Recherche appliquée
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Etude de l’effet d’inhibiteurs de cytokines, d’interleukines et d’intégrines sur des modèles de rétinopathies prolifératives murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rétinopathies leur sont induites par une exposition des mères et des portées à 75 % d'oxygène, par impacts laser sur l'œil ou par ultrasons, suivis d'injections intraoculaires répétées de composés à tester. Le porteur reconnaît une détresse respiratoire des mères, euthanasiées dès le retour à l'air normal, les souriceaux étant confiés à une mère adoptante. Il affirme que la néovascularisation de la rétine ne peut être modélisée in vitro et justifie ainsi le recours à la souris.
Objectifs
Les pathologies ophtalmiques tel que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) sont les premières causes de handicap visuel chez les personnes adultes. Ces pathologies, sont caractérisées dans leur forme tardive par l’apparition de néovaisseaux pathologiques, de fuites vasculaires et d’une inflammation chronique qui peuvent mener à une cécité définitive. Actuellement la prise en charge des patients est composée d’injections intraoculaire répétées d’anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Cependant, certains patients restent ou deviennent résistants à ce traitement. Dans ce contexte, nous proposons de tester l’effet de molécules inhibitrices de l’inflammation et/ou de la vascularisation dans divers modèle murin mimant la DMLA et la RD.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’effet anti-angiogénique de certaines molécules dans les différents modèles de rétinopathie et de dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) chez la souris, ce qui pourrait par la suite bénéficier aux patients atteints de rétinopathie diabétique proliférante ou de DMLA humide.
Procédures
Dans le cas de la rétinopathie induite par l’oxygénation : Les femelles et leurs portées seront vigiles et seront soumises à une concentration d’oxygène de 75 pour cent pendant 5 jours. Les souriceaux vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1 min/souris). Dans le cas de la sonication : Les souris seront anesthésiées pendant 5 mins et vont être soumises à une injection intrapénienne et à des ondes ultrasons au niveau de l’œil pendant 60 secondes. Par la suite, des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont être réalisées 1 fois par jour pendant 7 jours sur souris anesthésiées afin d’évaluer l’évolution des fuites vasculaire causé par la sonication. Enfin, deux injections intraoculaires de composé thérapeutique (1min/souris) seront réalisées sur souris anesthésiées. Dans le cas de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser : Les souris seront anesthésiées et vont recevoir 4 impacts laser par œil, la durée de ce traitement est d’environ 1 min par souris. Des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont ensuite être réalisés 1 fois par jour pendant 7 jours chez ces souris anesthésiées afin d’évaluer la croissance vasculaire liée aux impacts laser. Les souris vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1min/souris). Après la réalisation des actes décrits, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Le modèle de rétinopathie induit par l’oxygène (OIR) peut induire chez les femelles un stress physique et une douleur causer par une détresse respiratoire. Ceci peut donc engendrer chez les souriceaux une malnutrition ainsi qu’un stress thermique. La sonication, le laser ainsi que les injections intra oculaires peuvent engendrer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire dû à l’anesthésie mais également une légère douleur au niveau de l’œil causé par une neuro-inflammation.
Devenir
A l’issu des expérimentations les souris vont être euthanasiées, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
La néovascularisation caractéristique de la rétinopathie diabétique et de la dégénérescence maculaire liée à l'age (DMLA) ainsi que les fuites vasculaires sont le résultat d’une interaction complexe entre les vaisseaux de la rétine de la choroïde et de leur environnement. Ceci ne peut pas être modélisée complètement in vitro
Réduction
Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire (1621) pour avoir une puissance statistique suffisante afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences. Les variabilités interanimal et inter-expériences ont pu être déterminées au cours d’expérimentations précédentes avec des protocoles identiques autorisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 ou par portée dans des cages ventilées. Pour les femelles et leurs portées, les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Pour les mâles, les cages comportent plusieurs cotons et un bâton à ronger. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou par le personnel de l’animalerie. Les animaux auront une période de 5 jours d’acclimatation avant l’expérimentation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. L’âge des animaux est suivi par rapport à leurs dates de naissance (fournies par le fournisseur) qui sont indiquées sur les étiquettes de leurs cages. Les animaux sont numérotés par des bagues à l’oreille. Si nécessaire et en cas d’agressivité les mâles seront séparés et isolés (seul par cage). Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasirons les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante à la sortie du caisson. Lors des procédures expérimentales les souris seront sous anesthésie général, sous anesthésie local pour les injections intraoculaires et sur un tapis chauffant pour prévenir tous risquent d’hypothermie. Toute atteinte oculaire inattendue (inflammation, gonflement) entrainera l’euthanasie de l’animal).
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé dans les maladies oculaires. En effet, le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) et de sonication sont 3 modèles qui ont été établie chez la souris. La souris est un petit animal facile à manipuler et qui comporte beaucoup de similitude physiologique avec l’homme. Dans le cas de l’OIR les animaux seront utilisés dès 7 jours de vie. La mise en place des vaisseaux rétiniens se fait lors des 3 premières semaines de vie de la souris, l’hyperoxygénation entre le 7ème et le 12ème jour de vie de la souris nous permet d’induire une rétinopathie. Dans le cas du CNV et de la sonication les souris seront utilisées à partir de la 8 semaines de vie, en effet c’est l’âge ou le système visuel et inflammatoire de la souris est établi.
Evaluation de molécules thérapeutiques dans des modèles d’hépatites chez la souris immunocompétente
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un modèle d'hépatite leur est induit, avec des injections répétées plusieurs fois par semaine et des prélèvements sanguins, entraînant une perte de poids et un score clinique que le porteur relie à un changement de comportement. Le projet teste une thérapie ciblant des cellules immunitaires, les bénéfices annoncés pour les patients étant renvoyés à un éventuel essai clinique. Le porteur présente la souris comme un moyen d'éviter le recours au primate et affirme que le modèle animal est "nécessaire" avant tout essai humain.
Objectifs
Les maladies Auto-immune (hépatite auto immune) et les maladies inflammatoires (hépatite aiguë) n’ayants pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester une nouvelle cible thérapeutique et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies Auto-immune sont traitées avec des traitements qui bloquent de façon non spécifique le développement de la maladie et induisent des effets secondaires. Parfois, certains patients sont traités avec des molécules qui induisent la mort cellulaire d’un type cellulaire à l’origine de la pathologie mais cela entraine le plus souvent des effets indésirables. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie qui pourrait inhiber les cellules impliquées dans la chronicité de l’inflammation mais cela de manière spécifique en gardant un système immunitaire compétent pour se défendre contre de nouveaux pathogènes.
Bénéfices attendus
L’objectif est de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait une population cellulaire à l’origine de la pathologie afin de la bloquer ou de l’éliminer dans les maladies inflammatoires ou les maladies Auto-immune. Il est important de noter qu’actuellement la plupart des traitements utilisés ne sont pas spécifiques et ils réduisent la capacité des patients à se défendre contre de nouveaux pathogènes. La technologie que nous développant a pour objectif d’être plus spécifique et plus efficace. En étant plus spécifique, on réduit la probabilité d’avoir des effets indésirables et en étant plus efficace on donne la capacité aux patients de se défendre contre de nouvelles infections. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou une réduction des cellules pathogéniques à l’origine de la maladie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique spécifique et plus sûre. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.
