Recherche appliquée

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite est provoquée chimiquement, entraînant perte de poids et diarrhées pouvant contenir du sang, puis les souris reçoivent un traitement par voie orale pendant quatorze jours avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur cherche à identifier le rôle d'un gène dans l'action d'une molécule anti-inflammatoire déjà testée en essai clinique de phase 2. Il justifie le recours à la souris par l'échec des modèles cellulaires à "conclure" et par la "complexité d'un organisme vivant entier", et cite parmi les mesures de raffinement un fond musical dans les locaux.

Objectifs

La Rectocolite hémorragique est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin affectant 1 personne sur 1000. Elle se manifeste généralement par poussées plus ou moins sévères caractérisées par des diarrhées, des douleurs abdominales et un amaigrissement pouvant amener à des complications comme une péritonite. Sur le long terme, les patients sont exposés à un risque plus élevé de cancer du côlon. Des traitements existent et permettent de réduire cette inflammation mais ne fonctionnent pas chez un grand nombre de patients. Notre molécule a montré une efficacité anti-inflammatoire dans le modèle murin de colite et chez le patient atteint de rectocolite hémorragique lors d'un essai clinique de phase 2. Dans l’objectif d’une autorisation de mise sur le marché de cette molécule en tant que médicament, il est important de connaître son mode d’action afin de cibler les patients pour lesquels ce nouveau traitement serait bénéfique. Lors des études in vitro sur cellules et chez le patient, nous avons ciblé un gène qui pourrait être responsable de l'effet anti-inflammatoire de notre molécule. Pour valider notre hypothèse, nous utiliserons des souris chez lesquelles ce gène est non fonctionnel pour tester si l'effet anti-inflammatoire de notre composé est maintenu.

Bénéfices attendus

La mise sur le marché de ce composé permettra d'améliorer la prise en charge des patients pour qui les traitements actuels ne fonctionnent pas, et par la suite, de pouvoir travailler sur d'autres maladies dans lequel ce gène serait impliqué.

Procédures

Nous administrerons par voie orale quotidiennement aux animaux un traitement sur une durée de 14 jours. Cette procédure est non douloureuse et réalisée avec une contrainte de très courte durée (10 secondes en moyenne). Deux prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (d’une durée de 3 secondes en moyenne) au cours de l'étude afin d'analyser différents paramètres biologiques. Ces gestes seront réalisés par du personnel qualifié et expérimenté.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus chez les animaux résultent de la prise du composé qui induit la colite. Ce composé induit une altération du colon qui provoque une perte de poids chez les souris malgré une alimentation et une hydratation normale et des diarrhées qui peuvent ou non contenir du sang. Les effets apparaissent, notamment pour la perte de poids, entre le 6ième et le 7ième jour et persistent entre 2 ou 3 jours soit jusqu’au 9ème jour correspondant à la fin de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude pour pouvoir réaliser des prélèvements de tissus et évaluer l’efficacité du traitement.

Remplacement

Pour répondre à l'étude du mode d'action d'une molécule inflammatoire destinée à une mise sur le marché, seule l'utilisation d'un modèle murin est adapaté. En effet, les différents modèles cellulaires testés n'ont pas permis de conclure et ne représentent jamais la complexité d'un organisme vivant entier, l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés permet d’étudier plus précisément le rôle des gènes d’interêt.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en se garantissant l’obtention de résultats statistiquement représentatifs. Le nombre de souris pour chaque groupe est fixé à partir des résultats de tests statistiques précédemment obtenus dans un modèle de colite murine. Un maximum d’échantillons biologiques seront prélevès lors de l’euthanasie et seront conservés si une hypothèse est formulée après l’étude, permettant ainsi de ne pas recommencer l’étude pour y répondre.

Raffinement

La surveillance des animaux se fera quotidiennement avec une évaluation du stress et de la douleur. Plusieurs signes pour lesquels il est établi qu'ils reflètent une douleur ressentie par l'animal seront considérés comme points limites et entraineront l’euthanasie des animaux concernés. L'administration par voie orale sera privilégiée pour éviter l'apparition d'une péritonite douloureuse et stressante pour l'animal et elle sera réalisée par du personnel entrainé à un geste précis et rapide. Ceci afin de limiter le stress de l'animal. Une anesthésie gazeuse sera utilisée pour permettre un prélèvement sanguin indolore. L'hébergement des souris sera enrichi par l'ajout dans les cages de cabane en carton et de cotons, favorisant par exemple la construction de nids. Un fond musical est également assuré dans les locaux afin de diminuer le stress des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin de colite est très documenté et permet de reproduire les symptômes et les mécanismes immunitaires de la rectocolite hémorragique chez l'homme. C’est un modèle très utilisé car sa mise en place est rapide (9 jours) ce qui permet de ne pas garder les animaux trop longtemps en expérimentation tout en offrant une bonne reproductibilité des résultats, évitant ainsi la répétition des études et limitant l’utilisation d’animaux. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 9 semaines car c’est l’âge optimal pour une induction de la colite qui ne soit ni trop importante ni trop mineure pour observer des effets de la molécule.

