Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
233 souris vont être utilisées, dont des souris d'une lignée qui présente des lésions de la myopathie de Duchenne, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, la déclaration en comptant 143 en souffrance légère et 90 en souffrance modérée. Les souris reçoivent sous anesthésie gazeuse entre 6 et 11 injections intraveineuses de nanoparticules en 21 jours, vides ou chargées de molécules qui peuvent, selon le porteur, altérer le foie ou la rate. Elles sont utilisées entre 2 et 5 mois, avant l'âge de 7 mois où la lignée présente un "phénotype dommageable" marqué par une perte de poids et une atteinte cardiaque. Le but est de cibler les muscles malades tout en limitant l'exposition des autres organes. Le porteur qualifie le recours aux souris d'"indispensable" et rappelle que "l'acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie dégénérative mortelle atteignant les garçons, caractérisée par une perte progressive de la fonction des muscles (membres inférieurs, diaphragme, muscle cardiaque). Elle est caractérisée par une grande fragilité des fibres musculaires conduisant à des blessures répétées et une inflammation chronique, aboutissant à de la fibrose. L’espérance de vie des patients atteints de DMD est d’environ 30 ans. Il n'existe à l'heure actuelle pas de traitement curatif et le traitement palliatif utilisé, qui consiste en l'administration chronique de glucocorticoïdes, induit de nombreux effets secondaires (atrophie musculaire, obésité, fragilisation des os...). Il existe des modèles de souris pertinents présentant des signes histologiques de la pathologie proches de ce qui est observé chez les patients DMD. Il a été montré que l’administration de molécules régulant l’activité des cellules inflammatoires permet d’améliorer la fonction musculaire des souris modèles de la DMD. Cependant, un des problèmes lors de l’administration d’un traitement est sa possible captation par des organes non désirés comme le rein, le foie ou la rate, nécessitant d’augmenter les doses et pouvant conduire à des effets toxiques. Le projet vise à utiliser des nanoparticules (particules de très petite taille) pour délivrer des molécules actives dans le muscle malade en utilisant un modèle de souris pertinent. Ce projet permettra d'abord d’identifier le type de nanoparticules le plus adapté pour le ciblage des muscles et la fréquence des injections. Puis, il permettra de tester 10 molécules actives, préalablement validées comme étant anti-fibrosantes in vitro, en les couplant aux nanoparticules les plus adaptées afin d’améliorer la fonction musculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de développer de nouveaux traitements permettant d'améliorer la fonction musculaire dans un modèle de souris de la DMD qui seront potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Une biopsie de queue sera réalisé une fois (< 2 mm) pour vérifier le génotype des individus seulement sur la première portée de chaque femelle. Les animaux seront soumis à des injections intraveineuses qui seront réalisées sous anesthésie gazeuse (temps d'anesthésie inférieur à 10 minutes). En considérant une durée de vie des nanoparticules dans les muscles de 24 à 72h, nous estimons le nombre total d’injections entre 6 et 11 sur une période de 21 jours.
Impact sur les animaux
Nous utilisons une lignée de souris de phénotype dommageable mais avant l’expression de ce phénotype. En effet, les animaux sont âgés de 2 à 5 mois maximum, alors que le modèle de souris utilisé ne présente un phénotype dommageable qu'à partir de 7 mois, ce qui est caractérisé par une perte de poids et une altération de la fonction cardiaque. Nous n'attendons pas d'effets indésirables sur les animaux de l'injection des nanoparticules vides car le type de nanoparticules utilisé est approuvé par l’agence des médicaments américaine et européenne pour l'injection par voie intraveineuse. En revanche, les molécules actives utilisées étant des régulateurs métaboliques, il est possible qu’elles puissent altérer le fonctionnement de certains organes tels que le foie ou la rate, même si le but de leur couplage aux nanoparticules est de limiter ces effets indésirables. Dans ce cas, nous pouvons envisager une perte de poids des animaux associée à une mobilité réduite, du stress et un comportement anormal. Le cas échéant, ces animaux seront mis à mort dès les premiers signes de souffrance.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est indispensable pour ce projet car il vise à développer des stratégies thérapeutiques permettant de cibler plus spécifiquement les tissus musculaires (muscles des membres inférieurs, diaphragme) tout en limitant leur impact sur les autres organes. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l'effet de ce traitement sur des organismes entiers. La pertinence des molécules actives utilisées sera d'abord évaluée in vitro sur des cellules avant d'envisager leur utilisation in vivo. Afin de permettre une potentielle translation vers des applications cliniques, l’évaluation des différentes formes nanoparticulaires développées sur des modèles murins est la dernière étape essentielle de validation de ces nouvelles approches thérapeutiques. En outre, l’acquisition de données précliniques sur animaux est imposée par les autorités pour les nouveaux médicaments.
Réduction
L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Pour les procédures qui aboutissent à une analyse histologique et microscopique des tissus musculaires, il a été montré que 6 animaux par point d'analyse est suffisant pour des analyses statistiques. De plus, 2 lots différents de molécules encapsulées dans les nanoparticules seront testés en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux contrôles nécessaires injectés par des nanoparticules vides (pour des raisons de manipulation, il ne sera pas possible de tester plus de 2 molécules encapsulées à la fois). Le nombre maximal d'animaux utilisés pour ce projet est de 233 souris.
Raffinement
Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage et de bien-être afin d'enrichir l'environnement des souris. Un suivi quotidien et des pesées régulières des animaux permettent d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d'un éventuel phénotype dommageable. Des prélèvements multiples sont réalisés après mise à mort sur le même individu pour des tests parallèles. Nous utilisons une lignée de souris de phénotype dommageable mais avant l’expression de ce phénotype dommageable au moment des procédures (les animaux sont âgés de 2 à 5 mois maximum), alors que le modèle pertinent utilisé ne présente un phénotype dommageable qu'à partir de 7 mois.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Le modèle de souris pertinent utilisé présente des signes histologiques de la pathologie proches de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois mais ne présente un phénotype dommageable qu’à partir de 7 mois. Les animaux sont utilisés entre 2 et 5 mois d'âge (âge adulte et évolution de la pathologie pour le muscle dystrophique).
Impact environnemental d’écoaliments à basse teneur en azote utilisés en élevage porcin
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Nourris d'aliments expérimentaux, dont des régimes à très basse teneur en protéines, des porcs de 30 ou 60 kg passent 14 des 28 jours de l'essai dans des cages à digestibilité de 52 cm sur 117, réduites pour les empêcher de se retourner et recueillir leurs fèces sans urine. 60 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, six par régime. L'essai mesure leur croissance, leur digestion et leurs émissions gazeuses, pour réduire l'impact environnemental de la production porcine "en maintenant les performances de croissance des animaux", la réduction devant se vérifier "au kg de porc produit". Tous sont tués à la fin par une injection de T61 sous anesthésie, parce qu'ils auront consommé des acides aminés de synthèse pas encore autorisés dans l'alimentation porcine.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de quantifier les effets de stratégies alimentaires à très basse teneur en protéines associées à une gestion optimisée des effluents sur les performances de croissance des animaux, sur l’utilisation digestive et métabolique par les animaux, sur la répartition de l’azote entre urine et fèces avec des répercussions potentielles sur la composition des effluents, les émissions gazeuses associées et leur potentiel de valorisation.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse est que nous pouvons réduire l’impact environnemental de la production porcine en maintenant les performances de croissance des animaux. Pour que la réduction d’impacts obtenues au kg d’aliment produit soit conservée au kg de porc produit, il faut que les performances de croissance soient maintenues.
