Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de l’injectabilité de polymère d’anticancéreux par voie sous cutanée
- Recherche appliquée
- Cancers
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée d'un nanopolymère anticancéreux au moyen d'un injecteur sans aiguille, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever la peau au site d'injection. Le porteur décrit un projet visant surtout à évaluer un dispositif d'auto-injection destiné au confort des patients en oncologie. Il affirme que l'étude de la distribution du produit impose un "organisme entier" et écarte les modèles ex vivo.
Objectifs
Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée , de type nanopolymères (molècule chimique de taille nanométrique) contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie, 5 formulations de nanopolymères ont été développés par nos partenaires et ont fait preuve de résultats prometteurs sur les cellules. Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxique au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études d'efficacité antitumorale de ces nanopolymères après injection sous cutanée ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l'administration de ces nanopolymères à l'aide d'un injecteur sans aiguille, afin de toujours améliorer le confort de vie du patient.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendues sont l'aide à la décision de la définition du nanopolymère optimal pour une administration sous cutanée d'agents anticancéreux. L'emploi d'un tel dispositif d'injectabilité permettrait en effet de faciliter l'autoadministration du patient ainsi que son confort.
Procédures
1/ Administration unique des traitements par voie sous cutanée (102 animaux) - durée de l'intervention: quelques secondes 2/ Imagerie répétée sur animal anesthésié (51 animaux) - durée de chaque intervention: 10 minutes sous anesthésie 3/Prélèvement de sang et peau (51 animaux)- durée de l'intervention: 5 minutes sous anesthésie
Impact sur les animaux
Bien qu'administré par voie sous cutanée, du fait de ce nouvel dispositif, la douleur à l'injection devrait être de très courte durée et largement réduite. Lors des études de biodistribution par imageur et de prélèvement de peau au niveau du site d'injection, entre les omoplates, les animaux seront anesthésiés par cage à induction ce qui peut stresser l'animal avant l'endormissement.
Devenir
Afin d'évaluer la non toxicité des nanopolymères et leur bonne administration sous cutanée, nous devrons prélever chez lintégralité des animaux des échantillons de peau au niveau du site d'injection, nécessitant donc leur mise à mort.
Remplacement
Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal, afin de pouvoir étudier sa distribution et sa toxicité éventuelle dans un organisme entier. Ceci est essentiel pour la prise en compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Des modèles ex vivo ne permettraient pas de mimer l'injection sous cutanée, l'atteinte de la circulation sanguine et la biodistribution des polymères.
Réduction
Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives. Une étude pilote est mise en place pour limiter le nombre d'animaux par la suite.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - Conditions d'hébergement adaptées : nourriture et eau à volonté, température constante de 20°C et mise en place d'un cycle jour/nuit inversé par périodes de 12 heures - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe (6 souris par cage) - enrichissement des cages avec des domes en plastique et cotons prédécoupés spécifiques/stériles, réduction du stress (les études de biodistribution seront conduites sous anesthésie générale gazeuse au sévoflurane) et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne des signes de douleurs (exemple de critères d'évaluation de la douleur: difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, isolement, ou tout autre signe physique tel que la position des oreilles ou des vibrisses). L'intégralité de la conduite à tenir et la définition exacte des points limites se trouvent dans une grille des scores de la douleur qui évalue le bien être animal sur chacun de ces points et donne les directives à suivre en fonction de l'état de l'animal (ex de conduite à tenir: augmentation des fréquences de suivi, utilisation d'analgésique, mise à mort immédiate).
Choix des espèces
La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux ainsi que nos études préalables sont effectuées sur la souris. De plus tous nos travaux préliminaires de biodistribution, pharmacocinétique et d'efficacité antitumorale ont déja été fait sur cette espèce. Le dispositif d'administration sous cutanée sans aiguille testé pour cette étude n'est également développé que sur les souris ou rats. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus 6 semaines est considéré comme l'âge adulte, âge le plus retrouvé dans les cancers du sein.
Mécanismes cellulaires et moléculaires de la calcification valvulaire aortique dépendante de Pou5f1/ERRalpha et d’une dyslipidémie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras sans vitamine D pendant quatre mois, ces souris ApoE-/- reçoivent un gavage de tamoxifène et des échographies cardiaques sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les valves aortiques. Le porteur reconnaît que le régime gras apporte un inconfort mais affirme qu'il n'affecte pas la mobilité des animaux. Il présente la souris comme "un des très rares modèles" de calcification des valves et attend des données extrapolables à l'humain.
Objectifs
Environ 500 millions de personnes dans le monde souffriront de calcification de la valve aortique (CVA) d’ici 2050. La CVAest une maladie progressive caractérisée par une inflammation, une fibrose et finalement une calcification de la valve. Cela conduit à un retréssissement aortique, une maladie grave précipitant le patient vers une insuffisance cardiaque. Le seul traitement pour la CAVD, le remplacement de la valve , n’est pas disponible pour 85% de la population mondiale. En France, 10000 remplacements valvulaires aortiques sont effectués chaque année sans toujours un bon résultat et avec des suites à la chirurgie ou même au protocole sans chirurgie . Il n’existe aucun médicament pour cette pathologie. La dyslipidémie joue un rôle majeur dans la CVA. Cependant, les cellules valvulaires (unités biologiques composant la valve) spécifiquement impliquées dans la maladie sont encore en débat. De plus, les femmes, même atteintes de dyslipidémie, sont beaucoup moins sujettes à la CVA que les hommes. Fait intéressant, le microbiote intestinal masculin et féminin diffère. Notre projet propose : 1. Le suivi et l'identification des cellules et de leur profil de gènes à l’origine de la CVA dans un modèle murin de dyslipidémie- 2. L 'analyse du microbiote des souris mâles et femelles atteintes de dyslipidémie au cours de la CVA et après dérégulation de la voie dépendante de des hormones oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux cibler une thérapie anti calcification valvulaire par une connaissance plus précise du mécanisme pathologique notre étude devrait apporter des informations sur la différence de pathologie valvulaire ches les hommes et les femmes et des pistes de médicaments pour la maladie. Comme le microbiote de l'intestin de la souris est fonctionnellement similaire à plus de 90 % à celui de l'homme, nous nous attendons à ce que les données soient extrapolables à la situation des patients humains.
