Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude des caractéristiques pharmacocinétiques des composés d’intérêts administrés par voie intra-veineuse, voie intrapéritonéale ou voie orale en dose unique chez le rat ou chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 780
1 560 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal reçoit une administration unique d'un composé par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse, subit jusqu'à deux prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, puis est tué et exsanguiné par perfusion intracardiaque, pour mesurer le devenir des molécules dans l'organisme avant leur passage vers des programmes ciblés. Le porteur décrit un projet "généraliste" en amont, servant de filtre de sélection des molécules, et estime les nuisances faibles hormis une éventuelle toxicité aiguë. Sur le remplacement, il concède que des tests in vitro miment la métabolisation hépatique mais conclut que le modèle animal est "incontournable" pour la pharmacocinétique.
Objectifs
Les propriétés physico-chimiques des composés étudiés leur confèrent des propriétés pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo. Pour étudier l’efficacité pharmacologique des molécules dans un modèle donné ou dans une pathologie précise, il est nécessaire de savoir comment la molécule se comporte une fois administrée à un organisme vivant. C'est-à-dire quelle sera son impact et son devenir dans un organisme dans lequel elle est administrée. Le projet décrit ici a donc pour objectif de détailler des procédures de pharmacocinétiques expérimentales préalables au développement des molécules innovantes dans diverses pathologies. Pour être efficaces, les molécules doivent pouvoir atteindre leur cible, une fois administrées, car les molécules subissent une métabolisation ou une dégradation puis une élimination, la voie d’administration sera donc aussi un facteur essentiel sur la biodisponibilité de la molécule dans l’organisme. Ce projet « généraliste » se place donc en amont de nos programmes de recherches spécifiquement dédiés à une pathologie, il est composé de procédures expérimentales standardisée (voies IP, IV ou PO chez rats et souris) pour les études des caractéristiques PK (pharmaco kinetic en anglais) des molécules qui viendront alimenter les programmes de recherches avals. Ces procédures préalables nécessitent peu d’animaux au regard de l’ambition des programmes menés, ils permettent d’ajouter un filtre supplémentaire dans notre arbre de sélection des nouvelles molécules qui seront destinées aux études d’efficacité chez l’animal. L’ensemble des procédures décrites dans ce projet appliquées à des souris et des rats nécessitera l’emploi de 1560 animaux pour la durée de 5 années que couvre ce projet.
Bénéfices attendus
Ces études préalables aux études d’évaluation de l’efficacité des composés dans les modèles développés dans une pathologie données, permettent de déterminer les conditions optimales d’administration des principes actifs étudiés. Cela peut donc contribuer à obtenir des modèles plus qualitatifs (conditions optimales) et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés (moins de répétitions d’étude).
Procédures
Chaque animal inclus dans les procédures 1 à 4 subira une seule administration, selon les cas elle pourra être réalisée par voie intraveineuse (IV), Intrapéritonéale (IP) ou per-os (gavage intragastrique PO). Les injections IP et IV durent 10 à 15 secondes et peuvent nécessiter l’emploi d’un dispositif de contention lorsque les IV sont faites dans la veine caudale ou au sinus retro-orbitaire. Les administrations PO durent 5 à 10 seconde et sont pratiquées sur un animal maintenu en contention manuelle. • Les procédures 1 et 2 concernent les PK plasmatiques, chaque animal inclus dans ces procédures subira au maximum 2 prélèvements sanguins, ils sont pratiqués sous anesthésie volatile par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. Chaque prélèvement dure environ 20 seconde. •Les procédures 3 et 4 concernent les PK plasmatiques et tissulaire, chaque animal inclus dans ces procédures subira un prélèvement sanguin unique (terminal) réalisé sous anesthésie volatile (durée 20 secondes) par une ponction au sinus retro-orbitaire faite par un capillaire en verre. L’anesthésie volatile sera maintenue afin de procéder à l’euthanasie puis à l’exsanguination rapide par une perfusion intracardiaque (durée 30-40 secondes) d’une solution physiologique héparinée.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont produites par les administrations des composés, et sont estimés faibles ou modérées et uniquement produites lors des administrations par voie intraveineuse (au sinus retro-orbitaire) pour lesquelles le recours à l'analgésie est prévue. Les prélèvements sont effectués sous anesthésie et ne produisent pas d'inconfort autre que celui de l'état de l'animal au sortir de son anesthésie. On ne peut pas occulter l’éventualité d’une toxicité aigue post administration du composé étudié mais comme les produits utilisés ne sont administrés qu’une seule fois et qu’ils sont dosés faiblement, , la probabilité d’observation de signes clinique est très minime, mais permettrait les cas échéant de juger de la sévérité de la souffrance et de l’atteinte de points limites qui déclenchent un arrêt anticipé.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédures expérimentale. Dans le cas des procédures 1 et 2, bien que nous n'étudions que l'exposition plasmatique, nous mettrons les animaux à mort car il ne peuvent en aucune mesure être employés dans d'autres études ( ils ne sont plus naifs et ont pu stocker des quantités de composés ou de ses métabolites). Dans les cas des procédures 3 et 4, ils sont mis à mort au temps de cinétiques indiqués pour les mesures d'exposition des composés dans les organes clés du métabolisme (foie, reins, etc )
Remplacement
L'objectif principal est d'évaluer la pharmacocinétique de nos molécules suite à une administration per os qui est la voie la plus utilisée dans la Pharmacopée. Cette voie d’administration impose aux molécules un 1er passage entérohépatique lors duquel se déroulent de nombreuses modifications chimiques, même si des tests de stabilité mimant l’action des cytochromes peuvent être appréhendés in vitro, le modèle animal est incontournable pour la réalisation des études de pharmacocinétiques. D’autres voies d’administration systémique (intraveineuse ou intrapéritonéale par exemple) vont renseigner sur les paramètres ADME, elles pourront aussi être utilisées. Ces études seront menées sur animaux sains ou sur des animaux dans un état pathologique induit expérimentalement, en effet la pharamcocinétique des produits peut être modifée dans ces circonstances.
Réduction
Les méthodes analytiques sont performantes, de faibles quantités sont décelables de minière reproductibles, cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à ces études de pharmacocinétique.
Raffinement
Le point sur lequel l'expérimentateur peut agir concerne le raffinement au moment des administrations et prélèvements au cours desquels on apporte un confort par l'utilisation d'analgésique ou de moyens anesthésiques s'ils est avéré qu'ils n'induisent pas un biais expérimental.
Choix des espèces
Les rats et les souris constituent des modèles reconnus dans la littérature scientifique pour l’étude pharmacocinétique de molécules. Les animaux utilisés seront des animaux jeunes rats adultes à adultes ( 175-200gr minimum) ou des souris adulte de 25-30 gr , il ne sera pratiqué aucune expérience sur des animaux nouveaux-nés.
Rôle du récepteur nucléaire CAR comme senseur hépatiques des fibres alimentaires dans les maladies métaboliques du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour invalider le gène CAR, elles sont soumises trente semaines à un régime gras qui induit obésité et foie gras, avec gavages oraux, tests de tolérance au glucose et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal d'organes, pour étudier le rôle des fibres alimentaires et du microbiote dans les maladies du foie. Le porteur affirme que le régime provoque ces désordres "sans souffrance visible", et signale que le gavage peut stresser les animaux et irriter l'œsophage. Sur le remplacement, il décrit un dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux qu'aucun modèle cellulaire ne reproduirait, et conclut au recours à l'animal "entier".
Objectifs
Le syndrome métabolique affecte actuellement 18% de la population française. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de lipides dans celui-ci puis peuvent évoluer vers des stades plus avancés d'inflammation, de fibrose et de dysfonction du foie. Ces maladies représentent maintenant la 2ème cause de transplantation de foie et aucun médicament contre ces maladies n'a été approuvé. De plus, des études ont démontré que l’augmentation de la température d’hébergement des animaux, associée à un régime gras permettait d’induire le développement d’une maladie du foie plus sévère. Par ailleurs, le microbiote intestinal est impliqué dans le développement de cette maladie en produisant des petites molécules qui circulent entre l’intestin et le foie via la veine porte et qui peuvent favoriser le développement de l’inflammation dans le foie. Les fibres alimentaires (dont l’inuline) peuvent être transformées par le microbiote intestinal et ont des effets bénéfiques sur ces maladies hépatiques. Les effets de l’inuline sont dépendants des petites molécules produites par le microbiote intestinal, cependant ces molécules et les mécanismes en jeu dans le foie sont peu connus. Nos résultats préliminaires démontrent que les fibres alimentaires ont également un impact sur une protéine (le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor) connue pour être impliqué dans le maintien des fonctions de détoxification et de métabolisme lipidique du foie. Dans ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie. Ainsi, pour cette étude, nous utiliserons des souris dont le gène CAR a été invalidé et qui seront nourries avec un régime gras induisant une maladie hépatique similaire à celle observée chez l’Homme. Les institutions internationales recommandent de prendre en compte l’effet du sexe dans le métabolisme énergétique puisqu’il existe chez l’Homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement de la NAFLD mais également dans l’expression du récepteur CAR, donc nos études seront effectuées dans les 2 sexes.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact des fibres alimentaires fermentescibles sur le développement des maladies hépatiques et via la production de molécules microbiennes et leur impact sur le récepteur CAR. L’identification de molécules issues du microbiote intestinal et ayant des effets bénéfiques ou délétères sur le foie permettra une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques hépatiques et aidera potentiellement au développement de futurs agents thérapeutiques issus du microbiote intestinal (pro-, pré- ou post-biotiques) dans ces pathologies.