Procédures
Les animaux seront logés dans des cages à digestibilité de dimension : 52 x 117cm pendant 14 jours sur les 28 jours d'expérimentation.
Impact sur les animaux
La mesure de l’utilisation digestive d’un aliment chez le porc nécessite de collecter totalement les fèces des animaux, qui ne doivent pas être contaminées par l’urine. Ainsi, il est nécessaire de placer les animaux dans des cages à digestibilité (dimensions : 52 x 117cm) dont les dimensions sont réduites afin d’empêcher l’animal de se retourner tout en lui maximisant l’espace disponible. Les cages sont ainsi équipées d’un système de parois ajourées mobiles et de barreaux permettant de maintenir le contact entre les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation car nous allons tester des acides aminés de synthèse pas encore autorisés sur le marché de l'alimentation porcine (leucine, isoleucine, histidine). La mise à mort des porcs sera effectuée par injection intraveineuse de T61 (association d’embutramide, d’iodure de mébenzonium et de tétracaïne hydrochloride à la posologie de 1ml/10kg de poids vif) sous anesthésie (Imalgène IM à la posologie de 15mg/kg de poids vif).
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’incorporation d’aliments à moindres impacts environnementaux en condition d’élevage sur l’utilisation digestive des écoaliments, les émissions gazeuses à l’échelle de l’animal et la composition et valorisation des effluents. Ces objectifs ne peuvent être atteints par des méthodes mathématiques ou in vitro et nécessitent le recours à une étude in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux de l’essai et le dispositif expérimental mis en place ont été déterminés sur la base d’essais antérieurs afin d’atteindre le niveau de précision souhaité pour évaluer avec précision l’effet des écoaliments en élevage de porcs. Des protocoles similaires conduits dans l’unité ont utilisés entre 4 et 6 porcs par régime pour obtenir une précision satisfaisante dans les valeurs de digestibilité. En conséquence, nous conduirons nos mesures avec 6 porcs par régime.
Raffinement
La collecte totale des déjections sur des animaux entravés est à l’heure actuelle la seule méthode permettant de mesurer la digestibilité d’un aliment avec une grande précision. Les cages dans lesquelles seront hébergés les animaux seront équipées de barreaux et seront toutes placées dans la même pièce pour maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les porcs. L’appétit, l’ingestion d’eau, le comportement des animaux ainsi que l’état de la cage seront observés au moins deux fois par jour par le personnel technique afin de détecter des blessures éventuelles, des diarrhées ou des troubles respiratoires. Tout animal présentant l’un de ces troubles fera l’objet d’une prise en charge immédiate.
Choix des espèces
La cible de l’étude est le porc en croissance-finition. Nous allons utiliser un croisement répandu dans les élevages commerciaux français (Piétrain X (Large White X Landrace)). Les animaux seront des porcs d’un poids vif de 30kg en début d’essai pour l'étude des aliments croissance et de 60kg en début d’essai pour l'étude des aliments finition. Nous avons choisi de travailler avec des animaux dont le poids vif moyen atteint au cours de l’étude correspond au poids vif moyen des porcs en phase croissance et en phase finition.
Rôle des protéines tyrosines phosphatases Shp1 et Shp2 dans la myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour leurs prises de sang, des souris anesthésiées ont le bout de la queue sectionné sur moins d'un millimètre, puis la croûte grattée pour les quatre prélèvements suivants. 1 290 souris, dont des souris porteuses de la mutation JAK2V617F associée à la myélofibrose, vont être utilisées puis toutes tuées pour prélever leur sang et leur moelle osseuse, la déclaration en comptant 872 sans réveil, 58 en souffrance légère et 360 en souffrance modérée. Le porteur affirme que les traitements n'ont "aucun impact négatif sur l'animal", et indique que la plupart des souris les reçoivent par voie orale "sur animal vigile". Il écrit aussi que les expériences ont "toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées".
Objectifs
Les mégacaryocytes (MKs) sont de grandes cellules polyploïdes qui résident dans la moelle osseuse et libèrent continuellement les plaquettes dans la circulation sanguine. Une production réduite de plaquettes entraine une thrombopénie et des complications hémorragiques. Alors qu’un nombre élevé de plaquettes résultant d’une prolifération incontrôlée des MKs, conduit à une famille d’affections clonales appelée les néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) et la myélofibrose (MF). Ces pathologies sont causées par une signalisation tonique du récepteur Mpl de la thrombopoiétine (Tpo), le principal régulateur de la prolifération des MKs. De plus, les MKs sont le moteur de la MF et du remodelage destructeur de la moelle osseuse qui accompagne les NMPs, en raison de la libération excessive de cytokines et de facteurs de croissance pro-fibrotiques. Une mutation récurrente de la Janus kinase 2, JAK2V617F, est présente dans plus de 80% des patients atteints de NMPs. JAK2 est une enzyme de la famille des tyrosines kinases et est impliquée dans la transduction du signal de différentes cytokines telles que la Tpo. Cette mutation activatrice JAK2V617F est responsable d’une activation constitutive en absence de cytokines, responsable ainsi d’une prolifération accrue et incontrôlée des MKs responsables de la myélofibrose. A ce jour, les médicaments utilisés en clinique tels que les inhibiteurs de la voie JAK (ruxolitinib), en combinaison avec d’autres inhibiteurs de kinases (selutinimib), ont apporté́ de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Nos études précédentes chez la souris ont permis de mettre en évidence un rôle primordial de deux enzymes cytoplasmiques, les tyrosine phosphatases Shp1 et Shp2, dans la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes (Mazharian et al., Blood 2012 ; Nagy et al., Blood 2019). De plus, il a été proposé que Shp2 est phosphorylée dans les cellules hématopoïétiques des patients atteints de NMPs. Actuellement, un inhibiteur de Shp2 (Shp099) est utilisé en clinique dans le traitement de certains cancers à tumeurs solides. Ainsi, elles représentent des cibles prometteuses dans le traitement des NMPs et la myélofibrose associée.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles cibles importantes impliquées dans le néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des symptômes et de la myélofibrose chez les patients. En effet, à ce jour, les médicaments utilisés en clinique ont apporté́ de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Un deuxième bénéfice important est de cibler certaines cellules spécifiques. Actuellement, les traitements utilisés touchent différentes cellules. Ce projet vise à identifier des cibles bien spécifiques des mégacaryocytes, qui sont les cellules impactées dans ces pathologies. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement.
Procédures
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections, soit en i.p., soit en s.c ou lors des traitements par voie orale. Les traitments ont comme impact de diminuer modérément et transitoirement la production des plaquettes, de sorte qu’ils n’ont aucun impact négatif sur l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront majoritairement soumis à un traitement par voie oral sur animal vigile. Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang par section de moins de 1 mm à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les 4 autres prélèvements (toujours sur souris anesthésiée).
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous sacrifiés pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse.
