Recherche appliquée

96 porcelets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants et réintégrés au circuit d'élevage au sevrage. Âgés de trois à six jours, ils sont castrés après injection d'un anesthésique local et d'un anti-inflammatoire, l'étude comparant deux doses d'un produit associant procaïne et adrénaline censé mieux contrôler la douleur et limiter les saignements. Le porteur classe le projet en "bien-être animal" tout en pratiquant la castration sur des porcelets qui rejoindront ensuite la production. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'est possible puisque l'étude porte sur la douleur ressentie.

Objectifs

Quand elle est pratiquée en élevage, la castration doit être réalisée par un éleveur formé, avec anesthésie locale et analgésie. Des études ont montré un léger bénéfice de la lidocaïne comparativement à la procaïne comme anesthésique local lors de la castration. Pour cette raison, le protocole actuellement utilisé par les éleveurs associe la lidocaïne comme anesthésique local pour la douleur au moment de la castration, et un anti inflamatoire non stéroïdien pour la douleur post opératoire. Cependant la lidocaïne a des propriétés vasodilatatrices et on constate des saignements parfois importants lors de la castration. Le médicament utilisé pour notre essai associe procaïne et adrénaline. Sa concentration deux fois plus élevée permet de réduire le volume à injecter; la présence d'adrénaline par ses propriétés de vasoconstriction, pourrait permettre d'une part d'améliorer l'efficacité et la durée de l'anesthésie en limitant la diffusion de l'anesthésique et d'autre part de limiter les saignements liés à l'intervention. Les quantités à administrer restent à préciser pour permettre une bonne prise en charge de la douleur lors de l'anesthésie. L'objectif est de tester l'injection de deux quantités différentes du médicament pour réduire la douleur lors de la castration.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu est d'identifier un protocole qui soit au moins aussi efficace que le protocole actuel utilisant la lidocaïne pour réduire la douleur lors de la castration des porcelets, et qui permette de limiter les saignements consécutifs à la castration des animaux.

Procédures

Les porcelets seront tous castrés. Ils recevront tous préalablement une injection d'anesthésique local et d'anti inflammatoire non stéroidien pour prendre en charge la douleur . Toutes ces interventions sont courtes, inférieures à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les piqures d’injections vont entrainer une douleur légère et du stress, la castration une douleur modérée du fait de l'anesthésie et de l'utilisation d'anti inflamatoire pour calmer la douleur post opératoire.

Devenir

Tous les porcs seront gardés en vie à la fin des procédures. Ils intègreront le cycle habituel de production de l'élevage au moment du sevrage.

Remplacement

Sachant que le projet porte sur l’évaluation de la douleur ressentie par les animaux, il n’est pas possible de mettre en place de méthode de substitution qui évite l’emploi d’animaux vivants.

Réduction

Un maximum de 96 porcelets seront intégrés à ce projet. Cet effectif a été calculé sur la base d’études similaires, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant un effectif suffisant d’animaux pour pouvoir tirer des conclusions sur l’efficacité des anesthésiques utilisés. Tous les porcelets recevront une analgésie pour prendre en charge la douleur pos opératoire

Raffinement

Les animaux sont logés conformément aux règlementations définissant les conditions de vie des porcs d’élevage. Lors des interventions, les animaux ne sont jamais isolés de leurs congénères : les animaux de la portée auxquels sont administrés les traitements sont placés ensemble dans une caisse puis remis directement dans la loge avec leur mère une fois l’intervention réalisée. Les procédures utilisées sont des pratiques habituelles d’élevage (castration). Les castrations seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles d’hygiène et de sécurité.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des traitements qui seront testés. Les animaux seront utilisés entre 3 et 6 jours d’âge, ce qui correspond à l’âge habituel de cette intervention en élevage de porcs. La variabilité des âges dépend de la date de naissance des porcelets, les mises bas s'étalant sur une période de quelques jours dans une bande de truies. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’à leur sevrage vers 28 jours d’âge, date à laquelle ils sont habituellement pesés avant leur passage en salle de post sevrage.