Procédures
régime riche en acide gras (42% matière grasse, ENVIGO MD.88137 sans vitamine D3) :24 4 mois echocardiographie sous anesthésie isoflurane 30 min: 48 gavage tamoxifène: protocole de 1 min: 6
Impact sur les animaux
L’obésité des souris ApoE-/- en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie . Le gavage au tamoxifène
Devenir
tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la dernière étape (Echocardiographie) du projet. Cela permetra de plus de collecter les valves aortiques pour les experience de transcriptomique.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous avons au laboratoire et utiliserons des cellules valvulaires aortiques de patients CVA VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et avons dérivé à partir de ces cellules des cellules iPS spécifiques ; nous les re-différencions en cellules valvulaires et faisons des co-cultures 3D de VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et identifier les cibles médicamenteuses.
Réduction
Les mêmes souris serviront à nos deux objectifs analyse clonale et micobiote intestinal . Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une signification statistique
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage. Le tamoxifène est donné en présence de progestérone pour éviter les effects néfastes de blocage des récepteurs endogènes. L’anesthésie est utilisée pour l’échocardiographie qui se réalise en positionant l'animal sur un tapis chauffant et une sonde rectale pour controller sa température pendant les 20-30 min du protocole d’ échocardiographie.
Choix des espèces
la souris ApoE-/- est un des très rares modèles animal de calcification des valves les souris seront adultes, seul stade pour observer la pathologie
Elevage d’une lignée murine immunodéficiente à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
9 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 8 882 transférées vers d'autres projets d'expérimentation et les autres tuées. Issues du croisement de deux lignées immunodéficientes, elles portent un phénotype déclaré dommageable qui les rend vulnérables à toute infection, et sont élevées en conditions stériles pour que ce phénotype ne s'exprime pas. Le porteur indique que le génotypage combine tatouage des phalanges et biopsie de la queue sur des animaux de dix jours, geste qui peut provoquer un inconfort. Il revendique l'intérêt de ces souris pour "mimer les cancers humains" et présente la demande comme une simple déclaration d'élevage imposée par la réglementation.
Objectifs
La lignée de souris qui est l'objet de cette Demande d'Autorisation de Projet (DAP) est un croisement entre deux lignées immunodéprimées : les animaux issus de ce croisement sont donc fortement immunodéficients (sans défenses immunitaires). Leur phénotype (l'ensemble des caractères visibles) est par conséquent considéré comme dommageable : ils deviennent sensibles et vulnérables à tout pathogène, dont l'infection peut leur être délétère. Cependant, ce phénotype peut ne pas s'exprimer si leur élevage est réalisé dans des conditions sanitaires optimales : statut sanitaire contrôlé sans pathogène, hébergement en cages ventilées, manipulation sous hotte, utilisation d'équipements, d'aliment, d'eau de boisson et d'enrichissements stériles, ce qui est le cas dans notre Etablissement Utilisateur. Désormais la règlementation européenne nous demande de déclarer l'élevage de ces animaux à phénotype dommageable, même si ce phénotype ne s'exprime pas grâce aux conditions adéquates de maintien de cette lignée. C'est l'objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Cette lignée est utilisée par de nombreuses équipes de notre Etablissement Utilisateur, étant immunodéficiente elle représente un modèle de choix en oncologie afin de pouvoir mimer les cancers humains. Elle est également très résistante aux rayons X, ce qui permet de combiner la chimiothérapie et radiothérapie lors de protocoles de traitement, et de s'approcher au plus près des protocoles thérapeutiques humains.
Procédures
Il y aura une biopsie de queue (1-2 mm) sur certains nouveaux-nés d'environ 10 jours, une seule fois, pour leur génotypage. Ce prélèvement dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’élevage en lui-même de la lignée de souris qui fait l'objet de cette DAP ne présente pas de nuisance ou d’effet indésirables : étant donné les conditions d’hébergement et de soin, le phénotype délétère ne s’exprime pas. La technique de génotypage décrite dans cette DAP pour les animaux nécessaires au rafraichissement génétique est composée de 2 actes techniques invasifs: l'identification par tatouage des phalanges, et la biopsie de queue. Chacun de ces actes à lui seul n'induit pas de douleur, mais le cumul des deux actes de manière très rapprochée (quelques secondes d'intervalle) peut induire un inconfort léger et transitoire pour l'animal âgé de 10 jours.
Devenir
Procédure 1: Les animaux arrivant en fin de fertilité (environ 6 mois d'âge) sont mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Les animaux destinés à être expérimentés sont transférés en zone d'Expérimentation et inclus dans d'autres DAP en utilisation continue. Procédure 2: Après génotypage, si le génotype n'est pas d'intérêt, les animaux seront mis à mort par inhalation d'un gradient de CO2. Si le génotype correspond à celui qui doit être utilisé pour le rafraichissement génétique, alors ils seront destinés à la mise en accouplement.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. De plus, les lignées de souris immunodéficientes restent très intéressantes pour appliquer des paramètres humains en oncologie sans risque de rejet.
Réduction
Nous essayons de prévoir nos plans de production au plus précis afin de ne pas surproduire. Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Seuls les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt au moment du rafraichissement génétique seront sacrifiés.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs. Ils sont hébergés par couple pour les reproducteurs, ou par 5 pour les animaux de stock avant transfert en expérimentation. Nos conditions d'élevage permettent au phénotype dommageable de ne pas s'exprimer : cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, aliment, eau et enrichissements stérilisés. Ces derniers sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage (reproducteurs : plateforme+boule papier kraft+cotons; stock : plateforme+tunnel+cotons). Concernant les lots d'animaux qui doivent être génotypés (rafraichissement génétique), les préleveurs de notre Etablissement Utilisateur sont des expérimentateurs chevronnés et ont plusieurs années de pratique dans cette procédure de génotypage. Le geste est précis, rapide et maîtrisé. Ainsi l'inconfort et le stress de l'animal sont de courte durée.
Choix des espèces
Au sein de notre Etablissement Utilisateur, l'ensemble des équipes de recherche utilise le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de mimer Les animaux utilisés dans cette DAP sont déclarés dès leur naissance, génotypés aux environs de 10 jours (procédure 2), puis mis en accouplement à l'âge de 8 semaines (procédure 1), jusqu'à la fin de leur période fertile (environ 6 mois).
