Recherche appliquée

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une restriction alimentaire destinée à les motiver, des tests d'impulsivité de choix, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des prélèvements sanguins sur animal vigile, pour évaluer trois candidats médicaments. Le porteur décrit un design où chaque rat est son propre témoin et teste les trois composés, présenté comme une réduction du nombre d'animaux. Il rattache le projet à une phase préclinique, une entrée en clinique restant conditionnée à des résultats positifs.

Objectifs

La prise de décision fait partie intégrante de notre quotidien. Un déficit connu de la prise de décision se traduit par des troubles de l'impulsivité. Cette dernière se traduit par une impossibilité à retarder le début d'une action, qui commencera donc de manière prématurée, c'est alors une impulsivité d'action. Il existe également une autre forme d'impulsivité, appelée impulsivité de choix. Il existe différentes tâches comportementales pour étudier cette forme d'impulsivité. Dans ces tâches, les animaux doivent choisir entre 2 ou plusieurs options ayant des rapports coûts/bénéfices différents. Dans ce projet, nous souhaitons tester l'effet potentiel modulateur de 3 candidats médicaments sur l'impulsivité de choix chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégrè dans la phase pré-clinique du développement de candidat médicaments. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments retenus pourront, à terme, entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ainsi qu'a des injections intrapéritonéales 2 fois par semaine. Les tests comportementaux seront rapides et se dérouleront pendant 4 semaines. A la suite des injections des candidats médicaments, les animaux, vigiles, seront également soumis à un prélèvement sanguin. De plus, à la fin de chaque protocole, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Le traitement bi hebdomadaire des animaux par injection intrapéritonéale peut induire un stress, particulièrement lors des 1ères administrations. Ces injections peuvent également indurie une légère douleur. De plus, les tests comportementaux peuvent induire une nuisance chez les animaux, notamment à cause de la restriction alimentaire afin d'augmenter leur motivation à réaliser la tâche. Enfin les prélèvements sanguins, bien que réalisés par du personnel compétent et entrainé, pourront aussi entrainer une douleur légère chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

Les processus physiopathologiques de l'impulsivité impliquent l'interaction de différentes structures cérébrales. Les composés médicaments sont supposés agir sur des structures cérébrales précises. Ce degrè de compléxité et la validation du site d'action ne peuvent être atteints qu'avec un modèle animal. Le rat possèdant un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité, est donc un bon modèle pour notre sujet d'étude. De plus, les 1ères phases de validation des composés, de leur non toxicité ont été réalisées au sein du laboratoire de notre partenaire.

Réduction

En se basant sur la littérature scientifique et sur l'expertise de notre équipe en terme d'études comportementales, le nombre de rats (n=24 par expérience, n=8 par sous-groupe) a été optimisé afin d'avoir un groupe d'animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le design expérimental choisi permet de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque chaque rat sera son propre contrôle et testera les 3 candidats médicaments. Les 3 sous-groupes correspondent chacun à un ordre d'administration des candidats médicaments différents, afin d'éviter tout biais d'ordre. De plus, nous avons choisi de réaliser des tests statistiques de type régression linéaire multiple pour nos sorties comportementales de type temps de réaction, temps de mouvement (variable réponse numérique continu) ,ou de type modèle linéaire généralisé pour les paramètres comportementaux type nombre d'appui sur le levier, de réponses prématurées, d'entrée dans la mangeoire (variable réponse de type comptage) afin d'avoir une puissance statistique plus important et donc de pouvoir réduire notre nombre d'animaux.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs (par manipulation quotidienne) avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. De plus, des stratégies d'analgésie et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (poids) seront mis en place afin de veiller au mieux au bien-être des animaux durant toute la durée du projet. Une grille de score pour le suivi du bien-être des animaux sera utilisée pour surveiller au mieux les animaux et prendre les décision les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Dans le cas où les animaux atteindraient des points limites définis ou si le traitement analgésique n'était pas efficace, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le rat possède un système cérébral complexe, présentant des similitudes avec le système nerveux humain, en particulier dans le domaine de la prise de décision et de l'impulsivité. De nombreuses études ont déja été menées en neurosciences dans ce domaine là utilisant des modèles rongeurs. De plus, de part l'expertise de notre équipe, nous sommes en mesure de développer un modèle d'impulsivité fiable chez cette espèce. Nous disposons également de tout le matériel nécessaires à la manipulation et aux soins de ce type de rongeur. Nous utiliserons des rats jeunes adultes pour ce projet. Les animaux seront commandés à environ 10 semaines d'âge. Cet age correspond à l'age classiquement utilisé dans les études qui nous interessent et correspond à un stade de développement cérébral permettant de répondre à notre problématique scientifique. Après leur arrivée, les animaux auront 1 semaine d'acclimation. Ainsi, les rats auront 11 semaines au début des tests.