264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dépourvues de système immunitaire, elles reçoivent une irradiation corporelle totale puis une greffe de cellules humaines, développant à partir de trois à quatre semaines une réaction du greffon contre l'hôte avec perte de poids et altération de l'état général. Les retombées annoncées, améliorer la greffe de moelle osseuse contre la leucémie, sont présentées comme "indispensables" à de futurs essais cliniques. Le porteur reconnaît poursuivre des expériences in vitro mais affirme que l'efficacité des cellules "ne peut pas être déterminée in vitro".

Objectifs

Ce projet de recherche concerne les lymphocytes NKT invariantes (iNKT), qui sont des cellules importantes dans notre système immunitaire qui ont la capacité de réguler les réponses immunitaires et de tuer les cellules cancéreuses. Lorsqu'une personne subit une greffe de moelle osseuse pour traiter une leucémie, les cellules du donneur peuvent attaquer les tissus sains du receveur, causant des dommages graves appelés "réaction du greffon contre l'hôte" (GVH). L'ajout d'iNKT au greffon pourrait aider à réguler la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé associés à la GVH tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour cela, il est important d'étudier comment les iNKT régulent la réponse immunitaire pour éviter les problèmes de santé et déterminer la quantité d'iNKT nécessaire pour obtenir un effet bénéfique. Il est également essentiel de vérifier que l'ajout d'iNKT n'empêchera pas l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Pour atteindre ces objectifs, des modèles animaux seront utilisés pour étudier les effets de différentes quantités et sous-types d'iNKT sur la réponse immunitaire. Les interactions entre les iNKT et d'autres types de cellules immunitaires seront également examinées pour mieux comprendre leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire. Enfin, il sera étudié si l'ajout d'iNKT au greffon empêchera l'effet anti-leucémique de la greffe de moelle osseuse. Les résultats de cette étude pourraient améliorer les traitements de greffe de moelle osseuse et réduire les risques associés à la GVH, tout en maintenant l'effet anti-leucémique de la greffe.

Bénéfices attendus

Dans le contexte de la greffe de moelle osseuse, les cellules humaines intégrées dans le greffon détruisent les cellules leucémiques du receveur mais peuvent également reconnaitre et attaquer les tissus sains du receveur (réaction du greffon contre l'hôte appelée GVH). La GVH est responsable de la mortalité de 20% des patients greffés. Par ailleurs, l’effet anti-leucémique ne se développe pas chez tous les patients et le taux de rechute de la leucémie survient chez environ 30% des patients greffés. Ce projet vise à valider un sous type particulier de cellules humaines (les iNKT) qui favorisera l’effet anti-leucémique, avec un moindre effet sur les tissus sains. L’utilisation de ces cellules pourrait par conséquent améliorer le devenir des patients greffés. Les résultats de ce projet pré-clinique sont indispensables à la poursuite du développement de ce traitement innovant en vue de mettre en place des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 264 souris pendant 40 secondes par carrousel (6 à 8 souris). -Une injection intraveineuse (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 216 souris, et trois injections pour 48 souris, pendant 1 minute par injection. -Une injection intra-péritonéale (IP) sur animal vigile, au maximum 4 fois pendant 8 semaines sur 76 souris, pendant 1 minute par injections. -Un prélèvement de sang sur animal vigile sur 188 animaux, et cela à 21, 28 et 35 jours après la greffe de cellules humaines, pendant 2 minutes par prélèvement..