Procédures
Après les 2 semaines d’acclimatation, les animaux seront placés sous régime Western Diet (WD). Au cours des 30 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests de tolérance orale au glucose (semaine 14 et 28) et 2 tests de mesure de la perméabilité intestinale in vivo qui nécessiteront un gavage oral puis un prélèvement d’un ou 2 gouttes de sang à la queue. Le gavage oral sera réalisé après une contention rapide de l'animal puis un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée. Le geste de contention et de gavage durera moins d'une minute par animal. Les prélèvements sanguins à la queue seront réalisés après application d'un analgésique local sur la queue puis une incision légère de celle-ci sera réalisée. Le geste de prélèvement sanguin durera moins d'une minute par animal et nécessitera un maintien uniquement de la queue. Après 30 semaines de régime, nous procéderons à un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le régime WD induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Lors du test de tolérance orale au glucose et de la mesure de la perméabilité intestinale in vivo, le gavage oral peut provoquer un stress lié à la contention et des irritations de l’œsophage. Le prélèvement sanguin à la queue peut parfois induire un changement comportemental chez les souris mâles qui nécessitera une surveillance accrue des animaux afin d’éviter l’agressivité.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Différents organes (foie, intestin, …) seront prélevés afin d’approfondir les connaissances sur l’impact des fibres sur le développement des maladies hépatiques via la production de molécules microbiennes, ainsi que la fonction du récepteur CAR dans cet axe microbiote intestinal-foie.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme cardiaque, respiratoire et de la nature de ceux-ci) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris (C57Bl6J) soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition des maladies hépatiques. De plus, nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur CAR dans les pathologies hépatiques, ainsi nous utiliserons un modèle murin C57Bl6J déficient pour le récepteur CAR au niveau systémique. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression le récepteur CAR.
Etude des facteurs de pathogénicité de virus influenza aviaire A(H1N2)v chez la dinde
- Recherche appliquée
- Maladies animales
120 dindes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des dindes reproductrices de 32 semaines sont infectées par des virus influenza aviaires puis soumises à des écouvillonnages du bec et du cloaque et à des prises de sang répétées pendant deux semaines, avant prélèvement d'organes, pour caractériser dix virus et leur franchissement de la barrière d'espèce. Le porteur indique que l'infection provoque de fortes chutes de ponte pouvant aller jusqu'à l'arrêt total, et qualifie ces virus de faiblement pathogènes. Il écarte le remplacement au motif que la pathogénicité ne peut pas s'évaluer in vitro, invoquant la "nécessité" d'un test in vivo sur l'espèce cible.
Objectifs
Depuis début 2020, de nombreux cas d’influenza ont été identifiés dans le grand ouest et principalement en Bretagne dans les élevages porcins et sont causés par des virus influenza porcin A(H1avN2) DK-EA. Un virus proche, appelé A(H1N2)v a été caractérisé chez un patient hospitalisé en Bretagne en août 2021. Des virus similaires ont également été mis en évidence depuis avril 2020 dans des élevages de dindes présentant des symptômes de chute de ponte. Ce projet vise, dans le contexte actuel d’ « une seule santé », à identifier les déterminants moléculaires viraux de la pathogénicité de virus influenza aviaires A(H1N2)v dans un modèle d’infection chez des dindes reproductrices de 32 semaines, ainsi que ceux pouvant intervenir dans le franchissement de barrière d’espèce. Les dindes reproductrices âgées de 32 semaines représentent le modèle approprié pour reproduire les symptômes observés sur le terrain en élevage. Pour ce faire, une procédure expérimentale sera mise en place et répétée au plus 10 fois afin de caractériser la pathogénicité et les facteurs intervenant dans le franchissement de la barrière d’espèce de 10 différents virus influenza aviaire A(H1N2).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser 10 différents virus influenza A(H1N2) chez des dindes reproductrices de 32 semaines, représentant le modèle approprié pour reproduire les symptômes observés sur le terrain en élevage. Ce projet permettra en particulier de caractériser la pathogénicité de ces différents virus chez la dinde (signes cliniques, lésions, cinétique d’excrétion virale…), mais également d’identifier les déterminants moléculaires viraux pouvant intervenir dans le franchissement de la barrière d’espèce.
Procédures
Des observations cliniques quotidiennes, des prélèvements par écouvillonnage oro-pharyngé et cloacal et des prélèvements de sang seront effectués sur les animaux pour les différentes répétitions de la procédure tels que : - En tout, 7 écouvillons oro-pharyngés et 7 cloacaux par animal pour le lot B inoculé et 2 écouvillons oro-pharyngés et 2 cloacaux pour le lot A témoin seront réalisés dans les 14 jours. Chaque prélèvement d’écouvillon oro-pharyngé et cloacal dure une minute maximum par animal, en intégrant la contention de l’animal pour réaliser le prélèvement. - En tout, 4 prises de sang au sinus occipital pour le lot B et 2 pour le lot A seront réalisées dans les 14 jours. Pour chaque prélèvement de sang, 1 à 2 mL de sang seront prélevés par animal. Chaque prise de sang dure 30 secondes maximum par animal car les prélèvements sont effectués après la réalisation des écouvillons et ne nécessitent pas une contention supplémentaire des animaux. - Prélèvements d’organes sur les animaux mis à mort.
Impact sur les animaux
Les différents virus influenza A(H1N2) utilisés causent des signes cliniques modérés chez les dindes reproductrices. Les effets indésirables prévus pour les animaux inoculés sont des fortes chutes de ponte allant jusqu’à une absence totale de ponte quelques jours après infection et durant quelques jours.
Devenir
Pour la procédure réalisée et répétée plusieurs fois, les animaux seront systématiquement étourdis puis mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les animaux choisis pour ce projet sont uniquement des dindes reproductrices de 32 semaines, qui représentent le modèle approprié pour reproduire les symptômes observés sur le terrain en élevage. L’étude de la pathogénicité ne peut pas être évaluée in vitro d’où la nécessité de mettre en place un test in vivo chez l’espèce cible aviaire la plus adaptée pour évaluer la pathogénicité, c’est-à-dire les dindes reproductrices ainsi que pour évaluer les caractéristiques du virus permettant un franchissement de barrière d’espèce.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible tout en permettant l’obtention de résultats statistiquement significatifs à l'aide de tests statistiques adaptés. En effet, certaines répétitions de la procédure seront regroupées afin de n’avoir qu’un seul lot témoin pour deux ou plusieurs lots infectés en parallèle.
Raffinement
Les dindes seront hébergées dans des cages conformes aux conditions exigées en expérimentation animale (litière, densité, points d’alimentationet d’abreuvement…), dans des animaleries confinées de niveau 2 pour volailles. Concernant la taille des animaleries, le nombre d’animaux autorisé règlementairement pour une surface donnée sera respecté, à savoir 0,55 m2/animal. L’eau et l’aliment seront fournis ad libitum et des enrichissements appropriés tels que des cordelettes suspendues, seront mis à disposition. Les virus influenza A(H1N2) utilisés dans cette étude sont faiblement pathogènes et leur degré de sévérité est qualifié de modéré. Par ailleurs, lors de la création de virus mutés par génétique inverse, une réduction de fonction sera recherchée, diminuant ainsi la pathogénicité chez les dindes. Dans l’éventualité de signes cliniques provoqués par le virus occasionnant un mal-être chez l’animal, des points limites ont été définis pour que les animaux soient mis à mort avant que la souffrance ait un atteint un seuil non acceptable. L'approche pour réduire la souffrance des animaux réside également dans l’instauration d’observations cliniques quotidiennes.
Choix des espèces
Les espèces choisies sont des espèces des dindes représentatives de l’espèce sensible d’après les données observées sur le terrain dans les élevages. Les dindes seront âgées de 32 semaines, âge pour lequel la maturité sexuelle est atteinte et pour lequel les dindes produiront des œufs. Cet âge se justifie dans la mesure où les principaux signes cliniques observés sur le terrain suite à l’infection par le virus A(H1N2) sont des chutes de ponte chez des dindes reproductrices.
Evaluation de l’effet d’un nouveau traitement sur la douleur dans un modèle d’inflammation aigüe microcristalline.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection de cristaux d'urate dans une articulation déclenche une crise de goutte, puis leurs pattes subissent des stimulations mécaniques et thermiques répétées jusqu'à six fois par jour et des administrations de composés par de multiples voies, pour tester des candidats analgésiques. Le porteur indique que l'inflammation peut provoquer douleur, gonflement, ulcères et automutilation, et que ce modèle sévère laisse les animaux douloureux, ce qui exclut selon lui de les garder en vie. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes in vitro n'étudient que la nociception et non la douleur avec sa composante émotionnelle, et conclut que l'animal vigile reste la "seule option" avant l'humain.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin important de santé, celui du traitement des poussées aiguës d’arthrite goutteuse, qui occasionnent une souffrance importante, un handicap, et des séquelles à terme. Les dépôts de cristaux d’urate de sodium au sein des articulations sont fréquents et touchent plus de 17.5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante Certains médicaments utilisés pour contrer cette pathologie induisent des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens ou les corticoïdes sont aussi capables de contrôler l’inflammation goutteuse. Enfin, de nombreux patients ne peuvent pas utiliser ces médicaments en raison des comorbidités. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. Les modèles expérimentaux d’arthrite sont utilisés depuis longtemps pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, et non à inhiber la douleur. Celle-ci est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments innovants dans un modèle d’arthrite induite par des cristaux d’urate.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d'améliorer la prise en charge des patients par la mise au point de nouveaux traitements. Il répond à un besoin important de santé, celui du traitement des poussées aiguës d’arthrite goutteuse, qui occasionnent une souffrance importante, un handicap, et des séquelles à terme.
Procédures
Induction du modèle : injection intra-articulaire afin d’induire le modèle (quelques secondes à 2-3 minutes). Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, intra-articulaire, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
L’injection de cristaux d’urate est faite au niveau d’une articulation : Ceci peut entrainer une douleur articulaire ainsi que les symptômes d’une inflammation locale : rougeur, gonflement, chaleur. Quand l’inflammation est trop importante, les animaux peuvent se mutiler ou des zones ulcéreuses peuvent apparaître. - Nuisances liées aux tests : les animaux sont isolés en compartiments plexiglas, et leurs pattes arrière sont stimulées à plusieurs reprises. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Nuisances liées à l’administration de composés clients. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires qui sont listés dans les points limites (sédatio, posture anormale..)
