en axant plus spécifiquement sur le CCC et le CP, afin de proposer de nouvelles options thérapeutiques basées sur leur inhibition par les ligands.
Bénéfices attendus
Le CaR reste un problème majeur de santé publique aux stades avancés et métastatiques malgré les prises en charges thérapeutiques qui ont bien évolués ces dernières années. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques reste essentielle. Notre projet entre dans ce cadre de recherche, avec des outils transposables en clinique. Les 1ers résultats obtenus in vitro sont très prometteurs quant à la nature oncogénique de ce système, dont le ciblage pourrait ainsi étoffer l’arsenal thérapeutique disponible. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour contenir la maladie, voire l’éradiquer.
Procédures
Les souris anesthésiées (sous anesthésie générale gazeuse) subiront une injection de cellules tumorales puis 2 injections par semaine pendant les 3 semaines du traitement à tester. L’expérimentation durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique, et le poids des souris mesuré.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’injecter des cellules en sous-cutané en haut du dos des souris, donc aucune incision, aucune chirurgie, et sous anesthésie générale à l’isoflurane qui permet une induction et un réveil rapide. Nous avons une très forte expérience du développement de modèles CDX avec plusieurs lignées de divers types de cancers, et dans les traitements quel que soit le mode d’injection. Une nuisance attendue éventuelle sur les animaux est une légère douleur, voire un risque mineur d’inflammation au point de piqure lors des injections ip. des composés prévues 2 fois par semaine, mais qui est largement amoindrie par l’anesthésie gazeuse que nous utilisons. Une autre nuisance potentielle est la perte de poids liée aux composés injectés, et cela fait partie des points limites lors des expérimentations.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires.
Remplacement
Le CaR, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique intra et inter-individu. Les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Idem pour les systèmes de culture 3D, en cours de développement, qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme, même s’ils demeurent un outil indéniable comme première approche. En outre, il est connu que les études uniquement réalisées sur lignées cellulaires en culture peuvent donner des résultats artéfactuels, notamment dans le CaR, car les cellules en culture ont des sensibilités aux molécules qui ne sont pas retrouvés dans les modèles in vivo, comme les modèles CDX (xénogreffe de cellules tumorales), grâce notamment au microenvironnement qui est recréé dans les xénogreffes chez l’animal. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser les modèles in vivo, comme le modèle CDX, au plus proche des caractéristiques de la pathologie humaine, pour conforter les résultats. Le modèle CDX est un modèle de choix en comparaison aux modèles in vitro car les tumeurs qui se développent bénéficient d’un environ tumoral comme celui retrouvé in situ, avec également une vascularisation du tissu, très importante pour que les molécules testées arrivent jusqu’aux cellules tumorales.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, avec 10 souris par groupe expérimental pour les CDX, pour une raison statistique. En effet c’est le nombre nécessaire pour pouvoir faire des tests statistiques sur 8-10 souris dans chaque groupe. De notre large expérience on sait qu’il faut xénogreffer 10 souris pour pouvoir faire des statistiques sur 8-10 souris, car les tumeurs ne se développent pas sur toutes les souris mais dans 80% des cas minimum. Pour une question logistique nous prévoyons un groupe contrôle par formulation. Nous avons une forte expérience de ces expérimentations. Le nombre de souris nécessaire au projet a été calculé mathématiquement pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et les expériences réalisées sous PSM. L’expérimentation se fera sous anesthésie générale à l'isoflurane. Pour un meilleur confort, nous prévoyons d’alterner les côtés lors des injections ip (flancs droit et gauche) ; comme les expérimentations se font sous anesthésie gazeuse, une acclimatation n’est pas nécessaire, sauf celle de minimum 2 semaines lors de la réception des souris par le fournisseur. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. Il est à noter que le développement tumoral n'est pas douloureux pour les animaux. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immunodéprimés pour permettre le développement d'un tissu étranger, donc pour éviter les rejets de xénogreffes. En grande majorité les animaux utilisés sont des rongeurs (souris, rat), mais la souris est préférée au rat car elle présente une pharcodynamique plus proche de l’humain que celle du rat, et est plus facilement maniable (préhension, hébergement…) ; il s’agit donc du modèle de référence pour ces expérimentarions. Nous utiliserons des souris jeunes âgées de 6 à 7 semaines afin d’avoir un système immunitaire, autre que celui provenant du thymus, encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de xénogreffe optimale après injection des lignées cellulaires.
