Recherche appliquée

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une atrophie du nerf optique menant à la cécité, elles subissent tatouage, biopsie de la queue, plusieurs anesthésies pour des examens oculaires et, pour une partie, une injection dans l'œil qui peut provoquer une inflammation. Le porteur affirme à plusieurs reprises que ce modèle est le "seul moyen" d'explorer la maladie et de tester des traitements, et que le recours à la souris est "nécessaire" pour la thérapie génique. Les animaux, modifiés ou infectés par des virus, ne peuvent être ni relâchés ni adoptés et sont tués pour prélèvement de tissus, le bénéfice pour les patients étant renvoyé au long terme.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’étudier les mécanismes qui sont responsables de la perte de vision dans les atteintes du nerf optique et d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique. Le projet porte sur une maladie qui entraine une perte de la vision progressive dû à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous avons donc généré un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduit fidélement les atteintes retrouvées ches les patients. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul model qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons 2 approchent : 1) une étude sur les cellules de la rétine qui sont défectueuses que nous mettrons en culture afin d’étudier leur croissance en réponse à plusieurs traitements. 2) Un axe sur les animaux vivants auquels nous injecterons dans l’œil une protéine connue pour protéger la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme ce projet permettra de proposer un traitement de thérapie génique chez les patients atteints de perte de fonction du nerf optique.

Procédures

600 animaux seront identifiés par tatouage pour leur identification et une biopsie de queue pour le génotypage (identification génétique des animaux). 180 de ces animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois et 5 mois (4 anesthésies en 5 mois) pour les expériences de fond d’œil (10 min par animal) et d’OCT (10 min par animal), ERG (10 min par animal). 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne (5 minute par animal) à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 180 animaux seront anesthésiés pendant 30 minutes, 2 fois à une semaine d’intervalle à 3 mois, 5 mois et 11 mois (6 anesthésies en 11 mois) pour les expériences de fond d’œil et d’OCT, ERG. 120 d’entre eux auront une anéthesie supplémentaire de 20 min pour l’injection intravitréenne à 3 mois (injection unique pour toute la durée du projet). 240 animaux auront une injection intravitréenne, procédure durant 5 min maximum par animaux.

Impact sur les animaux

Les tests fonctionnels sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. Les injections induisent une légère lésion au niveau de la sclère de l’œil et peuvent induire une inflammation. Une partie des tests se feront sous anésthésie générale. Après chaque exploration (test), les souris seront observées quotidiennement.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem. De plus, la plupart des animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Nous avons généré une souris reproduisant une maladie qui entraine une baisse progressive de l’acuité visuelle dû à la perte du nerf optique. Il n’y a pas de traitement. Il est important de noter que ce modèle représente le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie et de tester des traitements. Dans le cadre d'essais cliniques de thérapie génique, le recours à la souris est necessaire et permet d’apporter une indication de l’efficacité du traitement.

Réduction

Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient porteuses de mutation ou non. Nous avons également constaté une différence d’atteinte chez les mâles et les femelles, de ce fait notre étude prend en compte mâles et femelles. Les mêmes animaux seront étudiés à 3, 5 et 11 mois avant leur euthanasie.

Raffinement

Tous les tests comportementaux présents dans ce projet sont effectués sur animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance et y mettre fin.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une mutation d’un gène sur l’organisme. La souris modèle que nous avons générée porte la mutation la plus souvent retrouvée chez les malades (30% des cas) atteints d’atrophie optique dominante, une maladie dans laquelle le nerf optique disparait et qui rend aveugle. Ce modèle reproduit les caractéristiques cliniques de la maladie chez l’homme. Cette souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements. Les animaux seront testés à 3 jours après la naissance pour faire des cultures de cellules rétiniennes. Ce stade est le stade utilisé pour avoir les meilleurs résultats. Des traitements seront testés sur ces cellules afin d’identifier des molécules protectrices des cellules ganglionnaires de la rétine. Les animaux génétiquement modifiés reproduisant la maladie seront traités par thérapie génique à l’âge de 3 mois et leur vision sera explorée au cours du temps (à 5 et 11 mois) afin d’évaluer le bénéfice thérapeutique de l’approche de thérapie génique. Des prélèvements de rétines seront réalisés sur les animaux de 5 et 11 mois après euthanasie afin d’évaluer l’effet du traitement sur la morphologie de la rétine.