218 souris juvéniles de quatre semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un ou deux gavages de streptocoque du groupe B, susceptible de provoquer une infection systémique, avant d'être tuées pour prélever leurs organes et dénombrer les bactéries. Le porteur reste bref sur les atteintes, mentionnant un léger stress au gavage et le risque d'infection, sans détailler l'état des souris atteintes. Il indique recourir à un modèle cellulaire de barrière intestinale quand c'est possible, tout en jugeant la souris "indispensable" pour les interactions immunitaires.

Objectifs

Le streptocoque du groupe B est une bactérie présente naturellement chez environ un quart de la population, sans pour autant entraîner d’infection. Il s’agit pourtant de la première cause d’infection grave chez les nouveau-nés. Le streptocoque du groupe B se trouve habituellement dans l’intestin qui possède normalement un rôle de barrière que les bactéries ne peuvent pas traverser. Parfois, chez les nouveau-nés, le streptocoque du groupe B commence par coloniser l’intestin avant de le traverser pour atteindre le sang puis le cerveau, avec des conséquences qui peuvent être mortelles. Dans ce projet, des souris seront colonisées par du streptocoque du groupe B au niveau intestinal pour comprendre comment l’interaction de la bactérie avec les cellules intestinales peut conduire à une infection sévère. Les objectifs de ce projet sont : 1. identifier si certaines cellules de l’immunité présentes dans l’intestin peuvent prendre en charge le streptocoque du groupe B pour l’amener dans le sang ; 2. comprendre comment le streptocoque du groupe B intervient dans la modification de la barrière intestinale pour la rendre plus permissive ; 3. déterminer si la colonisation par le streptocoque du groupe B facilite la traversée de la barrière intestinale.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous allons mieux définir l'impact de la colonisation par le streptocoque du groupe B sur la composition de la barrière intestinale ainsi que les facteurs et les cellules qui facilitent son franchissement. A plus long terme, cela permettra d'identifier de nouvelles thérapeutiques et de nouveaux moyens de prévention de l'infection chez les nouveau-nés.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à un ou deux gavages (à 5 jours d’intervalle) d’une durée de 20 secondes. Ils seront ensuite soumis à une injection d'analgésique par voie intrapéritonéale d'une durée de 3 secondes, suivie d'une mise à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L’inoculation par gavage est susceptible de provoquer un léger stress chez les souris. Le gavage oral par le SGB est susceptible de provoquer une infection systémique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements d'organes seront réalisés pour des études moléculaires, immunologiques, histologiques et pour dénombrement des bactéries.

Remplacement

L'étude des interactions du SGB avec des modèles cellulaires simples est utilisée à chaque fois que cela est possible en remplacement du modèle animal. Nous utilisons en particulier un modèle cellulaire permettant de reproduire la barrière épithéliale intestinale. Cependant, le modèle cellulaire est dépourvu en particulier de cellules immunitaires (cellules dendritiques, lymphocytes, etc.) qui sont d'une part essentielles à la maturation de la barrière intestinale et d'autre part qui concourrent à la dissémination du pathogène et au processus inflammatoire. Aussi, le modèle animal est indipensable à l'étude des interactions entre l'hôte et le SGB et au franchissement de la barrière intestinale par le SGB.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe, même âge et même poids, obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale dans un souci de réduction du nombre d’animaux. De même, la multiplication des prélèvements réalisés sur un même animal nous permet de répondre à plusieurs questions expérimentales tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d’animaux par lot a été estimé à l’aide de tests statistiques et les résulats des expériences seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec eau et nourriture à volonté, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les animaux dont les scores cliniques atteindront le score critique (point limite) seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la colonisation intestinale, l'infection par franchissement de la barrière intestinale et la survenue de méningite observées au cours de l'infection néonatale par le SGB chez l'espèce humaine. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes et types cellulaires impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 4 semaines car il s'agit d'une étude pédiatrique.

1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.

Objectifs

Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.