54 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une implantation sous-cutanée de gel sous anesthésie puis jusqu'à 35 séances d'imagerie sous anesthésie en 28 jours, pour suivre la libération d'un anticorps et la dégradation du gel. Le porteur indique que l'accumulation de contentions, d'anesthésies et d'injections entraîne une nuisance globale modérée. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace le modèle animal pour reproduire la complexité de l'environnement sous-cutané, l'objectif restant une preuve de concept à visée de confort des patients.

Objectifs

L'utilisation pharmaceutique de protéines thérapeutiques telles que les anticorps a augmenté au cours des dernières années. Ces actifs sont principalement administrés par voie intraveineuse (i.v.) conduisant fréquemment à une élimination trop rapide. Ceci entraine le besoin d’administrations régulières qui limitent la qualité de vie des patients et augmentent le coût global des traitements. Ces dernières années, l'administration sous-cutanée (SC) a attiré beaucoup d’attention car elle présente de nombreux avantages. Elle est en effet plus pratique, plus rapide, plus économique et plus facile à administrer que l'administration intraveineuse (i.v.). D’autre part, afin de limiter le nombre d’administrations, les efforts se sont tournés vers le développement de formulations permettant la libération prolongée des actifs thérapeutiques. Au cours des dernières décennies, les gels injectables sont apparus comme des matériaux prometteurs offrant une capacité de chargement élevée d'une large gamme d'agents thérapeutiques. Différents gels ont été développés dans la littérature mais certains présentent des limites. Il existe donc toujours un besoin de développer de nouveaux systèmes de délivrance de protéines thérapeutiques. Nous avons récemment formulé une famille de gels qui peut être chargé avec différents actifs thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’établir une preuve de concept de l’intérêt de ces gels pour la délivrance prolongée d’anticorps après administration sous-cutanée. Le but est d’évaluer sur souris saine la biodégradation des gels après implantation ainsi que la libération prolongée de l’anticorps par imagerie en fluorescence.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’établir une preuve de concept de l’intérêt des gels développés et de sélectionner des formulations prometteuses pour une libération contrôlée et prolongée d’un anticorps thérapeutique. L’objectif à long terme de ce projet est de proposer un système de délivrance de protéines thérapeutiques implantable en sous-cutané afin d’améliorer le confort de vie des patients tout en réduisant le coût global des traitements.

Procédures

Contention lors des déplacements (

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir plusieurs gestes tel que des contentions, des anesthésies, des injections sous-cutanées qui vont engendrer des douleurs et du stress et dont l’accumulation entraînera une nuisance globale modérée sur les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour permettre des analyses ex vivo nécessaires.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Des études in vitro ont déjà été réalisées mais ne permettent pas de reproduire toutes les conditions représentant la complexité d'un environnement sous-cutané. Le modèle animal est donc nécessaire pour évaluer la libération sous-cutanée des actifs piégés dans les gels ainsi que la biodistribution des gels dans le temps. Ces études auront lieu uniquement sur souris saines.