Les souris de ce projet portent des altérations génétiques qui provoquent une immunodéficience sévère et les rendent vulnérables aux infections microbiennes, et elles reçoivent entre cinq et sept semaines d'âge une greffe de cellules souches humaines. 2 058 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole énumère des anesthésies, un conditionnement chimiothérapeutique injecté dans le péritoine, sept injections sous la peau, une injection de cellules souches dans la veine, des prises de sang, une séance d'imagerie intravitale et la pose chirurgicale d'une pompe osmotique. Pour tester des vecteurs censés traiter la bêta-thalassémie et la drépanocytose en modifiant les cellules souches directement dans le corps, le porteur écrit que la nature du projet "nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l'homme".

Objectifs

La β-thalassémie et la drépanocytose sont les maladies héréditaires génétiques les plus fréquentes au monde. Elles sont dues à des mutations génétiques causant de nombreux symptômes ainsi qu’une réduction de l’espérance de vie (40 ans). Des thérapies géniques sont développées depuis des années afin de guérir ces maladies. Cependant, ces traitements nécessitent la manipulation des cellules souches hors du corps de chaque patient avant leur transplantation. Ce genre de manipulation est complexe et présente plusieurs limitations techniques. De plus, les traitements actuels nécessitent que les patients subissent une chimiothérapie dont les conséquences sont lourdes pour l’organisme. Nous proposons dans ce projet de contourner toutes ces limitations et d’améliorer l'efficacité de ces thérapies en testant une nouvelle génération de vecteurs thérapeutiques ciblant directement les cellules souches à l’intérieur du corps du patient.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront une preuve de concept de l’application de nos stratégies de modification du génome par administration directe dans la circulation sanguine. Ces nouveaux traitements permettront d’augmenter l’efficacité des thérapies actuelles et de réduire à la fois leur coût et la souffrance des patients.

Procédures

Anesthésie gazeuse (2X), 30s à 15min. Anesthésie profonde (1X), 1min. Injection intra péritonéale (3X), 30s par intervention. Injection en intraveineuse (1X), 1 min par intervention. Prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (2X) et sous anesthésie profonde (1X), 2 min par intervention. Injection en sous-cutanée (7X), 10s par intervention. Imagerie intravitale (1X), 10min par intervention. Pose de pompe osmotique (X1) : incision, 15min par intervention.

Impact sur les animaux

Les altérations génétiques des animaux utilisés dans ce projet provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. Le traitement myéloablatif léger appliqué aux souris peut provoquer une douleur transitoire durant les heures qui suivent l’injection intrapéritonéale. L’anesthésie gazeuse ou par injection intrapéritonéale peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. L’administration par injection sous-cutanée ou intrapéritonéale peut provoquer une douleur légère et un stress. La pose de pompe osmotique par chirurgie sous-cutanée peut provoquer une douleur légère durant plusieurs jours après l’opération. L’injection de cellules souches en intraveineuse et sous anesthésie peut provoquer un stress transitoire. L’imagerie intravitale peut provoquer chez les animaux un stress et une baisse de la température corporelle liée à l’anesthésie gazeuse prolongée nécessaire à sa mise en œuvre. Les prélèvements de sangs réalisés sous anesthésie gazeuse peuvent provoquer une douleur.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Le développement des vecteurs de ce projet a été réalisé en laboratoire, sans l’usage d’animaux, dans les conditions qui se rapprochent des celles observées dans le corps humain. La nature de ce projet, qui se focalise sur la capacité de ces nouveaux vecteurs à fonctionner dans la circulation sanguine, nous oblige naturellement à nous tourner vers un modèle animal proche de l’homme.

Réduction

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats significatifs. Pour le traitement statistique de nos données, nous aurons recours à plusieurs tests statistiques destinés à réduire les lots du projet de manière optimale. Par ailleurs, nos élevages de souris seront synchronisés en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.