Etude de l’effet d’un mélange d’acides aminés inclus dans l’alimentation de la truite arc-en-ciel, sur sa croissance et sa résistance à des conditions environnementales stressantes
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
Tester si un mélange d'acides aminés vendu par une entreprise améliore la croissance des truites d'élevage : 1 600 truites arc-en-ciel juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont pêchées à l'épuisette six fois puis anesthésiées pour la pesée, et 384 d'entre elles subissent une prise de sang avant d'être tuées dans la foulée. Pendant les 28 derniers jours, les 1 344 poissons restants passent quatre heures par jour dans une eau chauffée de 19 à 21 °C et appauvrie en oxygène, un stress d'élevage estival reproduit à dessein. Le porteur indique que ce mélange est déjà commercialisé pour l'alimentation animale et que son usage en salmoniculture pourrait augmenter avec les chaleurs estivales.
Objectifs
Les acides aminés sont des molécules organiques aux multiples rôles, constituants des protéines et polypeptides, indispensables au bon fonctionnement du vivant. Certains de ces acides aminés ne sont pas synthétisés par les organismes vivants et doivent donc être apportés par l’alimentation. Ces dernières années, en élevage, il est devenu courant d’enrichir l’aliment des animaux avec différentes sources d’acides aminés (issus de fermentation bactérienne, d’extraction chimique ou de synthèse de novo), afin d’obtenir un profil nutritionnel optimal. Cette pratique s’est également développée dans les élevages aquacoles, mettant souvent en évidence une amélioration des performances de croissance et de l’état de santé globale des animaux. Cependant, les différents essais sur le sujet ont mis en évidence que l’effet d’une supplémentation en acides aminés pouvait varier d’une espèce de poissons à l’autre. L’entreprise souhaitant mener cette étude, spécialiste de l’extraction d’acides aminés libres, mène depuis plusieurs années des essais sur le sujet qui ont déjà permis de mettre en évidence des améliorations notables pour l’élevage de plusieurs espèces tropicales d’importance comme le tilapia, le barramundi et la crevette à pattes blanches. Elle souhaite à présent étudier l’effet de son mélange d’acides aminés sur une espèce de poisson d’eau froide importante en aquaculture, la truite arc-en-ciel. Cet essai vise 1) à étudier les effets d’une supplémentation en acides aminés sur les performances de croissance de la truite arc-en-ciel et certains de ses paramètres sanguins, et 2) à voir si les effets d’une supplémentation permettent à la truite de mieux résister à des conditions d’élevage stressantes rencontrées en période estivale (température élevée associée à une baisse de l’oxygène dissous).
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de ce projet est qu’au moins une des doses d’acides aminés incorporées à l’aliment améliore la croissance et/ou la résistance au stress thermique et hypoxique, mettant ainsi en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite en conditions stressantes ou non. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à court ou moyen terme (quelques années), car ce mélange d’acides aminés est déjà commercialisé pour l’alimentation animale. Et si une meilleure résistance des truites à des conditions d’élevage parfois rencontrées l’été était avérée, l’utilisation de ce produit en salmoniculture pourrait rapidement augmenter avec l’augmentation des chaleurs estivales de plus en plus intenses et prolongées.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 types d'interventions : la pêche à l'épuisette et la prise de sang. La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 6 fois sur l'ensemble des poissons présents dans les bassins (transfert dans bac d'anesthésiant avant poids moyens), soit 1600 poissons après 2 semaines, 1536 poissons après 4 semaines, 1472 poissons après 6 semaines, 1408 poissons après 8 semaines, 1344 poissons après 10 semaines, et 1280 poissons après 12 semaines. La prise de sang, d'une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 16 poissons par lot (4 par bassin) à la suite du poids moyen, toutes les 2 semaines. Les poissons dont le sang aura été prélevé seront immédiatement mis à mort ensuite.