Devenir
Le modèle d’arthrite est un modèle sévère. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Une expérience préliminaire permettra de valider le modèle et de déterminer le nombre d’injections nécessaires afin de réduire le nombre de groupes et donc d’animaux dans l’expérience principale. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum nécessaire pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (briquettes en bois, tunnel en polycarbonate rouge transparent) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre des tests thermiques, le choix des températures est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite à l’induction du modèle : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de l'entreprise. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the Study of Pain) est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux péri-adolescents à adolescents. (5-7semaines ; 190-240g le jour d’induction du modèle). Ce stade a été choisi car il est adapté au développement du modèle, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Etablissement d’un modèle de défaillance hépatique aigue induit par un stress oxydatif et une inflammation. Evaluation de propriétés de composés actifs dans ce modèle expérimental.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 1380
2 760 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 2 400 étant classés en gravité sévère. Après un jeûne nocturne, ils reçoivent trois injections en trois jours, de pyrazole imitant une alcoolisation massive et de lipopolysaccharide, pour provoquer une défaillance hépatique aiguë, puis sont tués pour prélever foie, cerveau et reins. Le porteur indique attendre baisse d'activité, baisse de température et signes de douleur après les injections. Il présente le modèle comme un outil d'évaluation rapide de composés pour un "programme de développement pharmaceutique" et justifie le choix des espèces en une seule phrase.
Objectifs
La cirrhose est une maladie irréversible du foie caractérisée par un état inflammatoire continue de l’organe qui use les cellules, perturbe le fonctionnement des cellules et entraine leur destruction. La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes et qui survient de manière aiguë, généralement en raison d'événements précipitants de différentes natures, tels qu’un épisode infectieux, une affection virale ou une prise excessive d’alcool ou de médicaments. Lors de phase aigüe d’aggravation, il se produit un emballement de la réaction immunitaire et inflammatoire déterminante pour la survie des patients cirrhotiques dont le foie fragilisé n’est pas armé pour lutter contre cette agression. L’alcool est principalement métabolisé dans le foie, il produit un stress oxydant pour les cellules et les tissus par une forte production de composé toxiques oxydants et une diminution des moyens de défense naturelle antioxydante. L’alcool et certain produit toxique et aussi des médicaments sont pris en charge dans le foie par les mêmes mécanismes de détoxification. Le pyrazole fait partie de ces produits qui sont métabolisés par les mêmes voies que l’alcool, et son utilisation permet de développer des modèles expérimentaux animaux qui miment le phénomène de « binge drinking ou alcoolisation massive rapide » qui est un facteur déclenchant de la défaillance hépatique aigue. En associant chez un animal sain, l’utilisation du pyrazole à l’origine d’un stress oxydatif à celle d’un agent pro-inflammatoire similaire à celui qui est naturellement présent sur les bactéries et qui infecte les patients, nous reproduisons in vivo 2 conditions importantes dans le mécanisme de survenue de la défaillance hépatique. Nous développerons ce modèle chez les rongeurs dans l’optique de disposer d’un modèle d’évaluation rapide des propriétés de composés destinés à poursuivre un programme de développement pharmaceutique dans cette indication de décompensation cirrhotique.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes de défaillance hépatique aigue, notamment chez le patient cirrhotique, il est nécessaire que la prise en charge intervienne le plus précocement pour sauvegarder au maximum la fonction hépatique, ce qui peut se révéler être vital lors d’une récidive. Le stress oxydant est un des mécanismes qui entraine la mort cellulaire, il est donc essentiel de le limiter de manière à préserver le capital hépatocytaire qui subsiste après une défaillance hépatique. L’identification de composés et la mise en place de solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme).
Procédures
Au cours des procédures décrites dans ce dossier nous procèderons à différents geste ou acte sur les animaux qui peuvent avoir une action négative sur leur comportement, leur confort ou stress, il s’agit de mise à jeun, injections, et prélèvements La mise à jeun « over-night » c’est-à-dire au cours d’une nuit complète, qui est la période d’alimentation normale du rongeur. La privation de nourriture est source de stress. Les stimulations des processus pro-oxydatifs et inflammatoires sont réalisés par une injection intrapéritonéale, ces injections au nombre de 3sont faites au cours de 3 jours successifs : 2 fois le pyrazole et une fois le LPS ou TNFa. Elles durent chacune environ 15 secondes. Ceci concerne les procédures 1 et 2. Au cours des procédures d’évaluation des activités de composés, nous réaliserons en plus une administration dudit composé par une injection par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, cette administration sera unique et durera également une quinzaine de secondes. Ceci sera appliqué au cours des procédures 3 et 4 Un prélèvement sanguin intermédiaire pourra être réalisé sur les rats au cours des procédures 2 et 4 , il sera pratiqué sur des rats anesthésiés à l’isoflurane par une ponction à la veine sub-linguale, l’action est unique et dure 15 à 20 seconde. Les prélèvement sanguin terminaux se feront également sous anesthésie générale et précéderont la mise à mort.
Impact sur les animaux
Lors des procédures décrites dans ce projet, les animaux subiront des injections en intra-péritonéales ou intra-veineuses, à la suite desquelles, on s'attend à constater une diminution de l'activité, une diminution de la prise alimentaire, une diminution de la température corporelle ainsi que des signes de douleurs ou d'inconfort tels que fourrures ébourriffées, larmoiements.
Devenir
L'évaluation histologique, biochimique et transcriptomique des organes tels que le foie, le cerveau et le rein ainsi qu'une évaluation des taux plasmatiques de marqueurs inflammatoires et hépatiques nécessitent la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global».
Réduction
La méthode est majoritairement basée sur l’expérience déjà réalisée et publiée. Dans certaines conditions, à partir de données expérimentales disponibles, la variance des paramètres peut être connue. A l’aide de ces données, un calcul de puissance et la déduction par le calcul théorique des effectifs est possible. Le test de Welsh permet de définir cet effectif théorique permettant d’atteindre la significativité recherchée. Cette approche statistique permet d’affiner les plans d’expérience pour lesquelles une étude pilote par exemple a permis d’approcher un résultat très proche de la significativité. Sans cette condition, les effectifs calculés par la méthode de Welsch sont généralement démesurés.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé avec des personnes habilitées, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques afin de raffiner au maximum les procédures. Afin de prévenir des souffrances non nécessaires, une grille de scoring permettant de quantifier la douleur perçue par l'animal sera établie et des points limites seront définis, au-delà desquels les animaux seront retirés de l'étude et mis à mort de façon éthique. Compte tenu du fait que la pathologie implique un emballement du système immunitaire et une défaillance multi -organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro.
Choix des espèces
Les espèces souris et rats sont décrites dans la littérature comme des espèces en capacité de répondre biologiquement au stimulus par le pyrazole.
Modèle animal de mouvements anormaux après privation en oxygène chez le rat – projet pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Privés d'oxygène sous anesthésie pour reproduire le syndrome de Lance-Adams, ils subissent ensuite des stimulations sonores quotidiennes pendant quatre semaines et des injections de molécules anti-myocloniques, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que la privation d'oxygène peut tuer certains animaux et provoquer des secousses gênant leur déplacement et leur alimentation, tout en rappelant que ces secousses ne sont pas jugées douloureuses chez l'humain. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne peut étudier la mort des neurones et présente ce projet pilote comme un préalable à des travaux ultérieurs.
Objectifs
Chez l’homme, l’arrêt brutal de l'oxygénation du cerveau (ou anoxie cérébrale) peut être liée à des causes variées comme un arrêt cardiaque ou une crise d’asthme très sévère. Chez les survivants, ce manque d’oxygène peut entraîner des problèmes neurologiques chroniques comme le syndrome de Lance-Adams (LAS). Le LAS est caractérisé par des secousses musculaires involontaires (qu’on appelle myoclonies) très importantes et qui ne sont pas qualifiées comme douloureuses par les patients. Elles apparaissent spontanément ou en réaction aux sons notamment. Elles rendent impossible la réalisation de nombreux gestes de la vie quotidienne : marcher, s’alimenter, se laver ou aller aux toilettes. Les patients reçoivent souvent de nombreux médicaments qui exposent à des effets secondaires parfois graves et aux risques d’interactions entre médicaments. Malheureusement, l'efficacité de ces médicaments est souvent insuffisante pour traiter les secousses musculaires du LAS. Les mécanismes à l'origine du LAS restent peu connus. A ce jour, le principal modèle animal de secousses musculaires induites par un manque d’oxygène (donc équivalent du LAS chez l’humain) existe chez le rat. Compte-tenu des limites de cet ancien modèle, l'objectif de notre projet pilote est donc de mettre au point un nouveau modèle animal de secousses musculaires après un manque d'oxygène reproduisant les caractéristiques du LAS chez l’Homme. Avec une procédure expérimentale plus simple, moins invasive et plus représentative du mécanisme du LAS chez l’humain, nous souhaitons identifier les divers paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un modèle fiable et reproductible tout en limitant la mortalité et la douleur chez l’animal, indispensable pour vérifier nos hypothèses concernant les mécanismes à l'origine du LAS.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints du syndrome de Lance-Adams (LAS) est aujourd’hui limitée avec des traitements globalement peu voire pas efficaces. L’amélioration de la prise en charge des patients passe avant tout par une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant aux secousses involontaires (appelées myoclonies) du LAS. Cela repose donc notamment par l’exploitation des modèles animaux qui reproduisent cette pathologie. Comme évoqué précédemment, le principal modèle déjà publié de LAS a des points faibles. Nous souhaitons donc développer ce nouveau modèle de LAS chez le rongeur pour ensuite l’explorer finement afin d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes pathologiques du LAS. Les études animales déjà réalisées avec le modèle existant donnent des résultats assez hétérogènes. Chez l’homme, les études cliniques semblent indiquer que les secousses des patients avec un LAS pourraient provenir de l'écorce du cerveau appelée cortex. Dans notre groupe de patients atteints de LAS, les premiers résultats sont très en faveur d’une atteinte du cortex pouvant être à l'origine des secousses. Par ailleurs, certains neurones spécifiques du cortex sont très consommateurs d'oxygène. Le manque d'oxygène pourrait donc en priorité affecter le fonctionnement de ces neurones-là. Nous faisons donc l’hypothèse que les secousses musculaires du LAS sont, au moins en partie, dues à un souffrance de cette population de neurones au sein du cortex responsable des mouvements. A court terme, cette étude pilote permettra d’établir les différents paramètres expérimentaux permettant d’obtenir un nouveau modèle animal de LAS. A long terme, le bénéfice de la mise en place de ce nouveau modèle sera d’approfondir, dans un projet ultérieur, les connaissances déjà acquises sur le LAS, en particulier par des méthodes électrophysiologiques et immunohistochimiques afin de tester notre hypothèse.