Raffinement

La lignée de souris utilisée dans ce projet a été choisie dans le but de raffiner nos protocoles en diminuant la souffrance engendrée par le conditionnement chimiothérapeutique. Chaque procédure douloureuse sera précédée d’une anesthésie gazeuse ou une anesthésie par injection. Lors des prélèvements de sang, un anesthésique local sera appliqué à l’œil afin de diminuer la douleur qui suit la manipulation. Les animaux seront pesés au cours du conditionnement afin de surveiller toute perte de poids anormale. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Les animaux seront hébergés sur portoir ventilé, avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Enfin, la souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score spécifique.

Choix des espèces

Les seuls modèles animaux aujourd'hui disponibles pour l'étude des cellules souches humaines ont été développés chez la souris. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une homogénéité génotypique importante. Les membres de notre laboratoire disposent d'une expertise sur cette espèce, ce qui facilite la réalisation d'un tel projet. Les animaux subiront une greffe de cellules souches à l'âge de 5 à 7 semaines car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe de cellules souches humaines.

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent mises à jeun, contentions répétées, gavages et injections, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur décrit des signes de souffrance attendus, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il affirme que ces phénomènes sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme", tout en indiquant avoir déjà utilisé des organoïdes intestinaux pour une partie des questions.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) -Un 1er lot d'animaux vigiles feront l'objet d'une mise a jeun (14h), de 2 à 7 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). Ce 1er lot d'animaux recevra également un traitement dans l'eau de boisson (7 jours) induisant une inflammation intestinale. -Un 2ieme lot d'animaux fera l'objet d'une mise a jeun (14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et de 2 injections de produit (1min). -Un 3ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 4 à 9 contentions (30 secondes chacune), de 2 à 7 administrations orale de produit (1min) d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). -Un 4ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune) de 1 à 6 administrations orale de produit (1min), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). - Tous les animaux seront placés sous analgésie anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

L'identification, les prélèvements, l’anesthésie/analgésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou liées à l’inflammation intestinale. Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale ou l’infection par des entéropathogènes, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend 816 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles du syndrome de Barth, elles présentent dès la naissance un déficit de poids et un défaut cardiaque, et reçoivent un gavage deux fois par jour pendant cinq mois ainsi que des prélèvements de sang rétro-orbitaux, pour tester le repositionnement de quatre médicaments déjà commercialisés. La moitié est tuée pour prélèvements d'organes, l'autre moitié transférée vers une autre animalerie pour des analyses cardiaques puis tuée également. Le porteur affirme que le modèle cellulaire reste incomplet pour un "organisme tout entier" et conclut à la "nécessité" du modèle animal avant le passage à l'Homme.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (2 fois par jour pendant 5 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Si la procédure de gavage pose problème, comme des irritations, il pourrait y avoir éventuellement la pose de mini pompes 1 fois par/mois pendant 4 mois (de l'âge de 2 mois à 6 mois) où chaque intervention n'exéderait pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 5 mois. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10-12 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins rétro-orbitaux sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. Le prélèvement se fera dans un oeil différent d'une fois sur l'autre. Le gavage 2 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal . Les mises au points de gavage 2 fois par jour durant 3 mois lors d'une précédente DAP n'ont pas révélé de nuisances particulières.

Devenir

Euthanasie de 180 animaux (la moitié du nombre total d'animaux) pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet (DAP) précédentes. L'autre moitié (180 animaux) sera transféréé dans une autre animalerie (autre DAP acceptée) pour analyse par echocardiographie et course sur tapis (treadmill) et sera également euthanasiée afin de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les demandes d'autorisation de projet (DAPs) précédentes nous ont permis la mise en place des conditions optimales pour le bien-être des animaux. Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre (hors point limite), des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine, isolement si nécessaire jusqu'à ce qu'une amélioration soit observée. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des animaux modèles de la maladie (KO TAZ) inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance : si on dépasse les 25 pourcents d'écart l'animal sera euthanasié - défauts ventriculaires: si on observe une tachycardie, une bradycardie, une arythmie ou une fréquence respiratoire anormale, l'animal sera euthanasié par la dislocation cervicale pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. - points limites spécifiques à chaque geste développés dans chaque procédure. Pour les animaux KO TAZ, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les animaux contrôles, non malades (WT) seront séparés des KO dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque semaine pendant huit semaines une injection intrathécale de protéines pathologiques prélevées sur des patients atteints de la maladie de Charcot, pour tenter de reproduire la maladie, et subissent des tests de motricité, de force musculaire et de curiosité. Le porteur indique que les souris pourraient développer une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive, un point limite portant sur la fonction motrice déclenchant alors la mise à mort. Il affirme qu'il est "indispensable" de générer un modèle de la forme sporadique, inexistant à ce jour, aucune alternative cellulaire ne permettant selon lui d'étudier la propagation de la protéine.