Réduction

L’emploi d'un système d'imagerie du petit animal permet un suivi dans le temps pour chaque animal et permet ainsi de réduire le nombre d’animal pour le projet. Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe pour maintenir une interaction entre individus dans des cages enrichies. Les souris ont accès librement à la nourriture et à l'eau. Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur le stress et la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance et stress animal. Les imageries , administrations sous-cutanée et la mise à mort sont réalisées sous anesthésie pour réduire le stress. Après administration : suivi quotidien des animaux, avec mesure du poids lors des séances d’imagerie afin de minimiser le stress et la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec des souris pour lesquelles de nombreux protocoles sont bien établis et pour lesquelles, des études concernant l’administration d’hydrogels ou d’anticorps ont été décrites. Les souris utilisées n'auront pas de pelage qui interfèrerait avec les mesures d’imagerie optique in vivo. Seules des souris femelles (9-11 semaine en début de procédure) seront utilisées dans cette étude.

12 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, déclarés aptes puis proposés à l'adoption via une association. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale de cages sous-cutanées sur les flancs, puis leur retrait, et deux à trois prélèvements sanguins, pour tester l'action de bactériophages contre le biofilm staphylococcique. Le porteur présente ce modèle comme une réduction du nombre d'animaux, chaque lapin permettant d'évaluer jusqu'à 36 conditions ex vivo. Il décrit ces premiers résultats comme un préalable à de futurs essais thérapeutiques, dont l'application clinique reste hypothétique.

Objectifs

La recherche d’alternatives thérapeutiques dans le domaine des antibactériens constitue un enjeu majeur de santé publique et a été identifiée comme une priorité, aussi bien au niveau national, qu’international. Les bactériophages sont des virus ciblant spécifiquement les bactéries. S’ils peuvent représenter un support de transfert de matériel génétique (résistance, virulence) via leur cycle lysogénique, leur cycle lytique permet d’envisager leur utilisation en thérapeutique. La phagothérapie représente ainsi une alternative innovante à l’antibiothérapie dans le traitement des infections bactériennes, à l’ère de la diffusion de l’antibiorésistance.

Bénéfices attendus

La description de l’activité anti-biofilm des bactériophages est un prérequis important pour leur utilisation en thérapeutique humaine. Les modèles in vitro actuellement utilisés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm sont soumis à de nombreuses variations liées aux conditions de culture utilisées, justifiant l’utilisation d’un modèle animal. De plus, le modèle proposé permet, à l’inverse des autres modèles animaux développés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm des antibiotiques, d’évaluer un grand nombre de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux. Ce projet représentera la première description de l’activité anti-biofilm des bactériophages sur du biofilm formé in vivo, et son caractère concentration et temps dépendant. Ces résultats serviront de base aux choix à des modélisation pharmacocinétiques qui permettront de choisir les posologies et rythmes d’administration à adopter en thérapeutique locale ou systémique. Ces dernières seront validées secondairement dans ce même modèle par injection locale ou systémique de phages, seuls ou en association à des antibiotiques, dans un futur projet. Ces premières données serviront de rationnel et permettront de designer les futurs essais thérapeutiques prévus dans un projet plus global.

Procédures

Chaque animal aura 2 (minimum) ou 3 (maximum) prélèvement de sang. Le prélèvement est effectué après application d’un anesthésique local et dure moins d’une minute. Le temps chirurgical n’excédera pas 30 minutes par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour la mise en place des cages, 5 minutes pour les fixer et 5 minutes pour la fermeture des incisions) et conciste en l'implantation, puis plus tard le retrait d'implants (cages) insérés sur chaque flanc par le biais de 3 incisions cutanées de 1 cm de long réalisées en zone dorsale médiane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels sont : - i) locaux : troubles cicatriciels, formation d’abcès ; et - ii) généraux : généralisation de l’infection, avec bactériémie. A noter que le modèle est basé sur l’inoculum minimal efficace pour lequel les résultats préliminaires soulignent l’absence d’effets secondaires locaux et gébéraux. Les tensions cicatricielles potentiellement occasionnées par les implants seront réduites par le recours à un nouveau design plus adapté de section ovalaire. La gêne occasionnée devrait être réduite. Selon notre expérience, aucune infection systémique n’a été constatée lors de la validation du modèle tant sur le plan clinique que microbiologiques (hémocultures régulièrement prélevées).

