Recherche appliquée

12 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre plaies cutanées sont créées sur chaque animal sous anesthésie, avec des changements de pansement tous les deux jours sous anesthésie et un écouvillonnage répété, avant la mise à mort pour prélever le tissu cicatriciel. Le projet compare le pouvoir cicatrisant de trois miels régionaux de La Réunion, et le porteur suit la douleur au moyen de la Rat Grimace Scale. Il indique avoir déjà mené des tests in vitro et ex vivo sur explants de peau mais affirme "avoir besoin" d'un animal vivant pour étudier la cicatrisation dans son ensemble.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’amélioration du processus de cicatrisation par l’usage de miels de production régionale en application locale sur un modèle de plaies cutanée sur des rats Wistar. Le processus de cicatrisation comporte 4 étapes en condition physiologique : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage. Ces étapes se succèdent grâce aux recrutements des cellules immunitaires et la migration de cellules résidentes qui vont sécréter des facteurs permettant d’aboutir à la complète réparation de la lésion cutanée. En situation pathologique, ce processus peut être altéré (infection, maladie métabolique, irradiation…) et entrainer un retard de la cicatrisation et/ou une cicatrisation de moins bonne qualité, avec un risque de réouverture récurrente des plaies qui deviennent alors chroniques. Il est donc important d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’utilisation de ressources naturelles ayant des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-microbiennes. A ce titre les miels très utilisés en médecine traditionnelle pour leur potentiel cicatrisant présentent un intérêt croissant. Cependant il manque encore des données scientifiques pour étayer cela. Dans ce projet, les propriétés cicatrisantes de 3 miels appliqués localement ; avec une composition, des propriétés physico-chimiques et biologiques différentes en comparaison à un sucre analogue, à un miel commercial de référence et à un contrôle sans traitement (miel remplacé par de la vaseline) ; seront évaluées sur un modèle de plaies cutanées sur rat Wistar. Dans un premier temps, nous souhaitons évaluer les propriétés cicatrisantes des miels sur des plaies aigües en condition non pathologique. Nous pourrons ainsi étudier d’une part la potentielle amélioration de la qualité de la cicatrisation (composition du tissu cicatriciel, force, tension, contraction et résistance) et d’autre part la possible accélération du processus de cicatrisation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent principalement la santé humaine et vétérinaire. Les données scientifiques feront l’objet de publications dans des journaux internationaux permettant ainsi une valorisation de la biodiversité locale. De plus, cette étude participe au développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique innovante, dans les cas de plaies chroniques retrouvées dans le cadre de complications associées à des pathologies comme l’obésité et le diabète, qui constitutent de véritables problèmes de santé publique sur le territoire réunionnais.

Procédures

Les différentes interventions réalisées sur les 12 rats de l'étude sont les suivantes : - Procédure chirurgicale sous anesthésie générale volatile (30 min) - Changement de pansement (tous les deux jours) sous anesthésie générale volatile (15 min) avec écouvillonnage des plaies (à J0, J+10, J+20) - Mise à mort des 12 rats à la fin de l'étude sous anesthésie générale volatile

Impact sur les animaux

Les principales nuisances sont celles imputables à la chirurgie à savoir : anesthésie, injections, réalisation des plaies, stress et douleurs. Le suivi des plaies se faisant tous les deux jours sous anesthésie, peut engendrer un stress lié à l’endormissement et au réveil de l’animal. De plus, le positionnement des pansements peut constituer une gène (risque de retrait du pansement, difficultés à se mouvoir). L’isolement des rats en cas d’atteintes de points limites peut également constituer une source de stress.