Procédures
Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés plusieurs fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (X semaine) seront variables en nombre de semaines (Procédure 1 : 3 semaines, Procédure 2: 1 semaine ; Procédure 3 ; 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.
Impact sur les animaux
Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important qui peuvent induire chez la souris une modification du comportement et de l'apparence physique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés une fois les points limites atteints. L'injection peut entrainer une perte de poids, un changement dans le comportemant chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même euthanasiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat.
Remplacement
Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. En effet, les molécules sont testées in vitro afin de déterminer si elles ont la capacité d'induire l'effet attendue c'est à dire, la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, le blocage de molécules activatrices sur différents types cellulaires, ou l'activation de molécules inhibitrices afin de réguler l'inhibition des cellules cibles. Les modèles d'hépatites qui reproduisent au mieux ce qui se produit chez l'homme ont été décrit chez la souris et notamment la souris.
Réduction
Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests non paramétriques pour comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible.
Raffinement
Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et seront manipulés afin de les habituer aux expérimentateurs. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront un analgésique dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.
Choix des espèces
Des formats d’anticorps ont été validés in vitro. Les animaux sont indispensables car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 8 semaines.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 1038
Des rats et des souris reçoivent, pour le compte de clients, des candidats médicaments dont le laboratoire dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". 2 076 rongeurs, 1 038 souris et 1 038 rats, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements de tissus. Le létrozole sert à induire un syndrome des ovaires polykystiques, et le protocole peut comporter jusqu'à dix semaines d'administrations, jusqu'à deux fois par jour, un régime gras, une ovariectomie ou l'implantation de pellets, des frottis vaginaux et des prises de sang. Le porteur indique qu'aucun test statistique n'a fixé la taille des groupes, huit rongeurs chacun, et estime trois études par an raisonnables au regard de ses autres protocoles et des demandes de ses clients.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.
Procédures
Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien pendant une semaine ou un frottis par semaine pendant dix semaines. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.
Choix des espèces
Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix sera ainsi dépendant des demandes clients car le modèle SOPK induit par le létrozole est bien décrit dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des rats et des souris adultes ou prépubères (3 semaines). De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé).
Evaluation de l’effet de molécules à visée thérapeutique dans des modèles d’étude du transit intestinal chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 3600
7200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pathologie intestinale, constipation ou diarrhée, leur est induite pour tester des molécules dont le porteur indique ignorer "ni la nature ni les effets secondaires", avec des prélèvements sanguins et un maintien en cage sur grille de six à huit heures avant mise à mort. Le porteur reconnaît que les rongeurs ressentiront les mêmes symptômes que l'humain, douleur abdominale, diarrhée et déshydratation. Ce projet de prestation répond à des demandes de clients et présente le recours aux rongeurs comme "nécessaire", aucun modèle ne mimant selon lui la pathologie dans son ensemble.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur le transit intestinal chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de troubles intestinaux.
Procédures
Les animaux recevront des administrations de composés pour induire une pathologie intestinale type constipation ou diarrhées. Chaque geste d’administration dure environ 30 sec à 1 min selon l’expérimentateur et les produits à tester. Un stress peut être ressenti par l’animal lors de la contention. Comme nous induisons une pathologie à l’animal, celui-ci va ressentir les mêmes symptômes que chez l’Homme à savoir douleur abdominale, diarrhées, inconfort… Les animaux recevront des administrations de composés ou molécules inductrices des pathologies (environ 30 sec à 1 min par geste) et seront mis à mort peu de temps après. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés pouvant provoqués une douleur et une gêne à l’animal (environ 2-3 min par prélèvement). Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié pour limiter au maximum le stress des animaux. Pour une procédure, les animaux seront placés dans des cages individuelles sur grille pendant 6-8 heures maximum et seront euthanasiés juste après.
Impact sur les animaux
Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux. Cependant, toute manipulation, contention ou administration de produit peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille) à l’animal. Sachant que nous allons induire des modèles pathologiques intestinaux (diarrhées, constipation) nous pouvons nous attendre à ce que les animaux en ressentent les symptômes comme une légère déshydratation, des douleurs abdominales.
Devenir
A l’issue de 2 procédures, les animaux seront gardés en vie pour suivre une autre procédure. Dans la procédure finale, une des méthodes d’évaluation nécessite de récupérer l’estomac des animaux donc ces derniers seront forcément euthanasiés. Pour les autres méthodes d’évaluation, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude car ces derniers auront reçu des candidats médicaments à tester avec récupération d’organes possible et auront reçu d’autres inducteurs chimiques afin de leur induire une pathologie. Ils ne pourront donc pas être réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Le transit intestinal est un phénomène physiologique complexe qui ne peut pas être mimé dans des modèles cellulaires. Les fonctions motrices de l’intestin peuvent être étudiées à partir d’intestins isolés. Cependant, ce modèle ne prend pas en compte la difficulté du candidat médicament pour atteindre sa cible. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les pathologies intestinales dans leur ensemble et dans leur complexité. L’étude du transit intestinal nécessite donc le recours à des modèles expérimentaux in vivo afin de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine et d’évaluer au mieux les effets des candidats.
Réduction
Les expérimentations ainsi que le suivi des animaux au niveau de la zootechnie (change de la litière, suivi quotidien visuel, mise à disposition d’eau et de nourriture) seront réalisés par du personnel expérimenté, limitant au maximum le stress des animaux. Ce projet ayant déjà reçu une autorisation de projet de la part du Ministère il y a 5 ans, nous avons déjà réalisé ces études de nombreuses fois et du fait de notre expérience, nous pouvons constater que n= 10 animaux par groupe est le minimum pour obtenir des résultats statistiquement satisfaisants du fait de la variabilité interindividuelle des animaux et de leur réponse à l’administration de candidats médicaments dans un modèle pathologique.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Une procédure nécessite une mise des animaux dans des cages individuelles sur grille. Ces derniers seront placés dans ces cages au moins 1 heure avant le début de l’étude pour une habituation au nouvel environnement afin de limiter le stress lors de l’expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il sera isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Ce modèle est applicable à toute espèce/souche de rongeur. Le choix sera ainsi dépendant des demandes clients car les différents modèles sont bien décrits dans la littérature pour les deux espèces. Nous utiliserons des rats et des souris âgés d’au moins 6-8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures.
Fourniture de souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
250 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le projet consistant à leur greffer une tumeur puis à les livrer à un chercheur extérieur. Une lignée de cellules de glioblastome humain leur est implantée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis elles sont expédiées au demandeur dans les quinze jours, avant l'apparition annoncée de nuisances. Ce laboratoire se limite donc à greffer une tumeur et à fournir les animaux à un tiers, qui les utilisera pour tester des sondes d'imagerie. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" pour étudier la biodistribution d'un composé.
Objectifs
Ce projet a pour but de fournir, à la demande d'un chercheur extérieur à notre laboratoire, des souris modèles de cancer cérébral. Ces souris modèles seront ensuite utilisées chez le chercheur afin d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant en particulier le métabolisme du tryptophane. La lignée cellulaire tumorale d'origine humaine U87 MG Luc correspond aux besoins du chercheur. L’objectif du financement ANR du chercheur est le transfert en clinique de radiopharmaceutiques innovants pour l’imagerie TEP en oncologie et neurologie et la radiothérapie moléculaire. Il est donc nécessaire des réaliser ce projet sur une lignée cellulaire humaine. Les souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée seront envoyées au chercheur 15 jours maximum après leur induction.