Impact sur les animaux

Les animaux subiront un stress modéré lors de la procédure de radiothérapie à faible dose préalable à l’injection dans la veine caudale des cellules humaines. Ils développeront des signes cliniques de GVH à partir de 3 à 4 semaines après la greffe. Ces signes cliniques sont une perte de poids (-20% par rapport au poids pré-greffe) avec ou sans diarrhée et des signes de fatigue et d’altération de l’état général : voussure, perte de brillance du pelage, hérissement des poils, inflammation des yeux et diminution de l’activité dans les cas sévères. Ces signes sont gradés par le même expérimentateur selon le score de GVH. Le niveau de souffrance sera modéré. Dans les expériences où seront injectées des cellules leucémiques, les animaux présenteront à partir de 3 semaines après l’injection des signes de croissance tumorale avec prise de poids et développement de masses abdominales qui pourront altérer leur état général (augmentation du score clinique utilisé pour grader le degré de GVH). Le niveau de souffrance sera modéré.

Devenir

Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines plus ou moins avec des cellules leucémiques, une GVH ou une progression tumorale vont pouvoir se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences in vitro pour valider la fonctionnalité des cellules humaines de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé in vitro, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques : ainsi, l’expérimentation s’arrêtera dès l’obtention d’une différence significative entre les groupes (minimum 8 souris totales par groupe), et ne sera pas poursuivie en l’absence de différence statistiquement significative observée à 12 souris receveuses par groupe. Par ailleurs, les différentes étapes du projet seront conditionnées par les résultats obtenus dans les précédentes. Ainsi, au maximum 264 souris seront utilisées.

Raffinement

Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton), dans un portoir ventilé, dans un secteur spécifique pour les animaux immunodéprimés en animalerie EOPS avec contrôle de la température, de l'humidité, du cycle jour. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évalution sera utilisé. Des points limites sont mise en place.

Choix des espèces

La souris NSG permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines car cette souris, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans la greffe de moelle osseuse. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur la GVH et l’effet anti-leumique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 15 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

864 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines, des prélèvements de moelle osseuse et de sang sous anesthésie, des injections répétées et un gavage, puis une irradiation qui provoque une anémie d'une dizaine de jours, pour tester une molécule censée limiter les dommages sanguins des rayonnements. Les retombées annoncées, augmenter la survie de patients exposés à des doses aiguës d'irradiation, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme que le projet n'a "pas d'alternative non animale" et qualifie l'étape in vivo d'"indispensable", ces souris immunodéficientes étant présentées comme les "outils de référence" du développement sanguin humain.

Objectifs

Les chimiothérapies et radiothérapies peuvent altérer la production des cellules sanguines et immunitaires par la moelle osseuse (appelé myelosuppression). Les recherches menées depuis 2013, par une partenaire, portent sur le développement d'une molécule X1 pour l'indication de la myélosuppression induite par la chimiothérapie et par irradiation. Notre projet se base sur des données préliminaires, qui démontrent un effet positif de X1, en combinaison avec des facteurs stimulant la formation de cellules impliquées dans l'immunité anti-bactérienne et virale et dans la formation de plaquettes sanguines, améliorant ainsi la survie des animaux traités après une myélosuppression induite par irradiation. Le présent projet vise à valider si le traitement par X1 peut améliorer la récupération fonctionnelle des cellules sanguines humaines après irradiation. Cette étude nécessite d’explorer les effets de l’irradiation par des études d’efficacité sur des rongeurs dits "humanisés" (souris ayant reçu une greffe des cellules humaines) traités ou non avec X1. Ces modèles murins sont les seuls à l'heure actuelle à récapituler le développement sanguin normal humain. Notre projet a plusieurs objectifs: L'Objectif 1 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans laquelle nous allons mesurer l’effet de X1, seul ou combiné aux facteurs décrits plus haut, sur l’atténuation de la toxicité des radiations sur les cellules sanguines humaines lorsque X1 est donné à partir de 2 heures après irradiation aux souris humanisées. L'Objectif 2 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans une moelle osseuse humaine. Dans cet objectif, nous testerons l’efficacité de X1 comme dans l'objectif 1, mais cette fois dans des souris portant une niche de moelle osseuse humanisée contenant une production sanguine humaine active. L'Objectif 3 consiste en l'étude prophylaxique de X1 dans laquelle nous étudierons si X1 peut aussi être utilisé pour atténuer la toxicité des radiations sur les cellules hématopoïétiques humaines dans les modèles de souris humanisées en apportant X1 avant l'irradiation. Cette étude permettra de prédire au mieux la réponse sanguine humaine à ce nouvel agent thérapeutique.