Remplacement
La myélofibrose est une pathologie complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire in vitro. Il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Par conséquent, il est déterminant d’utiliser un modèle animal qui récapitule la myélofibrose induite par la mutation JAK2 et de pouvoir tester différents agents pharmacologiques sur l’évolution de la pathologie in vivo.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux sera minimisé : une même souris sera destinée à l’analyse de plusieurs paramètres, et plusieurs champs seront acquis par animal permettant de visualiser le plus d’évènements cellulaires. Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles disponibles au laboratoire. Les tests statistiques seront utilisés pour analyser les données obtenues entre les différents génotypes de souris. Les effectifs sont calculés suivant la loi normale N(μ ; σ). Le critère recherché est la comparaison de moyennes. On aboutit à n=18/d² avec d=|μ1 - μ2|/σ Pour les études in vivo, le nombre d’animaux par lot est n=18. Pour les études in vitro, le nombre d’animaux par lot est n=6, nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’une quantité suffisante de sang par condition. Le sang d’un animal ne pouvant pas être utilisé pour les 5 tests, car en quantité insuffisante par animal. Les groupes sont comparés par un test Anova ou Mann-Whitney.
Raffinement
Raffiner : Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées maintenue au chaud tout au long de l'expérience pour éviter une hypothermie due à l'anesthésie/l’analgésie. Pendant leur hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation et la présence de frisure de papier, de coton et le carré de cellulose pour enrichir l'environnement ainsi que de la nourriture déposée au fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux publiés montrant la génération de souris génétiquement modifiées permettant de modéliser la myélofibrose humaine. C’est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes d’intérêt sont inactivés. Nous nous baserons sur le même modèle : une lignée de souris présentant une mutation constitutive de JAK2V617F (JAK2KI/+) (Marty et al, Blood 2010). Ces animaux seront traités avec différents agents pharmacologiques pour tester leur effet sur la numération plaquettaire et l’évolution de la maladie, afin d’évaluer leur rôle protecteur /curatif sur le compte plaquettaire et la myélofibrose. Sur la base de ce modèle, nous générerons une lignée de souris quadruple mutantes, JAK2KI/+Shp1FL/FLShp2FL/FLGp1bCreKI/+, dans lesquelles les enzymes Shp1/Shp2 sont invalidées dans la lignée mégacaryocytaire. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 6 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise.
Mise au point de la cavitation ultrasonore pour la délivrance de chimiothérapie et le traitement du cancer du pancréas dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
739 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections de chimiothérapie et un traitement par ultrasons de puissance pendant cinq semaines, avec un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut causer une perte de poids et des signes de souffrance, pris en charge par analgésie, et qu'une soixantaine d'animaux subissent une chirurgie supplémentaire pour l'implantation de sondes. Il affirme que les cultures cellulaires en 3D ne représentent pas la physiologie tumorale et juge le modèle animal seul capable de la reproduire.
Objectifs
Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic. La raison principale de ce mauvais pronostic est que l’environnement de la tumeur (appelé stroma) est très dense et empêche la chimiothérapie d’atteindre sa cible. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie d’être plus efficace. Les ultrasons de puissance, focalisés, permettent de modifier cet environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains. En l’appliquant aux tumeurs du pancréas nous souhaitons savoir si ces ultrasons de puissance permettet d'améliorer l'efficacité de la chimiothérapie. Le projet se déroulera en deux phases : une première phase déterminera les paramètres ultrasonores optimaux augmentant l'efficacité de la chimiothérapie dans des tumeurs greffées. La deuxième phase utilisera ces réglages pour les appliquer dans un modèle génétique de tumeurs du pancréas, plus proche de la maladie humaine, mais pour lequel il est compliqué d’avoir suffisamment de tumeurs comparables en même temps pour réaliser une étude et nécessitant un nombre important d'animaux à élever. Ce projet de recherche translationnelle d’une durée de 3 ans mettra en œuvre un maximum de 739 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de valider le système de traitement ultrasonore ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais chez les patients pour traiter le cancer du pancréas par endoscopie.
Procédures
Pour la première phase de l'étude, des souris dépourvues de système immunitaire seront utilisées. Parmi ces souris, certaines se verront injecter des cellules tumorales par injection sous-cutanée (210 animaux). La croissance de ces tumeurs peut prendre jusqu'à 6 semaines . Les autres seront opérées sous anesthésie générale et analgésie pour greffer dans le pancréas des fragments tumoraux issus de ces tumeurs sous cutanées (489 animaux). Ces tumeurs mettent 3 semaines à se développer. Ces souris recevront ensuite des injections intra-péritonéales de chimiothérapie ainsi qu'un traitement par ultrasons de puissance pendant 5 semaines. Pour suivre la croissance des tumeurs dans le pancréas et leur réponse au traitement, les souris seront examinées par imagerie non-invasive sous anesthésie générale. Pour mesurer de manière précise les effets des ultrasons de puissance, certains animaux greffés (60) subiront une opération chirurgicale sous anesthésie générale pour appliquer des sondes de mesure directement dans la tumeur, les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Pour la deuxième phase de l'étude, des souris génétiquement modifiées seront croisées pour obtenir une mutation conduisant au développement de tumeurs du pancréas. Ces 40 souris voient appraître des tumeurs entre 10 et 20 semaines et seront ensuite traitées 5 semaines par injection intra-péritonéale de chimiothérapie et par ultrasons de puissance sous anesthésie générale. Tous ces animaux seront suivis par imagerie non-invasive pour suivre la croissance des tumeurs, et caractériser l'effet du traitement.
Impact sur les animaux
La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer des pertes de poids et des signes de souffrance si celles-ci sont trop importantes, d'où un suivi précis par imagerie non-invasive et une prise en charge de la douleur par analgésiques. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical, prise en charge par une analgésie adaptée.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort et les tumeurs prélevées seront utilisés pour les procédures 2 à 7. Tous les animaux des procédures 2 à 8 sont mis à mort en fin d'étude pour analyser les tumeurs qu'ils portent et caractériser les effets du traitement.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer la plage de fonctionnement à utiliser pour les ultrasons de puissance et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire 3D. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral (vascularisation, potentiel métastatique, réponse immune), seul un modèle animal le permet.
Réduction
Le nombre de souris suivies est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentiels et limitant le degré de souffrance des animaux, les tumeurs étant détectées très tôt. Les résultats de cette étude permettront de réduire par la suite le nombre d’animaux sur le modèle de référence.
Raffinement
Le suivi de la douleur et du stress sera réalisé un à deux fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort si nécessaire. Un suivi plus fréquent est prévu en suite opératoire et après injection des traitements. Les procédures d’imagerie et de chirurgie seront réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Dans ce projet de mise au point, les principaux organes seront prélevés afin de déceler d’éventuelles métastases. Les animaux seront hébergés dans des cages disposant d’enrichissement (tubes en carton et cotons compactés).
Choix des espèces
La souris est un bon modèle de tumeurs du pancréas et nous avons besoin de lignées spécifiques n'existant pour certaines que chez la souris. Les animaux utilisés pour les greffes de tumeur du pancréas seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines), les animaux transgéniques développant des tumeurs à partir de l'âge adulte (au delà de 10 semaines).