Impact sur les animaux
Un stress leger d’1 minute sera engendré sur l’ensemble des 1600 poissons de ce projet lors des pêches nécessaires à la réalisation des poids moyens et des prises de sang, réalisées toutes les 2 semaines. Les poissons utilisés pour la réalisation des prises de sang (4 poissons par bac et par prélèvement, soit 384 poissons) subiront une fois chacun, un stress léger supplémentaire d’1 minute. A l’issu des 56 jours (8 semaines) d’alimentation expérimentale, les 1344 poissons encore en essai seront soumis quotidiennement et pendant 28 jours à un stress modéré. Il consistera en une augmentation de la température (19 à 21°C) associée à une baisse en dioxygène dissous (7 à 5 mg/L), pendant 4h chaque jour. Ce stress pourra se traduire par une diminution de l’activité de nage des poissons. L’ensemble de ces nuisances est considéré comme modéré en raison de la courte durée des manipulations et de la durée quotidienne du stress thermique et hypoxique (4h).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes mesures et analyses (taille-poids individuel, prélèvement de tissus).
Remplacement
Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de ce mélange d’acides aminés sur une espèce de salmonidés. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de résistance à un stress thermique et hypoxique en comparaison d’un aliment non supplémenté en acides aminés, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.
Réduction
Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 réplicas de bac par régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre le travail à fournir pour la réalisation de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (24 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte de la densité d’élevage des poissons (entre 10 et 15 kg/m3 en fin d’essai) pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, sans nuire aux besoins analytiques. Les données issues de cette étude seront étudiées paramètre par paramètre et feront l'objet d'analyses statistiques.
Raffinement
La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés ne risquant pas de blesser les poissons, et les pêches de l’ensemble des poissons de chaque bac se fera par groupe de 15-20 poissons afin de minimiser autant que possible la compression au sein de l’épuisette, tout en limitant le nombre de pêches au sein d’un même bassin. Des tables de suivi de soins et de bien-être des animaux ont été mises en place lors de la réalisation des procédures.
Choix des espèces
L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude car il s’agit d’un poisson d’élevage carnivore d’importance économique en France et dans le monde. De plus, les résultats d’essais obtenus sur cette espèce pourrait être transposés au saumon Atlantique, qui appartient à la même famille et est l’un des poissons d’élevage les plus produits au monde, avec 2,7 millions de tonnes produites en 2020. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 10 g en début d’essai. La croissance et le métabolisme très rapides de poissons de cette taille permettent d’optimiser le temps nécessaire au suivi, et ainsi mettre en évidence un éventuel effet de la dose d’acides aminés testés. Cette taille initiale permet également de réaliser des prélèvements sanguins d’un volume suffisant pour la réalisation des analyses prévues dans cette étude.
Etude du développement cérébral chez des souris modèle de déficience intellectuelle d’origine génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris utilisées ici portent une mutation qui supprime la protéine RSK2 et reproduit le syndrome de Coffin-Lowry, avec ses retards d'apprentissage et ses déficits de mémoire. 586 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Biopsie de la queue vers sept jours, injections intrapéritonéales de marqueurs de neurogenèse, open-field, rotarod, puis piscine de Morris pendant sept jours à raison de huit essais quotidiens d'une minute de nage, un protocole que le porteur ramène à un stress léger limité aux premières minutes. Soixante reproductrices seront réutilisées pour des travaux pratiques, les autres tuées pour analyser leur cerveau.