Etude de l’interaction des cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique avec les lymphocytes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
2 984 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, 150 étant classées en gravité sévère. Une pathologie neuro-inflammatoire est induite par injection intra-péritonéale et 100 souris chimères subissent une irradiation, pour étudier le passage des lymphocytes dans le système nerveux central. Le porteur indique que les souris malades présentent perte de poids et troubles moteurs, et mentionne des tests comportementaux sans préciser lesquels. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne fournit de résultats exploitables et décrit son modèle comme "unique".
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'étudier les interactions entre les lymphocytes et les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique afin de cerner les mécanismes et particularités permettant un passage des lymphocytes dans le système nerveux central et le rôle de ce passage en condition physiologiques et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de mieux comprendre les interactions entre système immunitaire et système nerveux central, en condition physiologique afin de comprendre les conséquences de ces interactions en terme de susceptibilité aux infections, aux maladies auto-immunes mais aussi dans le cadre du vieillissement et des pathologies neurodégénratives. En conditions pathologiques, les modèles développés, in vitro et in vivo permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
Une pathologie neurologique inflammatoire sera induite par injection intra péritonéale unique chez certains animaux, pathologie qui pourra être surveillée pour étude entre 2 jours et 90 jours. Certains animaux seront des modèles de souris chimères et subiront une irradiation (100 souris) unique de 6 minutes et 36 secondes.
Impact sur les animaux
Une pathologie neurologique est attendue lors de l'étude de la condition pathologique. Dans ce cas les souris présentent des signes cliniques (perte de poids, troubles moteurs) et immunologiques qui seront alors surveillés.
Devenir
Au total l'ensemble des animaux sera mis à mort afin de pouvoir quantifier et étudier l'infiltrat lymphocytaire dans le système nerveux central.
Remplacement
L’étude de l’implication des cellules endothéliales dans la migration des lymphocytes dans le système nerveux central via la reconnaissance de l’antigène, nécessite des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées telles que l’activation et la différenciation lymphocytaire in vivo, la migration cellulaire, l’entrée et l’activation dans le tissu cible. Il n’existe pas actuellement des méthodes alternatives à ces études in vivo pour l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents des pathologies humaines. Notre modèle d’étude unique permet d’obtenir des informations nouvelles et importantes concernant les affections neuro-inflammatoires.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire a été déterminé d'après les conditions minimales nécessaires à une puissance statistique permettant d'établir des conclusions statistiques recevables. Les animaux de ces procédures étant utilisés pour des expérimentations in vivo ou in vitro pour générer des cultures primaires, le nombre peu difficilement être réduit. Cependant, la nouvelle version de ce protocole intègre une révision à la baisse des effectifs estimés en raison des premiers résultats d'étude sur les lymphocytes CD4 ayant mis en lumière des difficultés techniques non résolvables à l'heure actuelle. L'ensemble des organes étudiés sont prelevés chez les souris (système nerveux central mais aussi rate, ganglions, et tube digestif) afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures en condition pathologiques ou dans la procédure chimère auront une surveillance accrue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance anormale induisant son exclusion de la procédure et sa mise à mort. Les points limites à surveiller identifiés sont : Activité extrême (grattage ou léchage anormal) - Posture (courbée ou prostrée) - Aspect (perte de poids, déshydratation, poil hérissé, taches) - Absence de toilettage et diminution de l’appétit - Respiration anormale (rythme et mouvement) - Stéréotypies et hyperactivité (démangeaisons, léchage) - Présence d’anomalie (blessure, inflammation). Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie après une anesthésie gazeuse par isoflurane. Les animaux seront au maximum 5 par cage et auront un enrigissement permettant une stimulation de leurs comportements naturels et l'amélioration de leur bien être selon les recommandations en cours dans l'établissement utilisateur. Lors du suivi par test comportemental, les animaux auront une période d'entrainement progressive de 3 jours avant de débuter les tests comportementaux mesurés.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines (maladies infectieuses, maladies inflammatoires) comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Notre modèle, floxé, a été développé dans cette espèce et aucune autre espèce d’animaux possédant ce transgène n’est disponible. De plus, l’utilisation de la souris permet une compatibilité cellulaire avec les autres modèles murins développés. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Adultes entre 6 et 16 semaines d’âge car nous avons besoin d'animaux adultes qui ont un développement des systèmes immunitaire et nerveux central complet pour nos expériences. Seule la procédure 1 pour l'induction du modèle est réalisée plus tôt.
Cibler les protéines de sporozoïtes de Plasmodium pour prévenir le paludisme dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de parasites et de protéines, sont exposées 45 minutes à des piqûres de moustiques sous anesthésie et subissent des prélèvements de sang tous les un à deux jours, pour tester des protéines de Plasmodium comme cibles vaccinales contre le paludisme. Le porteur indique que l'infection provoque affaiblissement, anémie et symptômes neurologiques, et que les animaux sont tués avant d'atteindre les points limites. Il écarte le remplacement au motif qu'aucune culture in vitro continue du parasite n'existe et qu'il faut un "organisme muni d'un système immunitaire", tandis que la preuve de concept vaccinale annoncée reste au conditionnel.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans la recherche de nouvelles cibles vaccinales ou thérapeutiques ciblant la phase hépatique du paludisme, qui constitue la première étape d'infection chez l'homme après la transmission de Plasmodium, le parasite responsable du paludisme, par un moustique. Plusieurs protéines de Plasmodium ont été identifiées comme jouant un rôle essentiel au cours de l'infection et constituent des cibles vaccinales potentielles. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei pour caractériser la fonction de ces protéines et tester si elles sont des cibles potentielles pour des anticorps neutralisants.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait d'une part améliorer notre compréhension des mécanismes d'infection du foie par Plasmodium au cours du paludisme, d'autre part apporter la preuve de concept que de nouveaux antigènes de Plasmodium peuvent être ciblés par des anticorps neutralisants. La validation pré-clinique de nouvelles cibles vaccinales pourrait ouvrir de nouvelles perspective pour lutter contre le paludisme.