Maintien d’une banque de tumeurs épithéliales mammaires humaines par des approches de xénogreffes orthotopiques chez la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
904 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, parfois suivie d'une résection, pour entretenir une banque de xénogreffes issues de patientes atteintes de cancer du sein. Le porteur suit la croissance tumorale au pied à coulisse et prévoit des points limites, avant une mise à mort permettant de prélever la tumeur ou de cartographier les métastases sur de nombreux organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité tissulaire d'une tumeur, seule la greffe in vivo la restituant selon lui.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus meurtrier chez la femme, à l’origine d’un peu plus de 11 800 décès par an en France. C’est une maladie complexe. Il existe de nombreux sous types de tumeurs mammaires qui ont des profils histologiques, génétiques et génomiques variés expliquant une évolution clinique différente. Cette hétérogénéité constitue à l’heure actuelle un des freins majeurs à une prise en charge thérapeutique optimale des patientes. Le développement de modèles précliniques mimant la complexité de la maladie est donc indispensable pour définir au mieux le traitement de demain. Pour cela, nous avons établi, dans un précédent projet (#01152.03), une banque d’une cinquantaine de xénogreffes (également appelée xénobanque) issues de tumeurs de patientes atteintes de cancer du sein (PDXs : Patient Derivated Xenograft) qui ont été archivées sous forme d’ampoules. Ce modèle a été démontré comme mimant parfaitement la biologie de la tumeur chez la patiente avec des profils histologiques, génomiques et transcriptionnels identiques (Marangoni et al., CCR 2007; Reyal F et al., BCR 2012; Derose et al., Nat med 2011). Il a également été démontré que ces modèles de xénogreffe reproduisent fidèlement la réponse aux thérapies conventionnelles observée chez les patientes (Zhang et al., Cancer Res 2013). Par ailleurs, cette xénobanque a permis d’initier la caractérisation du rôle des cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes au sein de la tumeur et qui est à l’origine de 20 % des cancers du sein (Müller et al., 2020 ; Arfaoui et al., 2019, Guégan et al., 2019). Cette xénobanque sera donc au centre de notre projet qui aura 3 objectifs principaux: 1/ La préservation de la xénobanque; 2/ La caractérisation du développement métastatique des échantillons de la xénobanque; 3/ Le déploiement de la xénobanque dans des tests précliniques.
Bénéfices attendus
La préservation de la xénobanque réalisée grâce à ce projet permettra notamment de poursuivre la carctérisation de du développement métastatique des échantillons de cette banque et de mieux comprendre le rôle des CSCs dans ce processus permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes atteintes de cancer du sein. Le matériel issu de cette xénobanque sera également utilisé pour l’étude des thérapies ciblant les CSCs en combinaison avec des traitements de chimiothérapie conventionnels (#16487-2018082108541206 v3), le développement de traitements ciblant la maladie métastatique (#21988-2019080815368654 v4) et l’étude de l’impact de la radiothérapie seule sur les CSCs ou combinée avec une thérapie capable de radiosensibiliser les CSCs (#26523-2020070810304662 v2). In fine, le renouvellement de cette xénobanque nous permettra d'approfondir nos connaissances sur le cancer du sein, son développement métastatique, sa résistance thérapeutique et plus particulièrement les CSCs pour pouvoir, espérons un jour, proposer une thérapie ciblée pour chaque patiente.
Procédures
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale (sous anesthésie) lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire qui durera approximativement 15 minutes. Dans le cas de la procédures 2, les souris seront soumis à une procédure chirurgicale supplémentaire de résection de la tumeur qui durera 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire. La nuisance de ces actes chirurgicaux sera prise en compte par l'application d'une anesthésie générale, d'une analgésie post-operatoire et l'utilisation d'un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Les éventuelles nuisances liées à la croissance tumorale seront détectées au plus tot à l'aide d'une grille de score de la douleur intégrant des points limites les plus précoces possibles.
Devenir
A l'issue de la Procédure 1, les souris seront sacrifiées et les tumeurs seront prélevées, dissociées et soit réinjectées dans des glandes mammaires pour nos autres projets soit pour réaliser des ampoules pour notre xénobanque. Suite à la Procédure 2, les souris seront sacrifiées et différents organes seront prélevées afin de réaliser la cartographie métastatique de chaque souris (coeur, poumons, cerveau, rate, reins, foie, ovaires, cage thoracique, squelette).
Remplacement
Sur le plan physiopathologique, une greffe orthotopique de cellules tumorales obtenue chez un animal présente des caractéristiques, non pas identiques, mais similaires à celles d'une tumeur humaine, avec une complexité tissulaire impossible à reproduire in vitro. De même, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant la réalisation d’ampoules et de nos différentes études. De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux serviront aux étapes de rafraichissement et d’amplification. Ce projet de maintien d'une banque de xénogreffes nécessitera donc 904 souris immunodéficientes de type NSG.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs : la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande.
Effets thérapeutiques d’extraits de plantes sur les mammites subcliniques chez la vache laitière et conséquences sur les qualités sensorielle et technologique du lait
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
54 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, le porteur prévoyant de les réintégrer au troupeau à l'issue plutôt que de les tuer. Atteintes de mammite subclinique, elles reçoivent des huiles essentielles et subissent cinq prises de sang à la veine caudale par procédure. Le porteur affirme que ces huiles "ne présentent aucun effet indésirable" sur leur santé, sans décrire d'autre contrainte. Il justifie le recours aux vaches par l'objet même de l'étude, une pathologie de la vache laitière, et vise aussi les qualités du lait pour la production.
Objectifs
Au cours des trois dernières décennies, la production mondiale de lait a augmenté de plus de 58%, passant de 522 millions de tonnes en 1987 à 828 millions de tonnes en 2017. Cependant, cette activité, comme toutes les productions animales, est soumise à diverses difficultés. Ces dernières peuvent être d’ordre économique comme l’augmentation des coûts de production ou sanitaire avec les problématiques liées à l’élevage bovin. Du point de vue sanitaire, l’infection la plus importante en élevage bovin laitier est la mammite. Le coût moyen d’une mammite clinique revient à 230€ par vache et par an. Ce coût est composé de 52% de pertes directes (baisse de production, lait écarté, réforme prématurée, traitements, etc.) et de 48% de pertes indirectes (temps consacré aux soins, pénalités sur le paiement du lait, etc.) Le traitement des mammites chez les vaches en lactation s’effectue par l’utilisation d’antibiotiques. Cependant, leur utilisation prolongée développe une résistance antimicrobienne, contamine le lait et les autres productions animales et est à l’origine d’une pollution environnementale liée aux résidus d’antibiotiques. Dans ce contexte, les éleveurs recherchent de nouvelles solutions leur permettant de limiter l’apparition de mammites et l’utilisation des antibiotiques. L’objectif du projet est d’explorer l’utilisation d’huiles essentielles et d’extraits de plantes médicinales avec des activités antibactériennes et antiinflammatoires en thérapie contre les mammites subcliniques qui se traduisent sans symptômes apparents par une augmentation du taux de leucocytes dans le lait et d’évaluer leurs conséquences sur la qualité du lait.
Bénéfices attendus
Ce projet concernera donc des animaux atteints de mammite subclinique c'est à dire ayant une numération cellulaire dans le lait supérieure à 250 000 cellules par ml.
Procédures
Les animaux seront hébergés et logés selon les normes en vigueur dans les élevages laitiers. Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Pour chaque procédure, 5 prises de sang seront réalisées à la veine caudale (9 ml) au cours des jours suivants la mises en présence d'huile essentielle. J0, J4, J7, J14 et J28 pour la procédure 1 et J0, J7, J21, J28 et J35 pour la procédure 2
Impact sur les animaux
L’utilisation des huiles essentielles ne présente aucun effet indésirable sur la santé des vaches laitières.
Devenir
Suite à l'estimation de l'état général des animaux en fin d'essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation exprimentale de réintégrer les vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l'état général d'un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux pour étudier les effets thérapeutiques des huiles essentielles sur les mammites chez la vache.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive des animaux tout le long des expériences.
Choix des espèces
Il s’agit d’un travail sur une pathologie chez la vache laitière (mammite). Les bovins sont donc le modèle optimal pour cette étude. La race de vache laitière utilisée sera la Prim' Holstein. Il s'agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en lactation et non gestantes
Le test d’observation d’Irwin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3600
7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.