Devenir

Mise à mort pour récupération du tissu cicatriciel et analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

Des tests préliminaires in vitro de cytotoxicité ont été réalisés préalablement sur un modèle de cellules épithéliales humaines de la peau, afin d’extrapoler la concentration de miel à utiliser sur notre modèle animal. De même, les propriétés anti-inflammatoires et l’impact des miels sur la capacité de migration des cellules ont été évaluées in vitro. Par ailleurs, le potentiel anti-microbien des miels a été démontré sur des micro-organismes fréquemment retrouvés dans les plaies. Pour compléter cela et affiner les critères de séléction des miels, une étude ex vivo a été menée sur des explants de peau de rats, permettant de discriminer trois miels au potentiel cicatrisant remarquable. Afin de répondre à notre objectif scientifique, nous avons besoin d’évaluer les propriétés des miels sur un modèle animal vivant pour étudier le processus cicatriciel dans son ensemble, notamment des phases telles que l’angiogénèse et la réinnervation, avec les contraintes que peut subir la peau au quotidien à savoir étirement, relâchement, inflammation locale.

Réduction

Nous avons pu réduire le nombre de rats grâce à une revue systématique bibliographique et à l’utilisation de l’outil statistique R. De plus, la taille des plaies induites de 6 mm, ainsi que la taille des rats, permettront de réaliser 4 plaies par animal. Enfin, les analyses biochimiques et histologiques pourront être réalisées sur les mêmes plaies permettant de réduire encore le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre protocole a été optimisé afin de minimiser au maximum les contraintes subies par les animaux. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie avec une couverture analgésique en respectant strictement les règles d’asepsie. Le matériel chirurgical utilisé sera rigoureusement stérilisé au préalable. Les miels utilisés sur les plaies induites auront été soumis à un contrôle microbiologique. Les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour et seront observés tous les jours pour détecter tout inconfort lié aux procédures, avec un suivi post-opératoire renforcé dans les premières 48h ainsi que dans les phases de réveil faites en chambre de réveil thermostatée. Nous effectuerons également un scoring de la douleur via l’outil du Rat Grimace Scale.

Choix des espèces

Le modèle du rat WISTAR a été selectionné dans cette étude. Le rat est un modèle largement utilisé dans la recherche pré-clinique en chirurgie. La souche de rat choisie est reputée robuste et elle est peu couteuse. Il s’agit d’un modèle de référence dans les études sur la réparation de lésions cutanées et le modèle expérimental est donc très bien référencé. Par ailleurs, ce modèle possède une architecture de la peau proche de celle retrouvée chez l’Homme ; présence d’épiderme, lame basale, derme, hypoderme et présence de follicules pileux. La taille de l’animal nous permettra de faire plusieurs plaies par rat et donc de réduire notre nombre total d’animaux. Nous travaillerons avec des rats mâles adultes de 8 semaines (300 g en moyenne). Les jeune râts adultes ont une meilleure récupération post-chirurgicale et nous n’ajouterons pas de biais de cicatrisation lié à l’âge de l’animal qui aura une peau plus souple à 8 semaines. Cela permettra d’avoir un processus de cicatrisation optimal.

60 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est opérée des deux oreilles en une seule intervention de 45 à 60 minutes, pour recevoir un implant d'oreille moyenne chargé en dexaméthasone, et passe sous anesthésie générale, avant et après l'opération, trois ou huit enregistrements de son audition. Après un ou six mois, l'équipe prélève sous anesthésie le liquide de son oreille interne, puis la tue pour analyser ses cochlées. Le seul effet indésirable listé est une perte auditive due à l'implant, et le porteur décrit la chirurgie comme "peu invasive et peu douloureuse". Il affirme que seul un "modèle animale vivant" permet de suivre la diffusion du médicament dans l'oreille interne.

Objectifs

Selon l'OMS, 360 millions de personnes souffrent de déficience auditive handicapante (5 millions en France). Les traitements médicaux destinées a l’oreille interne par voie systémique sont limitées par l’existence de la barriere hémato-cochléaire qui empeche le principe actif d’atteindre sa cible. L’objectif de l’étude est le développement d’outils de délivrance de principes actifs via la fenêtre ronde.

Bénéfices attendus

Nous espérons que le prélèvement de liquide périlymphatique à l’apex cochléaire permettra une analyse précise et fiable de la pharmacocinétique du médicament. Nous nous attendons à mettre en évidence des concentrations plus élevées en dexaméthasone avec l’implant d’oreille moyenne, sans gradient de concentration baso apical et avec une concordance de gradient histo-biochimique. Nous espérons mettre en évidence une durée prolongée de délivrance de la dexaméthasone dans le groupe « long terme ».