Objectifs
Le projet consistera à étudier le développement de certaines structures cérébrales importantes pour la cognition chez une souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry. Les patients atteints de ce syndrome présentent une sévère déficience intellectuelle associée à des retards psychomoteurs qui se mettent en place au cours de l’enfance. Selon des études génétiques, cette pathologie est due à des mutations d’un gène qui conduisent notamment à l’absence d’une protéine appelée RSK2. Pour mieux comprendre les altérations qui se mettent en place lors du développement du cerveau en l’absence de RSK2, nous utilisons des souris modèle du syndrome de Coffin-Lowry qui n’expriment pas RSK2. Au cours des projets précédents, nous avons montré que ces souris modèles présentent de nombreuses altérations comportementales et cognitives comme des retards d’apprentissage et des problèmes de mémoire. Ceci est en accord avec les signes cliniques observés chez les patients. Pour ce projet, nous souhaitons désormais étudier le développement de certaines structures cérébrales qui sont impliquées dans les altérations comportementales et cognitives identifiées chez la souris modèle. Ces structures cérébrales continuent de se développer après la naissance, au moment où apparaissent les problèmes comportementaux et cognitifs. Ainsi, nous étudierons chez la souris modèle, les altérations cellulaires et moléculaires qui impactent le développement de ces structures cérébrales au cours de la période postnatale. De plus, nous envisageons désormais de mettre en place des stratégies thérapeutiques afin de corriger au plus tôt ces altérations dans le but de compenser, voire d’éviter la mise en place des problèmes cognitifs chez la souris. Nous testerons notamment si un enrichissement comportemental partiel (3h/jour pendant 3 semaines) dès le plus jeune âge peut être bénéfique pour restaurer le retard de développement du cerveau et restaurer les fonctions cognitives à long terme.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous comprendrons mieux le rôle de la protéine RSK2 dans le développement cérébral et dans les fonctions cognitives. Nous comprendrons notamment pourquoi, en l'absence de RSK2, le développement du cerveau est retardé au cours de la période postnatale, et analyserons plus particulierement le développement postnatal de deux strucutures cérébrales qui sont impactées dans le syndrome de Coffin-Lowry et qui poursuivent leur développement apès la naissance. De plus, pour la première fois, nous testerons une stratégie thérapeutique (enrichissement comportemental) qui devrait permettre de compenser les déficits cognitifs au plus tôt, ou d'éviter leur mise en place. Le modèle animal nous permettra de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Procédures
Pour être génotypés, tous les animaux subiront une biopsie de la queue vers l'âge de 7 jours. Pour le projet, une partie des animaux recevra des injections de marqueurs de neurogenèse. Pour chaque injection, l'animal est maintenu en contention pour effectuer la piqure en intrapéritonéale (durée max 10 secondes). Apres différents délais, ces souris seront euthanasiées afin d'analyser leurs cerveaux. Les prélevements de cerveaux sont réalisés post mortem. Une autre partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée en open-field (duree 20 minutes) et la coordination motrice en rotarod (6 essais sur 3 jours de 3 minutes maximum), ce qui ne génére aucune nuissance. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un leger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 7 jours, à raison de 8 essais par jour (2 blocs de 4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.
Impact sur les animaux
Pour les génotypages, une douleur légère de courte durée peut être ressentie lors de la biopsie de la queue. Les injections qui nécessitent de prendre l’animal en contention peut générer un stress ponctuel de quelques minutes. Lors des tests de comportement, les souris pourraient ressentir un leger stress pendant les premières minutes.
Devenir
Pour la procédure 1, certains reproducteurs pourront être utilisés pour participer à des études comportementales en travaux pratiques. Il s’agit de tests d'exploration, locomotion, d’apprentissage et de mémoire qui n’engendrent aucun stress chez l’animal et reposent sur les comportements spontanés (eg., openfield, exploration d’objets). Les souris des procédures 2, 3 et 4 seront euthanasiées pour étudier leur cerveau.
Remplacement
Notre problématique de recherche consiste à comprendre les altérations du developpement cerébral impliquées dans la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certains mécanismes pourraient être décrits sur des cultures neuronales, il est ensuite absolument nécessaire de valider le rôle des protéines dans le développement cérébral et dans les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales, d'apprentissage et de mémoire.
Réduction
Le nombre d’animaux correspond aux effectifs nécessaires pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 6-8 souris (analyse de la neurogenèse) à 8-15 souris par groupe (comportement) sont nécessaires. Des tests de puissance seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=5), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé (c'est à dire 8 souris dans chaque lot).
Raffinement
Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre à des tâches d’apprentissage, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et pour les habituer à sa présence. La mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela une grille d'évaluation sera utilisée.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Afin d’étudier le développement cérébral et notamment la formation des neurones qui continuent de se mettre en place au cours des premières semaines après la naissance, toutes les souris utilisées seront âgées de 0 à 60 jours. Il sera nécessaire également d’utiliser quelques embryons pour suivre la mise en place de certaines structures cérébrales qui s’installent au cours de la période embryonnaire. Des analyses de comportement seront également effectuées à l'âge adulte (vers 60 jours) afin de vérifier les effets bénéfiques de nos enrichissements environnementaux sur les fonctions cognitives à long -terme.