Procédures
Administrations sur animaux vigiles: injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes), injection sous-cutanée de protéines (3 injections espacées de 2 semaines, durée du geste 10-15 secondes), injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes), administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes), administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours). Prélèvements sur animaux vigiles: prélèvement d'une goutte de sang ( tous les 1 à 2 jours pendant 3 à 21 jours, durée du geste 10 secondes). Prélèvements sur animaux anesthésiés: prélèvement de sang (acte unique, durée 10 minutes). Exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes). Imagerie en bioluminescence sur animaux anesthésiés (pendant moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales, intraveineuses ou sous-cutanées sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, douleur au site des injections sous-cutanées, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie, symptômes neurologiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.
Remplacement
Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines essentielles du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, et à évaluer l'efficacité d'une vaccination contre ces protéines. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les études fonctionnelles. D'autre part, l'analyse de l'effet protecteur d'une immunisation nécessite le recours à un organisme muni d'un système immunitaire (en l'occurence la souris) pour pouvoir étudier les réponses anticorps.
Réduction
Au total ce projet utilisera 430 souris. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. Pour les immunisations, la taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La mesure de la charge parasitaire par bioluminescence est une méthode peu invasive, contribuant au raffinement des procédures. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La souris est également un hôte doté d'un système immunitaire permettant d'évaluer l'efficacité de stratégies de vaccination contre le paludisme. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.
Optimisation de vecteurs viraux en thérapie génique dans le système musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Différents vecteurs viraux dérivés de l'AAV9 leur sont injectés, dès le premier jour de vie pour une partie, par voie abdominale, intraveineuse ou derrière l'œil, avec un suivi hebdomadaire par bioluminescence. Le porteur reconnaît que l'injection derrière l'œil peut provoquer un gonflement de l'œil, une proptose ou une cécité, et que les anesthésies prolongées peuvent causer des troubles cognitifs. Il compare l'efficacité de ces vecteurs pour la thérapie génique musculaire et juge le recours à l'"organisme entier" nécessaire.
Objectifs
Les vecteurs viraux sont des outils largement utilisés en thérapie génique. Parmi eux, les virus adéno-associés (AAV) présentent de nombreux avantages comparés aux autres vecteurs car ils ne sont pas pathogènes chez l’Homme et présentent une faible immunogénicité ainsi qu’une grande stabilité génétique. Il existe plusieurs sérotypes d’AAV dont l’AAV9 présentant un tropisme pour les muscles. Une des limites de l’utilisation des AAV en tant que vecteur est le manque de spécificité. D'autres AAV dérivés de l'AAV9 décrit dans différentes publications présenteraient une augmentation de la spécificité musculaire en vitro et en in vivo. L’objectif du projet est donc de pouvoir comparer l'efficacité des différents dérivés de l'AAV9 avec l'AAV9 ainsi qu'entre eux chez la souris et par la suite de sélectionner celui qui montrera la meilleure optimisation de l’efficacité et la spécificité dans le muscle tout en limitant celle dans les autres organes. Le but final est d’améliorer la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques du système musculaire.
Bénéfices attendus
L’identification du meilleur sérotype d’AAV ciblant le plus spécifiquement les muscles et moins les autres organes permettra une meilleure efficacité des thérapies géniques applicables aux maladies musculaires.
Procédures
La cohorte « injections intrapéritonéales » seront soumises aux procédures suivantes : -Injection intrapéritonéale unique au premier jour post-natal, 1 minute par animal -Injection sous cutanée (1minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte « injections intraveineuses » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intraveineuse (1 minute) unique par la veine caudale chez la souris éveillée -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence. La cohorte "injections rétro-orbitales" seront soumises aux procédures suivantes :- Injection rétro-orbitale (1 minute) unique chez la souris sous anesthésie -Injection sous cutanée (1 minute) de la substance émettrice de lumière chaque semaine à partir de la 2ème semaine de vie pour l’analyse en bioluminescence
Impact sur les animaux
L’injection peut provoquer chez l’animal un stress dû à l’acte, ainsi qu’une perte de poids. L’injection intrapéritonéale peut provoquer une douleur transitoire chez l’animal. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal. L’injection rétro-orbitale peut provoquer l'apparition de gonflement oculaire au site d'injection, une proptose ou encore une cécité. Une anesthésie prolongée peut causer des troubles cognitifs chez l’animal.
Devenir
Notre projet nécessite la collection d’organes pour l’analyse au niveau histologique et moléculaire
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être remplacées par des tests in vitro sur des lignées cellulaires musculaires car celles-ci ne permettent pas l’étude de l’impact de l’AAV sur un organisme entier. En effet seul le modèle animal pourra nous permettre l’étude de la bio distribution d’un produit injecté. De plus, le modèle murin est physiologiquement assez proche de l’Homme, ce qui va nous permettre une étude représentative de l’efficacité et de la spécificité des différents vecteurs viraux.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur le nombre de virus et de doses à tester par âge. Ce nombre a été basée sur de précédentes études similaires et permet d’assurer une robustesse statistique nécessaire à l’interprétation des résultats. L’expérience de bioluminescence, qui est une expérience permettant de visualiser la localisation du virus dans l'animal, nous permet d’avoir un suivi hebdomadaire de l'expression du virus chez la souris, ce qui nous évite la création de plusieurs groupes de souris à différents âges.
Raffinement
Une alimentation enrichie en plus de l’alimentation inscrit dans l’agrément de l’EU sera mis en place si une perte de poids (inférieure à 22 grammes) est observée suite à l’injection des virus. Les animaux seront surveillés chaque semaine jusqu’à leur mise à mort. Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. De l’ocrygel sera appliqué dans l'ensemble des procédures expérimentales pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les point limites seront déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après l'injection de l'animal (changement du comportement, réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure d'injection seront arrêtés si ces points limites sont atteints.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration de l’efficacité et de la spécificité du vecteur viral, nous avons besoin d'effectuer des expériences in vivo sur modèle animal. Des projets similaires sur ce modèle animal ont déjà été publié, l’utilisation de ce modèle s’inscrit donc dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intrapéritonéale utilisera des souris dès le premier jour de naissance. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte concernant le groupe de souris qui seront injectées par voie intraveineuse utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité des virus pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. A partir de la modification, La cohorte RO à P1 utilisera des souris dès le premier jour postnatal. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique préventive. La cohorte RO à 6w utilisera des souris de 6 semaines d’âge. Cela permettra d’évaluer l’efficacité de l’AAV pour mettre en place une stratégie de thérapie génique curative. Le groupe de 10 souris pour l'apprentissage du geste RO à P1 utilisera des souris à P1.
