Recherche appliquée

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une modification génétique, elles sont soumises à des tests comportementaux d'anxiété, de dépression et d'activité motrice, dont le test de la nage forcée où l'animal est placé dans un bécher d'eau. Le porteur indique que si une souris met la tête sous l'eau elle est aussitôt retirée, et qu'une souris atteignant un point limite est mise à mort immédiatement. Le projet cherche des effets comportementaux d'une modification génétique dont ce n'était pas la cible, le cerveau des souris étant prélevé en fin d'étude.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier les changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de mettre en évidence des déficits ou améliorations comportementales suite à une modification génétique dans le domaine de l’anxiété, de la dépression et de l’activité motrice des animaux. Certaines modifications génétiques qui n’ont à l’origine pas ces cibles (ici : anxiété, dépression et activité locomotrice) peuvent quand même avoir des effets. Il est donc nécessaire d’étudier ces effets pour aider à la compréhension de mécanismes cellulaires et/ou neuronaux encore méconnus.

Procédures

A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, le cerveau de l’animal est prélevé. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 15 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il s'agit d'étudier les potentiels changements comportementaux induits par une modification génétique sur l’anxiété, la dépression et l’activité motrice des animaux. Les animaux reçoivent aucune administartion. Ils sont manipulés et pesés au moment des différents tests comportementaux. Au cours de l'étude, l’état général des animaux est quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Durant le test de la nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l'étude à un prélèvement de cerveau, sous anesthésie générale.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer une modification du niveau d’anxiété, de dépression ou de déficit moteur, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées dans ce projet sont : IP3R1 (fl/fl) et C57BL6/J Entre 7 et 15 semaines au moment des tests. Le Sponsor souhaite comparer certains résultats obtenus précédemment sur ces animaux à ceux obtenus dans ce projet.

64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose quatre biomatériaux sous la peau par chirurgie, avec un suivi au microscanner toutes les deux semaines pendant deux mois, pour tester un nouveau support destiné à la régénération osseuse. Le porteur n'attend comme seul effet indésirable qu'une réaction inflammatoire qu'il juge "peu probable". Le résumé décrit le réveil des rats après l'opération sans indiquer leur sort final, que le tableau du RNT classe pourtant comme une mise à mort, cohérente avec l'analyse des implants.

Objectifs

La consolidation des pertes de substance osseuses lors des reconstructions osseuses représente un problème majeur dans les domaines de la chirurgie orthopédique, de la traumatologie et de la chirurgie maxillo-faciale. Ces troubles peuvent nécessiter l’utilisation d’une greffe osseuse afin d'obtenir une consolidation osseuse. Bien que la greffe osseuse soit toujours considérée comme la référence pour les reconstructions osseuses, elle est associée à un taux important de complication au niveau du site de prelevement de la greffe. En outre, les quantités d'os disponibles pour un seul patient sont limitées. Par conséquent, les substituts osseux ayant une composition aussi proche que possible de celle de l'os natif offrent des alternatives intéressantes. Parmi eux, l'allogreffe ainsi que les céramiques représentent les substituts osseux les plus utilisés. Outre la greffe osseuse ou les substituts osseux, l'un des moyens les plus efficaces pour améliorer la formation et la reconstruction osseuses est la thérapie protéique, qui consiste en l'application locale de facteurs de croissance favorisant la production osseuse, tels que les protéines morphogéniques osseuses (BMP). Actuellement, la BMP-2 et la BMP-7 sont utilisées en pratique clinique et ont donné des résultats prometteurs. Ces BMP ont besoin d’un support afin d’être déposé sur le site chirurgical. Les supports utilisés aujourd’hui sont des éponges ou des pâtes de collagène. Néanmoins, la BMP a une faible faible affinité pour le collagène, ce qui nécessite des doses très importantes de BMP entrainant un risque de complication plus important et un coût beaucoup plus élevés. Dès lors, afin d'augmenter les applications cliniques de la BMP, il est indispensable de disposer de différents types de supports présentant une forte affinité pour le BMP. Le but de cette étude, est l’étude d’un nouveau support pour la BMP.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre de montrer que le film réticulé avec et sans BMP2 est biocompatible et n'est pas à l'origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur et d'autre part que les tissus du receveur ne sont pas susceptibles d'altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. Cette étude servira donc à prouver l'absence vraisemblable d'effet délétère du film et de la BMP2, et d'autre part, accumuler des données prédictives du comportement in vivo du matériau.

Procédures

1 seule procédure sera réalisée sur les 64 rats : - Mise en place de 4 implants en sous cutanés (4 incisions). Fermeture de la plaie à l’aide d’un surjet intradermique avec un monofilament 4-0 (polyglecaprone 25). L’intervention durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances ou effets indésirables de cette étude sur les animaux seraient une réaction inflammatoire anormale ce qui semble peu probable au vu des tests préalables.