Procédures

- Potentiels évoqués auditifs (PEA) réalisés sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 à 30 minutes maximum. Toutes les gerbilles avant la chirurgie puis à 1 semaine et 1 mois post opératoire et à 2 mois, 3 mois, 4 mois, 5 mois et 6 mois pour le groupe "long terme". Cela correspond à 3 interventions dans le groupe "court terme" et 8 interventions dans le groupe "long terme". - Chirurgie d'implantation du dispositif d'oreille moyenne sous anesthésie générale pour une durée totale de 45 à 60 minutes selon la courbe d'apprentissage : toutes les gerbilles avec le dispositif chargé en dexaméthasone dans une oreille, la moitié des gerbilles bénéficiera du dispositif non chargé en dexaméthasone dans l'oreille controlatérale et l'autre moitié bénéficiera d'une injection transtympanique de dexaméthasone dans l'oreille controlatérale. Ainsi, chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle les 2 oreilles seront opérées. - Prélévement péri lymphatique à l'apex cochléaire sous anesthésie générale de chaque oreille soit une durée totale de 40 à 50 minutes : à 1 mois pour le groupe "court terme" et à 6 mois pour le groupe "long terme". Chaque gerbille bénéficiera d'une seule intervention au cours de laquelle le prélèvement sera réalisé sur les 2 oreilles.

Impact sur les animaux

Perte auditive lié à l'implantation du dispositif d'oreille moyenne.

Devenir

L'ensemble des 60 animaux seront mis à mort après le prélévement péri lymphatique afin de réaliser le prélèvement puis l'analyse en immunofluorescence des cochlées.

Remplacement

Il s'agit d'une étude de délivrance d'un produit au sein de l'oreille interne, il n'existe pas d'alternative non animale pour la réalisation de ce type d'étude. Seul un modèle animale vivant peut nous permettre d'étudier la pharmacocinétique du dispositif au sein de l'oreille interne.

Réduction

Un nombre d'animaux suffisant (30 par groupe) a été choisi pour pouvoir réaliser des tests statistiques paramétriques, qui sont plus robustes (Tests t de Student et ANOVA). Les deux oreilles de chaque animale sera utilisé : l'une bénéficiera du principe actif l'autre bénéficiera de la technique de référence ou sera utilisé comme controle négatif.

Raffinement

En cas de signe(s) de souffrance (hyperactivité ou isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, fuite ou défense à la manipulation, poil hérissé par absence de toilettage, voussure dorsale, vocalises, perte de poids supérieure à 10 %) un traitement analgésique sera mise en place précocément par injection intrapéritonéale de Buprénorphine (Vétergésic® ou Buprécare®) à raison de 0,03 mg/kg toutes les 6 à 8 heures. Cette situation est peu probable car il s'agit d'une chirurgie peu invasive et peu douloureuse.

Choix des espèces

La gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal en audiologie et otologie pour 4 raisons : - spectre auditif étendu aux basses fréquences, ce qui en fait le rongeur (avec le Chinchilla) qui présente le spectre auditif le plus proche de l'Homme, - bulle auditive (zone qui contient les oreille moyennes et internes) naturellement hypertrophiée, ce qui en fait un bon modèle chirurgical pour ces régions, - rareté des épisodes d'otites moyennes aiguës, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation non infectieuse des chirurgies otologiques, - ancienneté d'utilisation du modèle depuis de nombreuses années par notre équipe nous permettant d'acquérir une certaine expertise le concernant. Les gerbilles de Mongolie auront environ 10 mois, ce qui constitue le meilleur compromis entre un âge adulte donnant des animaux de taille suffisante pour faciliter la microchirurgie et un âge suffisamment jeune permettant de s’affranchir des problèmes de presbyacousie. En effet, la gerbille de Mongolie est un excellent modèle animal de presbyacousie. Son audition est adulte à partir de 18 jours et la presbyacousie débute vers 18 mois, avec une élévation du seuil de 10 dB SPL vers 22-24 mois et une franche perte auditive (20 à 30 dB SPL) à 36 mois de vie.