Procédures
Le protocole des stimulations auditives sera réalisé chez tous les animaux, pendant 45 secondes, une fois par jour tous les jours pendant la semaine précédant la procédure de privation en oxygène, puis une fois par jour tous les jours pendant les 4 semaines suivant la procédure de privation en oxygène. Ces stimulations auditives se feront chez des animaux vigiles. Le protocole de privation en oxygène sera réalisé à une seule reprise sur tous les animaux, entre 0et 10 minutes. Cette procédure se déroulera alors que les animaux seront anesthésiés et après injection de médicaments anti-douleur. Au cours de la procédure d’évaluation de la survenue des secousses pendant les semaines suivant le manque d’oxygène, des injections de molécules anti-épileptiques et anti-myocloniques (durée d’injection et temps de maintien : 1 minute) seront réalisées une fois pour chaque animal par voie intra-péritonéale.
Impact sur les animaux
Ce projet pilote va permettre d’évaluer les effets indésirables possibles de ce protocole expérimental. Le risque anesthésique est à prendre en considération. La mort des animaux au cours de la procédure de privation en oxygène est une possibilité expérimentale. Les secousses musculaires engendrées dans un délai de quelques jours après l’anoxie pourront entrainer des difficultés de déplacement pour les animaux ainsi que des difficultés d’alimentation. Il nous semble également important de rappeler que, chez l’humain, les myoclonies (secousses musculaires) ne sont pas considérées comme étant douloureuses.
Devenir
Les mêmes animaux sont impliqués dans les manipulations de privation en oxygène et d’évaluation des secousses musculaires. A l’issue de ces manipulations, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, l’euthanasie étant requise pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que des procédures alternatives existent, ni les processus aboutissant à la mort des neurones ni les processus favorisant l'apparition de crises d'épilepsie ou de secousses musculaires involontaires (myoclonies) ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l’homme ou dans d’autres modèles non animaux. De plus, il n’est pas légitime de provoquer une crise d’épilepsie ou des myoclonies chez un patient pour des études scientifiques. Enfin, lors des expériences sur les animaux, l’environnement est mieux contrôlé et la qualité des données est nettement supérieure.
Réduction
Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cette objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres du protocole permettant de réduire au maximum la mortalité du protocole donc le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum (100) pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable. Une fois le modèle établi grâce à cette étude, nous calculerons plus précisément les différents indicateurs statistiques permettant d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Une période d’une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage, bruit et espace ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, d’alimentation et soins si nécessaire, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation). Une période d’une semaine d’habituation à la manipulation humaine est respectée avant la réalisation de nos procédures. Avant le début de chaque expérience, une période d’acclimatation de 30 minutes sera observée au cours de laquelle les animaux, laissés dans leur cage, ne seront pas manipulés. Cela leur permettra de s’habituer à leur nouvel environnement et éviter toute forme de stress. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de tunnels. Pendant la procédure d’anoxie, les paramètres physiologiques (fréquence cardiaque et saturation en oxygène) seront surveillés constamment. Tout au long de la procédure expérimentale, des points limites adaptés ont été définis afin de limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce choisie pour ce projet. Les méthodes d’investigations électrophysiologiques et immunohistochimiques (qui seront utilisées dans un deuxième temps au cours d’un projet ultérieur) sont maîtrisées au laboratoire et ont déjà permis la publication d’études sur d’autres modèles d’anoxie et d'épilepsie réalisées sur des rats adultes. Par ailleurs, les études déjà publiées sur les modèles animaux de syndrome de Lance-Adams (LAS) précédemment citées ont été faites chez le rat. Nous allons utiliser des rats adultes entre 5 et 10 semaines de vie. Le LAS chez l’humain est en effet décrit uniquement chez des adultes. Par ailleurs, les études électrophysiologiques d’anoxie cérébrale et d’épilepsie réalisées dans l’équipe dans d’autres projets ont été faites chez des rats adultes. Ces mêmes techniques seront utilisées dans un deuxième temps sur un projet ultérieur.
Etude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans des modèles murin d’hyperthermie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour provoquer une hausse de température, elles sont soit contenues et isolées afin d'induire un stress, soit injectées de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation, avec mesure de la température rectale, puis tuées pour prélever sang et cerveau. Le porteur indique que le lipopolysaccharide peut provoquer hypoactivité et perte de poids et que l'isolement dure jusqu'à 72 heures. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne permet d'évaluer l'hyperthermie induite par le stress ou l'inflammation.
Objectifs
Les troubles anxieux sont des troubles mentaux multifactoriels avec une étiologie complexe. Selon le DSM-V, les troubles anxieux comprennent le trouble anxieux généralisé, le trouble panique, les phobies et le trouble de stress post-traumatique. Ces troubles ont un impact sévère sur la qualité de vie et les traitements sont inconstamment efficaces et associés à des effets secondaires. Afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments sur l’hyperthermie, deux modèles animaux seront utilisés. Le premier modèle animal est celui reflétant l’anxiété anticipatrice : l'hyperthermie induite par le stress (SIH). La première utilisation du SIH dans la recherche sur l'anxiété a eu lieu après que l'on ait remarqué que le fait de retirer les souris une par une d'une cage où elles étaient logées en groupe augmentait la température corporelle de la dernière souris par rapport à la première. Par la suite, ce modèle a été affiné en hébergeant individuellement les animaux et la température rectale a été mesurée deux fois à 10 minutes d'intervalle. Cela a permis de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires par expérience. Ainsi, les effets reproductibles du SIH rendent ce modèle très approprié pour le criblage de nouveaux candidats médicaments. Par ailleurs, l’hyperthermie peut être également d’origine infectieuse. Pour cela, un second modèle par injection de Lipopolysaccharide (LPS), qui mime une réaction inflammatoire, sera utilisé. Chez l’homme, l’administration de médicament contre la fièvre (aspirine, paracétamol etc…) va réduire la température corporelle induite par l’infection. Cependant, ces traitements peuvent interagir avec d’autres médicaments. C’est le cas de l’Aspirine avec les anticoagulants et le paracétamol qui, quant à lui, est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Ainsi, ce second modèle d’hyperthermie peut être utile pour le développement de cible thérapeutique pour traiter cette problématique.
Bénéfices attendus
Depuis quelques années, il a été démontré que le stress/anxiété provoquait une hausse de la température corporelle. Ce phénomène est appelé "hyperthermie fonctionnelle". Celle-ci peut entraîner une augmentation de la température corporelle jusqu’à 41°C chez des personnes exposées à d’intenses événements émotionnels (comme par exemple les personnes souffrant d’anxiété généralisée, de trouble panique, de phobies et de troubles de stress post-traumatique). Dans notre premier modèle, la contention de l’animal engendre un stress/anxiété provoquant une augmentation de la température. Ce modèle est donc pertinent pour le développement de molécules contre l’anxiété/stress contrecarrant l’hyperthermie fonctionnelle. Le second modèle concerne l’hyperthermie d’origine infectieuse. Le plus connus et utilisé des traitements de l’hyperthermie chez l’homme est le paracétamol. Son efficacité clinique est variable et il est contre indiqué en cas d’insuffisance hépatocellulaire. Notre second modèle est donc pertinent pour le développement de candidat médicament pour traiter l’hyperthermie induite par une inflammation d’origine infectieuse.
Procédures
L’ensemble des animaux sera soumis aux interventions suivantes : (1) Des administrations sont réalisées sur animaux vigiles (moins d'une minute par administration). Les fréquences d'administration dépendent des caractéristiques pharmacologiques des produits (une à deux administrations par jours pendant un mois maximum) - (2) La température rectale est mesurée deux fois à 10 minutes d’intervalle (durée de l’acte moins d’une minute) - (3) La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont réalisés à la fin du test d’hyperthermie (après la seconde prise de température); juste avant la mise à mort de l’animal. Ces prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale profonde (anesthésie gazeuse sous isoflurane 2%). La durée totale pour réaliser ces prélèvements est d’environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables sont : (1) dans le premier modèle, la contention de l'animal engendre un stress chez celui-ci provoquant une augmentation de la température. Dans le second modèle, l’administration de LPS engendre une hyperthermie. Le LPS peut également induire chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection. ; (2) Dans les deux modèles d’hyperthermie, les animaux sont logés individuellement durant 72h maximum ; et (3) lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. De par notre expérience, les effets indésirables sont rares car la toxicité des candidats médicaments est généralement testée en amont.