Devenir

A l’issue de l’intervention chirurgicale d’implantation, les rats seront reveillés dans une cage à induction chauffée et seront ensuite remis avec ses congénères une fois réveillé.

Remplacement

De nombreux modèles in vitro ont été mis en place pour étudier la dégradation d’un matériel. Cependant, les interactions matériel-hôtes sont importantes et nécessitent une étude in vivo. Les données manquantes sur les propriétés anti-inflammatoires, sur la biocompatibilité et la dégradation de matériel ne peuvent être menées que sur l’animal entier vivant : la réaction inflammatoire et hémodynamique sont des processus vivants et dynamiques, mettant en jeu des mécanismes complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro. Lorsque les mécanismes biologiques entrent en jeu dans le processus inflammatoire de dégradation, on ne peut vérifier la biocompatibilité que dans un organisme vivant.

Réduction

Des études in vitro ont été menée au préalable afin de sélectionner les formulations d’implants les plus intéressantes à tester in vivo pour réduire au maximum le nombre de tests et le nombre d’animaux. De plus des études bibliographiques ont été menées afin de choisir au mieux le modèle animal et le matériaux contrôles. Afin de réduire le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisés pour l’étude de biocompatibilité et l’étude de biodégradation du film.

Raffinement

64 rats seront inclus dans l’étude. Tout le projet sera conduit dans des locaux agrées, avec du personnel dédié et expérimenté. Un protocole précis de prémédication, d’analgésie, d’anesthésie est mis en place. Les rats auront une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant l’implantation. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. L’injection d’hydrogel sera réalisé sous anesthésie générale avec analgésie préopératoire et post-opératoire par un vétérinaire. Les animaux seront observés quotidiennement : état général, alimentation, abreuvement, nettoyage, respiration, morbidité et mortalité. En cas d’animal considéré comme anormal, la personne en charge des observations : -manipulera l’animal pour confirmer ou infirmer cet état -Toutes anomalies cliniques seront signalées au vétérinaire pour un examen clinique complet si nécessaire. La douleur et le bien-être sont évalués selon des paramètres précis. En cas de signe de douleur importante, des antalgiques seront administrés jusqu’à disparition des signes. Si une souffrance et/ou une détresse de l’animal est mise en évidence, des mesures seront directement mise en place : fin de la procédure, traitement afin de soulager la souffrance. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté.

Choix des espèces

Le rat est un modèle couramment utilisé pour évaluer l'inflammation et pour étudier le délai de dégradation et l'effet de différentes modalités de traitement. L’évaluation de la dégradation au contact du tissu hôte est primordial dans l’étude des biomatériaux. Cette évaluation a été traditionnellement réalisée dans des modèles d'implantations sous-cutanées, intrapéritonéales et intramusculaires chez les rongeurs (souris et rats). Les modèles murins sous-cutanés, intramusculaires et intrapéritonéaux sont des outils utiles pour évaluer l'effet des médiateurs anti-inflammatoires et inflammatoires. Quelle que soit l'application finale prévue des biomatériaux, les modèles d'implantation sous-cutanée et intramusculaire offrent des informations sur l'effet direct du biomatériau au niveau du site d'implantation. L'application clinique finale étant une implantation osseuse, l'implantation sous cutanée est choisie. Les implants seront insérés dans le tissu sous cutané de rats adultes, conformément aux dispositions de la norme ISO 10993-2. Pour plusieurs de ces raisons, nous avons choisi d'utiliser des rats comme modèle pour réaliser l'étude de dégradation et de biocompatibilité du film enrichi en BMP-2.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, subissent à trois semaines un traumatisme crânien présenté comme léger, puis une batterie de tests comportementaux répétés à un, trois et six mois (open field, poutre et échelle, sensibilité tactile de von Frey, labyrinthe surélevé, boîte clair-obscur, labyrinthe de Barnes) et des IRM sous anesthésie. Le porteur choisit des souris de 21 jours pour représenter un enfant de 4 à 6 ans, présenté comme plus vulnérable. Il affirme qu'une fois réveillé l'animal "ne montre aucun signe de douleur" et que les conséquences à long terme ne sont "pas anxiogènes ou douloureuses".