Evaluation des effets curatifs d’un aliment thérapeutique prêt à l’emploi dans un modèle murin de malnutrition aiguë sévère
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Démontrer qu'un nouvel aliment thérapeutique fait mieux que celui utilisé depuis les années 1990 passe ici par la mise en malnutrition aiguë sévère de souris, un régime pauvre en protéines leur faisant perdre environ 15 % de leur poids en quatre jours. 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tube digestif, foie, rate, reins et cerveau. Elles subissent un gavage quotidien pendant sept jours, huit prélèvements de sang sous anesthésie, cinq séjours de dix heures en cage à fond grillagé pour collecter urine et fèces, et deux tests d'anxiété et d'activité locomotrice de dix minutes. Le porteur met en avant, parmi les bénéfices du nouvel aliment, une composition sans huile de palme ni graisses hydrogénées, plus respectueuse de l'environnement.
Objectifs
Selon un récent rapport de l’Organisation des Nations Unies, 828 millions de personnes ont été touchées par la faim dans le monde en 2021. Parmi les affections liées à la faim, la malnutrition aiguë sévère (MAS), qui se caractérise par une perte de poids très importante et une dysfonction du tube digestif, est une pathologie qui touche à l’échelle mondiale plus de 13 millions d’enfants âgés de moins de 5 ans. La perte de masse sévère chez les enfants de moins de 5 ans cause un cinquième de la mortalité infantile mondiale. Afin de lutter contre cette pathologie un aliment thérapeutique prêt à l’emploi (ATPE) a été développé à la fin du XXème siècle. La composition de cet ATPE n’a pas évolué depuis sa première formulation et pourrait être considérée comme désuète compte tenu des connaissances actuelles en physiologie de la digestion. Ce projet propose de montrer l’efficacité accrue d’un nouvel ATPE par rapport à l’ATPE existant sur la reprise de poids, la fonction intestinale et les fonctions cognitives de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère.
Bénéfices attendus
Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité d'un nouvel aliment prêt à l'emploi (ATPE2) par rapport à un ATPE1 de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère et valider l’ATPE testé en tant qu’aliment thérapeutique pour combattre la malnutrition aiguë sévère. En plus d'apporter une nouvelle solution pour lutter contre la malnutrition aiguë sévère, la composition de l’ATPE2 est plus respectueuse de l’environnement car il ne contient pas de graisses hydrogénées ou d’huile de palme.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Alimentation hypo-protéinée à volonté pour 360 souris vigiles. 2) Administration par gavage sur 360 souris vigiles (Durée 15 sec ; 1x tous les jours pendant 7 jours) 3) Administration à volonté de l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi sur 360 souris vigiles (Durée 5 min/jours pendant 50 jours). Les souris seront placées dans une cage vide avec une boite de pétri contenant l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi ou d’aliment standard. 4) Contention pour mesure de la masse (1x/jours tous les jours, 10 sec), de la longueur de la queue (1x/jours tous les jours, 10 sec) sur 420 souris vigiles. 5) Prélèvement sanguin (1x/7 jours, soit 8 fois, durée 2 min) sur 420 souris anesthésiées. 6) Mesure de l’activité métabolique (cage avec un fond grillagé permettant de collecter l’urine et les fèces) avec une durée de 10h sur 420 souris vigiles (5x) 7) Mesure de l’anxiété et de l’activité locomotrice (1x avant traitement et 1x en fin de traitement, durée 10 min) sur 420 souris vigiles. Les souris sont placées dans une boite de 40x40 cm et sont libres d’explorer cette boite pendant 10 min.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de la malnutrition aiguë sévère est l’importante perte de poids qui, pour la souris, est de l’ordre de 15%. Cet effet est visible après 4 jours de régime hypo-protéiné. De plus, les souris modèles de malnutrition aiguë sévère n’ont pas une courbe de croissance normale, leur masse n’augmentant pas en fonction du temps. Les aliments thérapeutiques prêts à l’emploi sont des produits alimentaires destinés à l’humain et pourraient avoir des effets indésirables sur les souris (Ex : diarrhée). L’induction de la dysfonction intestinale peut provoquer une inflammation du système digestif chez la souris, ce qui pourrait aussi nuire à la digestion normale de l’animal. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du nouvel ATPE. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.