Mise en place de modèles de glioblastomes implantés en stéréotaxie chez le rat immunocompétent Fischer puis opérés (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
88 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant une souffrance modérée à sévère. Une tumeur cérébrale leur est greffée par stéréotaxie, laissée se développer une vingtaine de jours, puis retirée par une chirurgie que le porteur classe en gravité sévère, avec des anesthésies répétées pour l'imagerie. Il reconnaît que le développement de la tumeur peut provoquer une atteinte de la motricité et de la coordination et une perte de poids, trente-six rats étant mis à mort pour atteinte d'un point limite. Il veut mettre au point un modèle de glioblastome opéré chez le rat immunocompétent et juge le remplacement par des méthodes alternatives "clairement pas possible".
Objectifs
Le glioblastome (=tumeur intracérébrale) est la forme la plus agressive des tumeurs du cerveau avec des récidives systématiques malgré des traitements lourds. Le traitement actuel consiste en une chirurgie pour enlever la tumeur accompagnée d’un traitement par chimiothérapie et radiothérapie. Notre laboratoire affiche une bonne expertise dans l'utilisation de modèles tumoraux d'origines humaines développés sur rongeurs immunodéficients. Cependant, ces animaux apportent une réponse incomplète à nos recherches menées sur les tumeurs cérébrales de par l'absence de la prise en charge de l’immunité. Pour cela, nous souhaitons développer des modèles issus de tumeurs de rongeurs portées par des rongeurs immunocompétents, dont la réponse immunitaire joue un rôle primordial dans le développement de la tumeur ou dans la réponse antitumorale. Notre choix s'est porté sur 2 types de glioblastomes (2 différents) de rat qui sont caractérisés par une forte capacité d'invasion et d'infiltration dans le tissu cérébral sain mais aussi par des capacités de radiorésistance et de chimiorésistance : cet échappement aux stratégies thérapeutiques standards en fait de bons candidats permettant l'extrapolation en cancérologie humaine. L’objectif à terme de ce projet de mise au point de modèle opéré (chirurgie pour enlever la tumeur) permettra de repositionner nos travaux futurs dans un contexte clinique de prise en charge thérapeutique (dont le traitement de référence inclut entre autre la chirurgie pour enlever de la masse tumorale principale). Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire permettra de mettre en place un modèle de tumeurs cérébrales enlevées par chirurgie sur rats immunocompétents au sein du laboratoire, l'intégration de la composante immunitaire étant primordiale dans la continuité de nos travaux. En outre, ce projet de mise au point d'un modèle expérimental avec notamment l'intégration de la chirurgie pour enlever la tumeur servira dans des études pour lesquelles une stratégie thérapeutique sera menée en utilisant la cavité laissée suite à la chirurgie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de proposer une stratégie thérapeutique pour améliorer la prise en charge du glioblastome humain.
Procédures
-Procédure 1 et 2 : greffe intracérébrale de tumeurs cérébrales réalisée une fois au début de l'étude à J0 (durée 45min) Puis développement de la tumeur du cerveau jusqu’à 21 jours. - Procédure 2 : Chirurgie pour enlever la tumeur : réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45 min). - Anesthésie isoflurane réitérée 4 fois (procédure 1) et 5 fois (procédure 2) pour l’imagerie durant 15 minutes. L’imagerie sera réalisé dans l’établissement utilisateur 2/2, toutes les autres procédures seront réalisées dans l’établissement utilisateur 1/2.
Impact sur les animaux
La première nuisance, modérée, est liée à l'implantation même de la tumeur dont le développement conduit chez les rats à une possible atteinte neurologique (atteinte de la motricité et de la coordination) associée à des pertes de poids. Notre recherche bibliographique a mis en avant une survie des animaux comprise entre J21 et J24 . La seconde nuisance est liée à la chirurgie pour enlever la tumeur (classée sévère). Enfin, le transport depuis l'animalerie (établissement utilisateur 1/2) jusqu'au site d'imagerie IRM (établissement utilisateur 2/2) et l’anesthésie à l’isoflurane hebdomadaires des animaux représentent une nuisance légère .
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. 44 pour prélèvement du cerveau et analyse histologique et 36 pour atteinte d'un point limite (suivi de la croissance tumorale par imagerie).
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène impliquant différents types de cellules. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que sur un modèle animal.
Réduction
S’agissant d’une étude prospective, aucune analyse statistique ne sera réalisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, les expérimentations seront menées étape par étape par pallier, tout d'abord en se concentrant sur une tumeur nécessitant 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires). Dans un premier temps, 8 rats seront utilisés pour réaliser le suivi de croissance. Ce nombre a été évalué comme minimum pour caractériser la croissance tumorale par imagerie et analyses histologiques. Dans un second temps, la tumeur sera enlevée par chirurgie sur 10 rats à condition que les résultats sur la 1ère série de 8 rats correspondent à nos attentes (prise de tumeur visible à l’imagerie et analyse histologique correspondant). Si cette série de chirurgie pour enlever la tumeur est satisfaisante, nous complèterons les effectifs avec respectivement 8 animaux pour le suivi de la croissance tumorale et 10 animaux pour la chirurgie pour enlever la tumeur. Les 2 séries ne seront répétées (avec la même stratégie) pour les 2ème type de tumeurs, que si les résultats obtenus avec la 1ère tumeur ne donnent pas les résultats escomptés en termes de croissance et de chirurgie pour enlever la tumeur (2° tumeur : 44 rats maximum (36 + 8 surnuméraires).
Raffinement
Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de papier craft et de buchettes en bois à ronger et bénéficieront d'un cycle jour/nuit inversé dans leur salle d'hébergement. Ils seront hébergés par 2 ou 3 dans des cages de 900 cm2 et les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur et après son retrait chirurgical (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement et de la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Le transport des animaux vigiles entre l’animalerie et le site d’imagerie sera réalisé en maintenant une température optimale par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages.