116 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant recevoir jusqu'à six injections intrathécales, dans le canal rachidien, sous anesthésie générale, et subir jusqu'à dix prises de sang par semaine sans anesthésie. S'y ajoutent des prélèvements de liquide céphalo-rachidien, une collecte d'urine de 24 heures en module d'hébergement, un examen des yeux de 30 à 40 minutes sous anesthésie et un gilet d'enregistrement porté 12 heures. Après chaque injection, le porteur envisage une baisse des réponses des membres inférieurs jusqu'à 48 heures, une démarche et une posture perturbées jusqu'à quatre heures après le réveil, des contractions musculaires et, plus rarement, des fuites urinaires. Tous sont tués pour l'analyse de leurs tissus, sauf 28 témoins qui pourront être réutilisés dans d'autres études. Ces travaux préliminaires servent à régler les doses des études réglementaires qui suivront, menées sur la même espèce.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer très précocement l’efficacité et la toxicité éventuelle de candidats-médicaments administrés par voie intrathécale afin de pouvoir proposer le meilleur traitement aux patients atteints de troubles neurologiques graves tels que par exemple les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson…) ou des atteintes neuropsychiatriques (épilepsie, …). Les études dans ce projet permettront d’ajuster au mieux les doses et le schéma expérimental des études réglementaires (diminution des contraintes pour l’animal).

Bénéfices attendus

Détecter le plus précocement possible des effets potentiellement toxiques des candidats-médicaments en développement permettra en plus d’assurer la réduction du nombre d'animaux qui seront utilisés à des fins de recherche pour sécuriser in fine l’utilisation chez les patients. Ce projet nous permettra également de comprendre l’impact du geste de l’administration spinale (voie intrathécale) répétée d’un traitement et à terme d’identifier des biomarqueurs d’intérêt pour rendre plus sûre l’administration du traitement chez les patients et améliorer ainsi leur prise en charge.

Procédures

•Injections intrathécales réalisées sous anesthésie générale : jusqu’à 6 injections maximum avec un délai minimum de 7 jours entre les 2 injections (durée acte : 15min maximum) •Prélèvements de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie générale juste avant les injections intrathécales et plus rarement entre 2 injections intrathécales. (durée : 2 à 3 min en fonction de la vitesse d’écoulement) •Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (au maximum 10 par semaine ou dans la limite de 7,5% du volume total circulant ; quelques secondes •Prélèvements urinaires en hébergeant l’animal dans un module d’hébergement adapté pendant 24 heures maximum pour collecter les urines. •Examen des yeux sous anesthésie générale (utilisation d’une lampe à fente) : 30 à 40 min •Examen du système cardiovasculaire (port gilet pour monitoring sur 12h) par électroencéphalogramme et prise de la tension artérielle (2min max).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les effets indésirables anticipés concernent ceux inhérents à la voie d’administration intrathécale et pourrait inclure : une diminution transitoire (jusqu’à 24-48 heures après injection) des réponses des membres inférieurs pouvant induire ou non une perturbation de la démarche et la posture de 30 minutes à 4 heures après le réveil, contractions musculaires durant la procédure ou juste après injection, de rare troubles neurologiques tel que des fuites urinaires (jusque 4 heures après injection). Ces effets potentiels seront gérés par l’utilisation de points limites adaptés afin de limiter au maximum l’apparition et la durée des effets décrits ci-dessus. La douleur et la souffrance potentiellement présentes sont liées aux administrations et aux prélèvements de sang et de liquide cérébrospinal. Ces désagréments sont gérés sous anesthésie générale excepté dans le cas des prélèvements de sang où l’anesthésie provoquerait plus de souffrance et de stress que l’acte en lui-même pour lesquels les animaux sont habitué par renforcement positif.