Objectifs
Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Devenir
A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.
Rôle du récepteur à l’ocytocine dans les cellules contrôlant la reproduction et les comportements
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie menée sous anesthésie sans reprise de conscience. Elles reçoivent des composés et une puce, et une délétion sélective du récepteur à l'ocytocine réduit selon le porteur leur sociabilité et leur bien-être. Après des tests comportementaux, une perfusion cardiaque termine les procédures. Le porteur affirme qu'il "n'y a aucune méthode de remplacement" pour l'étude des comportements sociaux et de la reproduction, et travaille sur des souris jeunes adultes.
Objectifs
L’ocytocine contrôle les grandes fonctions physiologiques permettant la survie des mammifères, depuis la reproduction, la mise-bas, la lactation jusqu’aux comportements sociaux. La libération de l’ocytocine au niveau du cerveau, permet de réguler tous les comportements sociaux, comme les comportements sexuels et parentaux, la mémoire sociale ou l’interaction sociale entre individus. Pour cela, l’ocytocine, en tant que neurotransmetteur, se fixe sur son récepteur exprimé dans différentes populations de neurones du cerveau. En tant qu’hormone libérée dans le sang, l’ocytocine est bien connue pour agir sur son récepteur situé dans les muscles de l’utérus et des glandes mammaires, pour la mise-bas et l’éjection du lait maternel. Le récepteur OXTR est aussi présent dans un sous-type de cellules des testicules, les cellules de Leydig, dont la fonction reste inconnue à ce jour. Récemment, nous avons mis à jour in vitro dans deux lignées transformées de neurones et de cellules de Leydig que le récepteur à l’ocytocine contrôlait directement l’expression et la traduction des gènes impliqués dans l’adaptation cellulaire au sein de ces deux types de cellules. Ayant fait la preuve de concept in vitro, nous voulons mettre en évidence 1) le rôle exact du récepteur OXTR dans les neurones et les cellules de Leydig dans un organe naturel au sein d’un organisme entier et 2) son impact sur les fonctions de reproduction et des comportements sociaux in vivo en l’inactivant spécifiquement dans chacune de ces cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre le rôle du récepteur à l'ocytocine, un des cibles thérapeutiques majeurs de l’interaction sociale chez la souris. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale , et également à plus long terme de développer une nouvelle approche pharmacologique pour soulager ces troubles.
Procédures
administration de composés (1 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal)
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. délétion sléective du récepteur à l'ocytocine : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être des animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
administration de composés, puçage des animaux, délétion spécifique du récepteur à l'ocytocine : les animaux sont gardés en vie afin de pouvoir réaliser les tests de comportement. Après les tests de comportement et perfusion cardiaque, les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Nous avons montré par des études préliminaires in vitro dans des cellules immortalisées et transformées en culture, la faisabilité de notre étude. Il n’y a aucune méthode de remplacement pour l’étude des comportements sociaux et la reproduction des animaux.
Réduction
Nous avons mis au point in vitro dans nos lignées de cellules les conditions expérimentales permettant de mettre en évidence des effets statistiquement significatifs, tout en minimisant le plus possible le nombre d’animaux utilisés. De plus, les différents tissus sont utilisés afin de pouvoir faire plusieurs méthodes d’analyse avec le même tissu d’un seul animal, réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont gardés dans des conditions classiques d’élevage avec deux types d’enrichissement, un igloo en carton et des frisures de papier kraft pour diminuer le stress des animaux et améliorer leur thermorégulation. Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements, sont les plus brèves possibles (< 1 heure par animal) et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, la plupart des tests de comportement mettent en jeu des interactions avec d’autres animaux et/ou des odeurs sociales dans les appareils de comportement ou cage, différents de leur cage d’élevage, satisfaisant leur curiosité naturelle envers leurs congénères et l’exploration spatiale de leur environnement. Ainsi, les tests de comportement permettraient de renforcer l’enrichissement des animaux. Les tests de fertilité consistent à mettre des animaux mâles avec des femelles de génotype sauvage en reproduction et ne varient pas des conditions d’élevage classique des animaux. Le suivi des animaux sera quotidien et assuré par les soigneurs et expérimentateurs habilités.
Choix des espèces
Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduisent bien et vite et dont les comportements sont mesurables par des tests bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-12 semaines) à un stade post-pubère.
Ocytocine-vasopressine dans les déficits d’interaction sociale chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un déficit de sociabilité leur est imposé par invalidation de gènes ou par isolement, avant une longue batterie de tests comportementaux dont le test de la nage forcée, l'enfouissement de billes, l'exposition à des odeurs de prédateur et le test d'intrusion. Le porteur décrit ces atteintes comme "légères" et une perfusion intracardiaque terminale clôt les procédures. Il affirme qu'il "n'y a pas de méthode de remplacement" du comportement animal in vitro, seul l'animal vivant permettant selon lui d'évaluer l'interaction sociale.
Objectifs
L’ocytocine, plus communément appelée « l’hormone de l’amour » est un petit peptide qui régule les comportements sociaux chez les mammifères. Bien qu’elle soit bien connue pour son rôle dans la lactation et l’accouchement, l’ocytocine est également sécrétée dans le cerveau pour moduler les interactions sociales (parent-enfant, fraternel, avec un congénère inconnu, …). Le système ocytocine est en réalité beaucoup plus complexe et encore mal connu. En effet, l’ocytocine, et la vasopressine, un peptide apparenté, se lient sur les récepteurs à l’ocytocine et à la vasopressine, et l’ensemble de ces acteurs contrôle les interactions sociales. L’administration d’ocytocine comme de la vasopressine restaure l’interaction sociale chez les mammifères souffrant de déficits d’interaction sociale, dont l’Homme (autisme, schizophrénie, addiction). De plus, il semblerait que les déficits d’interaction sociale soient liés à des dysfonctions dans le système ocytocine-vasopressine. L’objectif de cette étude est de 1) déterminer les dérégulations (communes) du système ocytocine-vasopressine dans des modèles de souris souffrant de déficits d’interaction sociale (fraternel et avec un congénère inconnu) et 2) d’identifier quels récepteurs de ce système restaure l’interaction sociale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer quelle est la cible thérapeutique la plus importante au sein de la famille ocytocine-vasopressine permettant d'améliorer l’interaction sociale chez la souris. Dans un second temps, le meilleur agent pharmacologique va être identifié sur cette cible. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale, et de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
Les procédures sont : induction d'un déficit de sociabilité par invalidation de gènes ou par isolement; administration de composés (1-14 fois, 5 sec) par voie intranasale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), tests de comportements (1-14 fois, 5 à 40 min), perfusion intra-cardiaque (1 fois, procédure sans réveil, 30 min). Le comportement social sera évalué en utilisant le test d’interaction sociale directe et le test des trois chambres pour la sociabilité, le test de monte pour le comportement socio-sexuel et le test de déplacement du nid et l'agression maternelle pour le comportement maternel. Enfin, la préférence et la détection olfactives seront mesurées pour la préférence des odeurs sociales. Les comportements stéréotypés, persévérants et répétitifs sont évalués par le scorage des stéréotypies motrices, et en mesurant les alternations dans un petit labyrinthe en Y. Les comportements de type anxieux sont mesurés dans le test de l’enfouissement de billes, le test de suppression de prise de nourriture induite par la nouveauté, le test de reconnaissance des odeurs de prédateurs et le test de la nage forcée. L’agressivité et la dominance seront évalués en utilisant le test d’intrusion d’un mâle résident et le test du tube.
