Recherche appliquée

1290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, dont un psoriasis induit par une crème et une péritonite par injection, avec perte de poids, lésions cutanées et diarrhée déclarées. Le porteur teste des molécules ciblant la résolution de l'inflammation, en réponse aux effets secondaires des traitements actuels du psoriasis. Il indique avoir présélectionné ses molécules in vitro pour limiter le nombre d'animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet sera d’étudier l’efficacité préclinique de molécules ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des pathologies pour lesquelles il a été décrit un déficit de cette résolution. Depuis quelques années il a été démontré que de nombreuses maladies inflammatoires chroniques sont causées par un échec de résolution de l’inflammation, c’est notamment le cas dans les maladies de la peau telles que le psoriasis. Les traitements les plus utilisés sont des pommades locales à base de dermocorticoïdes. Pour les formes les plus graves, des immunosuppresseurs peuvent être prescrit mais aussi de la chimiothérapie . Elles visent à inhiber le système immunitaire permettant une rémission des patients mais apportant de nombreux effets secondaires. Aujourd’hui de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être développées afin de proposer aux patients résistants ou en échecs de nouvelles possibilités d’avenir. Chez ces patients, un échec de résolution de l’inflammation a déjà été démontré. Ce mécanisme de résolution met en jeu différents récepteurs exprimés par les cellules de l’immunité et ciblés par des médiateurs lipidiques. Nous souhaitons, par ce projet, étudier l’efficacité préclinique chez la souris, de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation et permettant d’activer cette résolution lorsqu’elle est mise en échec. Pour cela nous comparerons notre traitement à un traitement de référence défini pour chaque modèle. Le nombre d’animaux utilisé sera de 1290 pour combiner un nombre réduit d’animaux avec une pertinence statistique. Au préalable des études in vitro seront effectuées afin de sélectionner 2 molécules à tester. Le suivi des animaux sera quotidien lors de la phase d’inflammation et de récupération afin de maitriser le plus adéquatement possible la douleur chez l’animal et de lui apporter les soins nécessaires le plus rapidement possible. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et des brindilles de papier pour s’enfouir et se cacher.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements pour les patients atteints de psoriasis sont des dermocorticoïdes, de la chimiothérapie ou bien des immunosuppresseurs. Depuis quelques années, les immunothérapies sont utilisées pour les formes sévères du psoriasis qui touchent environ 20% des patients. Les dermocorticoïdes, la chimiothérapie ainsi que les immunosuppresseurs induisent néanmoins de nombreux effets secondaires tels qu’une prise de poids, de l’hypertension, vomissement, perte de cheveux et des vertiges. Les immunothérapies utilisées lors des formes sévères, induisent, elles, une immunodépression du patient le rendant plus sensible aux infections du quotidien. De plus, et malheureusement, il a été démontré un échappement à ces immunothérapies dans 60% des cas moins d’un an après le début du traitement. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé une nouvelle molécule ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules ne modifient pas l’initiation de l’inflammation et donc permettraient aux patients de ne plus être immunodéprimés et de pouvoir répondre à tout type d’attaque extérieur puisque leur système immunitaire serait totalement fonctionnel. Chez l’animal nous espérons pouvoir accélérer la phase de récupération des différents modèles que ça soit au niveau des signes cliniques pour le modèle de psoriasis ou sur l’infiltration cellulaire pour les modèles d'inflammation aigue. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant échappés aux immunothérapies et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique.

Procédures

Pour l'un des modèles d'inflammation aigue les animaux subiront des injections en sous-cutanée afin de former la poche d'air (2 injections) et d'injecter l'agent inflammatoire (une injection), de plus ils subiront une injection intrapéritonéale pour les traitements. Le second modèle d'inflammation aigue sera induit par une injection intraperitonéale de l'agent inflammatoire et une injection intraperitonéale pour les traitements. Pour le modèle de psoriasis, les animaux seront traités par voie intrapéritonéale (injection 3 fois/semaine) et pourront subir un prélèvement sanguin (une fois). De plus une application quotidienne de crème Aldara sera faite durant 6 jours.

Impact sur les animaux

Modèle 1) l’application de crème induit une perte de poids chez l’animal durant les 4 premiers jours d’application, les souris récupèrent spontanément ensuite. Une perte de poids ainsi que la formation d’érythème et de desquamation seront observés chez l’animal, induisant une douleur légère durant les cycles d’application de la crème. Modèle 2) l’injection de l'agent inflammatoire dans le péritoine provoque quelques effets indésirables les premières heures : diarrhée, frisson, immobilité. Dès le lendemain les animaux ont récupéré. Modèle 3) La poche d’air n’induit aucune nuisance sur l’animal. L’injection de l’agent inflammatoire peut parfois amener des effets indésirables les premières heures : diarrhée, frissons mais cela est transitoire et s’estompe rapidement.

Devenir

Les animaux ne seront pas gardé une fois l'expérience terminée. En effet pour chaque modèle, differents prélèvements seront fait induisant obligatoirement la mort de l'animal.

Remplacement

Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour le récepteur mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux puisque seulement 2 molécules seront étudiées dans nos modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis ainsi que les études pilotes permettent de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant démontrée une efficacité thérapeutique. En amont nous avons définis par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre de 25 animaux necessaire pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences.