Devenir

Les animaux qui seront déclarés aptes par le vétérinaire seront mis à l’adoption à l’aide d’une association.

Remplacement

Si les méthodes statiques et dynamiques d’évaluation de la formation, la structure et la composition du biofilm développées in vitro ont permis des avancées considérables dans la compréhension de la physiologie du biofilm, leur analyse comparative montre une importante hétérogénéité dans les résultats obtenus dépendant de la phase de croissance bactérienne, des milieux de culture utilisés et de leurs éventuelles supplémentations en glucose et/ou plasma, du type de matériel, des durées d’incubation, des étapes de lavage et de coloration, etc. Au-delà de ces considérations techniques, le rôle de l’environnement lié à l’hôte est maintenant bien reconnu (insuline, hormones stéroïdes, vitamines, etc.). En conséquence, les évaluations in vitro de l’activité anti-biofilm des antimicrobiens donnent souvent des résultats contradictoires. Des modèles animaux ont été implémentés pour palier à cette variabilité, tous basés sur l’implantation et l’infection de divers matériaux, le traitement des animaux avec les molécules testées avant l’ablation du matériel pour évaluation du biofilm résiduel. Toutefois, ces techniques longues et coûteuses ne permettent l’évaluation que d’un nombre limité de conditions (molécules, concentrations) et dans des conditions parfois éloignées de la pathologie étudiée. Nous proposons ici d’évaluer l’efficacité des bactériophages sélectionnés sur un modèle lapin d’implantation de cages sous-cutanées permettant, avec un nombre limité d’animaux, le screening ex vivo nombreuses conditions (phages, concentrations) sur du biofilm formé in vivo.

Réduction

L’ensemble des techniques utilisées ont été validées in vitro au préalable. Par ailleurs, le modèle utilisé représente en soit un modèle de réduction du nombre d’animaux nécessaire à l’étude du biofilm par rapports aux méthodes existantes in vitro ou in vivo, le système d’implantation de cages/billes permettant d’évaluer, à partir d’un seul animal, 36 conditions ex vivo : - limitation du nombre de conditions : l’évaluation des CMEB (Concentration Minimal Eradicatrice du Biofilm) nécessite l’utilisation de l’ensemble des phages seuls ou en combinaisons, puisqu’il s’agit de l’objectif principal. En revanche, l’évaluation de l’impact du temps de contact entre phages et billes ne sera réalisée que sur 3 conditions selon les résultats des CMEB, et avec seulement 3 concentrations afin de limiter le nombre total d’animaux nécessaires Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum nécessaire pour atteindre les standards scientifiques nécessaires à l’interprétation des résultats, incluant 6 réplicas pour les comptes bactériens. Ce nombre de réplicas est le nombre habituellement nécessaire dans les modèles expérimentaux en microbiologie pour assurer la fiabilité et reproductibilité des résultats observés.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d’identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle tout au long du projet sera implantée sous la peau. L’animal sera habitué au passage du lecteur mais aussi au pyjama pour protéger les cages et les cicatrices afin de faciliter le suivi post-opératoire. Après 3 semaines d’acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères, l’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Un renfort de protection avec une compresse et une couche de coton cardé réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaire et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaire seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Suite au précédent projet, une nouvelle forme de cage imprimées en 3D de section ovalaire pour limiter les tractions cicatricielles sera utilisée par rapport au modèle princeps.