Devenir

Tous les animaux dans ce projet seront euthanasiés pour procéder à l’analyse post-mortem des tissus (immunohistochimie/biochimie) à l’exception de certains animaux témoins (n=28 sur l’ensemble du projet) qui pourront être ré-utilisés dans d’autres études après accord vétérinaire.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative validée scientifiquement, éthiquement et règlementairement à l’utilisation des animaux dans le cadre du développement clinique de tout nouveau médicament. Les progrès scientifiques ont permis de diminuer le nombre d’animaux utilisés en privilégiant les tests in silico et in vitro pour la sélection précoce des molécules. Cependant, les progrès réalisés n’ont pas permis la substitution complète des tests in vivo qui demeurent un requis réglementaire. Comme ces études permettent de choisir les doses des études réglementaires obligatoires et d’identifier les organes cibles potentiels pour ajuster au mieux les examens à réaliser dans les études réglementaires, elles doivent être réalisées sur le même modèle animal que celui des études réglementaires.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit à son minimum afin d’atteindre l’objectif du projet. Pour ces études, en tenant compte de la disponibilité de données historiques pour de nombreux paramètres étudiés et de leur variabilité, on utilise 1 à 3 animaux/sexe/dose. Le choix du nombre d’animaux dépend de la variabilité des paramètres étudiés. Ces études préliminaires permettront de limiter le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques dans les études réglementaires.

Raffinement

Une procédure d’analgésie et d’anesthésie sera appliquée au moment des administrations intrathécales. Une observation accrue et adaptée du comportement de l’animal sera faite suite à l’administration afin de s’assurer qu’il ne présente pas de signe défavorable ou que l’apparition d’éventuels signes liés à la procédure ne soit que transitoire (ex : démarche anormale). Concernant le reste des examens pratiqués, afin de ne pas interférer sur les paramètres étudiés, les animaux ne seront pas anesthésiés mais ils seront habitués par renforcement positif. Une grille de point limite adaptée est mise en place pour prise de décision rapide (arrêt de la dose, décalage d’examen prévu, euthanasie de l’animal). En cas de nécessité, le vétérinaire pourra intervenir et décider de la mise en place de soin spécifique. Tous les animaux sont mis en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (enregistrement télémétrie ou signes nécessitant l’hébergement individuel) ou éthologiquement (incompatibilités), avec de l’enrichissement adapté aux besoins des primates.

Choix des espèces

Les études de ce projet ont pour but de prédire au mieux les effets indésirables secondaires liés aux candidats médicaments chez l’Homme ainsi que son efficacité sur l’engagement de la cible associée à la distribution du médicament dans l’organisme humain. Dans ce contexte, le modèle primate non-humain peut être sélectionné à la place d’une autre espèce non-rongeur parce qu’ils sont plus proches de l’humain notamment sur la totalité des paramètres suivants : • Sur le plan pharmacologique et toxicocinétique : exposition au médicament, élimination, fraction libre du médicament… • D’un point de vue du métabolisme : type et quantité relative de métabolites produits suite à l’administration d’un médicament • D’un point de vue physiologique : réactions physiologiques similaires (engagement de la cible) et pertinentes pour évaluer la sécurité chez l’Homme • Sur le plan expérimental : évaluation des formulations et excipients tolérés, voies d’administration possibles Données historiques : expérience avec des médicaments compétiteurs de la même catégorie Ces études étant préliminaires aux études réglementaires qui utilisent principalement des adultes et de jeunes adultes, il est donc prévu d’utiliser des animaux du même stade de développement.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat subit une chirurgie du fémur pour y greffer un biomatériau imprimé en 3D, puis quatre séances d'imagerie X et IRM sous anesthésie sur huit semaines, avant la mise à mort pour analyser l'os. Le porteur indique une douleur modérée liée à la chirurgie et prévoit la mise à mort si la perte de poids dépasse le seuil fixé. Il présente cette étape sur le rat comme un préalable à des essais chez de "gros animaux" puis en clinique, l'issue conditionnant de futures demandes de financement.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Ce projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matrices personnalisées qui permettraient d'aboutir à une meilleur réparation osseuse ainsi qu'une meilleure régénération des nerfs et des vaisseaux sanguins de la zone.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences menées sur ce modèle animal sont un préalable à la poursuite des travaux sur d'autres modèles, notamment chez les gros animaux. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau conduiront à son abandon. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie orthopédique (il s'agit d'un acte chirurgical unique d'une durée de 20 minutes), puis à 2 séances d'imagerie de rayons X (durée de l'examen: 15 minutes) et d'IRM (durée de l'examen: 30 minutes) à J1, J14, J28, J56. Toutes les séances d'imagerie se dérouleront sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie orthopédique peut entraîner une douleur modérée. La radiographie et l'IRM peuvent être considérées comme des actes expérimentaux de gravité légère , développées sous anesthésie générale.