Bénéfices attendus
Le métabolisme du tryptophane via la voie de la kynurénine médiée par l'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) joue un rôle dans l'immunomodulation et est devenu une cible plausible pour l'immunothérapie contre le cancer. Ce projet permettra au chercheur d'évaluer la spécificité de nouvelles sondes d'imagerie TEP (Tomographie d'émission de positons) ciblant le métabolisme du tryptophane. L'imagerie TEP est un outil diagnostique de choix en cancérologie chez l'homme.
Procédures
Souris porteuses de tumeurs cérébrales en sous cutanée : 1 seule injection par animal, cellules injectées sous anesthésie gazeuse en sous cutanée au niveau du flanc des souris. Cette procédure dure moins de 5 minutes. Pesée des animaux vigiles , dure 30 secondes, 1 fois par semaine minimum. Mesure de la tumeur au pied à coulisse, se fait sous anesthésie gazeuse, dure moins de 1 minute, 1 fois / semaine maximum. Si l'envoie des souris se fait 15 jours après l'induction: pour chaque souris 3 pesées minimum et 2 mesures de tumeur au pied à coulisse).
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés au développement d'une tumeur sous cutanée. Dans ce modèle, il n'y aura pas de métastases. Les souris seront envoyées au chercheur avant l'apparition de nuisances ou d'effets indésirables soit 2 semaines maximum après l'induction des tumeurs. La douleur infligée par l’injection des cellules correspond à celle d’une piqûre d’aiguille et se fait sur souris anesthésiée (Isoflurane 2% dans l'air) tout comme la mesure de la tumeur au pied à coulisse qui est indolore. Les souris immonodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficiences qui n'apparait pas puisqu'elles sont hébergées en portoir ventilé.
Devenir
Tous les animaux du projet (50 souris x 5 envois= 250 souris) seront uniquement induits puis hébergés dans nos locaux pendant 2 semaines maximum. Ils pourront ensuite être fournis au chercheur demandeur de ce modèle pour des projets expérimentaux autorisés réalisés dans son UE. Nous lui fournirons la grille de scoring et le suivi pondéral des animaux dans nos locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro nous permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable pour l'étude de la biodistribution/ciblage de nouvelles sondes d'imagerie.
Réduction
Ce modèle de cancer chez la souris a pour finalité d'être utilisé par un chercheur pour l'étude de nouvelles sondes d'imagerie. D'une part, nous avons déterminé avec lui le nombre minimal de souris nécessaire pour mener à bien son projet et d'autre part le chercheur mettra en œuvre une technique d'imagerie (Tomographie d'émission de positon) qui permettra de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Pour chaque série expérimentale, il analysera les images ce qui permettra de comparer l’accumulation du traceur dans différentes zones (« zones d’intérêt ») entre les temps d’imagerie pour chaque groupe, et entre les groupes. Les différences d’accumulation du traceur dans chaque zone d’intérêt seront analysées statistiquement.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec des petits cylindres de coton pour la fabrication d’un nid. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement et afin d’éviter toute souffrance avant leur départ chez le chercheur, nous mettrons en place une grille de score et utiliserons des points limites adaptés et un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la biodistribution/le ciblage de nouvelles sondes d'imagerie. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Ouverture de la barrière hématomédullaire et traitement anti-inflammatoire chez un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles subissent des injections quatre jours par semaine et une ouverture de la barrière entre le sang et la moelle épinière sous anesthésie chaque semaine pendant cinq semaines, la moitié étant suivies jusqu'au stade terminal de la paralysie. Le porteur reconnaît une perte de force musculaire, une paralysie progressive, et des risques d'hypothermie et d'arrêt cardiaque liés aux anesthésies répétées. Il affirme que ce modèle murin est le seul à reproduire la paralysie progressive de l'adulte, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique (BHE) et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire (BHM) sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la SLA, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de SLA permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire de la barrière hématomédullaire, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteins de SLA pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.
Procédures
Les souris arriveront déjà numérotées par QR code auriculaire donc aucune procédure supplémentaire de numérotation ne sera nécessaire. Un génotypage sur prélèvement d’un petit bout de queue sera réalisé. Ce prélèvement aura lieu sous anesthésie générale, à l’occasion de la première anesthésie réalisée pour ouverture de la barrière hématomédullaire. • Injection d’un traitement immunomodulateur 4 jours par semaine pendant 5 semaines • Ouverture de la barrière hématomédullaire sous anesthésie générale durant une heure, 1 jour par semaine pendant 5 semaines. Cette procédure ne requiert aucune chirurgie et dure 5 minutes. Mesures dans chaque groupe : • 3 Prélèvements sanguins : un prélèvement toutes les 2 semaines • Pesée : une fois par semaine • Force musculaire : 1 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et l’effet du traitement. Durée du test 1 minute. Toutes les souris (N=80 souris au total, 4 groupes de 20 souris) seront euthanasiées par surdosage en anesthésiques. Dix souris/ groupe seront euthanasiées au stade symptomatique et 10 seront suivies jusqu’au stade terminal. Des prélèvements de tissus après euthanasie des animaux seront réalisés chez toutes les souris pour analyse du traitement sur la maladie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : • l’effet de la maladie sur les animaux, la perte de force musculaire et la paralysie progressive liée au modèle • le stress éventuel lié au test de force musculaire une fois par semaine sur les animaux entre l’âge de 48 et environ 162 jours, au cours de la maladie • un stress lié à la contention et la douleur de la piqure au cours des injections sous-cutanées répétées (4 jours par semaine et pendant 5 semaines consécutives) de l’immunomodulateur ou de placébo et des prélèvements sanguins • des irritations ou infections potentielles liées aux injections répétées intraveineuses des microbulles (ou placebo) pour l’ouverture de la barrière hémato médullaire une fois par semaine pendant 5 semaines consécutives • des conséquences négatives sur la maladie ainsi des hypothermies, hypoventilations et potentiellement des arrêts cardiaques liés aux anesthésies répétées (une fois par semaine pendant 5 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront utilisés à la fin de la procédure pour des études d’histologie ou de transcriptomique et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine, raison pour laquelle notre projet nécessite l’utilisation de ces souris.
Réduction
Pour mener à bien cette étude et obtenir un résultat interprétable il est nécessaire de former 4 groupes de N=20 souris/groupe selon le traitement administré. Groupe 1: ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation du système immunitaire, groupe 2 : ouverture de la barrière sans stimulation du système immunitaire, groupe 3 :stimulation du système immunitaire sans ouverture de la barrière, groupe 4, contrôle : ni stimulation, ni ouverture de la barrière. Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif d’après les lignes directives publiées et nos études précédentes pour déterminer le nombre de souris par groupe (calcul de puissance), afin de pouvoir obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Nous utiliserons: N=10 souris/groupe pour les courbes de suivi de la maladie et N=10 souris/groupe pour des analyses au stade symptomatique de la maladie. Dans chacun de ces sous-groupes de N=10 souris, N=5 souris serviront à des études histologiques, N=5 souris serviront à des études de transcriptomiques. Nombre total de souris = 80 souris. Tous les effets seront analysés par des tests statistiques appropriés pour les courbes de survie, les analyses histologiques et transcriptomiques.