Choix des espèces

Le choix du lapin repose sur un rationnel technique et biologique, en comparaison aux alternatives possiblement envisageables : - le modèle lapin est utilisé depuis le début du 20ème siècle pour l’étude des infections staphylococciques du fait de sa sensibilité à ces infections et à la reproduction d’infections proches de celles observées chez l’homme ; - la taille d’une souris ne permettant l’implantation que d’une seule cage par animal, le modèle perdrait l’intérêt de pouvoir évaluer un large panel de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux ; - le rat présente une sensibilité 100 fois moindre aux infections staphylococciques, nécessitant l’utilisation d’inoculum très élevés (et donc non pertinents cliniquement) sous peine d’une clairance spontanée de l’infection par la plupart des animaux Les animaux arriveront à 2,5 kg environ pour atteindre 3-3,5 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’un système immunitaire mature, et d’une taille permettant l’implantation de 6 cages par animal.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent deux tests de comportement mesurant la préférence et la reconnaissance sociales, à quatre mois puis à vingt mois après un isolement d'une semaine avant chaque test, puis sont tuées avec ou sans prélèvement d'organes. L'objectif est de savoir si la délétion d'un gène dans les cellules immunitaires du cerveau reproduit des troubles proches de la démence associée à la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur affirme que l'effet sur le comportement ne peut s'observer que chez l'animal et justifie le vieillissement de la cohorte par le lien de la maladie avec l'âge.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Tandis que la plupart des cas de SLA sont sporadiques, certaines formes sont familiales. Certains cas de SLA peuvent aussi être associés à une Démence Fronto-Temporale (DFT), On appelle ce syndrome SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Les formes génétiques de SLA (et SLA-DFT) sont cruciales pour la recherche car elles permettent de modéliser la maladie. Récemment, des mutations dans un nouveau gène ont été impliquées dans la SLA-DFT. Nous étudions le rôle de ce gène dans différents types de cellules du cerveau. Le but est de savoir si la déficience de ce gène peut changer le comportement des souris, en termes de défaut de mémoire ou d'interaction social, ce qui est lié aux symptômes de la DFT dans le syndrome SLA-DFT.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de notre gène d'intérêt, dans différents types de cellules du cerveau. Ceci est cliniquement important car des mutations dans ce gène peuvent causer la sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT) - donc, SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Si nous montrons que la perte de ce gène dans différents types de cellules du cerveau peut induire des anomalies du comportement, cela aiderait à expliquer pourquoi et comment des mutations dans ce gène peuvent causer la SLA-DFT.

Procédures

Des souris d'une lignée transgénique d’intérêt et des souris contrôlés (non-transgéniques), subiront 2 tests de comportement consécutifs, une fois à 4 mois (jeune), et, 16 mois plus tard, une fois à 20 mois (âgées). Le premier test nécessite 25 minutes par souris et le deuxième nécessite 5 minutes par souris. Les deux tests sont faits sur deux jours consécutifs. Ces 2 tests de comportement ne produisent pas de douleurs et sont réalisés sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements. Ces tests permettent d’évaluer la préférence sociale ainsi que la reconnaissance sociale. A la fin de la procédure (des 2 tests de comportement à l'âge vieille et/ou jeune), toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Impact sur les animaux

Pour les tests de comportements : Car l'animal à tester doit être isolé pendant une semaine avant ce type de test, cet isolement pourrait produire un stress. Aussi, avec ce type de test il y a un risque d'agression entre les animaux à testés, et ces tests de comportement peuvent eux-mêmes induire un stress/angoisse chez l'animal. Le vieillissement de la cohorte peut aussi augmenter le risque de pathologies générales liées à l'âge. A l’issue de la période de maintien, les animaux pourront subir deux types d’euthanasies réglementaires dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes.

Devenir

Parce qu’il s'agit d'une étude comportementale, les résultats des tests comportementaux sont collectés tout au long de la procédure. Toutes les souris sont donc utilisées pour ces tests de comportement. A la fin de la procédure, toutes les souris sont euthanasiées, avec différentes méthodes d’euthanasies réglementaires utilisées selon le type d’analyses à réaliser à posteriori (avec ou sans prélèvement d'organes).