Remplacement
L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’un régime alimentaire au niveau systémique. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 20 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres biologiques sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux seront suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. Dans le cadre de notre projet la perte de poids est l’élément majeur à prendre en compte. Dans le cas d’un animal montrant une perte de poids supérieur à 20% de son poids initial, l’animal sera exclu de l’étude le temps de son rétablissement et à nouveau alimenté pendant la période de convalescence. Si ce nouveau régime alimentaire ne permet pas une reprise de poids et que l’animal atteint les points limites définis il sera euthanasié. Par exemple, un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20% de son poids initial. Enfin, les études sont systématiquement optimisées (durée du régime) d’après la littérature. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible : alimentation (Administration à volonté). Enfin, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse afin de minimiser le stress induit par cet acte sur les animaux.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du produit que nous avons développé. Ce projet a pour but de démontrer qu’un nouvel aliment thérapeutique prêt à l’emploi est efficace dans un modèle de malnutrition aiguë sévère (MAS). Les rongeurs et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines. La pathologie dans notre étude est induite par une diminution de l’apport journalier en protéine. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques de la maladie (dont la perte de poids, ralentissement du développement). Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il est simple, rapide d’utiliser cette espèce et qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles, par rapport aux autres espèces. La malnutrition aiguë sévère est une pathologie qui peut affecter les individus à tout âge. Nous focaliserons notre étude sur la période de développement post-sevrage jusqu’à l’âge adulte. Les symptômes induits par la MAS, ainsi que les effets indésirables, ont une influence délétère à long terme lorsque cette pathologie intervient pendant l’enfance. Il s’agit donc ici de modéliser cette affection durant le développement, ce qui correspondra à la MAS observée durant l’enfance. De plus, des paramètres de développement pourront être mesurés durant l’expérimentation et comparés à ceux d’un développement normal (Poids, dimension des organes) en fonction de l’âge des animaux.
Evaluation de l’intérêt d’une ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons focalisés pour permettre une scintigraphie cérébrale avec un nanobody radiomarqué (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La barrière qui protège le cerveau est ouverte par ultrasons focalisés, geste qui peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème visibles à l'imagerie. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après la dernière séance d'imagerie. Elles font l'aller-retour entre leur animalerie et une plateforme d'imagerie, reçoivent une molécule radioactive par voie intraveineuse et passent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie, d'une heure au maximum chacune, l'enjeu étant de mettre au point un traceur pour diagnostiquer plus tôt la maladie d'Alzheimer chez l'être humain. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque les souris sont anesthésiées pendant l'imagerie, et annonce des points limites "adaptés aux modèles" sans dire lesquels.
Objectifs
L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.
Bénéfices attendus
Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).
Impact sur les animaux
La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.
Devenir
A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.
Remplacement
Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.
Réduction
Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.
Choix des espèces
Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.
Evaluation d’un ciblage de PCSK9 dans le cadre d’un traitement des conséquences cardiovasculaires du syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez des souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Placées quatorze ou cinquante-six jours dans un dispositif qui leur coupe l'oxygène par intermittence pour reproduire des apnées du sommeil, 446 souris vont être utilisées dans ce projet, 338 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 108 un niveau léger. S'y ajoutent une injection du traitement testé au premier jour, puis aux jours 28 et 42 pour les plus longuement exposées, deux à quatre prélèvements de sang, trois mesures quotidiennes de pression artérielle sous contention pendant trois jours, une échographie cardiaque de trente minutes sous anesthésie et un transport en voiture entre deux établissements. Le porteur relève un stress modéré et une légère perte de poids les trois premiers jours d'hypoxie, le temps que les souris s'adaptent. Les 338 souris de la partie expérimentale sont tuées par prélèvement de sang sous anesthésie pour analyse de leurs organes, les 108 autres restant en vie pour la reproduction.