Bénéfices attendus

1-Atténuation de la myélosuppression et des séquelles associées (infections, hémorragies) chez les patients à des doses myélosuppressives de irradiation aiguë. Par conséquent, augmenter la survie des patients exposés de manière aiguë à des doses de irradiation (syndrome aiguë de rayonnement). 2-Augmenter la survie des patients exposés de manière aigüe à des doses myélosuppressives d’irradiation. Les cytokines aident à la récupération des lignées granulocytaire et macrophagique, mais sont sources d’effets indésirables graves. De plus, elles sont très couteuses à produire. Il y a donc un besoin de développement de nouvelles contre-mesures médicales. Celles-ci devront se caractériser par leur efficacité à améliorer les séquelles post-myelosuppression induite par une irradiation, par une atténuation complémentaire ou plus large de la myélosuppression associée. Ces nouvelles contre mesures devront également avoir un profil d'innocuité et de tolérabilité, un stockage facile et pouvoir être administrées rapidement dans un scénario de pertes massives. X1 est une bio-molécule administrée par voie orale. Elle a été initialement développée pour le traitement des infections virales respiratoires et de la neutropénie induite par la chimiothérapie. Son utilisation est justifiée en tant qu'agent de radioatténuation pour le syndrome hématopoïétique d’irradiation. En effet, les lésions induites par la chimiothérapie et la radiothérapie ont des voies communes qui entraînent une myélosuppression aigüe et des lésions résiduelles de la moelle osseuse. La gravité des lésions des organes dépend de la dose de rayonnement et de la durée d'exposition. Les lésions par rayonnement sensibilisent les organes et les cellules cibles entraînant le syndrome d'irradiation aigüe (ARS). Ces dommages multiples nécessiteront probablement plus d'une seule thérapie pour atténuer et améliorer la récupération. Par conséquent, une approche polypharmaceutique est justifiée, en particulier lorsque les sujets sont exposés à des doses plus élevées d’irradiations aiguës.

Procédures

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation de cellules souches et de progéniteurs humains du sang. Ces deux actes, d’une durée inférieure à 2 minutes chacun seront réalisés sous anesthésie générale sur un tapis chauffant. Nous utiliserons du gel ophtalmique pour prévenir le déssèchement des yeux. Pour l’injection des molécules, via 2 actes en sous-cutané et un acte en intrapéritonéale, ils se feront sur animal vigile, une fois et pendant 4 semaines pour l’hormone parathyroïdienne. Cet acte prendra 1 minute. Il y aura un acte de gavage durant 4 jours sur animal vigile prenant une minute. Suite à ces prélèvements et injections/gavages, il sera ajouté de l’hydrogel et des cupules de nourritures enrichies dans les cages afin d’aider les animaux à récupérer. Les souris seront irradiées en 1 fois pendant une période d'environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation des cellules souches/progénitrices humaines du sang, pour vérifier que nos souris sont bien humanisées ce qui induira une douleur pour les souris. L’irradiation utilisée dans ce projet est subléthale mais provoque une anémie qui dure une dizaine de jours. Les souris recevront la molécule X1 par voie orale pendant 30 jours, dans le protocole thérapeutique. Le traitement en lui-même n’induit pas d’effet secondaire notable selon les expériences préliminaires réalisées par la compagnie qui produit X1. Les souris recevront transitoirement plusieurs injections de facteurs de croissance/hormonaux ce qui induit un risque d'inflammation locale temporaire ou des douleurs osseuses à courte durée.