Raffinement
Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Un programme d’enrichissement sera suivi en ajoutant dans la cage les éléments suivants : « Mouse house » ou carrés de coton pour nids. Les femelles seront hébergées ensemble à 5 souris par cage. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie SLA) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront dans ce cas isolées avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris/ cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Un soin particulier sera apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Ils seront observés quotidiennement et nettoyés à l’eau stérile en cas de suintement ou à la vétadine en cas de rougeur (suspicion d’infection). Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Bien que la sonication soit parfaitement indolore, afin d’éviter le stress lié à une contention, les animaux recevront une anesthésie chimique.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Nous utiliserons des souris adultes, plus particulièrement au stade symptomatique aux alentours de 5 mois et au stade terminal de la maladie. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers l’âge de 6 mois.
Etude de l’impact du dysfonctionnement de la connectivité neuronale cérébelleuse sur l’ataxie de Friedreich
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une partie subit une chirurgie lourde du crâne de deux heures et demie, pose d'une fenêtre crânienne et injection de virus dans le cervelet, d'autres passent des tests de coordination motrice, pour étudier l'ataxie de Friedreich sur un modèle de souris privé d'une protéine. Le porteur reconnaît une douleur postopératoire possible après la chirurgie du crâne, mais qualifie les tests comportementaux de non invasifs et non stressants. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire en culture des réseaux neuronaux aussi complexes, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive des neurones sensoriels. Elle mène à l’apparition de symptômes ataxiques, comme la perte de coordination des mouvements volontaires, mais affecte aussi d’autres organes comme le cœur et le pancréas. L’AF peut être déclenchée par plusieurs facteurs et est due à un déficit de la protéine frataxine (FXN) dans tous les tissus. Un modèle murin a été créé pour comprendre la maladie. Les résultats de nos collaborateurs et de notre laboratoire montrent que le modèle murin utilisé présente les symptômes de l’ataxie et peut donc être un bon modèle pour notre projet. Le projet va se diviser en plusieurs parties. En premier lieu, nous allons caractériser le comportement de ces souris à plusieurs temps, en utilisant des tests non douloureux et sans stress pour les animaux. En parallèle, nous caractériserons les cellules du système nerveux impliquées dans l’évolution de la maladie. La deuxième partie du projet vise à pratiquer de l’imagerie in vivo afin de visualiser l’activité du cervelet. Ceci nous permettra d’observer d’éventuels changements dans les réseaux neuronaux de façon directe chez les animaux. Ceci sera fait avant et après apparition des symptômes. Le dernier axe visera à utiliser les données d’imagerie obtenues précédemment afin de moduler les circuits neuronaux du cervelet par des approches chimiogénétiques. Cette approche consiste à injecter sous anesthésie différents types de récepteurs qui pourront être activés par un composé qui sera distribué dans l’eau de boisson des animaux. Ceci est dépendant des données obtenues précédemment, et notre approche sera adaptée au cours du projet. Nous espérons ainsi compenser les déficits comportementaux et obtenir des données fondamentales pour mettre en place le développement d’une thérapie. Ce projet présente donc deux intérêts majeurs, qui sont en premier la récolte de données fondamentales indispensables à une meilleure compréhension de la maladie, afin que la communauté scientifique puisse en bénéficier, et l’avancée vers un développement d’une thérapie pour traiter les patients atteints de l’AF.
Bénéfices attendus
Ce projet combine plusieurs techniques afin d’obtenir des données les plus complètes possibles sur ce nouveau modèle. En effet, bien que plusieurs modèles aient déjà été générés par le passé, notre modèle murin est celui qui est le plus proche génétiquement de ce qu’il se passe chez le patient, car il présente une quantité de la protéine Frataxine très basse dans tout le corps, dès le développement de l’embryon. Nos approches combinées de comportement, biologie moléculaire et microscopie vont permettre d’avoir une vue d’ensemble des événements responsables de l'évolution de la maladie. Ce projet permettra d'isoler des pistes pour mettre en place un traitement. Nous pourrons partager ces données avec l’ensemble de la communauté scientifique afin que d’autres travaux puissent utiliser ces connaissances et progresser dans la recherche fondamentale et pré-clinique. Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques. De plus, les techniques utilisées pour ce projet pourront être déclinées sur d’autres modèles. Les mécanismes sous-jacents de l’AF sont en cours d’étude et de nombreux éléments ne sont pas encore compris. Ce projet va permettre de rassembler une quantité de données non négligeable dans la compréhension de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes : -Tests comportementaux pour la caractérisation neurologique à 3, 6, 9, et 12 mois. 80 animaux au total (10 témoins et 10 mutants par temps). Les tests effectués visent à évaluer la coordination générale des animaux, et ne sont pas invasifs ni stressants. Comme pour toutes les procédures de comportement, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant plusieurs sessions avant le début des tests. Les tests ont une durée comprise entre 30 secondes et 5 minutes, et une période de repos est prévue entre chaque test. Au total, chaque souris passe au maximum 15min à être évaluée en comportement. Les tests comportementaux seront répétés à 4 temps différents. -Imagerie in vivo à 40j et 150j. 48 animaux au total. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale unique pour l’implantation d’une fenêtre crânienne et l’injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. L’intervention dure 2.5h par souris, et se fait sous anesthésie générale avec suivi vétérinaire quotidien pendant les 10 jours suivant l’intervention. -Modification chimiogénétique des circuits neuronaux cérébelleux par injection de virus codant pour des récepteurs activables chimiquement. 240 animaux au total, injectés à 40j et 150j -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, activés chimiquement via un produit dans l’eau de boisson (CNO) -80 animaux injectés avec le virus codant pour les récepteurs, qui ne seront pas activés chimiquement -40 animaux injectés avec un virus ne codant pas pour les récepteurs -20 animaux injectés avec le virus codant les récepteurs et traités au CNO -20 animaux injectés avec le virus non codant, traités également au CNO Les 4 premiers groupes seront utilisés pour les tests de comportement décrits précédemment, ainsi que des études histopathologiques. Les 2 derniers groupes seront utilisés pour des études protéomiques. Tous ces animaux seront soumis à l’intervention d’1h décrite précédemment, avec le même suivi vétérinaire.