Devenir

Ils sont tous euthanasiés à semaine 8 pour procéder à une analyse histologique des tissus dans la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel de différenciation ostéoblastique de ce complexe. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

L'utilisation de systèmes d'imagerie non invasive (IRM et microtomographie de rayons X) permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés. En effet, le suivi de chaque animal permet d'obtenir des informations sur le processus de régénération et sur divers autres paramètres biologiques à différents temps, sans avoir besoin de euthanasier les animaux. Sans ces procédures, il faudrait envisager des groupes de rats pour chaque temps expérimental où une analyse est requise.

Raffinement

Toutes les interventions sont faites sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. La chirurgie est faite dans les meilleures conditions d’asepsie, d’anesthésie, de prise en charge de la douleur. Surveillance accrue des animaux en post opératoire pour détecter tout signe de souffrance, et la soulager. L'itinéraire et les plans de voyage entre l'animalerie et les sites d'imagerie par rayons X et IRM seront optimisés afin de réduire la durée du voyage. Les animaux pourront s'acclimater après le transport afin de réduire leur détresse. Les conditions optimales d’hébergement sont garanties pour les animaux tout au long du projet. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination des points limites: en cas de isolement de l’animal, poil hérissé́, ou perte de poids hebdomadaire supérieure à 20 %, de la nourriture hydraté et de l’eau sera mise à disposition au fond de la cage, et un traitement antalgique par Buprénorphine sera également administré, cependant, en cas de persistance de un de ces points pendant plus de 3 jours, le vétérinaire ou le porteur de projet sera contacté pour prendre une décision sur la procédure à adopter (continuation/adaptation des soins ou mise à mort); la perte de poids pendant plus de 5 jours entraînera la mise à mort immédiate de l’animal; et la perte de poids pendant plus de 2 jours, associé à des problèmes de locomotion, et douleur évidente au niveau de la patte opéré, entraînera aussi la mise à mort immédiate de l’animal.

Choix des espèces

Le rat Sprague Dawley a été choisi à la suite de travaux réalisés dans notre laboratoire et par d'autres équipes portant sur l'analyse des propriétés histologiques et biologiques des membranes induites en site osseux fémoral chez le rat . Il est d'autre part décrit dans de nombreuses études dans le monde. Animaux adultes , poids 350-400 grammes. La croissance du squelette doit être arrivée à son terme. Il faut des animaux de poids suffisant pour supporter la procédure

300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des animaux sains, soumis à des examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer jusqu'à trois heures avec injection d'un agent de contraste, uniquement pour mettre au point des séquences d'imagerie. Le porteur indique que l'anesthésie provoque hypothermie, dépression respiratoire et cardiovasculaire, et présente pourtant l'IRM comme "en parfaite adéquation avec les 3R". Ces animaux sains sont tués à l'issue, jugés non réutilisables du fait de leur âge et des anesthésies répétées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point, optimiser et développer de nouvelles méthodes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'offrir le plus grand panel d'outil pour la caractérisation, la recherche de biomarqueurs de pathologies. L’IRM, technique d’imagerie biomédicale en perpétuelle évolution, est extrêmement attractive pour les études précliniques et cliniques. Elle est non invasive et non irradiante en parfaite adéquation avec les 3Rs. Elle permet : 1) de remplacer l’utilisation de techniques plus invasives pour l’obtention d’information similaire ; 2) d’avoir des informations anatomo-fonctionnelles complémentaires et/ou inaccessibles par d’autres techniques dans des conditions de bien-être animal sans comparaison. Ces nouvelles informations peuvent être intégrées dans une étude pour la raffiner comme nouveau critère d’inclusion ou d’exclusion. Cela permet d’obtenir une meilleure qualité des résultats qui n’auront pas besoins d’être répétés, réduisant ainsi le nombre d’animaux; 3) un suivi longitudinal individuel des modifications anatomo-fonctionnelles permettant ainsi de réduire très significativement le nombre d’animaux nécessaires ; 4) d’avoir accès à des informations déjà utilisées chez l’homme quotidiennement dans les services hospitaliers, permettant de développer des projets de recherche translationnelle.