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une pathologie touchant 5-20% de la population générale, caractérisée par des apnées répétitives pendant le sommeil conduisant à un manque d’oxygène dans le sang, qu’on appelle hypoxie intermittente (HI). Les complications cardiovasculaires qui en découlent posent un réel problème de santé publique, avec en particulier une incidence accrue d’athérosclérose chez les patients SAOS conduisant à une augmentation de la mortalité par infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Le traitement de référence du SAOS, la pression positive continue (PPC), permet d’améliorer les symptômes et la qualité de vie des patients, mais son effet sur le risque cardiovasculaire reste controversé. Ainsi, un axe futur de la prise en charge des patients apnéiques est d’associer la PPC à un traitement permettant de réduire le risque cardiovasculaire, mais il est nécessaire de bien connaitre les mécanismes associés au SAOS pour cibler les thérapeutiques les plus pertinentes. Parmi les mécanismes impliqués dans les premières phases de la formation des plaques d’athérome on peut citer une inflammation et des problèmes de paroi des vaisseaux, entraînant une augmentation de la migration des globules blancs et conduisant à un remodelage des vaisseaux avec un épaississement de la paroi et l’apparition de lésions d’athérosclérose. Ces phénomènes vont ainsi être activés chez les patients SAOS. Une protéase d’intérêt à commencer à se détacher ces dernières années dans la recherche sur l’athérosclérose. Notre hypothèse est donc que cette protéase serait un acteur majeur des troubles aux niveaux des parois des vaisseaux induits par l'HI. Afin de confirmer cette hypothèse nous voulons évaluer l’impact d’un blocage de cette protéase sur le remodelage vasculaire provoqués par une hypoxie intermittente, dans nos modèles expérimentaux de souris. Nous espérons ainsi déterminer si cette protéase pourrait servir de cible thérapeutique pour les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si notre protéase d’intérêt pourrait être une cible thérapeutique possible pour lutter contre les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Celles-ci n’ayant pas de traitement suffisamment efficace actuellement, et les anticorps contre celle-ci étant déjà approuvés chez l’homme pour d’autres indications, les résultats de cette étude pourraient conduire à proposer un nouveau traitement à moyen terme pour ces malades.
Procédures
Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 14 ou 56 jours selon leur groupe. Le traitement étudié sera injecté aux animaux le premier jour pour les animaux exposés 14 jours et les jours 28 et 42 pour ceux exposés 8 semaines (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Deux prélèvements sanguins auront lieu pour les animaux exposés 2 semaines, et quatre prélèvements pour les animaux exposés 8 semaines (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jour pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives à la queue. La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure). L'imagerie sera réalisée dans un des établissements utilisateurs et toutes les autres interventions se dérouleront dans l'autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection de médicament ce qui conduira à un léger stress. Les animaux se verront aussi prélever de sang toutes les semaines ou toutes les deux semaines ce qui entrainera un léger stress. La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. Enfin le transport des animaux après les échographies entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront tous maintenus en vie pour effectuer les reproductions. Tous les animaux de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires.
Remplacement
L’étude du remodelage des vaisseaux nécessite des manipulations invasives ce qui exclut une étude in vivo chez l’homme. Nous utilisons des modèles cellulaires pour les premières étapes de nos travaux, mais ils ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier. Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur l’intégrité et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été défini à minima, soit 12 par groupe, afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Cette valeur a été obtenue par une approche statistique. Nous évaluerons la présence d’un effet sexe sur nos résultats après la première série d’expérimentations. S’il n’y a pas de différences entre les sexes alors nous rassembleront nos groupes d’animaux et réduirons leur nombre de moitié. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (pour les mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement. Une fois réceptionnées, les souris seront transférées dans des cages propres pour une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations dans la salle où se trouve le dispositif à hypoxie intermittente. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition ad libitum en nourriture et eau. De plus, un enrichissement de leur milieu de vie adapté sera mis en place pendant la période d’acclimatation et d’expérimentation. Les conditions d’hébergement respecteront les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Afin de limiter leur angoisse, ils seront acclimatés à l’expérimentateur pendant ces 7 jours. Tout comportement anormal sera signalé afin de mettre en place des soins adaptés. Le vétérinaire responsable des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle. Les animaux seront examinés quotidiennement et pesés de manière hebdomadaire par les zootechniciens ou l’expérimentateur.
Choix des espèces
Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur les parois des vaisseaux et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser les souris sauvages et génétiquement modifiées, déjà existantes au laboratoire. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. De plus, l’anatomie des vaisseaux de la souris est parfaitement connue et les outils qui permettront l’analyse sont déjà maîtrisés au laboratoire. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur le système vasculaire sans être biaisé par l’effet de l’âge.