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux sont soumis à la fin de l’expérience (juste après la dernière prise de température) à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer l’hyperthermie induite par un stress ou par l’administration de LPS. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d'une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux candidats médicaments, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d'assurer un nombre minimum d'animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Toutes les expériences sont réalisées après une période d’acclimatation de 6 à 10 jours. Les animaux sont hébergés par 5 dans des cages transparentes. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (Physiologie clinique, aspect général, comportement...) est effectuée durant la période d’acclimatation et d’expérimentations.Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) est mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer facilement les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur ces pathologies dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont utiles pour modéliser la base biologique des troubles anxieux, du stress ainsi que l'inflammation. Ils sont donc nécéssaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Dans ce projet, seuls les animaux adultes (entre 6 à 12 semaines au moment du test) seront utilisés car il n'a pas pour objectif d'étudier les effets du candidat médicament sur l'animal à d'autres stades de développement.
Cycle hormonal et déficits de reconnaissance chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des frottis vaginaux, des tests de mémoire nommés, reconnaissance et association objet-place, des IRM répétées et, pour 114 d'entre elles, une ovariectomie, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur soutient que le phénotype de ces souris n'est pas dommageable et que leurs déficits de mémoire n'affectent pas leur bien-être. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou cellulaire ne reproduit encore les processus cognitifs de façon fiable.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par des pertes de mémoire et par la pathologie tau et la pathologie amyloïde qui sont liées respectivement à des formes de la protéine tau et de la protéine amyloïde anormalement aggrégées dans le cerveau. L’APP est la protéine précurseur du peptide amyloïde. Les modèles rongeurs actuels surexpriment des gènes humains de l’APP avec des mutations rares provoquant la MA (formes familiales) et/ou des gènes mutés de tau qui ne sont pas associés à la MA mais qui provoquent une pathologie tau. La présence de pathologies tau et amyloïde chez ces animaux ont permis des progrès dans la compréhension de la MA, mais la surexpression de l’APP et/ou de tau provoque aussi d’autres effets qui ne se retrouvent pas dans la MA. Les souris double knock-in (dKI) AppNL F/MAPT évitent ces effets car elles ont un gène de l’APP humanisé avec deux mutations familiales humaines (Swedish et Iberian : AppNL,F) et le gène humain normal de tau (MAPT) au lieu des mêmes gènes chez la souris. En analysant la mémoire de nos souris dKI de l’âge de 2 à 6 mois, nous avons découvert que les femelles dKI ne parviennent plus à reconnaitre un objet après un délai de 24h (test RO24h) dès l’âge de 2 mois. De plus, elles n’ont pas de bons résultats dans un test de changement de la règle dans un labyrinthe, contrairement aux mâles dKI. Or ces deux tests dépendent du dialogue entre deux structures du cerveau, l’hippocampe (HC) et le cortex préfrontal (CPF). Ces résultats sont cohérents avec une étude montrant une altération de la connectivité HC-CPF plus marquée chez les femmes que chez les hommes en début de MA. Une perturbation des rythmes veille/sommeil, comme celle observée chez le patient, peut perturber le dialogue HC-CPF. A 4 mois, les dKI des deux sexes oublient rapidemment une association objet-place (OiP). Cette forme de mémoire dépend du dialogue HC-cortex entorhinal latéral (CEL). Elle est atteinte chez des personnes âgées des deux sexes et c’est un signe précurseur de la MA. En conclusion, chez les souris dKI de 4 mois, la voie CEL-HC semble affectée chez les deux sexes, tandis que les femelles semblent affectées en plus et plus tôt sur la voie HC-CPF. Les souris dKI sont les premières à montrer une perturbation aussi précoce et aussi proche de celle trouvée en phase préclinique des patientes développant une MA. Le but de ce projet est de comprendre l’origine de cette vulnérabilité féminine dans la pathologie Alzheimer.
Bénéfices attendus
L’objectif du projet est de mieux comprendre l’origine de la vulnérabilité féminine dans les premiers stades de la MA. Il est important d’explorer le rôle des oestrogènes car le développement de la MA a maints fois été attribué à la baisse marquée de production d’œstrogènes privant ainsi le cerveau d’un puissant neuroprotecteur contre les pathologies amyloïde et tau. Ici, nous analyserons chaque étape clé de l’implication des œstrogènes dans les processus de mémoire affectés chez les dKI femelles dès les premiers signes de la pathologie. Si nous découvrons une altération d’une ou plusieurs étapes, cela aidera à la compréhension de cette vulnérabilité féminine et révèlera des cibles intéressantes pour mettre au point des tests de diagnostique précoce et/ou de traitements adaptés à la femme. Cette démarche s’insère dans la statégie actuelle de développement d’une médecine personalisée. Le projet décrit ici ne représente que l’approche fondamentale développée dans un vaste. Ce programme inclue aussi des approches translationnelles en utilisant des techniques applicables à l’Homme : investigations en IRM (IRM fonctionnelle, tractographie, …), en électroencéphalographie à haute densité (EEGhd) et en biologie des rythmes (évaluation comportementale du fonctionnement de l’horloge circadienne). De plus, après adaptation et validation des tests de RO24h et OiP à l’Homme, ils pourront être intégrés dans des évaluations neuropsychologiques pour un dépistage. En conclusion, le programme dans son ensemble aborde certes les cibles neurobiologiques (présente saisine) qui seront utiles à long terme, mais il ouvre également des perspectives à moyen terme pour le développement d’outils de diagnostique par IRM, par EEGhd et par de nouveaux tests neuropsychologiques. Les résultats de notre étude bénéficieront d’abord à l’Homme puisque les souris ne développent pas la MA. Néanmoins, certains animaux de compagnie (chien, octodon) ou sauvages (microcèbe, ours blanc) développent une pathologie rappelant la MA avec pathologie amyloïdes et tau. Au mois deux de ces espèces (octodon ; microcèbe) possèdent un gène de risque génétique majeur pour la MA (APOE4). Chez l’Homme, l’APOE4 peut multiplier par 10 le risque de développer une MA. Il est donc tout à fait envisageable que les progrès réalisés dans le domaine de la MA en termes de dépistage et de traitement pourraient être adaptés à des pathologies proches chez l’animal, puis intégrée dans une approche vétérinaire.
Procédures
Procédure 1 modérée: 4 groupes de souris (de génotype et sexe différents, maximum 60 au total) sont mises dans des cages individuelles placées côte à côte sur une étagère munie de détecteur de mouvement (petites cellules de détection) pour mesurer leur activité locomotrice sur 4 jours. Malgré la proximité de leur congénères, cette séparation pourrait générer un stress modéré, mais transitoire. Les autres procédures P2 à P8 et P10 sont légères pour 800 souris. Elles comportent 1) la réalisation de frottis vaginaux sur les femelles (dépôt d’une goutte à l’entrée du vagin puis réaspiration), 2) la passation d’un ou deux tests d’exploration d’objet dans un environnement rendu familier par une habituation (10 min) préalable avec leur groupe social, et 3) les manipulations préalables à la mise à mort (dislocation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde). Aucune perte de poids, inactivité/mobilité réduite ou expression d’un comportement anormal n’est connu pour ces trois types de manipulations. dans la procédure 8, les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour effectuer un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. Seule la procédure 9 modérée concerne une chirurgie pour l'ovariectomie sur 114 souris.
Impact sur les animaux
Le suivi de lignée jusqu’à l’âge de 12 mois indique que le phénotype des souris dKI n’est pas dommageable : le succès reproducteur, le poids et l’occurrence d’anomalies comportementales ou physiologiques restent identiques entre les WT et les dKI. Leur fonds génétique C57BL/6J est entretenu par backcross pour éviter une dérive génétique. Par ailleurs, il faut préciser que ces souris ont été caractérisées dans des tests de mémoire et d’anxiété classiques et dans des tests hypersensibles à la pathologie Alzheimer. Les mâles et femelles dKI de 2 à 6 mois réussissent comme leurs témoins les tests classiques (test spatial en labyrinthe de Barnes, tests de reconnaissance d’objet et de place jusqu’à un délai de 3h). Même à 12 mois, il n’y a toujours pas de déficit dans ces tests. Entre 2 et 6 mois, le problème n’apparait que dans des tests hypersensibles : une performance moindre au premier jour du changement de règle dans un labyrinthe, un déficit marqué dans les tests d’association objet-place (test OiP), de mémoire du détail et pour un long délai de rappel (RO24h). En conclusion, les souris dKI présentent des problèmes légers de mémoire qui sont présents chez des personnes âgées déclarées cognitivement normales. Ces déficits ne sont donc pas de nature à affecter le bien-être des souris dKI par rapport à leurs témoins WT. Seules deux procédures pourraient induire un stress transitoire : la procédure 1 pour l’isolement en cage permettant de mesurer l’activité locomotrice individuelle sur 4 jours et la procédure 8 où les souris seront transportées (aller-retour dans la journée) en restant dans leur groupe social (2-3 souris/cage) pour un scan IRM à 2 mois, 4 mois et 12 mois. La procédure 9 impliquant une ovariectomie ne devrait pas affecter le bien-être avec les traitement analgésiques et précautions de manipulation prévues. La couverture analgésique, les soins et le suivi individuel des souris devrait permettre d'éviter toute souffrance ou de l'interrompre rapidement s'il y a complication.
Devenir
Le but du projet est de découvrir les altérations neuropathologiques impliquées dans le dimorphisme sexuel face à l’émergence d’une pathologie Alzheimer afin de mieux comprendre les causes de la vulnérabilité du cerveau des souris dKI femelles par rapport aux mâles. A part pour les mises au point de techniques, les cerveaux seront systématiquement recueillis et analysés afin de déterminer ces causes.
Remplacement
L'étude des animaux modèles de la MA est encore indispensable pour progresser dans la compréhension de cette pathologie. Il n'est pas encore possible actuellement de modéliser les processus cognitifs de façon fiable et complète dans un modèle in silico ou en culture cellulaire. Il est donc encore nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie et les performances cognitives.