Choix des espèces
Dans les études menées pour traiter le cancer, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante permettant une implantation de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour permettre l’imagerie. Par soucis de cohérence avec les données et protocoles de la littérature, les rats utilisés seront des âgés de 6 semaines à la réception. Au moment de l'implementation de la tumeur, ces rats seront pubères (envron 7 semaines pour un poids de 200 à 250g).
Etude in vivo de la virulence de Pseudomonas
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles sont infectées par la bactérie Pseudomonas par voie urétrale, nasale, abdominale, plantaire ou intraveineuse, puis reçoivent des inhibiteurs testés pour réduire la virulence, avec des prélèvements répétés de sang et d'urine. Le porteur reconnaît que ces infections peuvent provoquer une inflammation urinaire ou pulmonaire et un affaiblissement général qualifiés de sévères. Il vise de nouvelles cibles contre les infections nosocomiales et juge le recours à l'animal "irremplaçable" pour suivre la dissémination bactérienne entre organes.
Objectifs
Les bactéries du genre Pseudomonas y compris Pseudomonas aeruginosa, sont présentes dans le monde entier dans le sol et l’eau. Elles préfèrent les endroits humides, tels que les éviers, les toilettes, les piscines insuffisamment traitées par le chlore, les spas et les solutions antiseptiques périmées ou inactivées. Ce sont des pathogènes opportunistes qui touchent principalement les personnes présentant un système immunitaire affaibli. En effet elles représentent à elles seules plus de 8% des infections nosocomiales en France. Ces bactéries peuvent infecter le sang, la peau, les os, les oreilles, les yeux, les voies urinaires, les valves cardiaques et les poumons, ainsi que les plaies (telles que les brûlures, les blessures ou les plaies d’origine chirurgicale). L’utilisation de matériel médical tel que les cathéters qui sont insérés dans la vessie ou les veines, les tubes respiratoires et les systèmes de ventilation mécanique, augmente le risque d’infections à Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie représente un problème de santé publique majeur avec plus de 550 000 morts globalement chaque année et une résistance accrue aux antibiotiques. En 2017, l'Organisation mondiale de la santé OMS a classé Pseudomonas parmi les trois premiers micro-organismes « critiques » qui constituent une menace en raison de leur capacité à devenir de plus en plus résistants à tous les antibiotiques disponibles. La découverte de nouvelles molécules antibactériennes devient donc une nécessité face à un futur manque d'antibiotiques efficaces. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la virulence de cette bactérie pour développer de nouvelles stratégie d’anti virulence contre ce pathogène bactérien. Le but de notre étude est d’étudier et de cibler les facteurs de virulences de Pseudomonas au cours d’infection chez la souris.
Bénéfices attendus
L’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas va permettre de mieux comprendre les mécanisme mis en place par la bactérie pour infecter l’hôte. Cela permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques qui viserait à diminuer la virulence de ce pathogène et donc de diminuer les symptômes associés à des infections nosocomiales qui représentent 750 000 infections par an en France et qui sont en lien direct de 4 000 décès par an.
Procédures
Les souris vont recevoir une inoculation de bactéries par différentes voies suivant la procédure : trans urétral (2 injections à 1h ou 6h d'intervalle suivant le modèle) ; intra nasale (une injection) ; intra péritonéale (une injection) ; voie coussinet plantaire (une injection) ; intraveineuse (une injection). Dans chacunes des procédures nous allons tester des inhibiteurs de facteurs de virulence qui seront eux injectés via différentes voies suivant l'inhibiteur sélectionné : i) traitement par eau de boisson comme cela peut être réalisé avec les antibiotiques, traitement de 48 à 72h, ii) par injection IP sur 3 jours à 24h d’intervalle, iii) par gavage comme il est souvent utilisé pour les antibiotiques également, 3 gavages à 24h d’intervalle ou iv) par injection trans-urétrale (pour la procédure 1) 3 injections à 24h d'intervalle. Pour chaque lot de souris un prélèvement de sang à la queue sera effectué pour récupérer 20 µl qui permettrons de faire une énumération sanguine De plus un prélèvement d’urine quotidien (hors weekend) par contention de la souris et application d’une bandelette de buvard au niveau de l’urètre sera réalisé pour suivre la colonisation vésicale au cours du temps dans le modèles d'infection urinaire.
Impact sur les animaux
Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer une souffrance chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire ou pulmonaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Ces nuissances seront qualifiées comme sévères.
Devenir
A la fin de toutes les procédures tous les animaux seront euthanasiés car nous avons besoin de récupérer différents tissus et liquide biologique pour réaliser une analyse ex vivo.
Remplacement
L'utilisation de méthode alternative in vitro a été préalablement réalisée pour démontrer l'impact des différentes souches mutées ou non ou des inhibiteurs sur la cellule eucaryote en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont i) de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de Pseudomonas, ii) d’identifier des inhibiteurs de Pseudomonas qui permettront de diminuer sa virulence iii) de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de Pseudomonas, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.
Réduction
Certains des modèles décrits précédemment sont déjà mis en place dans l’équipe, c’est le cas par exemple du modèle d’instillation dans la vessie, ou encore l’infection en coussinet plantaire. Les autres modèles vont devoir être mis en place au laboratoire, mais nous nous appuyons uniquement sur des modèles déjà établis dans la littérature. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Enfin les gestes à réaliser pour les modèles qui ne sont pas encore implantés au laboratoires sont déjà acquis par le personnel de l’équipe dans le cadre d’autres projets. Une attention particulière est portée sur le nombre d’animaux strictement nécessaire pour chaque expérience. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale sera réalisée à L’IVIS (In Vivo Imaging System) qui est un système d’imagerie tomographique sur animal vigile. Il permet de visualiser des marqueurs fluorescents ou bioluminescents, dans notre cas des bactéries, dans les différents organes de la souris (vessie, poumons, rate …) sur des animaux vivants endormis à l’isoflurane. Une bonne corrélation entre le signal de bioluminescence et le nombre de bactéries retrouvées dans les organes par analyse microbiologique a été établie dans des expériences précédentes. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Des points limites adaptés seront mise en oeuvre afin d'évitre toute souffrance inutile de l'animal.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de Pseudomonas dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec Pseudomonas est largement décrite. Souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Issues de couples reproducteurs commerciaux, les souris de ce projet appartiennent à une lignée transgénique de la maladie d'Alzheimer décrite par le porteur comme à "phénotype dommageable", dont les défauts neuropathologiques apparaissent dès six semaines. 1 327 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la déclaration en comptant 929 en souffrance modérée et 398 en souffrance sévère. Les souris traitées reçoivent une seule injection de vecteur viral, soit dans la veine derrière l'œil sous cinq minutes d'anesthésie, soit dans le cerveau par une ouverture du crâne sous 90 à 120 minutes d'anesthésie, puis passent un test d'alternance spontanée et un test d'apprentissage et de mémoire non nommé, avant un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang sous anesthésie, sans réveil. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours aux souris est "essentiel" et précise que les animaux non-humains utilisés sont "nés et élevés en captivité dans des élevages agrées".