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. Modèles de déficit de sociabilité (génétique ou par isolement) : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être et éventuellement une augmentation légère du stress de ces animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
Les animaux à l'issu des procédures sont euthanasiés pour prélèvement des organes.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement animal in vitro. Le comportement animal et les conséquences fonctionnelles de l’interaction sociale ou des déficits ne peuvent être évalués que sur des animaux vivants. Bien que les déficits d’interaction sociale ne menacent pas la durée de vie, ils entravent la qualité de vie et la capacité à concevoir des animaux d’élevage et pour l’homme.
Réduction
Notre étude vise à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et le temps d’expérimentation. Les expériences en aigu (jour 1) et en chronique (jour 8) sont réalisées sur les mêmes groupes expérimentaux. Tous les cerveaux des animaux sont conservés et utilisés afin de ne pas sacrifier de nouveaux animaux. Des conditions de réussite sont appliquées à l’utilisation de certains groupes. En effet, le nombre d’animaux sera réduit de moitié si aucun effet genre n’est mis en évidence.
Raffinement
Pour la procédure nous amenant à isoler certains animaux, les animaux auront plus d'enrichissement (matériau de nid) à leur disposition et seront élevés en contacts visuels, olfactifs et sonores avec les autres animaux pour minimiser leur inconfort. Les animaux sont très vite habitués aux procédures, menées dans les délais les plus courts possibles, dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser la contrainte et l’anxiété des animaux. Les animaux sont surveillés avant et après chacune des procédures et quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel de l'animalerie. De plus, les tests de comportement permettent de satisfaire les comportements de curiosité naturelle des souris à explorer leur environnement et interagir avec leurs congénères. D’après notre expérience, les animaux ne subissent aucune altération de leur état de santé. Si un animal est blessé ou atteint un point limite (pelage négligé, posture anormale, diminution de poids ou diminution d'activité), l'animal sera traité (antiseptique et/ou analgésique) en accord avec le vétérinaire référent et sa surveillance sera renforcée. Si l'animal atteint des signes cliniques inquiétants ou une combinaison de points limites, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux et hiérarchisés. Les souris expriment les mêmes déficits d’interaction sociale et de comportement stéréotypés que les mammifères de plus grosse taille ou les humains. De plus, leur comportement social est régulé par l’ocytocine et la vasopressine et leurs récepteurs qui sont extrêmement bien conservés chez tous les mammifères. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les conséquences moléculaires et les effets de composés sur l’interaction sociale. De plus, la souris est un petit mammifère, une taille compatible avec l’utilisation de petites quantités de composés. Les études seront menés chez le jeune adulte (7-10 semaines), le souriceau nouveau-né (0-1 semaine) ou l’animal après sevrage (3-4 semaines).
Implantation en tant que pontage artérioveineux chez le gros animal d’un vaisseau sanguin allogénique obtenu par tissage de fils de matrice extracellulaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
13 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de trois à quatre heures pour l'implantation d'un substitut vasculaire tissé posé en pontage entre carotide et jugulaire, puis des contrôles échographiques répétés sous anesthésie et une ponction à l'aiguille simulant l'hémodialyse. Le porteur mentionne parmi les nuisances l'absence de traitement anti-inflammatoire, un risque d'hémorragie et de déchirement du greffon, et prévoit la mise à mort à quatre et huit semaines pour prélever le vaisseau. Il affirme qu'une implantation "chez le gros animal" est "indispensable" et que la brebis est la seule espèce dont les cellules produisent les feuillets recherchés.
Objectifs
Les substituts vasculaires entièrement biologiques d’origine humaine issus d’une approche basée sur la synthèse de matrice par les cellules in vitro dite de « Cell-Assembled extracellular Matrix-CAM » ont été implantés chez l'Homme avec succès. Pour pallier les limites des prothèses vasculaires synthétiques, l’approche CAM permet la production de feuillets entièrement biologiques grâce à des cellules extraites à partir de peau humaine adulte saine. Des greffons de vaisseaux sanguins obtenus par roulage de ces feuillets ont été implantés avec succès chez des patients montrant une remarquable biocompatibilité. Cependant, leur méthode d’assemblage est longue pour permettre la fusion des différentes couches du vaisseau. Pour réduire le temps de production, ces feuillets sont transformés en fils qui, une fois montés sur un métier à tisser, permettent l’obtention d’un substitut vasculaire par tissage. Une implantation dans un modèle de gros animal ayant une anatomie proche de celle de l’humain est indispensable pour évaluer le comportement mécanique des produits d’ingénierie tissulaire tissés issus de l’approche CAM. Ainsi, l’objectif de ce projet est d’étudier le comportement mécanique ainsi que le remodelage in vivo de nos substituts vasculaires biologiques tissés à partir de fils de CAM face à une hémodynamique propre à l’hémodialyse, un contexte clinique pertinent, et ce dans un contexte de greffe allogénique, c’est-à-dire dans un contexte où un tissu d’un individu d’une espèce est implanté chez un autre individu d’une même espèce. Cela permettra d’étudier les réactions immunitaires innées et adaptatives, et de mettre en évidence que notre substitut peut être implanté en tant qu’accès vasculaire artérioveineux et subir/s’adapter à une hémodynamique importante et subir un remodelage adapté. Cela permettra également de mettre en évidence la faible réponse immunitaire à court terme de l’hôte suite à l’implantation. Ces résultats permettront d’envisager la réalisation d’une étude à plus long terme (jusqu’à 1 an) pour évaluer la viabilité à long terme du greffon et ce à terme pour utiliser cette technique chez les patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples. Ce projet permettra de mettre en avant la possibilité d’utiliser des substituts vasculaires tissés à partir de CAM allogénique. En effet, ce projet permettra de mettre en avant la faible réponse immunitaire de l’hôte à notre substitut allogénique. Ces réponses supporteront l’idée que des vaisseaux allogéniques tissés dévitalisés peuvent être utilisés avec efficacité et peuvent pallier à la limite des substituts autologues. Également, les études du comportement mécanique et du remodelage du substitut apporteront des réponses essentielles qui permettront de modifier les paramètres de tissage des substituts afin d’adapter leurs propriétés mécaniques et structurelles de l'organisme. Les adaptations mises en place suite à ces résultats permettront ainsi d’obtenir un substitut dont les propriétés répondront au mieux à une situation clinique donnée.
Procédures
Toutes les interventions dans cette étude seront faites sur des animaux anesthésiés. Premièrement, les implantations d’un substitut vasculaire tissé ainsi que d’un contrôle avec une prothèse synthétique commercialisé et actuellement utilisée en clinique, seront effectués dans un modèle bilatéral sur chacune des huit brebis, après anesthésie et avec des protocoles pré, per et post opératoires adaptés. Cette procédure chirurgicale est prévue une fois par animale pour une durée estimée à 3 à 4 heures. Les animaux seront soumis à des contrôles échographiques post-implantation et à des temps de 2 et 4 semaines (pour le groupe de 4 semaines), et post- implantation et à des temps de 2, 4, 6 et 8 semaines (pour le groupe 8 semaines). Chaque échographie sera réalisée sur animal anesthésiée pour réduire le stress des animaux. Chaque échographie ne durera pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure. Pour le groupe de 8 semaines, une ponction de l’abord vasculaire sera effectuée avec une aiguille 16G afin de simuler un contexte d’hémodialyse. Cette ponction sera réalisée à 4 semaines, lors de l’échographie de contrôle, sur animal anesthésié. La ponction et l’échographie ne dureront pas plus d’une heure et chaque animal sera anesthésié pour une durée maximale d’une heure.