Réduction
Pour étudier le lien entre les performances comportementales (mémoire et rythme circadien de l’activité locomotrice) et les données neuropathologiques obtenues par des approches histologiques ou biochimiques (P1 à P6, et P10), le nombre d’animaux sera au maximum de 15 animaux par groupe pour assurer l’efficacité des statistiques dans les tests comportementaux. Cet effectif est nécessaire en particulier dans notre modèle car nous testons des souris avec une pathologie débutante et des déficits subtils qui pourraient passer inaperçus si les groupes sont trop petits. La procédure 8 est une étude longitudinale d’animaux destinés à des analyses en IRM. Elle permet donc le suivi d'un même animal à trois âges pour étudier l’émergence et l’évolution de la pathologie ce qui permet une réduction du nombre d'animaux. Le nombre de souris sera au maximum de 35 animaux par groupes (4 groupes mâles et femelles des génotypes dKI et témoins WT) afin d’assurer l’efficacité des tests statistiques et donner des résultats statistiquement fiables pour les données IRM et pour des analyses corrélatives avec les données comportementales et histopathologiques obtenues sur les mêmes animaux au sein de notre laboratoire. La procédure 9 fait appel à la technique d'ovariectomie pour tester l'origine cérébrale de la vulnérabilité des souris femelles dKI. Le risque de perte avec une opération chirurgicale est couvert en augmentant à 16 le nombre de souris par groupe. L’ensemble du projet requiert 974 souris.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’éléments d’enrichissement dans leur cage (matériel de construction du nid, un tube refuge et des boulettes de nourriture à manipuler), ainsi qu’un suivi quotidien de leur état général. Elles seront maintenues en groupe sociaux sauf pendant deux périodes de 10 minutes/jours pour chacun des tests de mémoire. Tous ces tests sont basés sur le comportement d’exploration spontanée de la souris dans un milieu adapté à l’espèce (lumière faible de 20 lux maximum et ambiance sonore atténuée à 45 dB). Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés est mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Trois nouvelles techniques de raffinement sont à mettre/mise en place au cours du projet. Elles concernent la manipulation/transport des souris, l’habituation à l’enceinte des tests de mémoire et une méthode non invasive de prélèvement pour le génotypage. Les souris sont d’ores et déjà transportées de la cage à l’enceinte de tests (et vice versa) grâce au tube refuge présent dans leur cage. L’habituation à l’enceinte des tests se fait depuis plus de 6 mois avec l’ensemble du groupe social de chaque cage. Le bien-être qui en résulte se reflète par une plus grande régularité dans la durée d’exploration des objets présents dans l’enceinte au cours des tests de mémoire réalisés ensuite en individuel. Enfin, la nouvelle méthode de prélèvement non invasive pour le génotypage à partir d’une pincée de poils (au lieu du punch d’oreille de 2 mm) est désormais appliqué en routine pour cette lignée.
Choix des espèces
A ce jour, les modèles animaux de la MA ont essentiellement été créés chez la souris, même s'il existe des modèles chez la drosophile et d'autres espèces. Nous avons un modèle de souris qui est en rupture par rapport aux modèles précédents, car il n’a pas les effets secondaires dûs à la surexpression des protéines clé. Il présente une différence entre les deux sexes dans l'apparition des premiers troubles de la mémoire qui ressemble à celle trouvée au stade préclinique de la MA, c'est-à-dire 5 à 10 ans avant le premier diagnostic. Toutes les souris seront sur un fonds génétique C57BL/6J. Dans toutes les procédures sauf une, les souris seront utilisées entre 1 et 4 mois (jeunes adultes) car c’est l’âge où apparaissent les premiers déficits de mémoire dans ce modèle de maladie d’Alzheimer. Dans la procédure 8, les souris atteindront l'âge de 12 mois pour analyser leur neuropathologie lorsqu’elle devient manifeste (plaques amyloïdes notamment).
Validation d’un dispositif de mesure de la prise alimentaire et de la motivation chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles sont entraînées à un distributeur automatique de nourriture puis, pour certaines, reçoivent une injection de lipopolysaccharide déclenchant une inflammation ou subissent un régime hypercalorique de six à sept semaines, avec des périodes d'isolement en cage. Le porteur décrit ces atteintes comme modérées et transitoires, alors que le projet est déclaré en gravité sévère. Il présente l'étude, menée avec une entreprise privée, comme devant à terme améliorer le bien-être des animaux non-humains dans ses recherches futures.
Objectifs
Les dérégulations de la prise alimentaire sous-tendent certaines conditions médicales comme l’obésité ou les troubles du comportement alimentaire (anorexie, boulimie, binge eating, addiction alimentaire). Dans ce contexte, nous nous intéressons en particulier aux modulations de la prise alimentaire par l’axe microbiote-intestin-cerveau dans des modèles murins. Outre la mesure de la prise alimentaire totale, la compréhension des troubles du comportement alimentaire nécessite d’explorer également des processus psycho-neurobiologiques comme la motivation. Ces processus peuvent être analysés chez le rongeur à travers la réalisation de tâches opérantes. Ainsi, dans une volonté d’affiner et d’automatiser les outils permettant l’étude du comportement alimentaire dans ces modèles, nous souhaitons tester un système embarqué permettant i) une mesure automatique de la prise alimentaire et ii) de tester le comportement opérant des animaux dans leurs cages d’hébergement. Ce système permet à la fois de mesurer la prise alimentaire au sein des cages d’hébergement avec une haute résolution temporelle et de mesurer la motivation alimentaire par le biais du comportement opérant. Ainsi les objectifs de ce projet sont : 1- Tester la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire 2- Mesurer des désordres motivationnels dans une tâche de comportement opérant dans deux modèles animaux. Cette étude sera réalisée sur des souris consanguines immunocompétentes. Afin d’examiner un potentiel effet dépendant du sexe, nous réaliserons cette étude sur des individus mâles et femelles. Cette étude correspond à la première phase d’un projet en collaboration avec une entreprise privée. Le but de ce projet est de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Ainsi, les résultats issus de ce projet sont nécessaires afin de passer à la phase suivante qui permettra d’améliorer le dispositif et d’avoir un impact positif sur le bien-être des animaux lors de nos études futures.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet permettront de passer à une phase d’évolution du dispositif dans son design pour permettre notamment une utilisation autorisant l’hébergement en groupe. Scientifiquement, les analyses post-mortem envisagées (histologie, biologie moléculaire) contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux sous-jacents et à établir de futurs protocoles expérimentaux. Ce projet contribuera également à alimenter la collaboration avec une entreprise dans le développement du médicament et permettra éventuellement de tester des molécules en développement pour des indications de troubles du comportement alimentaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à des entraînements à utiliser un dispositif embarqué qui leur permettre de s'alimenter d'une part (durée : env. 2 semaines). D'autre part une partie des souris seront entraînées à utiliser ce dispositif pour réaliser des tâches opérantes (durée : env. 1 semaine). Certaines souris recevront une administration unique de lipopolysaccharides ou seront exposées 6-7 semaines à un régime riche en lipides pour induire des désordres motivationnels.
Impact sur les animaux
Les procédures contiennent des périodes d’hébergement en individuel. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. L’hébergement en individuel dans ce projet a été limité au maximum et durera au maximum 2 semaines. Un surenrichissement des cages sera proposé. Dans une des procédures, certains animaux seront injectés avec du LPS. Cet agent induit une réaction inflammatoire systémique pouvant être objectivée à travers des signes cliniques. Les modalités d’administration choisies altèrent modérément l’état clinique de l’animal et conduisent à une résolution de la réponse moléculaire pro-inflammatoire en moins de 9h. Dans une des procédures, certains animaux seront exposés à un régime hypercalorique. La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment hypercalorique riche en lipides (HFD) conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des mofifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition à ce régime dans notre projet (6-7 semaines) perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Cette étude vise à tester un distributeur alimentaire pour souris dans le but de faire évoluer le système notamment pour permettre une utilisation autorisant l’hébergement des animaux en groupe. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de vérifier la fiabilité et la sensibilité du dispositif pour la mesure de la prise alimentaire et de mesurer des désordres motivationnels dans deux modèles animaux. Plus précisément, des tests statistiques permettant une analyse de l’effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou l’effet sexe des animaux lors de mesures répétées seront employés ; des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données seront utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés soit en groupe, soit en individuel. Les cages d’hébergement contiendront un objet leur permettant de se mettre à l’abri, des carrés de cotons ou des sticks de papier pour réaliser leur nid. Pour les animaux hébergés en individuel, un surenrichissement par rapport aux individus hébergés en groupe sera prévu. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Le bon fonctionnement et chargement des dispositifs distributeur d'aliments sera vérifié régulièrement voire quotidiennement (lors de l’apport d’aliment uniquement par le dispositif). Le design de la procédure comportementale a été conçu pour assurer la validité des données obtenues tout en limitant la durée de l’hébergement individuel au minimum.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De plus, le dispositif testé a été conçu pour la souris. Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Approches physiopathologiques et thérapeutiques du syndrome de Sanfilippo B EU 3/3
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Modèles du syndrome de Sanfilippo B, une maladie neurodégénérative pédiatrique, elles passent des séances d'IRM d'une heure sous anesthésie, puis sont tuées par prélèvement intracardiaque à 2, 5 ou 9 mois pour mesurer le fer cérébral. Le porteur présente l'IRM comme non invasive et le prélèvement intracardiaque terminal comme la nuisance la plus importante du projet. Il affirme qu'à ce stade le recours à l'animal est "inévitable" pour confirmer les résultats obtenus sur cellules.