Impact sur les animaux
Les données recueillies par nos collaborateurs et notre laboratoire montrent que notre modèle murin de l'AF ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois. A partir de 4 à 5 mois, des symptômes légers d’incoordination motrice commencent à apparaître. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs ni stressants, et ne causent donc aucun dommage aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection et d’implantation de fenêtre crânienne est une chirurgie lourde, et les mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires ont été prises en amont. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. Les traitements pharmacologiques pour les animaux concernés se fera via l’eau de boisson, et n’apportera donc aucun stress pour les animaux. Lors des sessions de microscopie, la tête des animaux sera immobilisée sur une courte période de 30min maximum par souris, pour assurer une acquisition optimale des images.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques. Tous les animaux sont réutilisés d’un autre projet de notre laboratoire dont l’un des axes vise à étudier le comportement néonatal des souriceaux. Ces 2 projets sont donc complémentaires et permettront l’obtention de données sur toute la durée de vie des animaux. Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l’Ataxie de Friedreich affecte de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. De plus, nous effectuons un marquage de couleur à la base de la queue avec une encre légère non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Pour la prise en charge de la douleur per-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet, comprenant plusieurs molécules, avec la vétérinaire référente de la structure. Pour éviter au maximum de séparer les animaux lors de la phase post-opératoire, nous allons tester un système séparateur de cage qui permettrait aux animaux de se voir, se sentir et d’avoir des contacts sociaux réduits afin qu’ils soient moins stressés lors de cette période critique du projet. Pendant cette période, de l’enrichissement supplémentaire sera fourni pour prévenir toute apparition de comportement stéréotypique, marqueur de souffrance. De plus, un suivi vétérinaire sera effectué quotidiennement pendant 10j, avec une grille de score adaptée et plusieurs types d’analgésiques disponibles pour prévenir toute douleur post-opératoire. Des points limites adaptés à cette chirurgie ont été mis en place afin de prévenir toute souffrance. Ceux-ci comprennent notamment l’évaluation de la consommation d’eau et de nourriture, le toilettage et les mouvements de chaque animal. L’administration de molécules pharmacologiques sera faite via l’eau de boisson, qui sera sucrée pour en masquer le goût. Ceci permettra un traitement sans aucune manipulation supplémentaire, ce qui ne stressera pas les souris.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Ce nouveau modèle va permettre de raffiner l’étude de l’AF car il s’agit du premier modèle disponible qui présente une perte de FXN dans le corps entier. Plusieurs stades de la vie adulte ont été choisis pour ce projet, afin d’avoir une vision globale de la progression de la maladie. La caractérisation neurologique par tests comportementaux se fera à 3, 6, 9 et 12 mois. A 3 mois, les souris ne présentent pas encore de symptômes, mais il est possible que des dégradations neuronales soient déjà en cours. Les 3 stades suivants nous permettront de relier l’évolution des symptômes avec l’état de dégradation du système nerveux central. Pour les expériences d’imagerie in vivo, les animaux seront opérés à 40j puis observés à 70j pour la partie pré symptomatique. Pour la partie post symptomatique, ils seront opérés à 150j et observés à 180j. comme précédemment, ceci nous permet de mesurer les paramètres d’intérêt avant et après l’apparition de la maladie, pour déterminer la gravité des changements qui ont lieu.
Evaluation in vivo de la biocompatibilité et de la dégradation de polymères à visée thérapeutique chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
2 588 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des disques de polymère leur sont implantés sous la peau ou dans un muscle sous anesthésie, puis les rats sont gardés de un à vingt-quatre mois avant mise à mort pour analyser la dégradation et la tolérance des matériaux. Le porteur ne décrit que des effets transitoires, léthargie, douleur et perte de poids après l'opération. Il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à reproduire les propriétés d'un organe entier et présente l'étape in vivo comme un préalable à l'implantation chez l'humain, sur l'un des effectifs les plus élevés du lot.
Objectifs
La réparation tissulaire conventionnelle par chirurgie implique l’utilisation de sutures, d’agrafes ou autres techniques utilisant des points d’ancrage qui induisent un traumatisme supplémentaire au tissu. Ces techniques peuvent engendrer une inflammation et de la fibrose à l’origine d’effets délétères sur la réparation, notamment fonctionnelle, des tissus, et sur la qualité de vie du patient. Ces techniques constituent pourtant, faute d’alternatives satisfaisantes, les méthodes de référence pour la réparation chirurgicale des tissus. L’objectif de notre laboratoire est de développer des systèmes de réparation sans sutures qui pourront être utilisés dans la réparation de tissus. Des dispositifs sous forme d’implants et de colles chirurgicales sont développés pour différentes applications de la réparation des nerfs périphériques aux hernies abdominales. Les formulations d’adhésifs et d’implants développées à ce jour ont démontré une efficacité pour restaurer la fonction de certains tissus avec une grande biocompatibilité. Pour étendre les indications possibles pour la réparation des tissus, notre laboratoire développe de nouvelles formulations de polymères applicables à de nouveaux tissus. Le développement de ces systèmes de réparation nécessite de caractériser le comportement in vivo des matériaux qui les constituent, notamment en termes de biocompatibilité et dégradation. Pour cela, les différents matériaux seront synthétisés sous forme de disques qui pourront être implantés chez l’animal en sous-cutané (dégradation) ou en intramusculaire (biocompatibilité). Les disques seront analysés avant implantation, puis à différents temps après implantation pour déterminer leur dégradation et leur biocompatibilité au cours du temps. Ces informations sont cruciales pour caractériser nos produits avant implantation chez l’Homme. Afin de réaliser cet objectif, le rat a été choisi comme modèle expérimental pour sa pertinence. Nous intégrerons, au maximum, 2588 rats dans l’étude sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique le comportement de nos polymères, notamment en termes de biocompatibilité et de dégradation. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à une implantation sous-cutanée ou intramusculaire de disques de polymère effectuée sous anesthésie et analgésie (durée de la chirurgie 30 minutes). Les animaux seront ensuite maintenus et suivi durant une période comprise entre 1 mois et 24 mois selon les groupes et euthanasié selon une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Les deux procédures nécessitent un geste chirurgical réalisé sous anesthésie générale. L’anesthésie est associée à un risque d’hypothermie et d’assèchement de la cornée. La procédure va engendrer une léthargie et une douleur transitoires pouvant être à l’origine d’une perte de poids post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure pour des analyses post-mortem destinées à évaluer la dégradation et la biocompatibilité des disques de polymère.
Remplacement
De nombreux tests ont été réalisés ex vivo et in vitro pour obtenir un maximum de données préliminaires et sélectionner les polymères les plus prometteurs pour une utilisation in vivo. Malheureusement, ces études ne peuvent pas suffire car ces modèles ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Le présent projet in vivo consiste à caractériser la biocompatibilité et la dégradation des polymères in situ dans un individu intégré et autonome pour permettre un développement optimal pour la clinique.
Réduction
Au maximum, 2588 rats seront intégrés dans l’étude. Nos dispositifs ont subi une batterie de tests préalables. Seuls les implants et colles les plus prometteurs ont été sélectionnés pour un passage sur l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. 3 à 4 disques seront implantés chez un animal en sous-cutané et 1 en intramusculaire. Au cours de l’étude les résultats intermédiaires seront analysés et pourront permettre d’écarter d’autres formulations. La taille des groupes expérimentaux a été définie à l’aide d’un test statistique de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en utilisant le moins d’animaux possible (n=8 animaux exploitables par groupe). Les résultats seront également analysés par un test statistique.
Raffinement
Les rats seront hébergés en cages individuellement ventilées (2 rats/cage), en milieu enrichi par des tunnels et des balles en bois avec eau et aliments à volonté. La température et l’hygrométrie seront contrôlées. Une période de stabulation réglementaire minimale d’une semaine sera respectée entre l’arrivée des animaux et le début de la procédure pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement et ainsi de limiter leur stress. Une étape de socialisation sera mise en place pour habituer les rats à la préhension et réduire leur stress avant la procédure. Les gestes expérimentaux seront pratiqués par du personnel qualifié avec une anesthésie et/ou une analgésie adaptée à la nature et à la durée du geste. Une pesée des animaux sera réalisée 24h après la chirurgie pour évaluer la récupération de l'animal. Si nécessaire, un complément gélifié et/ou des granules humidifées seront déposés directement dans le fond de cage pour faciliter la prise alimentaire (1 pot par cage). Des graines de tournesol seront ajoutées à l'alimentation ususelle pour diversifier l'enrichissement. Suivi tout au long de l'étude: suivi quotidien. Une grille de score et des points limites seront mis en place.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour des protocoles de chirurgie. De plus, la taille des rats permet d’utiliser de faibles quantités de polymères en comparaison avec d’autres espèces mammifères telles que porc ou brebis. De plus, leur taille, comparée à celle de la souris, permet plus aisément de pratiquer un acte chirurgical fin. Enfin, la composition de la matrice extracellulaire des humains et des rongeurs est très similaire. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques, les études présentées dans ce projet étant des études précoces du développement. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l’étude (une période d’acclimatation minimale de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations). Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. L’efficacité de nos systèmes de réparation tissulaire est testée sur des animaux adultes du même âge. Pour assurer une reproductibilité des résultats, l’étude de biocompatibilité/dégradation est réalisée au même âge. De plus, les animaux seront jeunes et auront donc une plus forte chance de ne pas développer des maladies liées au vieillissement ce qui est un critère important pour notre projet qui implique un suivi sur 24 mois pour certains groupes expérimentaux.