Objectifs

La maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe à ce jour aucun traitement de la maladie, et la recherche sur la maladie de Charcot a été marquée ces 20 dernières années par une multitude d’essais thérapeutiques négatifs. Ces résultats sont en grande partie liés à la faible connaissance des mécanismes à l’origine de la maladie, et à l’absence de modèles animaux fiables. Deux formes de la maladie existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques représentent moins de 10% des patients, et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie est inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : une protéine appelée TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de la maladie. Parallèlement, cette protéine semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Malgré les avancées réalisées dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie ces dernières années, l’absence de modèle animal reproduisant la maladie est une limite majeure. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de formes familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique pour avancer dans la compréhension de la maladie et faire émerger de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la maladie de Charcot en générant un modèle animal de la forme sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la maladie de Charcot chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes impliqués afin de mieux comprendre l'origine et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier de nouvelle cible thérapeutique.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Au total, 36 souris subiront une injection intrathécale par semaine pendant 8 semaines (équivalence de la ponction lombaire chez l’Homme) sous anesthésie générale courte avec anesthésie locale. L’anesthésie générale et l’injection durent en moyenne 10 minutes. La procédure démarre par deux semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, ainsi que l’habituation aux tests comportementaux qui seront réalisés. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux et cognitifs. Ces tests sont au nombre de 3 et visent respectivement à évaluer la motricité, la force musculaire et la curiosité. La durée de ces tests est d’environ 30 minutes par souris (3 tests différents de 10 min chacuns avec des temps de récupération entre chaque). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Une procédure modérée telle que l’injection intrathécale entraine peu de douleur car cette procédure est réalisée sous anesthésie générale avec anesthésie locale sur la zone de l’injection, et que les animaux recevront une injection d’analgésique pour couvrir une éventuelle douleur post-injection. Les animaux sont surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée et des antalgiques setont administrés si toutefois une douleur est décelée. L’injection de protéines pathologiques ayant pour but de créer un modèle de la maladie, les animaux seront également surveillés quotidiennement. D’après notre expérience, pas ou peu de signes de mal être sont attendus car la maladie de Charcot chez l’Homme n’entraîne pas de troubles cognitifs ni de dépression, mais ces symptômes seront tout de même surveillés. En revanche, si notre modèle permet d’induire des symptômes semblables à la maladie chez l'Homme, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, la pesée bihebdomadaire à partir des premiers symptômes, ainsi que par l’utilisation de tests hebdomadaires d’évaluation de la fonction motrice des animaux. La grille de score des points limite s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement. Enfin, les tests comportementaux réalisés pouvant engendrer un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la maladie de Charcot. En effet la maladie met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central (cerveau et moelle épinière). Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, 36 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet : 3 groupes de 12 animaux (groupe expérimental, contrôle sain, contrôle négatif), dans chaque groupe se distinguent 2 sous-groupes en fonction de la destinée des animaux (6 animaux pour analyses biochimiques et 6 animaux pour analyses histologiques), et chaque sous-groupe est constitué de 50% de souris mâles et 50% de souris femelles. Ainsi 36 animaux sont nécessaires pour avoir minimum 3 réplicas par sous-groupe et par sexe. De plus, un groupe de souris sera utilisé pour mettre au point le protocole de mise à mort et de dissection permettant ainsi d’améliorer le protocole et de diminuer le nombre d’animaux utilisés par lots car moins de perte étant donné que le personnel sera formé. Ce groupe de souris utilisera des animaux de l’animalerie n’ayant pas les caractéristiques qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (cabane, coton, rouleau de sopalin, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie générale courte et accompagnée d’une anesthésie locale par précaution. Les animaux seront surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à une grille de score. L’injection a pour but de créer un modèle pathologique modéré. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, ainsi que par l’utilisation d’une grille de score et de points limites adaptés. La grille de score s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement. Par ailleurs, si moins de 8 injections sont nécessaires à l’induction de la pathologie elles seront réduites au strict minimum. Aussi, les tests comportementaux pouvant engendrer un stress lié à l’isolement, une habituation 15 jours avant le début des tests sera réalisée. Par ailleurs, un groupe de souris sera prévu pour mettre au point le protocole d'injections, de dissection/expérimentation. Ce groupe utiliseras des animaux de l’animalerie n’ayant pas les bons génotypes qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas. Ceci contribue à réduire le nombre d’animaux dans les autres groupes et permet une meilleure utilisation des animaux dans un soucis de réduction et de raffinement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherches. Les souris seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et mature car la maladie de Charcot est une maladie qui touche des adultes.