Objectifs
Le projet financé est une étude préclinique de thérapie génique intraveineuse pour le syndrome de Sanfilippo B. Ce syndrome est une pathologie neurodégénérative pédiatrique touchant 1 enfant sur 200 000 et pour lequel il n’y a aucune thérapie aujourd’hui. Ce syndrome est dû à la déficience d’une enzyme lysosomale impliquée dans la dégradation d’un glycosaminoglycane, l’héparane sulfate. Cette déficience conduit à l’accumulation de ce substrat qui présente une toxicité majeure pour les cellules du système nerveux central. Nous souhaitons, à travers cette étude, pouvoir proposer un essai clinique par thérapie génique permettant d’apporter l’enzyme déficitaire (N-acétylglucosaminidase). L'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de vérifier s'il est possible de détecter de façon reproductible et fiable des variations de susceptibilités magnétiques caractéristiques de la teneur en fer (Fe) dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux sans mise à mort des animaux comme c’est le cas pour les méthodes classiques de mesures post-mortem. L'IRM est un outil important pour le diagnostic in vivo des pathologies ainsi que pour suivre au cours du temps la réponse à différents traitements ou procédures chirurgicales. La durée maximale des acquisitions sera d’une heure par animal.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’étude physiopathologique, l'objectif de l'exploration par IRM, technique non invasive permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle des tissus, objet de ce projet, sera de mesurer des valeurs de susceptibilités magnétiques T2* dans le cerveau des animaux. Ces mesures permettront de comparer la teneur en Fe dans différentes régions cérébrales (cortex, striatum, …) des différents groupes expérimentaux. L’accumulation de fer ou non dans le cerveau est un marqueur de validation de l’efficacité du traitement de nos souris en préclinique. A terme, cette mesure IRM pourrait remplacer les mesures faites post-mortem et devrait donc nous permettre de réduire le nombre d'animaux mis en œuvre pour mesurer la quantité de fer dans les tissus et permettre de suivre l'évolution au cours du temps de la teneur en fer de différents organes d'intérêt dans un même animal renforçant ainsi la valeur statistique des résultats.
Procédures
L'IRM est une procédure d'imagerie in vivo, non invasive et atraumatique. La totalité de la procédure étant menée sous anesthésie volatile (1h maximum), les animaux ne subissent que le stress dû à la préhension avant induction de l'anesthésie. Le réveil post-anesthésique est la seconde étape critique, les animaux restent sous surveillance pendant toute la phase de réveil.
Impact sur les animaux
L'IRM est une technique non invasive d'imagerie qui n'entraine aucune douleur chez les animaux. Les signes vitaux (respiration, fréquence cardiaque et température) sont contrôlés tout au long des manipulations afin de garantir le suivi du bien-être des animaux. La procédure est cependant susceptible d'induire un stress au moment de la préhension des animaux pour les placer dans la cage d'induction de l'anesthésie. Le prélèvement intracardiaque que subiront les animaux au moment de leur mise à mort (sans réveil) est la nuisance la plus importante du projet, elle est cependant indispensable pour réaliser dans des conditions optimales la mesure de teneur en fer intra-tissulaire de référence.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des délais 2, 5 ou 9 mois de vie suivant une technique réglementaire qui permettra de pouvoir obtenir des prélèvements de qualité tout en protégeant l'animal de la douleur.
Remplacement
Une modélisation intégrée est nécessaire pour valider les études in vitro. Les animaux sont utilisés en fin d’étude afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Les études sont systématiquement optimisées (quantité de vecteurs, temps de traitement et nombre d’animaux) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. Même si le traitement est administré en injection intraveineuse, il est réalisé par un personnel compétent.
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Nous allons utiliser des tests statistiques afin de comparer les groupes. Les tests sont réalisés avec un logiciel de statistique. Nous utiliserons des groupes de 10 souris par expérience et nous répéterons les expériences à 3 âges différents afin de rendre nos résultats comparables à ceux de nos études antérieures. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo. L'IRM étant une technique d'exploration non invasive, elle permet le suivi longitudinal des lots d'animaux mis en œuvre ce qui participe à la réduction globale.
Raffinement
Cette procédure expérimentale a pour objectif d'évaluer la possibilité de remplacer une procédure post-mortem (mesure de la teneur en fer dans les tissus prélevés) par une procédure non invasive, in vivo qui permettra de suivre une même cohorte au cours du temps dans un but de raffinement (suivi du même animal pour s'affranchir de la variabilité interindividuelle et réduction du nombre de lots d'animaux nécessaire pour assurer ce suivi longitudinal selon la procédure classique). Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Nous nous attachons à ne pas laisser un animal seul dans une cage (groupes sociaux de 5 individus maximum par cage). Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Lors des expériences d’imagerie, les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane (gaz vecteur O2) dès le début de la procédure pour réduire leur stress et éviter tout mouvement au cours de l’exploration IRM. La cellule d’imagerie dans laquelle est maintenue la souris est thermo régulée. Pendant la phase de réveil, la cage est également placée sur tapis chauffant et reste sous contrôle visuel jusqu’au réveil complet de l’animal. Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié.
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus est un modèle animal adapté aux pathologies de surcharge lysosomale. L’application de la politique de réduction mise en place permet d’optimiser au mieux chaque expérimentation afin de retirer d’un minimum d’animal un maximum d’information. De plus la formation des personnes habilitées à manipuler les animaux et la diffusion par ces personnes de leur savoir dans des conditions appropriées (temps de formation respecté) permet de réaliser nos expérimentations animales dans le respect de l’animal et des conditions optimales du suivi des règles d’hygiène et de sécurité. Il est nécessaire d’utiliser les souris à partir de d'âge de 2 mois afin de pouvoir comparer les résultats avec ceux obtenus dans nos précédentes études et celles décrites dans la littérature.
Evaluer l’impact d’anticorps murins dirigés contre des peptides impliqués dans la fonction de reproduction sur la fertilité chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les souris traitées étant tuées et les non traitées et leurs petits réutilisés. Des souris saines reçoivent une à trois injections d'anticorps dirigés contre des peptides de la fertilité, puis sont accouplées en trios pour mesurer le nombre de portées et de nouveau-nés. Le porteur indique que les injections intraveineuses peuvent provoquer saignement, inflammation, voire une opacification avec cécité. Il affirme que seul un "organisme complexe" comme la souris permet de prouver l'effet de ces anticorps, produits pour explorer un lien supposé entre Covid-19 et troubles de la fertilité.
Objectifs
Les agents infectieux jouent un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes et ce par divers mécanismes dont le plus important est le mimétisme moléculaire consistant à déclencher une réactivité auto-immune lorsque l’agent pathogène et l’antigène tissulaire humain sont structurellement similaires(1). L'épidémie de COVID-19 a incité les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une auto-immunité par le biais d'une réactivité croisée. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains partageant des séquences communes avec la protéine SPIKE, entraînant une réactivité auto-immune. Pour exemple, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns pouvant par exemple conduire à une altération de la spermatogenèse et notamment de l'étape de spermiogénèse nécessaire à la maturation des spermatozoïdes . Une première analyse in-silico a permis d'identifier 4 peptides liés à la spermatogénèse qui partageaient au moins 5 acides aminés communs avec la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons découvert que les patients infectés par la COVID-19 développaient des anticorps contre 2 peptides (peptide A et B dans l'étude) impliqués dans la spermiogénèse. Une analyse biochimique a prouvé que les anticorps anti-Spike S du virus Sars-COV2 peuvent reconnaitre les deux peptides A et B liés à la spermatogenèse chez les hommes mais également chez les femmes affectés par la COVID-19. Ce résultat indique l'apparition possible de nouveaux troubles de la fertilité et féconditité dans la population. Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons produit des anticorps murins de sous-classe IgG réagissant avec les peptides A et B en immunisant des souris saines contre ces peptides. Le but de ce projet est d’évaluer la pathogénicité de ces anticorps en les administrant à des souris mâles et femelles saines et en déterminant leur effet sur la fertilité (nombre de portées) et la féconditité (nombre de nouveaux-nés)..
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur l'ensemble de la population. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'infection par le SARS-Cov-2 sur les humains, en particulier la pathogénicité d'auto-anticorps sur le système reproducteur.
Procédures
Les souris mâles et femelles recevront 1 à 3 injections maximum d’une durée de 2 minutes chacune sur animal vigile ou anesthésié. L'accouplement est composé d'un trio : 1 mâle et 2 femelles. Temp d'accouplement 12 heures.
Impact sur les animaux
L'administration dans la cavité abdominale peut induire une inflammation, une induration, un hématome ou une infection de la cavité péritonéale et l'administration Intra-veineuse peut induire un un saignement, une inflammation, une infection ou une opacification avec cécitéselon que l'animal recevra une injection ou au maximum 3. Ces injections pourront induire une douleur légère transitoire si réalisée une seule fois sur l'animal voire modérée transitoire si au maximum selon les résultats de l'étude pilote 3 injections devaient être réalisées.
Devenir
Tous les souris traitées seront mise à mort pour analyses ultérieures. Les souris non traitées et les souricaux seront réutilisés.
Remplacement
Le projet actuel représente la partie finale d'une étude plus étendue préalables visant l'identification des peptides partageant des identités de séquence avec la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, elle a été suivie des studios dans les sérums des patients atteints de COVID-19 . Actuellement, le seul modèle disponible pour prouver le rôle des anticorps anti-peptides sur le système reproducteur est un organisme complexe comme le modèle murin. Aujourd'hui, notre objectif ne peut pas être atteint en utilisant des modèles cellulaires artificiels. Le modèle murin représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux dans le projet est évalué selon les calculs de puissance visant à réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude.