Bénéfices attendus

L’IRM est une technique d’imagerie biomédicale non-invasive et non irradiante largement utilisée chez l’Homme. Son utilisation dans les projets précliniques permet de remplacer des techniques plus invasives, de réduire le nombre d’animaux avec des suivis longitudinaux, de raffiner en donnant accès à de nouveaux points limites précoces.

Procédures

Examen IRM sous anesthésie d'une durée maximum de 3h. Injection d'agent de contraste sous anesthésie (durée du geste 1 min max.).

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire.

Devenir

Dans la mesure du possible, afin de respecter la règle des 3Rs, les animaux de ce projet seront des animaux sains de réforme non au-préalable utilisés dans un autre projet. Ne pouvant pas être réutilisés au-delà de ce projet du fait souvent de leur âge (animaux de réforme), la répétition de l'anesthésie et surtout la présence d'agent de contraste, ils seront mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Des objets tests seront utilisés autant que possible pour limiter l’utilisation des animaux vivants. Malheureusement, à l’heure actuelle, aucun ne reproduit le tissu vivant et les contraintes pour l’IRM de ce dernier (mouvement respiratoire, cardiovasculaire, flux sanguin, hétérogénéité des tissus…). De ce fait, nous sommes contraints de valider nos paramètres sur des animaux vivants.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage à l’IRM à plusieurs reprises du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens IRM et pour les injections limitant ainsi la douleur. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.

Choix des espèces

L’IRM préclinique est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur (souris, rat) est depuis toujours le modèle de prédilection pour la recherche biomédicale, par sa taille, son coût, sa manipulation aisée et son taux élevé de reproduction. Il est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Les organes ayant des tailles et des caractéristiques à l’IRM différentes au cours du développement, les animaux sains utilisés seront à différents stade de développement allant de quelques jours après la naissance à l’état adulte.

1 040 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules de cancers du sang humains par la veine ou sous la peau, puis des injections dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant trois à six semaines, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids, et que les injections répétées peuvent irriter le site et y provoquer une douleur. Il affirme l'animal "indispensable" pour étudier l'effet des molécules sur un organisme entier, quatre peptides ayant d'abord été sélectionnés in vitro.