Bénéfices attendus

A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.

Procédures

Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.

Devenir

Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.

Raffinement

Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.

124 souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une photobiomodulation par la lumière trente minutes par jour pendant onze à douze mois, subissent des prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux (labyrinthe radial, labyrinthe de Barnes, rotarod, open field), avant une ponction de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie létale et une perfusion intracardiaque. Le porteur cherche à déterminer l'heure de la journée la plus favorable à ce traitement. Les retombées annoncées, un passage chez le singe puis un traitement humain, restent renvoyées à la suite, tandis que le porteur affirme le modèle animal "indispensable" et "seul moyen" de répondre à la question.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux avec un fond génétique hybride 129/C57BL6, en prenant en compte des connaissances du modèle 3xTgAD par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en s'appuyant sur une approche statistique, nous avons déterminés que nous aurions besoin de 60 souris 3xTgAD soit 15 souris par groupe (femelles), de 18 souris contrôles femelles avec le même fond génétique et de 22 souris pour l’expérience pilote (22 souris WT). Le total de souris sera de 100 individus. Les modèles murins utilisés seront les 3xTg-AD et les WT femelles exclusivement car les stigmates anatomiques et cognitifs de la MA sont beaucoup prononcés. L’expérience pilote permettra d’affiner les paramètres de la photobiomodulation (PBM), de mettre au point parfaitement les techniques mis en œuvre pour répondre à l’hypothèse du projet et d’obtenir des résultats exploitables. Une modification du nombre de souris WT est actuellement demandé. Selon la première hypothèse et les connaissances sur le sujet, nous avions diminué le nombre de groupe de souris WT pour suivre la stratégie de réduction des 3Rs et car le cycle circadien et la photobiomodulation n’aurait pas dû avoir une influence sur ces souris. Nous avions également expliqué que le groupe WT-PBM sera illuminé série 1 le matin, série 2 l’après-midi et série 3 la nuit pour répondre aux futurs reviewers des journaux scientifiques. Cependant aux vues des premiers résultats, nous devons effectuer la photobiomodulation sur l’ensemble du cycle circadien. Passant de 2 à 4 le nombre de groupe de souris WT et pour obtenir des résultats statistiquement corrects (avec l’aide du logiciel G*Power), le nombre de souris supplémentaire est de 24, soit 124 souris au lieu de 100 auparavant. Ces groupes seront divisés en 4 séries avec pour les 3 premières séries un n=3 pour les WT/ WT-PBM-N et un n=5 pour les 3xTg-AD (au total n=18 pour les WTs et n=60 pour les ADs). Pour la 4ème série, il y aura seulement des souris WTs avec un n=3 pour les WT, n=9 WT-PBM-AM, n=9 WT-PBM-PM et n=3 WT-PBM-N (au total n=24 pour les WTs). Pour respecter les 3Rs, nous avons effectué un test statistique pour limiter le nombre d’animaux tout en ayant des résultats exploitables pour le projet.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse. Selon la dynamique évolutive de la maladie d’Alzheimer dans ce modèle, les marqueurs pathologiques (plaques amyloïdes et Tau) sont observables scientifiquement entre l’âge de 12 et 14 mois d’où la procédure sans réveil à cet âge et les déficits cognitifs sont, quant à eux, visibles à partir du 12ème mois. La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative sur des personnes âgées. Dans le cas des souris, cela correspond aux stades adultes/âgés entre 12 et 14 mois.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une greffe de cellules hépatiques humaines sous la capsule rénale, subit jusqu'à seize prélèvements sanguins pour suivre la formation d'un hépatome, puis est tué pour l'extraire, certains échantillons nécessitant un second passage dans le rein d'une autre souris. Le porteur décrit des risques d'hypothermie, de saignement, d'infection et de perte de poids liés à la chirurgie. Il présente ces lignées cellulaires comme un moyen de "réduire l'utilisation d'animaux" dans les tests d'hépatotoxicité, tout en fondant leur production sur l'usage de 900 souris.