Remplacement

Avant de réaliser les expériences in vivo que nous proposons dans ce protocole, nous avons mené des études in vitro, pour tester si notre hypothèse est solide. Nous avons utilisé des cultures primaires de cellules microgliales (isolées de cerveaux de souris nouveau nées), avec une délétion du gène d’intérêt, pour tester si les fonctions normales des cellules microgliales sont défectueuses (la prolifération et activation après stimulation, la phagocytose). Nos résultats étant prometteurs, nous nous sommes demandé si cela pourrait entrainer un phénotype comportemental subtil in vivo. Même si on peut modéliser certaines interactions pathologiques entre cellules microgliales et cellules neuronales in vitro, déterminer un effet sur le comportement est seulement possible dans un animal.

Réduction

Nous avons déterminé notre stratégie de croisement afin de produire le moins possible de génotypes non intéressants. Cependant, cette stratégie est nécessaire pour que tous les génotypes étudiés soient générés dans la même portée. Pour les deux tests de comportement, nous avons besoin de 15 souris par génotype (avec 3 génotypes) et par sexe. Il s’agit du nombre minimal de souris nécessaire pour évaluer un modificateur génétique sur le comportement - défini par des consignes internationales de la communauté de la recherche contre la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc, ALS-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale). Pour tout test de comportement, les deux sexes sont nécessaires. En plus, car la SLA et la SLA-DFT sont liées à l'âge (l’âge est un facteur de risque majeur), nous allons réaliser ces tests sur des souris jeunes (4 mois) et des souris âgées (20 mois). Comme les deux différents tests de comportement ne produisent qu'un stress mineur sur les souris, nous ré-utiliserons les mêmes souris pour ces deux tests consécutifs pour en utiliser le moins d'animaux possible. En plus, afin de réduire le nombre de souris utilisées, nous ferons vieillir la cohorte jeune (4 mois) pendant 16 mois pour obtenir la cohorte âgée (20 mois). Donc, 120 souris transgéniques (sans phénotype) sont nécessaires, plus des souris de contrôles non-transgéniques (90). Le nombre TOTAL d'animaux utilisés : 210

Raffinement

(Hébergement) Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton, et des fibres en carton, permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles sont hébergées ensembles (au moins 2 par cage, maximum 6), et les mâles sont hébergés entre fratrie autant que possible avant les expériences, mais peuvent être séparés en cas de bagarre. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. (Présence de points limites) L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent. Toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance (plaies, ulcères, tumeurs, fractures etc.), est considérée comme un point limite, et la souris sera euthanasiée. (Tests de comportements) Une surveillance particulière des animaux testés sera faite durant la semaine suivant les tests comportementaux. Pendant l'isolation nécessaire d'une semaine avant les tests de comportementaux, la stimulation environnementale reste présente (maison et fibres en carton), mais est renforcé en ajoutant aussi des carrés de coton compact (pour faire des nids). En cas de stress trop important suivant un test (souris prostrée, ne se déplaçant plus), l’individu sera euthanasié. Le test sera aussi suspendu en cas de comportement agressif. En cas de blessure, l’individu sera euthanasié. (Euthanasie pour prélèvement d'organes) A la fin de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés. Deux types d’euthanasies réglementaires sont utilisées, dont l’une est précédée d’une anesthésie générale nécessaire pour la réalisation des prélèvements d’organes. Le seul risque dans ce cas (défini comme un point limite), est le réveil pendant la chirurgie, mais c'est très peu probable en vue de l'anesthésie profonde (surdose d'anesthésique).

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), et la SLA avec en plus des symptômes de Démence Fronto-Temporale (DFT), donc SLA-DFT (Sclérose Latérale Amyotrophique avec une Démence Fronto-Temporale): souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre neurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bon modèle pour répondre à nos questions. Les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis chez la souris. Il existe également de solides données dans la littérature qui ont montré que la microglie peut influencer le comportement chez la souris. De plus, des souris ont été utilisées avec succès pour modéliser les phénotypes moteurs de SLA-DFT. Par conséquent, nous pensons que la souris est le bon modèle pour notre question de l'effet de la modulation des microglies sur les défauts de comportements liée à la SLA-DFT. Les souris sont utilisées à l'âge jeune (à 4 mois) et à l'âge vieille (à 20 mois).