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adéno-associés) codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Ils seront issus de couples reproducteurs commerciaux. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (90-120 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-opératoire, application d'analgésique sur le site incisé et injection d'analgésique en post-opératoire). Des études comportementales (consistant à évaluer l’alternance spontanée, l’apprentissage et la mémoire des souris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. Le test mesurant l’alternance spontanée sera réalisé en une session d'une journée. Le test mesurant l’apprentissage et la mémoire comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste après la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera réalisé (45 minutes) sous anesthésie après injection d’un anti-douleur. Ces prélèvements sont réalisés juste avant l’euthanasie des animaux (sans réveil après les actes).
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV (Adeno-Associated Virus ou virus adeéno-associés) pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour analyse).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (1327) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux jeunes adultes (souris : 4-8 semaines) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses de manière précoce (4-8 semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement).
Evaluation de l’activité et d’absence de toxicité de produits synthétiques de transfert d’acides nucléiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Le but affiché est de commercialiser des agents qui font entrer de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules, et les essais sur des souris doivent en vérifier l'activité et l'absence de toxicité. 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois injections, sous la peau, dans la veine, le muscle, le péritoine ou par le nez selon le produit, puis une prise de sang sous anesthésie avant d'être tuée pour l'examen de ses organes, avec un risque de thrombose, de réactions inflammatoires et de troubles de la démarche. Le porteur affirme que l'administration par voie locale ou générale est "nécessaire pour permettre de valider l'activité et l'absence de toxicité des produits", et choisit la souris parce qu'elle permet "d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.
Bénéfices attendus
Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection et un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%). Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.
Rôle du récepteur au Tumoral Necrosis Factor de type 2 (TNFR2) des lymphocytes T régulateurs (Treg) au cours des états d’immunosuppression induite par les infections sévères
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le plexus veineux derrière l'œil, par la trachée, par gavage ou dans l'abdomen, et sont infectées par des bactéries pour provoquer un sepsis suivi d'une perte de poids et de poils hérissés. Le porteur indique retenir un inoculum faible censé éviter la mortalité, et précise qu'aucun anti-inflammatoire ne peut être administré sur un projet portant sur le système immunitaire. Il étudie le rôle de lymphocytes régulateurs dans l'immunodépression qui suit une infection sévère et affirme que seule l'étude in vivo permet cette approche globale.
Objectifs
Notre laboratoire a montré que suite d’une infection sévère, une cicatrice immunitaire se mettait en place, avec des perturbations prolongées des capacités des organismes à se défendre contre une nouvelle infection. Cette cicatrice immunitaire associé à un plus haut risque de complication infectiologique secondaire est associée à l’apparition de plusieurs populations de lymphocytes dont l’activation des lymphocytes dit « T régulateurs » spécialisés dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons montré qu’une sous population ces lymphocytes T régulateurs porteur d’un récepteur de type 2 au Tumoral Necrosis Factor (aussi appelé TNFR2) jouaient un rôle majeur la survenue de cette immunodépression faisant suite à une infection sévère. Les objectifs du projet sont de caractériser le rôle de ces populations de lymphocytes T régulateurs porteur du récepteur TNFR2 au cours de la défense anti-infectieuse et lors de la phase d’immunodepression post-septique.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’améliorer nos connaissances des mécanismes d’extinction des capacités de réaction du système immunitaire faisant suite à une infection sévère aussi appelée immunosuppression post-septique (IS). Ce projet nous aidera à comprendre les modifications induites par le sepsis sur les fonctions des lymphocytes des Treg et les conséquences de ces modifications au cours d’une 2ème infection. Ceci nous permettra la mise en place de traitements adaptés pour lutter contre les infections bactériennes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-veineuse retro-orbitale sous anesthésie générale. Un tiers des animaux de ce projet est soumis à une administration intra-trachéale sous anesthésie générale. Deux tiers des animaux sont soumis à une administration unique per os (sonde de gavage pour l’administration du traitement) en condition vigile. Un tiers des animaux est soumis à des injections intrapéritonéales en condition vigile. Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et pour les souris anesthésiées, le réveil est quasiment instantané. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanées d’analgésiques pourraient être réalisées.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Le modèle d’infection par administration de bactéries par voie intra-veineuse, a déjà été validé dans ce projet, nous utiliserons des souches bactériennes de référence de laboratoire. Nous réaliserons une injection dans le plexus veineux sous orbitaire d’une suspension bactérienne. Suite à l’administration de bactéries (inoculum faible concentration) par voie intra-veineuse, une inflammation est attendue durant les 4 premiers jours avec comme signes cliniques une perte de poids inférieure à 20% et des poils hérissés, suivis d’une récupération progressive de leur poids au 5ième jour du sepsis. Cette injection entraine une septicémie sans induction de mortalité, permettant d'évaluer l'impact d'une seconde infection et d'éviter les biais de sélection. Les procédures de gavage et de transfert adoptif utilisées au cours des procédures expérimentales n’induisent pas d’effets indésirables connus chez la souris. La pesée de référence est réalisée au J0 avant le début de l’induction du sepsis ou de tout autre procédure. Avec l’utilisation d’un inoculum bactérien faible pour l’induction du sepsis (permettant de reproduire l’IS), aucun signe de souffrance n’est observé en dehors d’une perte de poids inférieure à 20% et les poils hérissés. L’effet de la délétion du TNFR2 sur les Treg sur le sepsis. Il est envisageable que les Treg étant moins suppresseurs, les effets du sepsis sur l’état général des souris pourraient être plus marqués. Il en est de même pour l’effet du traitement par des anticorps anti-TNFR2 sur le sepsis. Pour ces raisons, Les animaux seront observés quotidiennement pendant 3 jours après l’induction du sepsis et pesés tous les 48 à 72h de façon à s’assurer que s’il y des effets, ils ne soient pas durables dans le temps. Les modèles d’inflammation respiratoires aiguës sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (inférieure à 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les mécanismes responsables d’une immunosuppression suite au sepsis sont à l’heure actuellement mal compris. Les méthodes in vitro développées par d’autres laboratoires de recherche ne permettent pas une étude globale des modifications entrainées par une activation du système immunitaire. L'étude du rôle des Treg dans cette maladie et la mise au point de nouveaux traitements ne peut se faire qu'in vivo. Cependant, dès que la question scientifique le permet nous privilégions l’utilisation de méthodes substitutives (méthode in vitro et ex vivo) pour y répondre. Nous avons développé des protocoles de culture de Treg primaires permettant de disposer d’une grande quantité de Treg.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=7) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le test statistique utilisé sera une Anova suivie d’un test post-hoc. Une valeur de p inférieure à 0,05 sera considérée comme significative.