Objectifs

Les lésions hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché tandis que de nombreuses molécules en cours de développement échouent au cours des essais cliniques pour des raisons d’hépatotoxicité. Pour ces raisons, les études d’hépatotoxicité et de pharmacocinétique représentent des éléments essentiels pour réduire les échecs de développement de nouveaux médicaments. Le foie est un organe essentiel d’où les hépatocytes represente environ 70-80 % de sa totalité et ont des fonctions essentielles telles que : la régulation du métabolisme des glucides, des lipides et du cholestérol ; la production de composants du sérum (facteurs de coagulation, albumine, etc) ; la sécrétion et l’excrétion d’acides biliaires et la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Les hépatocytes humains primaires (PHH) constituent le modèle de référence pour prédire le métabolisme et l'hépatotoxicité des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité. Devant cet accès très limité aux prélèvements cadavériques d’échantillons de foie humain, rares, au coût très élevé et de qualité très variable notamment en fonction du donneur et du prélèvement, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires transgéniques très éloignées de la physiologie humaine. Ainsi notre projet a pour objectif de développer des hépatocytes humains hautement fonctionnels, illimités, reproductibles et prêts à l'emploi provenant de différents donneurs, totalement similaires à des PHH. Ceci en se basant sur notre technologie Natline® d’immortalisation et de maturation ciblée de cellules fonctionnelles qui a déjà fait ses preuves avec la création de cellules béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles EndoC-bH1 à -bH5. Ainsi, nous pourrions répondre au besoin très fort des laboratoires de recherche et de développement pharmaceutique de modèles humains physiologiques et prédictifs de la physiologie des hépatocytes et de leur réponse aux toxines.

Bénéfices attendus

Le développement de lignées d’hépatocytes humains fonctionnels, ainsi disponibles en quantité illimitée, aurait des conséquences très bénéfiques pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments. En recherche, ces cellules remplaceraient les hépatocytes humains primaires, d’accès limité, et seraient un complément idéal aux lignées cellulaires humaines et modèles animaux. Elles permettraient d’accélérer la recherche sur la physiologie hépatocytaire humaine, les mécanismes des maladies du foie et de toxicité et permettraient la création de modèles pathologiques reproductibles. Concernant la pharmacologie et la toxicologie, l’impact de ces cellules serait immense. La possibilité d’avoir une source illimitée et reproductible de cellules similaires aux hépatocytes humains primaires et représentatives de la variabilité des réponses à l’hépatotoxicité rencontrée dans la population serait un bouleversement pour le processus de développement des médicaments. Une meilleure prédiction de l’hépatotoxicité permettrait de réduire le nombre de médicaments retirés du marché et augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché, ce qui diminuerait le risque de toxicité hépatique chez les patients. Enfin, l’utilisation de tels hépatocytes humains prédictifs permettrait de réduire l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et d’hépatotoxicité.

Procédures

Deux interventions: 1) Chirurgie pour greffe sous la capsule rénal de la souris (1 greffe par souris) et 2) prélèvement sanguin pour suivre le succès de la greffe (toutes les 2 semaines après la greffe ou tous les mois, en fonction des premiers résultats et du développement de l'hépatome, 16 prélèvements maximum par souris). La chirurgie, une procédure d’environ 30 min, sera effectuée sous anesthésie et analgésie et il y aura un analgésique administré en préventif pendant 3 jours. Pour la prise de sang, il s'agit d'une procédure sans anesthésie et analgésie car très peu douloureuse. La souris aura une gêne au moment de la piqure ce qui ne durera que très peu de temps. Les prélèvement s’effectueront par la queue de l’animal ou par voie submandibulaire.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris seront soumises à une chirurgie afin de greffer des cellules ou tissus humains dans la capsule rénale. Ainsi, la chirurgie et les jours qui suivent sont les moments pendant lesquels les animaux pourront subir des effets indésirables et des nuisances. Les effets indésirables et nuisances possibles sont de la douleur et du stress liés à la chirurgie et une gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Dans le cas de complications liées à la procédure celles-ci pourraient se traduire par une hypothermie liée à l’anesthésie, un saignement dû à la chirurgie, une infection suite à la chirurgie et une perte de poids. L’amplification des hépatocytes humains sous la capsule rénale des animaux ne devrait pas générer de douleur ou d’inconfort supplémentaire étant donné que leur taille restera très modeste. Néanmoins, dans le cas où un hépatome se formerait vite, l’expérience serait arrêtée au plus tôt et l’animal serait euthanasié et le tissu prélevé afin de minimiser les effets indésirable sur l’animal. La formation de l’hépatome sera suivie via des prélèvements réguliers de sang (1 fois toute les 2 semaines à 1 mois, selon les premiers résultats), pour la mesure de l’albumine humaine. Concernant ces prélèvements sanguins, il s’agit d’une procédure légère qui pourrait occasionner une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements.