Impact sur les animaux
La phase déterminante pour le bien-être de l’animal repose sur un temps d’intervention court. En effet, chaque brebis sera sous anesthésie générale pour effectuer la chirurgie d’implantation du greffon. Plus le temps passé sous anesthésie est court, mieux c’est pour le bien-être de l’animal et la réduction des effets indésirables de l’anesthésie. Nous estimons la durée de la chirurgie de 3 à 4 heures. Une fois implanté, des effets indésirables liés au greffon pourraient apparaître. Si des problèmes d’hémorragie ou d’écoulement à travers le greffon apparaissent, le protocole d’anticoagulation pourra être revu et adapté. Un autre effet indésirable potentiel est le déchirement du greffon, suite à un mouvement brusque de la brebis ou un coup porté sur l’implant par un autre animal. Si un déchirement est observé et est attribué directement au greffon, le design de ce dernier pourra être adapté pour les brebis suivantes. Afin de gérer le stress des animaux et d’éviter un endommagement du greffon et/ou une blessure de l’animal, les contrôles échographiques se feront sous anesthésie générale. De plus, cela permettra d’analyser le greffon avec plus de précision que si la brebis est vigile et en mouvement. Ces contrôles et l’anesthésie générale dureront une heure maximum. Une des nuisances pour l’animal au sein de cette étude est également l’absence de traitement anti-inflammatoire en post-opératoire. En effet, ce projet repose sur l’étude de la réaction inflammatoire de l’hôte suite à l’implantation des substituts vasculaires. Ainsi, aucun traitement anti-inflammatoire ne sera administré suite à l’implantation Au cours de cette étude, un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié.
Devenir
A l’issu des contrôles terminaux, tous les animaux seront mis à mort aux différents temps définis (4 et 8 semaines). En effet, nous étudierons la réponse immunitaire ainsi que le remodelage des allogreffes par les cellules ; cette étape nécessitant le prélèvement du substitut vasculaire préalablement implanté entre la carotide et la veine jugulaire, la mise à mort de celui-ci est inévitable.
Remplacement
Un modèle de vaisseau humain peut être largement étudié in vitro d’un point de vue mécanique grâce à des bancs d’essais. Cependant, ces plateformes de tests ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire ou l’intégration d’un greffon dans des conditions réelles d’utilisation. Il ne sera donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. Ainsi l’utilisation d’un modèle animal de grande taille possédant un système cardiovasculaire proche de l’homme (porcin, ovin, canin ou primate) est souhaitable pour ce projet. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la fonctionnalité, la réponse immunitaire et l’intégration du substitut vasculaire dans l’organisme vivant et entier et ce, dans un contexte clinique pertinent (pontage artérioveineux), afin d’envisager à terme une utilisation chez les patients.
Réduction
Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables sur le plan statistique. Huit brebis seront implantées avec le même nombre de conditions expérimentales. Un modèle bilatéral sera utilisé ; ainsi, chaque animal sera son propre contrôle, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation.
Raffinement
Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet sera mis en place dans des locaux agréés avec du personnel dédié et expérimenté. De l’enrichissement sera mis en place pour répondre au besoin des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupe sociaux, paille). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie sera mis en place lors des différentes phases et le bien-être des animaux sera suivi constamment par le personnel dédié et formé à l’espèce étudiée. Si nécessaire, des actions adaptées seront appliquées et le vétérinaire désigné de l’établissement sera sollicité.
Choix des espèces
Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique, notamment en pontage artérioveineux. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire (comme le modèle canin et le modèle porcin). En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de CAM qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes, à ce stade les brebis possèdent un système immunitaire et un système vasculaire mature.
Evaluations de deux candidats-médicaments par neuroimagerie dans un modèle d’inflammation cérébrale chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
110 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien directement dans le cerveau par voie stéréotaxique pour induire une neuro-inflammation, puis des injections d'un candidat-médicament et une imagerie TEP sous anesthésie avec un traceur radioactif. Le porteur indique que l'inflammation peut provoquer un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie, et prévoit la mise à mort en cas de signes de détresse. Il affirme qu'il est "nécessaire" de valider l'effet des molécules chez "l'animal entier et vivant" et retient uniquement des mâles pour limiter la variabilité.
Objectifs
Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Face à ce constat, les stratégies thérapeutiques se tournent aujourd’hui vers une population cellulaire de plus en plus considérée que sont les cellules gliales et en particulier, les astrocytes, acteurs majeurs de la réponse inflammatoire. Ces processus neuro-inflammatoires, associés à une multitude de maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, atrophie multisystématisée ou sclérose en plaques par exemple) sont encore mal connus. La protéine translocatrice de 18kDa (TSPO), est considérée comme une cible de référence pour visualiser et quantifier la neuro-inflammation. Cette protéine est la plus étudiée actuellement au moyen de différents traceurs radioactifs par Tomographie par émission de positons (TEP). Elle est ainsi pour notre étude, un atout majeur pour la mise en évidence d’efficacité de candidats-médicaments pour certaines pathologies du système nerveux central. Un des modèles de prédilection dans l’étude de la neuro-inflammation est le modèle par administration de lipopolysaccharide (LPS), élément bactérien déclenchant une cascade de réactions inflammatoires dans l’organisme. Nous travaillerons sur un modèle d’inflammation chez le rat par administration stéréotaxique unilatérale de LPS. Ce modèle est reconnu pour l’étude de la neuro-inflammation chez l’animal, dont les données comportementales, phénotypiques et d’imagerie sont bien décrits dans la littérature. Ce modèle est certes plus contraignant que l’injection systémique, mais il présente l’avantage de produire une inflammation plus spécifique dans le cerveau (une inflammation généralisée pouvant entrainer une captation non spécifique du traceur et donc une réponse non-spécifique de nos candidats-médicaments). Ainsi, nous souhaitons évaluer l’effet de candidats-médicaments sur la neuroinflammation chez ce modèle par imagerie TEP du TSPO.
Bénéfices attendus
Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du système nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels. Il est nécessaire de revisiter certains concepts pharmacologiques afin d’ouvrir le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce contexte, la neuroinflammation apparait comme un processus physiopathologique d’intérêt car ce phénomène est exacerbé dans de nombreuses pathologies du cerveau, ce qui contribue aux symptômes des patients. La neuroinflammation est induite par la sécrétion de médiateurs moléculaires pro-inflammatoires par les cellules gliales dans le cerveau. Une stratégie thérapeutique prometteuse serait donc de réduire la production de médiateurs de l’inflammation dans un contexte de neuroinflammation. Ainsi, l’enjeu de cette étude est d’évaluer grâce à l’imagerie TEP de la TSPO (une protéine surexprimée par les cellules gliales lors de la neuroinflammation), l’efficacité de candidat-médicaments à réduire la neuroinflammation. Ces candidats-médicaments sont sélectionnés sur la base de données préliminaires suggérant leur capacité à réduire la sécrétion de médiateurs inflammatoires. Des analyses immunohistochimiques complémentaires permettront de préciser davantage le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire des candidats-médicaments dans le cerveau. Ce projet pourrait mener à l’identification d’un candidat-médicament efficace dans le traitement des maladies du système nerveux central.