750 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à trois anesthésies, deux laparotomies dont l'une pour léser le nerf des corps caverneux et poser des électrodes, ainsi que la pose de cathéters dans l'aorte et le pénis pour mesurer des pressions. La dernière anesthésie, irréversible, est menée sans réveil et dure jusqu'à trois heures, avant la mort et le prélèvement d'organes. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la dysfonction érectile dans sa complexité et conclut au caractère incontournable de l'expérimentation animale.

Objectifs

Après 40 ans, un homme sur trois a des troubles de l’érection, pouvant avoir une incidence sur la qualité de vie des patients. La dysfonction érectile (DE) est un symptôme sentinelle des maladies cardio-vasculaires mais peut être également due à des traumatismes (chirurgicaux ou accident). Les traitements actuels présentent soit des contre-indications importantes soit des contraintes d’utilisation et/ou de prescription, d’où l’importance de développer de nouveaux candidats médicaments sur différents types de modèles. L’érection est une fonction complexe faisant intervenir des mécanismes vasculaires, musculaires et nerveux. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de candidats médicaments dans un modèle de dysfonction érectile chez le rat mâle anesthésié.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysfonction érectile.

Procédures

Les animaux subiront : - 3 anesthésies au maximum (2 gazeuses qui vont durer 15-20 min et 1 fixe sans réveil qui va durer jusqu’à 3 heures), - 2 chirurgies (1 laparotomie pour la lésion du nerf des corps caverneux qui va durer 20-30 min selon les expérimentateurs, 1 laparotomie pour installation d’électrodes au niveau des nerf du corps caverneux qui va durer 1 heure). - L’administration des composés à tester pourra se faire sous anesthésie gazeuse pour l’administration dans les corps caverneux (directement via le pénis, anesthésie de 20 min) ou via des voies plus classiques (i.p., s.c….). Les gestes étant réalisés par du personnel qualifié, les administrations de composés, d’antalgiques ne dureront que quelques secondes. De plus des cathéters seront implantés dans l’aorte carotide et dans le pénis au niveau du corps caverneux afin de mesurer des pressions. Le dernier acte fait sur l’animal est sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, les animaux vont être manipulés, ce qui d’une part peut engendrer un stress, une nuisance, une douleur. Les animaux vont également subir 1 laparotomie sous anesthésie gazeuse pouvant induire une gêne post-opératoire. L’administration du produit à tester pouvant se faire sous anesthésie gazeuse (pour l’administration dans les corps caverneux par exemple), cette succession d’anesthésie pour induire une nuisance à l’animal. De plus, une troisième anesthésie sans réveil sera réalisée pour l’évaluation de l’effet des candidats médicaments avant l’euthanasie de l’animal (ceci ne devant pas conduire à des nuisances particulières) à part la douleur de l’aiguille pour l’administration intrapéritonéale de l’anesthésiant).

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure car l’anesthésique utilisé est irréversible et les animaux ne pourront pas se réveiller. De plus, des organes pourront être collectés à la fin de la procédure.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de la dysfonction érectile. Tous les traitements existants ont d’importants effets secondaires. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle de dysfonction érectile se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. Dans une étude classique, il y aura 5 groupes expérimentaux. Un nombre minimum de 15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et interprétables.

Raffinement

Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (tunnel, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … . Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps, hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est très bien décrit dans la littérature chez le rat. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.