Devenir

Tous les animaux utilisé dans se projet seront soumis à une chirurgie pour la greffe de hépatocytes sous la capsule rénal. Ils resteront en vie le temps que l’hépatome progresse et ils seront mis a mort à la fin de l’expérience pour l’extraction de l’hépatome (les hepatocytes). Le cas écheant ils seront mis a mort après l'age de 20 semaines.

Remplacement

Afin d’assurer le succès de notre projet de développement d’hépatocytes humains hautement fonctionnels, stables et en quantités illimités similaires aux PHH, nous nous baserons sur la méthodologie qui a permis la génération des cellules bêta pancréatiques EndoC-bH1 à -bH5, la plateforme NatLine. Une des étapes de cette plateforme est la transplantation de cellules primaires récemment transduites avec un gène immortalisant dans la capsule rénale de la souris SCID afin de permettre l’amplification sélective de cellules différenciées et leur maturation. Pour le développement des cellules EndoC-bH, cette étape a été indispensable, aucune autre stratégie n’ayant permis d’obtenir l’amplification de cellules béta pancréatiques humaines fonctionnelles sécrétrices d’insuline et répondant aux incrétines. Plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro d’hépatocytes humains primaires à différents stades de développement ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées cellulaires n’a aboutit à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des hépatocytes primaires, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empèche leur utilisation dans les études de pharmaco-toxicologie. Pour cette raison, la greffe initiale des hépatocytes primaires dans la capsule rénale de souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de lignés d’hépatocytes similaires aux hépatocytes primaires humains. Par ailleurs, dans le cas des cellules béta pancréatiques, après récupération du premier insulinome pour chaque échantillon primaire donné, cet insulinome a du être transplanté à nouveau sous la capsule rénale d’un seconde animal. Sans quoi ces lignées primaires ne survivaient pas in vitro. Seulement après un second passage dans l’animal, les lignées d’insulinome créées étaient suffisamment stabilisées pour pouvoir être adaptées à la culture in vitro. Dans le cas des hépatocytes nous procéderons de la même manière en séparant les hépatomes primaires en deux afin de tenter leur culture in vitro tout en sauvegardant une partie d’hépatome in vivo. Après les premiers essais, si les premiers hépatomes survivent in vitro, nous éliminerons cette étape de passage secondaire dans la capsule rénale de souris et la remplacerons par leur culture in vitro. Cela aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des lignées d’hépatocytes.

Réduction

Nous avons estimé que le projet nécessiterait l’utilisation d’un nombre maximal de 900 animaux. Ce calcul est basé sur l’utilisation de 3 animaux pour la greffe primaire puis d’un maximum de 6 animaux pour les greffes secondaires soit jusqu’à 9 animaux par échantillon primaire de foie. D’autre part, basé sur l’expérience de la génération des cellules béta EndoC-bH, nous avons estimé qu’il nous faudrait un total de maximum 100 échantillons primaires, étalés sur une période maximale de 5 ans, pour générer environ 30 à 40 lignées cellulaires stables à partir desquelles seraient caractérisées les 5 à 10 lignées d’hépatocytes humains les plus fonctionnelles et représentatrices de la diversité de métabolisme hépatique. L’expérience des cellules béta nous a montré qu’il pourrait être indispensable de procéder à une ré-implantation des hépatomes primaires incapables de survivre in vitro. Si cela n’est pas le cas pour les hépatomes et que lors des premières expériences pilotes nous observons qu’ils peuvent être amplifiées in vitro tout en acquérant un caractère de cellules fonctionnelles, nous n’effectuerons plus de passage secondaire dans la souris pour les échantillons primaires suivants. Ceci aurait pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet de jusqu’à 400 animaux (30 échantillons primaires x 9 souris puis 70 échantillons primaires x 3 souris = 480 animaux) si nous considérons qu’il nous faudra traiter un tiers des échantillons primaires via un passage secondaire dans l’animal avant d’avoir un recul suffisant sur notre capacité à amplifier in vitro des lignées fonctionnelles à partir des hépatomes primaires.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les nuisances et douleurs induites par la procédure (chirurgie) et subies par les animaux, différentes actions seront menées. Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus dans les locaux de la zootechnie et seront acclimatés pendant au moins 5 jours avant la procédure. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets prévus pour enrichir leur environnement. Avant la procédure (30 mins), les animaux seront soumis à une injection sub-cutanée d’analgésique en préemptif. Ils seront ensuite soumis à une anesthésie injectable à la kétamine et à la xylazine Ces deux derniers composants entraînent une anesthésie, d’une durée de 20 à 30 minutes et celle-ci sera re-administrée dans l’éventualité où la procédure prendra plus de temps, à une dose équivalente au tiers. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera placé sous l’animal et celui- ci sera couvert tout au long de la procédure. Dans la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur et confort pendant les heures qui suivent la chirurgie, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, soit 6 à 8 heures après la chirurgie puis 2 fois par jour espacé d’environ 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (7-10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les condition d’hébergement classique A2 de nos installations et surveillé tous les jours. De plus l’apparition des points limites sera surveillé afin d’éviter la souffrance de l’animal ou résoudre d’éventuelles complications opératoires ou post-opératoires. Ainsi, l’animal sera surveillé pour des signes : d’hypothermie, de douleur ou stress, de perte d’activité, de déshydratation ou d’absence de prise de nourriture, de perte de poids, pour l’apparition d’ une infection ou d’une ulcération de la plaie. Dans le cas où un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’évité la degradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il ne sera pas possible de reverser ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons mis au point chez la souris, un modèle expérimental qui permet de récapituler la différenciation du pancréas humain. Ainsi, en greffant sous la capsule rénale de souris SCID immuno incompétentes des fragments de pancréas embryonnaires humains immatures, nous sommes capables de reproduire le développement du pancréas tel qu’il a lieu in vivo. Cette méthode, associée à la transduction lentivirale d’un oncogène, nous a permis de générer les seules lignées cellulaires béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles (EndoC-bH). Ces lignées cellulaires ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires dans le monde. Cette stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain définitif. Ce modèle expérimental n’a été testé que sur la souris et pas sur d’autres espèces, rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet hépatocytes. Les souris qui seront utilisées auront entre 6-20 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits. Ceci car avant l’animal est trop petit et donc la chirurgie est plus compliqué du fait de leur petite taille. En autre, l’amplification in vivo du tissu pourra prendre ensuite jusqu’à 8 mois ( notre expérience avec le développement des cellules béta), ce qui fait que l'animal ne doit pas être trop âgé.