Procédures
Les 110 animaux effectueront une procédure comprenant 2 interventions majeures : 1) Injections stéréotaxiques dont l’objectif est la mise en place du modèle inflammatoire (durée : 45 minutes) • Réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) et analgésie • Sur la totalité des animaux décrits dans cette demande de projet : 110 rats • Chaque animal subira de manière unilatérale, une injection stéréotaxique dans une région d’intérêt d’une endotoxine (le lipopolysaccharide ; LPS) • Immédiatement après l’injection stéréotaxique, les animaux recevront une injection intrapéritonéale du candidat-médicament. Ils recevront également une injection du candidat-médicament 1 jour et 2 jours après la chirurgie. 2) Imagerie TEP /TSPO dont l’objectif est la visualisation de la neuro-inflammation (durée : 1h30) • Un examen d’imagerie TEP/CT avec injection intraveineuse d’un radiotraceur, le [11]PK11195, sera réalisé sous anesthésie générale (isoflurane), 3 jours après l’injection stéréotaxique • Sur la totalité des animaux décrits dans la demande
Impact sur les animaux
Les animaux subiront l’injection stéréotaxique dans un état d’anesthésie générale sous isoflurane, et sous analgésie (buprénorphine, et lidocaïne en local). Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une pilo-érection, une perte d’appétit et une léthargie. De plus, une nuisance possible de cette procédure serait l’apparition d’hémorragie lors de la chirurgie ou bien d’infection éventuelle à la suite de celle-ci. Le protocole est alors optimisé pour que les risques de ces complications soient minimes (zone opérée réduite au maximum, nettoyage et désinfection de la zone, stérilisation du matériel).
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés
Remplacement
Le projet et la procédure utilisée ont été choisis après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Etant donné la complexité du phénomène de neuroinflammation, il est nécessaire de valider l’effet des médicaments-candidats chez l’animal entier et vivant pour établir un effet thérapeutique avec un niveau de preuve suffisant pour justifier de futurs essais cliniques. L’utilisation de modèles in vitro, préalable à cette étude, s’inscrit dans une logique de sélection des composés les plus prometteurs mais ne dispense pas de vérifier l’efficacité in vivo des produits à l’issue de cette première phase de sélection.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la recherche de molécules thérapeutiques de ce projet, un criblage in vitro a permis en amont de réduire considérablement le nombre de candidats-médicaments sur la base de leur toxicité et leur d’efficacité. Un minimum de 8 animaux par condition est requis afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une taille d’effet de 7%, avec une variabilité de 5%, une puissance de 80% et un risque alpha de 5%. Le nombre final d’animaux par groupe a été choisi à 10 pour garantir cette puissance statistique en cas de perte éventuelle d’animaux au cours du protocole, tout en le réduisant à son minimum (selon notre expérience de ces conditions expérimentales, nous estimons une perte de données maximale de 2 animaux par groupe, incluant les éventuels décès suite à la chirurgie mais aussi les éventuelles images TEP non interprétables par passage du radiotraceur insuffisant en intraveineux). Concrètement, les données expérimentales générées seront traitées à l’aide d’un test d’analyse de variance à une dimension (one-way ANOVAs). Les résultats seront exprimés en moyennes affectées de l’erreur standard. La distribution normale des données sera d'abord testée et si tel est le cas, un test paramétrique sera utilisé (one-way ANOVAs) sinon un test non-paramétrique équivalent sera utilisé (Kruskal-Wallis).
Raffinement
L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. L’acquisition TEP sera réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés tous les jours grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte l’éventuel état fébrile observable dans les heures suivant l’injection de LPS. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boîtes ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle animal pour lequel il existe de nombreuses données précliniques impliquant les différentes méthodes utilisées au sein de ce projet. De plus, l’utilisation du rat se justifie également par la taille du cerveau de cette espèce (plus importante que celle de la souris) favorable en TEP. Rats Mâles : Similairement aux autres études réalisées sur ce modèle et afin de limiter une possible variabilité dans notre étude (le LPS induisant des effets différents en fonction du sexe) et de réduire au maximum le nombre d’animaux, le choix se porte uniquement sur le sexe masculin.
Evaluation de l’efficacité d’un implant de titane recouvert d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau un dispositif puis on y dépose la bactérie Staphylococcus aureus, avant un prélèvement du cœur et une dislocation cervicale, pour tester un implant recouvert d'une molécule antibactérienne contre le biofilm. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui risquerait d'aggraver l'infection, et n'attend surtout que des atteintes locales. Il répond à la "demande de l'industriel" et présente l'essai in vivo comme un "besoin incontestable".
Objectifs
L’objectif de ce projet d’évaluer l’efficacité d’un implant coaté d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer un matériel innovant permettant de réduire ou même d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme. Les biofilms bactériens sont généralement définis comme des agrégats de cellules bactériennes attachés à une surface et enrobés d’une matrice visqueuse. La formation d’un biofilm se fait selon un modèle bien établi et suit différentes étapes (adhésion, croissance, maturation et dispersion). On estime que 80 % de la biomasse microbienne de notre planète réside sous forme d’un biofilm. Le biofilm protège les bactéries et leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles. Les bactéries du biofilm peuvent résister à la réponse immunitaire de l’hôte et sont beaucoup plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les cellules bactériennes planctoniques (non adhérentes). Ainsi, la présence de biofilm dans les infections est particulièrement redoutée en clinique (ex : prothèse orthopédiques, sondes de ventilation mécanique, cathéters veineux…). Parmi les espèces bactériennes largement retrouvées dans les biofilms figurent les espèces du genre Staphylococcus sp.
Procédures
La mise en place de l’implant coaté ou non en position sous-cutanée chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe en intra-péritonéal (kétamine 50mg/kg + xylazine 10 mg/kg). Les flancs seront rasés puis désinfectés par un cycle Bétadiné. Une incision cutanée de 0.5cm sera réalisée stérilement et l’implant sera inséré dans la poche ainsi constituée. L’infection bactérienne sera effectuée dans un même temps en déposant 50µL de l’inoculum au contact de l’implant dans la poche sous-cutanée. Deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris concernées par la phase 1 du projet seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylzaine 10 mg/kg) avant la mise à mort par dislocation cervicale. Toutes les autres souris seront mises à mort comme précédemment cité sans prélèvement intracardiaque.
Impact sur les animaux
S’agissant d’un matériel étranger non connu les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire. Aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une quantification bactérienne.
Remplacement
Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées par des méthodes traditionnelles in vitro. Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement mais ne suffisent pas à déterminer l’efficacité en conditions réelles des traitements en développement. En effet, de nombreux échecs thérapeutiques ont été décrits malgré une bonne sensibilité in vitro du pathogène à la molécule d’intérêt. Ainsi, la mise en place de méthodes d’évaluation préclinique in vivo des agents anti-infectieux dans des systèmes plus complexes constitue un besoin incontestable et est devenue l’une des exigences des sociétés savantes telles que l’EMEA (European Medicines Agency).
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (5 souris pour la phase pilote et 10 souris pour la troisième partie du projet) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne sur l’implant et dans le broyat du tissu environnant par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)). Pour la première partie (étude de la toxicité, le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe).
Raffinement
D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées par un mélange de kétamine (50 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg). L’incision cutanée réalisée ne dépassant pas 5mm, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Par ailleurs, il s’agit d’une infection très localisée et en aucun cas une infection systémique n’est anticipée. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance bi quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris Balb/cByJ de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 26-27g