Devenir

Afin de mesurer la récupération en cellules sanguines humaines après traitement, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire et à des tests fonctionnels in vitro. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou pas du traitement effectué après ou avant l'irradiation.

Remplacement

Ce projet n'a pas d'alternative non animale. Nous allons réaliser des expériences in vitro en parallèle, mais ces tests ne récapituleront jamais l'hétérogénéité organique des réponses in vivo, étape indispensable pour l’évaluation des effets potentiels de radio-atténuation de X1 (seul ou combiné) pour le syndrome hématopoïétique aigue lié aux radiations. En effet, notre projet nécessite une étape indispensable in vivo afin d'étudier les effets de X1 en suivant la récupération et la production hématopoïétique humaine dans un modèle préclinique capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique. Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine.

Réduction

Nous avons à coeur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Pour celà, lorsque les effets de différents traitements seront testés en utilisant la même procédure expérimentale, les expériences seront combinées et réalisées en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle (qu'il est inévitable de faire pour que le résultat soit validé). Aussi, nous avons choisi de réaliser des expériences préliminaires (objectif 1) de choisir une dose d'irradiation et une seule souche de souris, pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses inutiles. Afin d’améliorer le bien-être des souris, vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de moelle osseuse réalisé pour mesurer le niveau de reconstitution du système sanguin humain avant irradiation et traitement avec X1. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale

Choix des espèces

La souris domestique Mus Musculus est un mammifère de petite taille à l'âge adulte qui peut être facilement élevé et reproduit en captivité. De plus, la génétique et le comportement de cette souris étant parfaitement connus, cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux élevés en captivité et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Enfin, la souris reproduit de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l'homme ; les résultats des expériences réalisées chez la souris pourraient à terme améliorer l'étude des pathologies humaines ainsi que leurs thérapeutiques. Nous utilisons plus particulièrement un modèle de souris dépourvu de système immunitaire fonctionnel permettant les études sur le développement des cellules sanguines humaines normales et pathologiques.

588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'anticorps déclenchant une maladie rénale, des injections répétées et des prélèvements sanguins, dont des prélèvements dans l'orbite de l'œil que le porteur reconnaît associés à un risque de lésions oculaires. Il fixe comme points limites une perte de poids importante et des saignements urinaires, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les conditions de circulation sanguine ne peuvent être reproduites in vitro, les biopsies humaines étant rares et limitées.

Objectifs

Les vascularites humaines (maladies inflammatoires des petits vaisseaux sanguins) sont associées avec le développement de maladies rénales. Celles-ci sont induites par des anticorps dirigés contre les petits vaisseaux du rein et provoquent des lésions, de l'inflammation, de l'activation des plaquettes et le remodelage du tissue. La chronicité de cette lésion vasculaire rénale provoque une perturbation des fonctions rénales (insuffisance rénale), et peut nécessiter une greffe d'organe pour remplacer le rein défaillant. Nous avons montré récemment que l'inflammation rénale provoque la production de molécules qui stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires dans la moelle osseuse. Les objectifs de ce projet sont : 1/de comprendre quelles molécules stimulent la production de plaquettes et de cellules immunitaires au cours de la maladie. 2/ d'identifier les cellules immunitaires qui participent à l'inflammation rénale au cours de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : 1- mieux comprendre le rôle de l'inflammation dans la maladie rénale. 2- cibler l'inflammation pour prévenir le développement de la maladie rénale et améliorer la santé des patients. 3- Proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de médicaments plus spécifiques ayant moins d'effets secondaires.