198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cerveau est irradié sous anesthésie sur une à cinq séances, avec trois prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux répétés pendant six mois (open field, rotarod, reconnaissance d'objet, labyrinthe aquatique), pour comparer des schémas de radiothérapie FLASH. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer détresse, perte de poids et des dépilations, croûtes ou ulcérations au point d'irradiation. Les bénéfices affichés, des essais cliniques en oncologie pédiatrique et contre les gliomes, restent renvoyés à la suite du projet, tandis que le porteur juge "indispensable" le modèle animal pour étudier un "organisme vivant intégré".

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique (ratio entre l’efficacité du traitement et les effets indésirables) en essayant de réduire la toxicité de ces techniques innovatrices en explorant différents schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains des différents schémas temporels, son impact n’étant pas connu dans cette nouvelle technique de radiothérapie pour le moment.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques d’évaluation de la toxicité qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans la procédure visant à étudier l’influence du schéma de fractionnement temporel de la dose sur la préservation des tissus sains et des fonctions cognitives, émotionnelles et motrices, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau (environ 20 minutes d’anesthésie). Ces irradiations seront réalisées 1 fois par jour pendant soit 1 ; 2 ; 3 ou 5 séances consécutives (espacées de 48 h). Trois prélèvements sanguins sur les animaux anesthésiés seront réalisés 24h avant la première irradiation, 24h après la dernière irradiation et 7 jours après la dernière irradiation. Tous les animaux seront ensuite évalués par les tests comportementaux suivants : Open Field : évaluation du niveau d’anxiété, de l’activité locomotrice et exploratrice des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), il se déroule en 1 session de 5 min, à partir d’une semaine avant la première irradiation. Rotarod : évaluation de la coordination motrice, quantification de l’équilibre, l’endurance et la force d’agrippement. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’un mois après la première irradiation, il se déroule en 2 sessions de 5 min par jour pendant 4 jours. Reconnaissance d’objet : évaluation des capacités mnésiques des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’une semaine avant la première irradiation, il se déroule en 3 phases : Phase d’habituation (Jour 1 : 2 fois 3 min d’exploration) ; Phase d’acquisition (Jour 2 : 5 min d’exploration) ; Phase de test (Jour 2 : 5 min d’exploration). Labyrinthe aquatique : évaluation d’une potentielle altération des capacités mnésiques par l’irradiation. Les rats l’effectueront 2 fois : à court terme (1 mois après la première irradiation) et à long terme (6 mois après la première irradiation). Ils réaliseront 4 essais par jour pendant 8 à 13 jours. Cage d’activité : cages de vie adaptées, équipées d’une roue de grand diamètre pour mesurer l’activité spontanée des rongeurs sur de longues périodes de stabulation, maximum 7 jours consécutifs. Ils l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent également présenter des dépilations, croûtes et même ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Les nuisances liées aux prélèvements sanguins sont comparable à celles occasionnées par une coupure superficielle. Pendant les tests de comportement, une légère baisse de poids transitoire peut être observée due à l'augmentation de l’activité physique. Les animaux retrouvent leur poids quelques jours après l'arrêt des tests. L'exposition à un nouvel environnement peut générer un léger stress initial chez le rat, ils sont donc habitués progressivement aux salles de comportement et les tests sont répétés plusieurs fois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour analyses histologiques post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains (en particulier l’impact cognitif). De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. C'est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d'outils statistiques. Les animaux seront suivis 6 mois maximum. Ce délai est considéré long-terme pour évaluer la possible apparition des effets secondaires sur le tissu sain chez les animaux survivants à long-terme et ainsi pouvoir évaluer l’augmentation de la fenêtre thérapeutique.