11 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée puis deux à trois injections d'un candidat vaccin, subissent plusieurs prélèvements de sang à l'oreille en cage de contention, et terminent par une ponction intracardiaque sous anesthésie pour recueillir un maximum de sérum. L'objectif est de mesurer la production d'anticorps selon le protocole d'administration, ces anticorps étant ensuite injectés à des souris. Le porteur affirme qu'il n'est pas encore possible de se passer de l'animal pour produire des anticorps, et présente la lapine comme un modèle de choix pour son volume sanguin.

Objectifs

S’appuyant sur les données communiquées par 87 pays en 2020, un nouveau rapport de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) met en évidence des niveaux élevés de résistance des bactéries aux antibiotiques (supérieurs à 50 %), en particulier chez des bactéries fréquemment retrouvées en milieu hospitalier, comme Klebsiella pneumoniae et Acinetobacter baumannii, responsables de septicémie. Le traitement de ces infections requiert obligatoirement l’utilisation d’antibiotiques de dernière ligne, tels que les carbapénèmes. Cependant, 8% (jusqu’à 50% dans certains pays) des souches de Klebsiella pneumoniae responsables d’infections sanguines sont résistantes à ces mêmes carbapénèmes, ce qui augmente notoirement le risque de décès imputables à ces infections. D’autres alternatives, en particulier vaccinales, sont actuellement à l’étude. Un candidat vaccin, basé sur des cellules d’Acinetobacter baumannii inactivées et génétiquement modifiées pour exprimer des protéines de surface de Klebsiella pneumoniae (OMPs), a déjà montré une protection significative dans un modèle d’infection à Klebsiella pneumoniae chez la souris. Une précédente étude a également testé la production d’anticorps chez le lapin en réponse à l’administration de ce candidat vaccin. L’objectif du présent projet est de poursuivre l’étude de ce vaccin chez le lapin afin d’analyser la variabilité de réponse à son administration chez cette espèce animale et de tester des protocoles d’administration différents.

Bénéfices attendus

Après la mise en évidence de l’efficacité du candidat vaccin chez la souris, et de sa capacité à entrainer la production d’anticorps chez la lapine ce projet vise à déterminer le meilleur protocole d’administration et à évaluer la variabilité de réponse à son administration. Les anticorps collectés à la fin de l’expérience seront ensuite administrés chez la souris pour réaliser une vaccination dite passive. L’efficacité de cette vaccination permettra d’en apprendre davantage sur les mécanismes immunitaires déclenchés par l’administration de ces bactéries atténuées chez la lapine et sur leur potentiel en tant que vaccin. A terme, l’idée est de pouvoir favoriser la vaccination de populations à risque, en l’absence de traitement antibiotiques efficaces.

Procédures

Les animaux vont être soumis à différentes interventions : - Mise en place d’une puce de température en sous cutanée à J-1 sur animal vigile - 3 secondes par puce - 3 Injections intramusculaires du candidat vaccin à J0, J28 +/- J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) sur animal vigile - 3 secondes par injection - 3 à 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14 et J28 +/- J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - 5 minutes de maintien en cage de contention par prélèvement - 1 anesthésie générale (3 secondes) suivie d’une ponction intracardiaque (2 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur légère : - Mise en place d’une puce de température en sous-cutané à J-1 - La mise en place de la puce est réalisée à l’aide d’une seringue prévue à cet effet et ne dure pas plus de 3 secondes. Aucune contention particulière n’est requise et d’après notre expérience aucune gêne n’est ressentie par l’animal lors de la pose ni après la mise en place de la puce. - 2 à 3 injections intramusculaire à J0, J28 +/- J56 (en alternant la cuisse droite et la cuisse gauche) - Le candidat vaccin ainsi que l’adjuvant ont déjà été testés chez la souris et le lapin et n’ont montré aucun signe de toxicité. - 3 à 5 prélèvements sanguins à l’oreille à J0, J14, J28 +/- J42 et J56 (en alternant l’oreille droite et l’oreille gauche) sur animal vigile en cage de contention - Les animaux seront familiarisés à la cage de contention au cours de 3 séances d’habituation réalisées avant le début de l’expérience. - 1 anesthésie générale par injection intramusculaire suivi d’une ponction intracardiaque. - La ponction intracardiaque étant réalisée sous anesthésie générale, elle ne sera associée à aucune douleur particulière.