Objectifs

Les études cliniques, et pré-cliniques chez les rongeurs, ont clairement montré que le traumatisme crânien (TC) est suivi d’un processus neurodégénératif dépendant d’une inflammation chronique au niveau du cerveau, entrainant des effets secondaires tels que formation d’œdème, modifications de la perfusion cérébrale, perméabilisation de la barrière hémato-encéphalique et mort neurale. Dans le cadre de cette étude, nous allons chercher à mieux caractériser les processus de neuro-inflammation et de dégénérescence au niveau du système nerveux central en se focalisant sur le rôle neuroprotecteur des cavéolines. Spécifiquement nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine Cav-1 dans les astrocytes, cette protéine étant impliquée dans la régulation de la perméabilité de la barrière hématoencéphalique. Dans la mesure où les jeunes enfants sont des populations particulièrement vulnérables au TC et plus sensibles à l’inflammation, nous allons mener nos études sur un modèle juvénile de TC léger, réalisé sur des souris 21 jours après la naissance correspondant chez l’humain à un âge de 4 à 6 ans.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 348 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. injection unique (virus inactivé non-pathogène) intracérébrale le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. 2. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 3 semaines après la naissance. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 348 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie/analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

360 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prises de sang à la jugulaire ou à la queue, des mises à jeun de vingt-quatre heures et des prélèvements de fèces, pour tester des stratégies nutritionnelles face au stress thermique. Le porteur reconnaît que les porcs "sont susceptibles de souffrir de la chaleur", enjeu même de l'étude. Il indique qu'à l'issue de chaque essai les animaux entrent dans le circuit de commercialisation, l'objectif déclaré étant de maintenir leur croissance en cas de fortes températures.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la réponse zootechnique et physiologique des porcs en engraissement de 25 à 120 kg à des pratiques alimentaires et nutritionnelles ciblées lorsqu’ils sont soumis à un stress thermique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise en marché d'une ou plusieurs solutions nutritionnelles ou additifs afin d'éviter les dommages causés aux cellules comme ceux liés à l'inflammation et au stress oxydatif et de maintenir voire d'améliorer la croissance des porcs lorsqu'ils sont soumis à de fortes températures.

Procédures

Au maximum, 2 séries de maximum 3 prises de sang par ponction à une veine jugulaire ou à la région caudale pourront être réalisées sur les porcs impliqués dans cette procédure. Les prises de sang seront espacées d'au moins 30 minutes et les séries de 3 prises de sang seront espacées d'au moins 7 jours. La première prise de sang de chaque série pourra être successive à une mise à jeun de 24 heures maximum. Deux mises à jeun de 24 heures pourront donc avoir lieu par procédure expérimentale (=1 essai). Par ailleurs, des mesures répétées de glycémie ou d'hémoglobinémie (5 en 4 heures environ) à l'aide d'un Accue Check ou d'un HemoCue pourront être faites sur les porcs deux fois maximum par application de la procédure expérimentale (=1 essai). La deuxième série de mesures répétées aura lieu au minimum 7 jours après la première. Pour réaliser ces mesures, une goutte de sang sera prélevée grâce à une piqûre réalisée à l'oreille ou à la queue à l'aide d'une aiguille. Les porcs de cette procédure pourront être concernés par les séries de prise de sang et/ou les prélèvements par goutte de sang à l'oreille. De plus, de 0 à 3 prélèvements de fèces pourront avoir lieu pendant la période expérimentale. La récolte des fèces se fait par légère pression sur l’abdomen du porc ou par légère stimulation rectale. Les prélèvements de fèces seront réalisés directement dans la case soit, sans contention particulière, soit à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. Les prélèvements pourraient également avoir lieu en plaçant les animaux dans une cage balance (au moment de leur pesée ou non). De plus, afin de faciliter le déroulement des prises de sang et de limiter le stress ressenti, les animaux seront immobilisés à l'aide d'une cordelette placée autour du groin et fixée à l'extrémité d'un bâton avec lequel l'animalier serre le nez des animaux. Les prises de sang seront effectuées à l’extérieur de la case. Les prises de sang et de fèces sont réalisées sur 15 porcs par traitement expérimental au maximum, sachant qu’il y a au maximum 4 traitements expérimentaux par procédure (=1 essai). Ce chiffre peut être revu à la baisse selon l’objectif de l’essai et la variabilité du critère analysé. Les prélèvements de fèces et de sang sont réalisés sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les porcs sont susceptibles de souffrir de la chaleur comme lors de périodes estivales.

Devenir

A la fin de chaque essai, les animaux seront mis à mort et entreront dans le circuit de commercialisation pour la plupart, sauf ceux ayant reçu un additif non autorisé dans l’Union européenne. Ces derniers partiront à l’équarrissage.

Remplacement

L'objectif du projet est de mettre en place des stratégies novatrices afin de limiter l’effet négatif du stress thermique sur le bien-être et les performances de croissance des porcs en engraissement. L'effet d'une solution nutritionnelle ou d'un changement de conditions environnementales sur les performances de croissance des porcs est la résultante d'une série de mécanismes et régulations physiologiques (digestives, métaboliques, endocrinologiques) interagissant entre elles. La complexité de ces interactions ne permet donc pas d'utiliser des modèles alternatifs comme la modélisation ou la mise en place d'études in vitro. Par ailleurs, l'évaluation des paramètres d’intérêt du projet (croissance, ingéré volontaire d'aliment, ....) ne peut être réalisée que sur des animaux vivants.