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante cicatrisante pendant au minimum une semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de cancer colique et des gavages répétés, puis sont tuées pour prélever tumeur, côlon, foie, rate, sang et fèces, afin d'étudier le rôle d'un acide aminé, la sérine, dans l'effet pro-cancérigène d'une bactérie E. coli. Le porteur indique que le développement tumoral devrait provoquer une perte de poids, un amaigrissement et de possibles lésions cutanées ou nécroses. Les retombées pour les patients, une alimentation appauvrie en sérine après chirurgie, restent renvoyées au long terme, et le porteur affirme l'expérimentation animale "indispensable" faute d'alternative in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour but de poursuivre nos études en précisant les mécanismes d’action impliqués dans la capacité à participer au développement du cancer colorectal (CCR) suite à une infection bacterienne. Nos travaux préalablement publiés démontraient que l’infection avec des souches d’Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) isolées de CCR humains accéléraient le développement tumoral sur des modèles murins de carcinogenèse colique et via des mécanismes induits au niveau des cellules épithéliales intestinales. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide amine, la serine, dans les effets pro-carcinogènes des CoPEC, au niveau des cellules épithéliales intestinales et dans un modèle murin de prédisposition à développer un CCR. Ce dernier est un modèle long (4 mois), et la taille des tumeurs ne suffit pas à réaliser une étude mécanistique complète de la carcinogenèse. Ainsi, nous proposons d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en serine sur le rôle pro-carcinogene des CoPEC dans un autre modèle murin. Pour cela, nous évaluerons le développement tumoral de cellules d’adénocarcinome colique murines greffées en sous-cutané chez la souris. Nous avons choisi de travailler chez la souris C57BL/6 avec un modèle murin syngènique afin de nous affranchir des limites de la xénogreffe, en injectant des cellules d’adenocarcinome colique murines MC38 isolées de souris C57BL/6. Il s’agit donc d’un modele tumoral se developpant assez rapidement (20 jours) et qui nous permettra d’obtenir suffisamment de materiel biologique pour les différentes études.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus pourraient nous permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC. Plus précisément, à long terme les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne chez les patients. Suite à une chirurgie et afin de limiter la recolonisation du tratus digestif par les E. coli producteurs de colibactine, il pourra être envisagé d'administrer aux patients une nourriture artificiel déplétée en sérine.

Procédures

Aucun prélèvement ne sera effectué pendant la durée de l’expérience, en dehors du prélèvement de fèces (1 fois par semaine après gavage soit 5 fois) . En revanche, des prélèvements seront réalisés sur animaux après la mise à mort (feces, sang, tumeur, côlon, foie, rate).

Impact sur les animaux

L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal ainsi que l'aspect et la localisation de la tumeur. Une baisse d'activité́, de locomotion ainsi qu'une perte de poil et un amaigrissement sont attendus au cours de l'expérimentation. D'éventuelles lésions cutanées/nécroses lié au développement tumoral pourront aussi être observées.

Devenir

Des prélèvements de tissus (tumeur, côlon, foie, rate), de sang et de fèces seront réalisés sur chaque animal. Des études histologiques et moléculaires seront ensuite mises en œuvre afin d’évaluer l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène à distance des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes d’interaction bactéries/hôtes/nutrition sur la carcinogenèse colique.