Devenir

Les 11 animaux du projet seront mis à mort à l’issue des 42 ou 70 jours d’expérience ou plus précocement s’ils montrent des signes de souffrance. Avant la mise à mort, une ponction intracardiaque sera réalisée sur l’ensemble des animaux afin de récupérer un maximum de sang (ainsi de sérum) final afin de doser la quantité d’anticorps produit tout au long de l’étude.

Remplacement

La production d’anticorps polyclonaux est un mécanisme complexe basé sur l’interaction entre plusieurs types de cellules immunitaires. La première étape indispensable à cette production est l’immunisation chez l’animal. Il n’est pas encore possible aujourd’hui de se passer du modèle animal pour la production d’anticorps.

Réduction

Cette étude a été construite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé. Seuls 3 groupes seront comparés et ces groupes contiendront au maximum 5 animaux. Le groupe control (sans vaccin) sera composé de seulement 3 animaux tout comme le groupe recevant 2 administrations de vaccin qui servira à déterminer si seulement 2 administrations peuvent être suffisantes à la production d’anticorps. Le groupe recevant 3 administrations de vaccin nécessitera 5 animaux afin d’évaluer la variabilité de la réponse au vaccin. Ce nombre d’animaux (11 au total) permettra également de récupérer suffisamment d’anticorps pour de futures expériences d’immunisation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Ils seront suivis 2 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Un suivi accru sera réalisé durant les 6h suivant les administrations du candidat vaccin et la fréquence de surveillance sera augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux. Le suivi de la température sera effectué grâce à une puce placée en sous cutané ce qui évitera l’utilisation d’un thermomètre rectal souvent stressante pour l’animal. L’administration du candidat vaccin n’est pas censée entrainer d’effet indésirable. Cependant des critères d’interruption de l’étude, supportés par une grille de score de douleur, ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance.

Choix des espèces

La lapine est un modèle de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. En effet sa taille moyenne implique un volume sanguin important et donc un plus grand potentiel de récupération d’anticorps que pour la souris par exemple. Les lapines de cette étude seront âgées de 3 mois de façon à avoir une maturité immunitaire suffisante.

31 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale d'un composé, pour douze d'entre elles une prodrogue par voie intraveineuse et un prélèvement de sang à la jugulaire, puis jusqu'à quatre séances d'imagerie sous anesthésie avant la mise à mort et le prélèvement des organes. L'objectif est de vérifier que deux produits se concentrent bien dans la tumeur, une étape de pharmacocinétique préalable au test de leur effet anticancéreux dans d'autres travaux. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut pas être prédite in vitro, faute de circulation sanguine et de système excréteur.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer et de comparer les propriétés pharmacocinétiques des nouveaux agents thérapeutiques dans le domaine de l'oncologie préclinique. Ces agents se composent de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=12 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsque les tumeurs auront atteint la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de tests statistiques. Cela donne un total de 24 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus (taille homogène des tumeurs), 7 animaux résiduels seront également ajoutés pour un total final de n=31 souris.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux pour lesquels le volume de la tumeur n’excède pas 1000-1200 mm3 (plus rarement, il est toutefois possible d’inclure des animaux dont le volume de la tumeur est supérieur à 1000-1200 mm3, mais sans dépassement de point limite). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.