Evaluation par bioluminescence de l’efficacité combinée de la radiothérapie et du temozolomide sur un modèle de glioblastome opéré ( EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
85 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance déclarés modérés à sévères. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, 72 subissent une chirurgie d'exérèse partielle de la tumeur et 54 des séances de radiothérapie, pour reproduire le protocole appliqué aux patients atteints de glioblastome. Le porteur indique que la tumeur ne peut être contrôlée et atteint des points limites qui conduisent à la mise à mort de toutes les souris, et reconnaît une chirurgie classée sévère et le stress de l'hébergement individuel. Il affirme que la chirurgie ne peut pas être menée sur des modèles in vitro, justifiant le recours à la souris.
Objectifs
Nos projets de recherche portent sur le développement et la validation de stratégies innovantes pour le traitement des glioblastomes, tumeurs cérébrales très agressives et de très mauvais pronostic. Dans ce contexte, nous cherchons à affiner nos modèles , tant in vitro qu'in vivo afin qu'ils deviennent plus pertinents et plus représentatifs de la réalité clinique de cette pathologie. Nos modèles jusqu'à présent étaient limités car l'intervention chirurgicale pratiquée en première intention chez les patients n'était pas appliquée dans nos expérimentations. Nous sommes parvenus à mettre au point le modèle de glioblastome opéré chez la souris immunodéprimée porteuse d'une tumeur intracérébrale. Nous souhaitons donc maintenant appliquer à nos animaux, le traitement classiquement délivré aux patients (appelé "protocole de Stupp") qui combine chirurgie + radiothérapie + chimiothérapie : l'objectif est de caractériser les effets des traitements et de mieux comprendre les mécanismes conduisant à la récidive tumorale.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de glioblastome opéré dans nos expérimentation permettra de replacer nos recherches dans un contexte thérapeutique plus représentatif de la pratique clinique. En particulier, cette étude devrait nous aider à comprendre les mécanismes induits par la radiothérapie et la chimiotherapie, lorsque celles-ci sont administrées juste après une chirurgie, et déterminer comment les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement favorisent la rechute. Au final, ces données seront essentielles pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les phénomènes de récidives.
Procédures
Tous les animaux (85) recevront une injection de cellules tumorales dans le cerveau : l'injection est réalisée une fois au début de l'étude (durée 45min) et le suivi du développement de la tumeur intracérébrale se fait par imagerie de bioluminescence 2 à 3 fois par semaine (durée de chaque examen environ 15 min). Parmi les 85 animaux prévus, 72 animaux subiront une intervention chirurgicale permettant de retirer partiellement la tumeur qui s'est développée dans le cerveau : cette chirurgie d'exérèse est réalisée une fois au milieu de l'étude (durée 45min) et les animaux sont placés après l'opération en cage individuelle pendant 4 jous pour convalescence. Pour 54 animaux : traitement par radiothérapie (chaque irradiation dure environ 5 min ; 18 animaux recevront 1 irradiation ; 18 animaux recevront 2 irradiations espacées de 72h, 18 animaux recevront 5 irradiations à raison d'1/jour pendant 5 jours consécutifs)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine en phase péri-opératoire de l'exerèse) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux, qui se produiront de surcroit lors de la phase péri-opératoire. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire et l'augmentation du volume injecté est de l'ordre d'une dizaine de µL entre le début et la fin des expérimentations. La bioluminescence et la radiothérapie sont des protocoles rapides et nécessitent une anesthésie de 15 minutes maximum. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de raffinement. Chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux. Hébergement en cage individuelle après la chirurgie d'exérèse pouvant conduire à un stress des souris (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux.
Devenir
Tous les animaux du projet développent une tumeur qui ne peut pas être contrôlée par les traitements appliqués : la tumeur finit par provoquer l'apparition de points limites qui expliquent la mise à mort à l'issue de chaque procédure (soit 85 souris au total)
Remplacement
Dans notre contexte, le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est clairement pas possible puisque nous tentons de modéliser chez l'animal l'impact de l'ablation chirurgicale des tumeurs dans le cas de tumeur cérébrale très agresssives et de très mauvais pronostic : la chirurgie ne peut pas être réalisée sur des modèles in vitro.
Réduction
Pour deux groupes d'études, nous avons réduit le nombre d'animaux car nous avons, lors une étude préliminaire, acquis des données qui pourront être compilées avec celles acquises dans ce nouveau projet. Afin de suivre la croissance tumorale, nous utiliserons une méthode d'imagerie permettant ainsi un suivi dans le temps de chaque animal. De plus, concernant les animaux qui recevront les différentes modalités de radiothérapie, les procédures se feront de façon séquentielle, palier par palier, de la procédure d'irradiation la moins contraignante à la procédure d'irradiation la plus contraignante pour les animaux. Seules les procédures bien tolérées seront conduites.
Raffinement
Un soin tout particulier sera apporté aux animaux notamment par un suivi post-opératoire rigoureux (désinfection de la plaie, analgésie, réhydratation par injection de glucose à 37°C...). Les souffrances de l'animal seront évaluées en appliquant une grille de score adaptée aboutissant à une prise de décision adéquate, en fonction de points limite et de crières d'arrêt préalablement définis et validés pour nos protocoles. Les conditions d'hébergement et d'enrichissement garantiront les conditions de bien-être animal. Le transport des animaux se fera de façon à éviter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles souris et rats. Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de son accessibiltié et de sa facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines. Nous privilégions des souris femelles, plus dociles et moins agressives, pour faciliter l'hébergement collectif. Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur crâne a une conformation très bien définie qui permet l'injection de cellules tumorales sans danger et sans difficulté.
Infection à Bacillus cereus sensu lato : nouvelles thérapies et réponses de l’hôte chez le nouveau-né dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 975 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux de deux jours sont infectés par la bactérie Bacillus cereus puis traités par injection, et sont tués au bout de 48 heures avec les mères, susceptibles d'avoir été contaminées. Le porteur indique que l'infection provoque une baisse d'activité, une pâleur, puis le rejet par la mère et l'absence d'alimentation, la survie des animaux étant le critère suivi. Il affirme avoir déjà testé les composés in vitro mais conclut à la nécessité de vérifier l'effet dans un modèle d'infection vivant.