Remplacement

L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effet pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique en méthode in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité de la colonisation et de prise de la greffe entre les différents animaux. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage et aux injections sous cutanées, le nombre d'animaux par lot a été réduit au minimum Ainsi, nous avons montré que l’effectif optimal était de 10souris/groupe. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d'abord, un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau et de nourriture, observera le comportement général de l’animal (activité́, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, perte de poids) ainsi que l’aspect et la localisation de la tumeur. Cela permettra de repérer d’éventuelles lésions cutanées/nécroses, ainsi que des développements tumoraux trop importants qui pourraient gêner la souris. Ce suivi sera réalisé par une personne formée en interne au suivi des animaux et désignée compétente à détecter les signes de comportement anormal. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring. Une mise à mort anticipée de l’animale sera réalisée si besoin.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l'homme. Ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur des questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux trous sont percés dans la voûte crânienne de chaque animal sous anesthésie, puis la reconstruction est suivie par imagerie pendant douze semaines, pour tester des implants en titane destinés à la réparation du crâne. Le porteur annonce des douleurs post-opératoires, des infections locales et une ulcération de la plaie possibles, les rats étant tués pour analyser l'os reconstruit. Il retient le rat comme "l'espèce animale la moins évoluée" de taille suffisante pour la chirurgie et juge ces essais nécessaires avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier le potentiel de nouveaux implants en titane pour aider à la reconstruction osseuse du crâne.

Bénéfices attendus

Les implants en titane permettent une reconstruction osseuse complète du defect, sans complications. Ils limiteront également les complications de reconstruction liées aux infections post-opératoires.

Procédures

Les animaux subiront une création de défauts osseux au niveau de la voûte crânienne (sous anesthésie chimique). La durée de l'intervention est estimée à 20-25 minutes. Il y aura deux defauts osseux par rat. La reconstruction osseuse sera suivie, par imagerie tomodensitométrique, pour tous ces animaux à 2, 4, 6, 8, 10 et 12 semaines après l'opération (sous anesthésie volatile). La durée de l'imagerie est estimée à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient être observés sont : douleurs post-opératoires, infections locales de la zone opérée, ulcération de la plaie. L'intégrité de la dure-mère sera particlulièrement surveillée lors de l'intervention. A la moindre atteinte, l'animal sera écarté de l'étude. Si des effets non attendus surviennent, ils seront évalués et pris en charge par l'expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue d'effectuer des analyses histologiques de l'os reconstruit et de la zone environnante.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de structuration à tester et d'évaluer le risque potentiel d'inflammation post-implantation. Les informations de biocompatibilité et d'efficacité de reformation osseuse sont obtenues uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

L'expérimentation se déroulera en 2 séries d'animaux successives. La première série comprendra 8 animaux de chaque configuration. Le nombre d’animaux total pourra être réduit si l’effet attendu est suffisamment important, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables, après la première série. Les groupes expérimentaux sont constitués de n = 12 individus afin de disposer d’une puissance statistique suffisante pour l’évaluation des différentes structurations. Si la normalité est respectée (test de Shapiro), le test statistique utilisé sera soit un Test T soit une ANOVA. Si l’ANOVA est significative (p < 0,05), elle sera suivie d’un post hoc de Tukey. Si la normalité n’est pas respectée, un test de Mann-Whitney ou un test de Kruskal Wallis sera effectué.

Raffinement

Le rat est une espèce animale très proche de la physiopathologie humaine et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. Les différentes étapes de chirurgie seront réalisées sous anesthésie chimique profonde. La douleur post-opératoire sera gérée par l’administration de substances antalgiques de façon systématique pendant les 48h suivant la chirurgie, puis de façon optionnelle en cas de signes de douleurs observés. Les animaux seront anesthésiés par anesthésie volatile pendant les sessions d'imagerie tomodensitométrique. Les points limites seront particulièrement surveillés dans les 48 à 72h qui suivront les expérimentations. Parmi ceux-ci le poids et le comportement seront les premiers contrôlés. Ceci permettra d’intervenir immédiatement en cas de souffrance (administration de substances antalgiques), et/ou d’appliquer les critères d’arrêt prédéfinis de l’étude le cas échéant. Tous les résultats obtenus lors de ces études seront exploités.

Choix des espèces

Le rat est l’espece animale la moins evoluee et de taille suffisante pour permettre des études de chirurgie. En effet, la physiologie de la reconstruction osseuse et des réactions inflammatoires chez le rat sont proches de celles de l’humain. Ce modele permet ainsi la realisation d’etudes precliniques de chirurgie reconstructrice avec evaluation radiologique et histologique. Rats matures, âgés de plus de 22 semaines pour exclure un effet potentiel de croissance.