Raffinement
Nous avons établi des points-limites qui permettent de soustraire l'animal à la souffrance sur la bse d'une grille de score permettant d'évaluer l'état de santé des animaux ainsiq ue la douleur. L'injection intra-veineuse est réalisée sous anesthésie. Afin de réduire la douleur, une goutte d'anti-douleur sera ajoutée après l'injection. Les souris sont logées en groupe social et chaque cage sera équipée de matériaux de nidification pour que les mères puissent construire le nid et d'un bâton à ronger.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme et elles développent des pathologies similaires à celles observées chez l'homme. De plus, le modèle murin a un taux de reproduction élevé permettant d'obtenir rapidement des résultats. Les souris CD1 sont utilisées à l'âge de 6-8 semaines après avoir atteint leur maturité sexuelle.
Développement de nouveaux radiotraceurs de la neuroinflammation par imagerie en tomographie par émission de positons chez le rat
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils subissent pose de cathéters, injections de radiotraceurs, séances d'imagerie TEP d'une heure sous anesthésie et, pour certains, une injection cérébrale stéréotaxique d'un vecteur viral ou d'un agent neuro-inflammatoire, avant une euthanasie par exsanguination pour prélever le cerveau. Le porteur indique que les radiotraceurs sont administrés à très faible dose et qu'aucune toxicité n'est attendue, les nuisances venant surtout des manipulations. Il décrit de nombreuses caractérisations in vitro et in silico en amont mais conclut que l'étape in vivo reste "indispensable" pour prédire l'affinité et le métabolisme réels.
Objectifs
La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale non invasive utilisée à l’hôpital pour le diagnostic qui utilise essentiellement le fluorodésoxyglucose marqué au fluor-18. Le développement de nouveaux radiotraceurs plus spécifiques donne accès à une imagerie moléculaire de hautes sensibilité et spécificité pour le diagnostic et la thérapie et pour une meilleure compréhension des maladies, notamment celles du système nerveux central. L’objectif de ce projet est de caractériser et de valider chez le rongeur de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie TEP en évaluant leur interaction avec des cibles impliquées dans différentes maladies neurodégénératives associées à la neuroinflammation Trois types de caractérisations seront effectuées au cours du projet : - les caractérisations pharmacologiques in vitro aident au choix du radiotraceur et permettent d’optimiser sa structure chimique ; - les caractérisations ex vivo permettent d’étudier la biodistribution tissulaire du radiotraceur et ses métabolites. Lors de cette étape, nous développerons de nouvelles méthodes analytiques originales pour localiser et quantifier les nouveaux radiotraceurs et leurs principaux métabolites dans le cerveau, en amont des étapes de radiomarquage pour maximiser le transfert en clinique et diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Cette première étape de validation nécessitant des animaux est limitante et cruciale dans la sélection des meilleurs candidats ; - l’évaluation préclinique in vivo nécessite ensuite l’administration du radiotraceur chez l’animal afin d’étudier son métabolisme et sa pharmacocinétique plasmatique ainsi que sa spécificité et sélectivité pour la cible d’intérêt par imagerie TEP et de déterminer les paramètres pharmacocinétiques caractéristiques de cette interaction. Cette étape in vivo est indispensable et nous permet d’obtenir les données nécessaires pour l’utilisation ultérieure du radiotraceur chez l’homme (transversalité).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer de nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie de la neuroinflammation associée à différentes maladies neurodégénératives à travers des cibles cérébrales impliqués dans le métabolisme des stéroïdes du cerveau comme le cholestérol. En effet, la modification de ces cibles pharmacologiques a été associée à des pathologies comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, la sclérose en plaques ou encore l’épilepsie. A court terme, la sélection et la validation de nouveaux radiotraceurs évalués en préclinique (sur les animaux) permettront de tester des molécules plus spécifiques chez l’homme dans des protocoles de recherche. A long terme, le développement et l’utilisation en routine clinique de traceursspécifiques de la neuroinflammation pourraient permettre le diagnostic, le suivi et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives pour lesquelles il n’existe que très peu ou pas de traitement efficace, en particulier dans la maladie d’Alzheimer. Ces marqueurs permettront également d’optimiser les traitements en matière de dose et de limitation des effets toxiques potentiels. Cela implique l’étude et la compréhension de l’action des traitements et de leur devenir dans l’organisme.
Procédures
Dans ce projet, les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane afin de limiter au maximum douleur, souffrance et angoisse. Elles comprennent la pose de cathéters veineux/artériels (environ 15 min) pour les prélèvements sanguins, les injections de produits (durée
Impact sur les animaux
Les radiotraceurs développés dans ce projet seront administrés à doses extrêmement faibles, ce qui limite voire élimine tout risque de toxicité. Concernant les autres molécules utilisée, les doses chez l’animal sont généralement connues dans la littérature, notamment chez les rongeurs, en terme d’efficacité et d’effet secondaires. Ainsi aux doses prévues dans cette étude, aucune toxicité n’est attendue. Cependant, des effets indésirables ou nuisances possibles comme du stress, changement de comportement, douleur éventuelle peuvent provenir des manipulations (en particulier lors de l’injection d’une durée maximale de 5 min ou lors de la phase de réveil d’une durée maximale de 60 min avant l’euthanasie) oudes pathologies induites (animaux AD en particulier).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter le cerveau (et autres organes) pour des analyses ex vivo (radio-HPLC, spectrométrie de masse, immunohistochimie, autoradiographie…).
Remplacement
Nous mettons en œuvre de nombreuses approches in vitro pour les premières caractérisations des radiotraceurs et la sélection des meilleurs candidats. Ces expériences sur membranes, homogénats tissulaires, cellules, protéines recombinantes nous permettent d’estimer leur affinité et leur sélectivité pour une cible d’intérêt et de détecter leurs principaux métabolites et les enzymes responsables de ces biotransformations. Cette étape nous permet aussi de modifier éventuellement la structure des composés pour les rendre plus stables in vivo en diminuant le niveau de métabolisme. En parallèle, des études in silico peuvent également être mises en œuvre pour sélectionner les composés les plus enclins à interagir avec une cible d’intérêt (récepteur/enzyme). Cependant l’étude in vivo sur les rongeurs s’avère indispensable par la suite car les approches in vitro ne sont pas suffisamment quantitativement prédictives de l’affinité/spécificité in vivo et du taux de métabolisme in vivo. L’extrapolation in vitro-in vivo nécessite la mise en place de modèles mathématiques complexes qui ne sont pas adaptés à tous les paramètres pharmacologiques. Par ailleurs, les paramètres d’absorption, de distribution et de pharmacocinétique du radiotraceur dans le sang et les organes doivent être mesurés dans l’organisme de l’animal. Cette étape préclinique est essentielle à l’évaluation du meilleur candidat pour un passage chez l’homme (transversalité).
Réduction
Dans cette étude, le nombre d’animaux prévu a été déterminé d’après des études antérieures réalisées au laboratoire et des articles bibliographiques. Pour les études de biodistribution et de métabolisme, des groupes de 120 animaux ont été prévus, correspondant à l’analyse de 3 animaux/temps (nombre minimum pour obtenir des résultats statistiquement significatifs,). Pour les études d’imagerie, les groupes de 6 animaux permettent d’obtenir des résultats significatifs compte tenu des variations interindividuelles observées chez le rat. L’ensemble des études in vitro permettant de caractériser pharmacologiquement les radiotraceurs et de ne sélectionner que quelques candidats présentant des propriétés adéquates pour l’imagerie nous permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux. Parmi ces propriétés, nous vérifierons par des méthodes alternatives que la molécule peut entrer dans le cerveau, présente une haute affinité et sélectivité pour sa cible, peut être radiomarquée avec des isotopes compatibles avec l’imagerie et que son métabolisme n’est pas incompatible avec son développement. Nous développerons par ailleurs des méthodes analytiques de quantification des radiotraceurs et de leurs métabolites, les plus sensibles possibles pour utiliser des volumes de sang ou de tissus les plus faibles possibles et réduire ainsi le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant le début des expérimentations et seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés par paire dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Lors de toutes les expériences in vivo et/ou ex vivo, biodistribution, métabolisme et imagerie, les animaux seront anesthésiés. Dans certains cas particuliers, afin d’éviter toute influence de l’anesthésique sur le métabolisme d’un radiotraceur ou une pollution du signal par l’anesthésique, les injections pourront être réalisées sur animaux vigiles placés dans un tube de contention. Dans ce cas, les animaux seront entraînés à la manipulation de manière à limiter la douleur et le stress le jour de l’expérimentation. Les animaux seront étroitement suivis tout au long de l’étude par du personnel expérimenté, permettant l’application des critères d’arrêt en amont afin d’empêcher toute souffrance animale. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier le rat font partie des modèles animaux les plus décrits dans la littérature pour les études de biodistribution, de métabolisme et d’imagerie cérébrale. Il existe par ailleurs de nombreux modèles de maladies neurodégénératives décrits chez le rat (Alzheimer, Sclérose en plaques, Huntington, …) qui nous permettent de tester les meilleurs candidats sélectionnés sur des animaux pathologiques/génétiquement modifiés et d’étudier les modifications de leur interaction avec la cible d’intérêt. Les animaux utilisés dans ce projet auront entre 4 semaines et 6 mois selon les modèles de rats (sains ou pathologiques) et les procédures. Pour les études de métabolisme, des rats jeunes seront utilisés (environ 40 jours). En effet, une diminution du métabolisme avec l’âge a été observée et décrite dans la littérature. Pour les études d’imagerie, le cerveau doit être assez développé. Les rats transgéniques et contrôles seront utilisés à l’âge de 6, 12 et 18 mois afin d’investiguer la capacité des traceurs à détecter leur cible à un stade précoce (6 mois), moyen (12 mois) ou tardif (18 mois) du développement de la maladie d’Alzheimer. Pour le modèle de rat injecté par un vecteur viral l’imagerie sera réalisée entre 5 et 10 semaines après l’injection du vecteur afin de vérifier l’absence de vecteur viral et l’expression du récepteur humain. L’injection du vecteur viral étant réalisée à l’âge de 8 semaines, les rats auront entre 13 et 18 semaines lors de l’examen d’imagerie.