Objectifs
L’identification d’un nombre croissant de cas d’infections dues aux bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato, pathogène opportuniste (ne causant en général pas de maladie chez les personnes en bonne santé) présent dans l’environnement, représente un problème majeur en santé publique. Il s’agit de la 3ème cause d’intoxications alimentaires dans le monde (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments : EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). EFSA J, 2016), et de plus en plus de travaux font aussi état d’infections fatales chez le nouveau-né prématuré. Le traitement antibiotique de référence contre ces infections à Bacillus cereus consiste en une association vancomycin/aminoglycoside. Cependant, la recherche d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place serait un plus dans la prise en charge de ce type d’infections. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Alimentation de l'Environnement et du Travail) sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe Bacillus cereus et permettre la mise au point de nouveaux traitements contre ce type d’infection.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Bacillus cereus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection chez le nouveau-né prématuré, la découverte d’un traitement plus simple et moins lourd à mettre en place constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.
Procédures
Aucune intervention ne sera effectuée sur les femelles gestantes avant, pendant ou après mise bas. Les souriceaux de 2 jours seront infectés par voie intrapéritonéale, puis, une heure plus tard, traités par injection par voie intrapéritonéale. Le temps nécessaire à l'infection ou au traitement, par voie intrapéritonéale, n'excéde pas 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront ceux liés à l'infection en général, à savoir principalement chez les souriceaux, baisse de l'activité, pâleur, pouvant aboutir au rejet par la mère et à l'absence d'alimentation, visualisée par l'absence de lait dans l'estomac. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées dans un précédent projet. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au bout des 48 heures de la procédure, les souriceaux ayant été infectés et/ou traités avec différents composés chimiques et les femelles gestantes après mise bas ayant pu être contaminées par les souriceaux infectés.
Remplacement
Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Bacillus cereus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats d'un précédent projet. Il pourra être réduit encore en fonction des résultats obtenus.
Raffinement
En termes de raffinement, afin de garantir le bien-être des souris, celles-ci seront hébergées dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Également, ce projet fait suite à un précédent projet au cours duquel les doses infectantes ont été déterminées. Après infection et après traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement (aux temps 2 heures post infection et 1, 2, 4, 6, 8, 24 et 48h post traitement) par les responsables du projet et par le personnel animalier, permettant de détecter toute apparition de signes de souffrance durables non reliés à l’infection et pouvant être dus à une mauvaise injection. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris, dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa. Plus précisément, ce modèle d'infection chez la souris C57Bl/6JRj nouveau-née est celui que nous avons utilisé par ailleurs dans l'étude de l'infection à Bacillus cereus chez le nouveau-né prématuré. Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours, afin de coller au plus prés aux cas d'infections fatales observées en clinique chez le nouveau-né prématuré.
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perte de substance du palais leur est infligée sous anesthésie pour créer une communication entre la bouche et les sinus, comblée par un biomatériau à base de collagène et de lysat plaquettaire, avec un suivi de trois semaines par scanner avant mise à mort au 21e jour. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, des risques d'infection, de nécrose et une mortalité pouvant atteindre 5 %. Il affirme qu'il n'est pas possible de se passer d'animaux et présente ce modèle comme un préalable à des essais chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales.Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorise la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...) Le but se ces travaux d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique.
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in-vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rangeur (rats)
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes. Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (micro-TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle. Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes. Les cadavres des rats seront ensuite transférés au service de zootechnie expérimentale pour la dissection, et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons.
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur postopératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. /Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composé de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in-vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface. En utilisant un plan de A’Hern sous les hypothèses alpha=5%, puissance=85%, p0=25% et p1=55%, il est nécessaire de randomiser 20 rats dans chaque bras expérimental. Un ratio 1:1:1 sera utilisé pour la randomisation, le bras contrôle étant uniquement présent pour valider les hypothèses. Au total 60 rats (bras contrôle : n=20 / bras expérimental 1: n=20 / bras expérimental 2 : n=20) seront randomisés dans cette étude. Le critère principal est le taux de rats présentant un succès (cf. section critère de jugement principal).Il sera présenté par bras sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% selon une distribution binomiale exacte.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées seront réaliser par un personnel qualifié composé de concepteur de projet et d’applicateur de procédure expérimentale ainsi de chirurgiens ORL Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Mise en place d’un système d’administration intranasale de médicaments biologiques chez le Primate Non Humain dans le but de traiter l’encéphalopathie hypoxique-ischémique (HIE) chez les nouveau-nés.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
31 macaques à longue queue vont être utilisés, une partie tuée à l'issue pour nécropsie et l'autre réutilisée dans de nouvelles procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des anesthésies répétées, plusieurs fois par semaine, pour des séances d'imagerie pouvant durer huit heures, des administrations dans le nez sous anesthésie, des prises de sang jusqu'à quatre fois par semaine et des ponctions lombaires, afin de valider un dispositif d'administration de médicaments par le nez chez le nouveau-né humain. Le porteur qualifie l'administration de peu traumatique tout en reconnaissant un possible manque d'appétit, de la fatigue et une irritation de la narine. Il affirme avoir d'abord testé un moule en trois dimensions mais présente le recours à l'animal vivant comme "indispensable", le macaque cynomolgus ayant selon lui les cavités nasales les plus proches de celles d'un nouveau-né humain.
Objectifs
Cette demande s’inscrit dans le cadre d’un projet international, qui implique 4 partenaires. Elle vise à développer un dispositif biomédical innovant d’administration de médicaments au niveau du système nerveux central chez le nouveau-né humain en utilisant la voie de transport directe de la cavité nasale au cerveau et en contournant la barrière hémato-encéphalique. Ce nouveau dispositif doit permettre de cibler très précisément la lame criblée, une zone perméable entre le nez et le cerveau, et ainsi d’améliorer l’efficacité thérapeutique de l’administration intranasale, jusqu’à présent moindre que par les voies systémiques (intraveineuse ou intramusculaire). Le projet prévoit le développement de candidats thérapeutiques, le développement d’un système d’administration intranasale chez le nouveau-né humain, et des essais précliniques qui permettront d’évaluer à la fois les candidats médicaments et le dispositif d’administration. Le dispositif en cours de développement chez notre partenaire sera pratique, sûr, devra être adapté à l’anatomie des nouveau-nés, aux pratiques cliniques actuelles des néonatologistes, ainsi qu’aux produits biologiques, des anticorps monoclonaux à la thérapie cellulaire. Dans ce projet, nos objectifs sont : -de valider le dispositif innovant d’administration intranasale dans un modèle primate non-humain (PNH) -d’évaluer l’innocuité du dispositif d’administration dans notre modèle PNH -d’étudier la biodistribution des produits administrés chez le PNH.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de développer et faire progresser l’administration intranasale de produits biologiques chez le nouveau-né humain grâce au développement d’un nouveau dispositif biomédical et sa validation préclinique dans un modèle PNH. L’efficacité de l’administration sera validée et caractérisée par la mesure de la molécule d’intérêt au plus près de la zone ciblée dans le cerveau (méninges…). À court terme, nous développerons une technologie innovante de marquage des cellules souches par le complexe 89Zr-oxine pour permettre le suivi spatio-temporel de cellules par une technique d’imagerie non invasive, le PET-CT scan, sans avoir recours à l’euthanasie. Ainsi grâce à cette technique, nous pourrons suivre en temps réel la position des cellules dans les primates. Grâce aux propriétés lipophiles du complexe 89Zr-oxine, qui s’insère dans la membrane plasmique, ce type de marquage pourra s’appliquer ensuite à tous types de cellules. L’étape de validation du dispositif d’administration demeure un prérequis nécessaire avant d’envisager l’évaluation de candidats thérapeutiques et des essais cliniques chez des humains nouveau-nés souffrant d'encéphalopathie hypoxique-ischémique.