Raffinement
L’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. L’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas possible dans le cas de projet sur le système immunitaire. Comme indiqué dans notre tableau de points limites, il est également prévu un apport d’enrichissement en cas de signes cliniques légers ou modérés, définis par les scores de 1à 14 suivant notre échelle de suivi (cf annexe). Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’anesthésiant local afin d’anesthésier localement la trachée. Une anesthésie générale est réalisée pour les procédures d’injection intraveineuse. Pour les injections IV en retro-orbital, en plus de l'anesthésie par inhalation, une anesthésie ophtalmique sera réalisée sur l'œil qui recevra l'injection. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable, en comparaison des souris contrôles, elles ne développent aucune forme de maladie apparente même à l’âge d’un an.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Impact de la « cellule d’origine » sur le phénotype de la tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Chaque souris, immunodéficiente et pré-pubère, subit deux chirurgies pour l'"humanisation" d'une glande mammaire puis la greffe de cellules tumorales humaines, et développe ensuite une tumeur du sein. Le porteur reconnaît le développement d'une pathologie potentiellement grave et cherche à comprendre comment la "cellule d'origine" façonne le type de tumeur. Il valide des étapes préalables in vitro mais juge le modèle in vivo "indispensable" pour reproduire l'environnement tumoral.
Objectifs
Au cours des dix dernières années, les progrès des technologies de séquençage et de la biologie computationnelle ont conduit à une nouvelle ère de médecine de précision en oncologie. Les tests génomiques permettent d'adapter la prise en charge clinique à chaque patient cancéreux en fonction des altérations génomiques des cellules cancéreuses. L'état actuel de l'oncologie de "précision" repose sur l'administration de médicaments ciblés capables de contrôler les voies mutées. Malgré les grands espoirs que suscite cette approche, seule une fraction des cancers répond aux interventions "ciblées". Le succès décevant de la médecine génomique dans le domaine du cancer est dû à une relative inefficacité à détecter des altérations exploitables ainsi qu’à un manque de compréhension fonctionnelle de la dépendance des voies moléculaires d'une masse tumorale donnée. Il est donc crucial de définir le schéma cellulaire et moléculaire de causalité conduisant à la progression tumorale et à la résistance thérapeutique. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment l'initiation du cancer du sein peut conduire à différents sous-types de tumeurs mammaires avec une réponse spécifique aux thérapies. Plus précisément, nous voulons examiner comment la cellule de l’épithélium mammaire soumise à la première agression oncogénique - la "cellule d'origine" - peut avoir un impact sur la tumeur résultante en termes de paysage moléculaire et de réponse au traitement. Dans ce but, nous voulons mettre en place un modèle expérimental dans lequel nous pouvons suivre l'effet d'un oncogène sélectionné dans différentes cellules à l'origine de la hiérarchie de différenciation de l'épithélium mammaire et ensuite étudier la tumeur résultante.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment une agression oncogénique donnée dans des cellules différentes de l’épithélium mammaire (les cellules d’origines) donne naissance à des tumeurs dont les caractéristiques phénotypiques et l’agressivité varient. Ceci permettra par la suite de mieux comprendre les mécanismes de l’initiation tumorale et de prédire l’évolution d’une tumeur et sa réponse aux traitements.
Procédures
L’ensemble des animaux subira deux procédures chirurgicales (sous anesthésie+analgésie) : l’humanisation de la paire de glandes mammaires numéro 4 qui durera environ 20 minutes et l’implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire humanisée qui durera approximativement 15 minutes. L’induction in vivo sera réalisée par l’injection ip de doxycycline qui durera quelques secondes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. Les gestes chirurgicaux et l'anesthésie associée ainsi que l’injection de doxycycline constitueront une nuisance sur les animaux. Les manipulations et les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées, dissociées afin d’analyser l’immunophénotype et les caractéristiques moléculaires des cellules tumorales.
Remplacement
En amont de l’étape in vivo, l’expression des oncogènes et leur impact seront validés in vitro avant d’envisager leur transplantation. Cependant, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro et c’est pourquoi le modèle expérimental in vivo reste actuellement indispensable.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant l’obtention de résultats statistiquement robustes. Pour cela, nous nous appuierons sur la méthodologie de calcul disponible sur le site http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ qui permet d’estimer statistiquement la fréquence de cellules à l’origine de l’apparition de tumeurs.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de des lanières de papier compacté utiles à la nidification et d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris pré-pubères de 3 à 4 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, avant le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande. Il est donc nécessaire de faire la résection de la glande mammaire et l’injection de fibroblastes humains avant la formation des canaux mammaires afin d’« humaniser » la glande mammaire murine. Deux à quatre semaines après l’« humanisation » des glandes mammaires, les souris pourront alors être greffées avec des cellules épithéliales mammaires humaines transformées par des oncogènes classiques des cancers du sein chez la femme.