Réduction

Grâce à la collecte individuelle des données sur les animaux, le nombre de répétitions (ici l'individu) nécessaire à la mise en évidence de différences significatives entre plusieurs traitements est réduit. La méthode de calcul de « la puissance statistique du test » prenant en compte une valeur seuil de significativité de 5%, une différence de 8% entre les traitements et un coefficient de variation de 8.5% donne un nombre minimal de répétitions de 18 individus par traitement expérimental avec un maximum de 4 traitements expérimentaux par essai. Par contre, si la différence à détecter est de 2% avec un coefficient de variation de 3%, alors le nombre minimal de répétitions est de 35 individus par traitement expérimental avec un maximum de 2 traitements expérimentaux par essai. Ce test est robuste et est couramment utilisé pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d'une différence significative entre deux groupes dans un essai. Les essais seront réalisés sur des animaux homogènes (poids vif, sexe et origine génétique) et en bonne santé afin de réduire la variabilité individuelle en début d’essai. Dans le cas de paramètres hématologiques ou fécaux, les prélèvements ne seront réalisés que sur une partie des effectifs jugés nécessaires et suffisants au regard des éléments disponibles (bibliographie et expérience interne). Le nombre d’animaux sera ainsi ajusté, en essayant de le diminuer au maximum. La distribution des données sera évaluée selon qu’elles se situent, ou non, dans l’intervalle moyenne ± 2 écarts-types afin d’identifier les données aberrantes. Après élimination des données aberrantes, les données zootechniques seront soumises à des analyses de variance (ANOVA) avec le traitement expérimental en effet fixe. La mortalité sera évaluée selon le test Chi-2. Le niveau de significativité est fixé à P

Raffinement

L’état de santé des animaux sera vérifié quotidiennement par les techniciens animaliers de l’établissement utilisateur. Si un porc présente des signes de stress, des difficultés à supporter la chaleur, ou des douleurs (boiteries, blessures…), alors il sera écarté de l’étude. Des points limites stricts et définis à l’avance sont appliqués tout au long du projet. De plus, le nombre de tentatives de collectes d'échantillons biologiques sera limité et la manipulation des animaux sera restreinte afin de réduire la souffrance ou le stress appliqué à ces animaux. Par ailleurs, ce projet sera réalisé en condition « élevage » pour que les réponses observées soient directement transposables sur le terrain, ce qui implique une densité de 1,06 m²/porc lorsqu’il y en a 9 par case au lieu de 1,35 m²/porc comme le prévoit la réglementation expérimentation animale. Les cases seront enrichies avec des balles suspendues et des disques en fibres de bois. Des interactions sociales entre les animaux seront possibles car les porcs seront logés par case de 8 ou 9 individus.

Choix des espèces

L'espèce choisie pour la réalisation du projet est le porc car les phénomènes physiologiques (digestifs, métaboliques, endocrinologiques) étudiés dans le cadre de ce projet sont hautement spécifiques de l'espèce porcine. Les animaux pèseront entre 25 et 120 kg. Cela correspond à la période d’engraissement, période à laquelle les porcs peuvent le plus souffrir des fortes températures.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux modèles pathologiques sont induits, puis les animaux subissent des mesures de sensibilité avant une mise à mort par surdose d'isoflurane et dislocation cervicale pour prélèvement de tissus. Le résumé annonce l'étude de la rosacée oculaire, mais ses justifications glissent vers le syndrome de l'intestin irritable et une infection à C. rodentium, sans que le protocole soit détaillé. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de travailler sur des animaux" et qu'il n'existe "pas d'autre alternative".

Objectifs

La rosacée est une maladie commune de la peau, inflammatoire et chronique, avec une variété de manifestations cliniques telles que l’érythème centro-facial, les papules et les pustules, ainsi qu’une atteinte oculaire. Il s’agit d’une pathologie fluctuante, avec une alternance de poussées et de rémissions. Plusieurs facteurs exacerbant la pathologie ont été décrits, comme l’alcool, l’exposition au soleil, le sport, la nourriture épicée, le stress, les émotions et les changements de température.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs et d'inflammation associées à la rosacée occulaire afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Suite à l'induction des 2 modèles (procédures 1 et 2), l'ensemble des animaux subiront les procédures 3 et 4 une seule fois et une semaine après l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à mort par une overdose d’isoflurane puis dislocation cervicale. Ceci concernera les animaux en fin d'expérimentation mais aussi si un animal présente au moins 1 des points limites décrits par la suite.

Devenir

Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 4 (mesure de la sensibilité mécanique), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.