Procédures

Nous effectuerons des prélèvements d'urines à l'aide d'un dispositif de collecte (pendant la nuit) permettant de ne pas changer les animaux d'environnement (adaptation à la cage), et les animaux recevront une injection de liquide contenant les anticorps dans une veine (5 minutes); cette injection se fera au niveau de la queue sur animal vigile. 3 injections dans l'abdomen seront effectuées par semaine, pendant 2 semaines (3 x 2 minutes) pour les traitements pharmacologiques. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront effectués sur une période de 3 semaines (3 prélèvements, 5 min par prélèvement). Les prélèvements seront effectués sous l'oeil . Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de chaque procédure afin d'étudier les organes d'intérêts avec différentes techniques.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien-être de l'animal. Une injection en intraveineuse de sérum contenant les anticorps qui induisent la maladie sera réalisée à la veine caudale sur animaux vigils. La collection d'urine se fera sur la nuit, pendant une période de temps restreinte (

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour une utilisation post-mortem (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les pièces opératoires (biopsies rénales) chez l’homme sont limitées en nombre et en nature (petite quantité de tissue, une seule biopsie/patient). De plus, l'étude des facteurs de croissances produits par le rein et agissant sur la moelle osseuse, et l'étude du role des cellules immunitaires pendant la maladie rénale nécessite la présence des conditions mécaniques et fluidiques caractéristiques de la circulation. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux au strict minimum, tout en garantissant l'obtention de résultats fiables, une étude statistique a permis de determiner que 12 animaux/groupe seraient necessaire pour obtenir une différence significative entre 2 groupes. Pour confirmer ces résultats, une étude cinétique sera effectuée par la suite, et nécessitera 5 animaux/groupe.

Raffinement

Pour prévenir la souffrance et détecter les points limites les animaux seront pesés et observés de façon journalière, du lundi au vendredi (suivi de poids). Si douleur avérée un analgésique sera injecté jusqu'à la disparition des signes de douleur. Ce modèle de maladie rénale est caractérisé par une perte d’appétit, une réduction de l'activité et du sang dans les urines. Les points limites que nous avons identifiés sont: une perte de poids importante, et des saignements urinaires associés à une réduction importante du nombre de globules rouges circulants. Pour prévenir l’apparition de ces signes, plusieurs approches sont en place: nourriture humidifiée dans la cage, injection de liquide pour hydrater, mesure des fonctions rénales (bandelettes urinaires) et prélèvement de sang pour évaluer le nombre de globules rouges. L'atteinte des points limites entrainera la mise à mort des animaux. Une phase d'habituation aux insert de collection d'urine sera effectuée la semaine précédant l'induction de la maladie afin de réduire le stress des animaux. Afin de réduire l'angoisse, les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie. Afin de prévenir la douleur, les prélèvements sanguins seront effectués en alternant les sites de prélèvements. Conditions d'hébergement: les animaux ont accès à la nourriture/eau ad libitum, alternance jour/nuit (12h/12h), accès à du matériel pour se nicher (coton, petite maison en plastique), litière classique, en portoir ventillé (système Techniplast). Lors de la collection d'urine, les animaux seront placés dans un système adapté aux cages d'hébergement, pendant la nuit, avec accès à de la nourriture/eau sous forme de gelée (CLEARH2O). Les animaux sont replacés dans leur environement après chaque periode de collection.

Choix des espèces

Les modèles murins de maladie rénale induits par des anticorps sont préférables aux modèles utilisant d'autres animaux dans le cas de ce projet car : - Ce modèle est déjà en place dans le laboratoire et maitrisé. -Les outils pour étudier ce modèle murin sont aussi maitrisés au laboratoire, en particulier les anticorps neutralisants et capable de supprimer les cellules immunitaires in vivo. -Nous avons montré avec ce modèle que la production de plaquettes et de cellules immunitaires contribuent au développement de la maladie rénale. Chez l'Homme, cette maladie se développe chez l'adulte, donc nous utiliserons des souris adultes.

Greffées sous la peau de cellules tumorales, les souris reçoivent une injection intrapéritonéale chaque jour pendant environ quatorze jours, trois gavages et une irradiation de leur tumeur sous anesthésie générale. 1 100 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leurs tissus. Le projet teste contre des cancers bronchiques une triple combinaison de radiothérapie, d'inhibiteur et d'immunothérapie, qui "pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers". Le porteur décrit une gêne quand la tumeur grossit et une "douleur légère et temporaire" due aux injections et aux gavages, puis affirme que les protocoles d'exposition aux agents anticancéreux "ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux".