Procédures
Lors de chaque intervention, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter tout stress ou douleur. Chez les premiers animaux un radiotraceur classiquement utilisé chez l’humain sera administré pour caractériser et localiser le dépôt intranasal en utilisant le nouveau dispositif médical. Ce radiotraceur sera visualisé par imagerie à différents temps pour valider le dispositif et affiner le mode opératoire. La séance d’imagerie durera au maximum 8h avec la possibilité de faire un suivi dynamique de la molécule durant les trois premières heures. Deux autres sessions courtes d’une heure maximum pourront être programmées dans la même journée. Cette séquence d’imagerie pourra être réitérée 2 fois, espacées de 7 jours minimum. Le deuxième groupe d’animaux recevra les cellules souches radiomarquées utilisées comme traitement potentiel (administration simple ou multiple sur un temps de 30 minutes maximum). La migration de ces cellules sera observée par imagerie pendant 2 semaines maximum en fonction des résultats obtenus, avec 3 sessions possibles le jour de l’administration comme décrit précédemment pour le radiotraceur classique, et un maximum de 10 sessions. En parallèle, des échantillons de sang seront prélevés au maximum 4 fois par semaine pour monitorer les effets cliniques (durée 20 minutes). Des prélèvements lombaires seront possibles, au maximum 3 fois par animal avant ou après l’administration de cellules (durée 30 à 45 minutes). Enfin, nous traiterons 4 animaux avec chaque candidat ce qui durera 30 minutes maximum et nous procéderons à une euthanasie pour une nécropsie extensive afin de déterminer la biodistribution exacte de chaque candidat après administration intranasale. Pour chaque animal, nous pourrons procéder 2 fois à des prélèvements de sang, des prélèvements du tractus respiratoire et à des lavages broncho-alvéolaires ainsi que des ponctions lombaires le tout durera au maximum 1 heure.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés plusieurs fois par semaine et certaines anesthésies pour les séances d’imagerie seront relativement longues, ceci pourra induire un manque d’appétit et de la fatigue pour les animaux. L’administration intranasale sera faite sous anesthésie et est peu traumatique mais elle pourrait induire un stress et possiblement une petite irritation (introduction d’un cathéter dans la narine).
Devenir
Les animaux utilisés pour suivre par imagerie le dépôt du radiotraceur ou la migration de cellules souches marquées pourront être inclus dans de nouvelles procédures après examen et validation par un vétérinaire. En effet, aucune séquelle n’est a priori attendue suite à ces traitements. Une partie des animaux sera euthanasiée afin de caractériser la biodistribution des candidats thérapeutiques. Dans tous les cas, l’état clinique des animaux sera étroitement surveillé, et une euthanasie sera envisagée en cas de dégradation pour éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Dans une première partie du projet, un modèle de moule en 3 dimensions de la partie supérieure d’un PNH a été conçu pour tester le dispositif d’administration par voie intranasale développé par notre partenaire. Des ajustements du dispositif d’administration ont ainsi pu être réalisés sur ce modèle de moule en remplacement des PNH. Le modèle 3D permettra de plus de déterminer la position optimale du PNH lors des interventions pour déposer la solution contenant le composé d’intérêt au plus près de la lame criblée. Toutefois, nous devrons valider le dispositif sur les animaux grâce au dépôt d’un composé radioactif utilisée en clinique chez l’homme. Le recours à des animaux vivants reste indispensable, aucun modèle ne représentant que partiellement un organisme ne pouvant mimer les muqueuses et les échanges entre le nez et le cerveau, ni ensuite la biodistribution dans le cerveau.
Réduction
Malgré des données encourageantes de notre partenaire sur des PNH juvéniles d’une autre espèce, cette étude reste assez précoce et nous ne disposons pas de données chez l’espèce qui sera utilisée ici. Nous envisageons de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, tout en nous assurant de la fiabilité de nos résultats pour valider nos hypothèses. Dans un premier temps, nous prévoyons de tester le mode d’administration sur 3 PNH pour valider le ciblage de la lame criblée. En cas d’échec et après modification du système, le dispositif d’administration sera à nouveau testé sur 3 PNHs, avec un maximum 3 cycles de tests, soient 9 PNH pour cette phase. Dans un second temps, afin de développer la technique et le marquage des cellules, les tests seront réalisés sur 5 groupes de 2 PNH. Après validation de la technique de marquage, une même préparation de cellules marquées sera inoculée à 2 animaux. Pour répondre à cette dernière question, des sous-groupes de 4 animaux seront constitués, avec administration du même candidat médicament et euthanasie au même moment afin d’obtenir des données de biodistribution solides.
Raffinement
L’ensemble des procédures sera réalisé sur des animaux anesthésiés. Nous serons très vigilants lors des anesthésies répétées au cours d’une même semaine et avons un système d’alerte automatique via notre base de données en cas de perte de poids supérieure à 10% en 15 jours ainsi que pour les analyses sanguines anormales. Lors des sessions d’imagerie, un soin particulier sera apporté au confort de l’animal et notamment au maintien de sa température corporelle par tapis chauffant, et de son hydratation par perfusion. Les animaux seront monitorés en continu pour différents paramètres (oxymétrie, fréquences cardiaque et respiratoire, pressions artérielle, température rectale). Un suivi vétérinaire est en place et l’arrêt de l’expérimentation sera décidé en cas d’observation d’une anomalie sur l’un des paramètres surveillés durant l’anesthésie (hypothermie, hypotension, arythmie etc). Les animaux seront surveillés quotidiennement et tous les cas décrits ensuite seront rapportés à un vétérinaire. Toute modification de comportement comme une agitation ou une apathie sera remontée. Nous suivrons le poids et la température de chaque animaux et les variations déclencheront une alerte automatique grâce à un logiciel de suivi quotidien. A chaque alerte, un examen clinique approfondi sera alors réalisé afin d’évaluer les chances de survie de l’animal et de procéder à une euthanasie précoce si nécessaire.
Choix des espèces
Le modèle de PNH macaque cynomolgus a été sélectionné pour plusieurs raisons : -Il représente (avec le babouin) l’espèce dont les cavités nasales sont les plus proches de celles de l’humain. Il est indispensable de mener l’étude sur un modèle dont les cavités nasales proches de celles d’un nouveau-né, ce qui est le cas des macaques cynomolgus âgés de 2 à 4 ans, qui présentent une taille et un poids comparables à ceux d’un nouveau-né humain. Des analyses morphologiques à partir de scan de macaques et de babouins, nous ont permis de visualiser que la cavité nasale la plus comparable à l’homme est celle du macaque cynomolgus. -Pour étudier le passage de molécules/cellules du nez vers le cerveau via la lame criblée, le modèle doit se rapprocher au maximum du cerveau et des tissus muqueux humains. -Notre partenaire a déjà montré un passage possible du nez vers le cerveau dans un modèle de PNH. Dans cette étude, des animaux adultes de 2 ans minimum seront utilisés, pour leur poids semblable à celui d’un nouveau-né humain. Nous utiliserons préférentiellement des animaux jeunes de 2 à 4 ans dont la morphologie de la tête est très proche de celle d’un nouveau-né humain,