Objectifs

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par leur capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmé. Pour résister à la mort cellulaire, elles inhibent les mécanismes de mort, augmentent l'action des facteurs de survie ou effectuent ces deux actions simultanément. Nos travaux ont montré que la protéine de survie AAC-11, conférait aux cellules cancéreuses une résistance aux agents thérapeutiques. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante, en particulier dans les cancers du sang, dans lesquels AAC-11 est fortement exprimée. Nous avons développé et optimisé une série de petites molécules capables d’empêcher l’action protectrice de cette protéine in vitro. Il est maintenant nécessaire de poursuivre l’évaluation de ces petites molécules en tant qu’agents thérapeutiques à l’aide de modèles animaux pour différents types de cancer du sang. Nous utiliserons en particulier des modèles de lymphome de Burkitt, myélome multiple et leucémie lymphoïde chronique, qui sont des modèles de cancers du sang dans lesquelles nos petites molécules semblent particulièrement efficaces dans nos tests in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre l’évaluation de petites molécules ayant un potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers du sang. En raison de la stratégie originale mise en place pour développer ces molécules et sur leur mode d’action, les bénéfices de ce projet à long terme seraient de proposer une alternative thérapeutique efficace et mieux tolérée par les patients les plus fragiles car ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons dans un premier temps une étape de mise en place des modèles en injectant les cellules tumorales soit dans la veine de la queue soit sous la peau (au niveau d'un flanc) dans deux types de souris présentant un système immunitaire défectueux (l'absence de système immunitaire chez ces souris leur permet d'accepter la greffe de cellules d'origine humaine). L'injection dans la veine de la queue est réalisée sur souris éveillées et dure 30 secondes. L'injection sous la peau se fait sous anesthésie généralegazeuse et dure environ 2 min. Le développement de la tumeur sera suivi soit par prélèvement sanguin à la veine de la joue (une fois par semaine sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes) soit par la mesure de la tumeur lorsque celle-ci est apparente (mesure au pied à coulisse sur souris éveillée, d’une durée de 30 secondes, ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque les lignées tumorales expriment le gène de la luciférase seront utilisées. L'acquisition par IVIS sera réalisée sur des souris placées dans une chambre d’analyse équipée d’un plateau chauffant (37°C), d’un système d’anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pour l’induction puis 1,5-2% pour la suite de la procédure) et d’une caméra permettant la mesure de la bioluminescence émise par les cellules tumorales. La durée maximale d’acquisition des données de bioluminescence sera de 20 min. Après avoir déterminer la meilleure lignée de souris pour les différents types de cancer, nous évaluerons l'effet thérapeutique de nos petites molécules. Quel que soit le modèle de cancer utilisé (injection des cellules tumorales dans la veine de la queue ou sous la peau), le protocole thérapeutique consistera à injecter les petites molécules dans l’abdomen des souris éveillées 5 jours par semaine pendant 3 à 6 semaines. Le suivi impliquera des prélèvements de sang hebdomadaire sur toute la durée du protocole (modèles avec injection des cellules dans le sang) ou une mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque celle-ci est apparente.

Impact sur les animaux

L’injection des petites molécules thérapeutiques dans l'abdomen peut entrainer un stress une douleur avec possible risque d'irritation au site d’injection en particulier lorsque celle-ci sera répétée dans le temps (1 fois par jour, 5 jours/semaine, pendant 3 à 6 semaines). Comme tous les médicaments qui doivent entrainer la mort de certaines cellules, ils sont susceptibles d’avoir des effets indésirables sur le bien-être (perte de poids, diarrhée). La mise en place des différents modèles de cancer implique des injections. Dans le cas des injections sous la peau au niveau du flanc, nous pourrons observer dans le temps un inconfort lié à la croissance de la tumeur (gène dans la locomotion des souris). L’injection dans le sang des cellules tumorales pourra également conduire à une douleur de l’animal au cours du temps (développement de la pathologie) avec apparition d’une paralysie des membres inférieurs notamment et/ou perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront générer un stress transitoire de l’animal lié à sa manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser de manière la plus exhaustive possible l’effet thérapeutiques des petites molécules (prélèvement du sang, des organes et des tissus cancéreux). Dans tous les cas, l’euthanasie se fera au bout de 6 mois maximum ou de manière anticipée en cas d'atteinte de points limites prédictifs et précoces.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Il est a noté que les 4 peptides testés ont été sélectionnés par des études in vitro préalables.

Réduction

Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Deux fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi en cas dès les premiers signes de soufffrance suivi par l'euthanasie des animaux.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère pour laquelle de nombreux modèles de cancer sont déjà bien caractérisés. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes car les modèles de cancers sont bien établis dans ces conditions.

23 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale, pour certaines une prodrogue par voie veineuse et un prélèvement à la jugulaire, puis un suivi par imagerie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les mouvements et provoquer un amaigrissement, l'étude devant s'arrêter au seuil de taille tumorale fixé. Il précise que les molécules ont d'abord été testées in vitro mais juge ces données insuffisantes pour prédire leur distribution dans un organisme.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques d'un nouvel agent thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Cet agent se compose de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsqusie les tumeurs auront atteignent la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’administration du traceur ou de la prodrogue, l’étude sera stoppée.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de différents tests statistiques. Cela donne un total de 18 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus, des animaux résiduels seront également ajoutés comme décrit dans le paragraphe 3.4.10.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux avec de petits volumes tumoraux. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.