Objectifs

Le but du projet consiste en l’étude de l’efficacité antitumorale de la radiothérapie associée à un médicament inhibiteur ainsi qu’à une immunothérapie. Le rôle de la ferroptose dans les effets observés précédemment et comment mieux exploiter cette mort cellulaire afin de potentialiser les effets de la triple combinaison de traitement. L'immunnothérapie permet d'inhiber une molécule qui induit une polarisation des lymphocytes T du microenvironnement tumoral vers un phénotype anti-inflammatoire et pro-tumoral. De récentes études montrent que l’association de la radiothérapie et d’une immunothérapie ciblant cette voie est susceptible d’améliorer la réponse antitumorale en comparaison avec l’immunothérapie seule. De plus, d’autres études ont montré que l’utilisation de cet inhibiteur combiné avec la radiothérapie, entrainait une réponse antitumorale

Bénéfices attendus

Les résultats de ces expériences pourraient, en expliquant le mécanisme d’action des interactions des traitements, ouvrir la voie à de nouveaux schémas thérapeutiques, dans lesquels la triple combinaison thérapeutique pourrait constituer un traitement de référence dans certains cancers. De plus, l’utilisation d’inducteur ou d’inhibiteur pourront nous permettre (i) d’exploiter cette mort cellulaire dont les cellules sont particulièrement dépendantes et (ii) d’élucider la proportion que représente la ferroptose dans les effets observés en réponse à notre triple combinaison de traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée (anesthésie locale) de cellules tumorales, à des injections intrapéritonéales quotidienne (anesthésie locale) durant environ 14 jours ainsi qu'à trois gavages lors des différentes procédures. Pour finir les souris subiront également sous anésthésie générale une irradiation localisée de la tumeur.

Impact sur les animaux

Le developpement de tumeurs sous-cutané chez la souris peut entrainer une gêne chez ces dernières lorsque la tumeur sous-cutané va grossir. De plus, les diférentes injections sous-cutanées, intra-péritonéales ainsi que les gavages sont suscetibles d'entrainer chez l'animal un stress du a la manipulation de l'animal et aux différents traitements appliqués ainsi qu'une douleur légère et temporaire. Il en est de même pour l'irradiation des tumeurs des souris qui va déclencher un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédures, pour examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est indispensable car les interactions au sein du microenvironnement immunitaire tumoral est au centre des effets de la triple combinaison, impliquant des composantes cellulaires et moléculaires impossibles à reproduire actuellement dans des modèles ex-vivo. Nous allons donc procéder à des expériences in vivo utilisant des modèles murins, mais aussi des expériences in vitro complémentaires en utilisant le modèle de culture d’organoïdes murins.

Réduction

Pour chaque point expérimental nous utiliserons le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous comptons utiliser 4 lignées cellulaires tumorales (génétiquement modifié pour les différentes voies de signalisation étudiées). Le nombre mnimal d'animaux, nécessaire et suffisant, a été déterminé grâce à un calcul de puissance.

Raffinement

Les animaux seront élevés en groupe, avec un équipement et des conditions sanitaires adéquates. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel. Les animaux seront en groupes sociaux de 5. Les protocoles d’exposition aux agents anticancéreux ont déjà été utilisés chez les souris et ne donnent pas lieu à des manifestations de gêne ou de douleur chez les animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, ils recevront un antiinflammatoire non stéroïdien ou un analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Dans ce type de combinaison thérapeutique, le recours à l’utilisation d’un modèle animal (organisme vivant entier), est indispensable car les interactions entre radiothérapie et immunothérapie au sein d’une tumeur obéissent à des processus cellulaires complexes impliquant de multiples voies immunitaires et métaboliques impossibles à reproduire in-vitro.