Raffinement

Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des anti-douleurs 2 fois/jours puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort. Les animaux ne seront pas maintenus au de-là des délais décrit pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe (5 animaux/cage), avec des brindilles pour se camoufler ainsi que des dômes lorsque cela sera nécessaire. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissement de type : dôme ou tunnel, brindilles

Choix des espèces

Le modèle de psoriasis et de péritonite seront étudié sur une souche de souris qui est la plus sensible pour déclencher un psoriasis et une péritonite. Le modèle d’AirPouch sera lui étudié sur une autre souche qui est la souche décrite pour ce modèle. Les animaux seront utilisés entre 7 et 10 semaines car l’inflammation générée les différents agents inflammatoires est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces où avancés ou les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections d'un anticorps thérapeutique et subissent huit prélèvements de sang sur 42 jours, avant une mise à mort pour prélèvements terminaux. Le porteur cherche à vérifier si son anticorps déclenche une réaction immunitaire, une étape qu'il présente comme imposée par la réglementation avant un passage en clinique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale pour reproduire ces mécanismes physiologiques.

Objectifs

Le potentiel thérapeutique des anticorps médicaments ne cesse de croître avec d’indiscutables succès. Mais le bénéfice clinique de leur utilisation peut être compromis par l’induction d'une production d’anticorps anti-médicaments par l'organisme lui-même. Cette réaction, de production d’anticorps anti-médicaments, est appellée communément "réponse de type ADA", elle altère l’efficacité des anticorps médicaments ainsi que leur devenir dans l'organisme, ce qui peut aboutir à leurs éliminations. La réglementation, concernant le développement préclinique de molécules médicaments, impose de rechercher dans des modèles animaux une éventuelle production d'anticorps anti-médicaments. Nous souhaitons dans cette étude savoir si des injections répétées d'un anticorps médicaments développé pour le traitement d'une maladie auto-immune, le lupus, induit une réponse de type ADA chez la souris. La voie d’injection étant un paramètre non négligeable dans l'apparation des ADA, trois voies d'inoculation seront comparées : la voie intraveineuse, la voie sous-cutanée et la voie intrapéritonéale (cette dernière étant la plus immunogène).

Bénéfices attendus

A court terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et vérifier si notre anticorps thérapeutique induit ou pas une réponse de type ADA chez la souris. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement de notre anticorps en clinique humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à 5 injections d'anticorps d'une durée de 1 à 5 minutes maximum sur animal anesthésié ou vigile. 8 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés sur une durée de 42 jours (soit une moyenne d'un prélèvement tous les 6 jours).

Impact sur les animaux

Du stress sera engendré lors des pesées, 5 pesées de moins de 30 secondes au total pour chaque animal et lors des 5 anesthésies gazeuses d'une durée de 5 minutes réalisées pour les injections sous-cutanées ou intraveineuses. Une douleur légère sera engendrée par les injections intrapéritonéale d'anticorps, un total de 5 injections de moins de 30 secondes par animal espacée de 3 à 4 jours. Du stress lors des prélèvements sanguins sera engendré lors de la manipulation des souris qui seront positionnées dans un tube à contention prévu à cet usage (durée de 2 minutes maximum) ainsi qu'une douleur légère liée à la piqûre de l'aiguille dans une des veines saphènes (8 piqûres par animal espacées d'une semaine) pour collecter le sang (durée de moins de 30 secondes). Une douleur légère sera également engendrée lors de l'injection intrapéritonéale d’un mélange anesthésique/antalgique réalisée avant la mise à mort de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements terminaux de tissus et de sang.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animales pour réaliser ce projet car les études de pharmacocinétique font intervenir des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits en dehors d’un être animal. Nous avons besoin de réaliser des prélèvements de sang pour évaluer si la souris produit des anticorps contre notre anticorps thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par lot est calculé pour obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Si tous les prélèvements de sang étaient réalisés sur un même animal, l'état d’anémie serait certain et leurs fréquences auraient également un impact sur la tolérance aux futurs prélèvements et surtout aux interférences avec les résultats. Ce projet ayant une approche longitudinale, nous avons fait le choix de doubler chacun des groupes afin d'alterner les prélevements sanguins, ce qui nous permet d'une part d'éviter de déstabiliser l'homéostasie de la souris et nous permet d'intégrer des points pour gagner en puissance. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité nécessaire afin de réaliser les analyses voulues. Dans le principe de la réduction, nous avons un seul groupe contrôle, celui avec l'anticorps contrôle injecté par voie intrapéritonéale, cette voie d'injection est la plus immunogène si cette réponse est visible, elle le sera dans ce groupe. Ceci nous permet de réduire le nombre d'animaux de 20 souris.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Une anesthésie sera mise en place pour réaliser les injections sous-cutanées et intraveineuses.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons choisi d’employer des souris BALB/c qui sont couramment utilisées dans des études de pharmacocinétique et de bio-distribution des anticorps thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 7-8 semaines, c’est-à-dire un stade adulte pour que leur système immunitaire soit à maturité et la réponse métabolique optimale.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des implants sous la peau du dos, du crâne et du genou sous anesthésie, avec un risque annoncé de douleur, d'infection et de développement de tumeurs liées aux cellules souches humaines implantées. Le porteur vise des implants de comblement osseux pour l'arthrose, une application renvoyée au long terme. Il affirme que la complexité de l'environnement sous-cutané est impossible à reproduire in vitro et que la réglementation rend l'étude du cancer "nécessaire" sur animal vivant.

Objectifs

Dans le but de développer de nouveaux types d’implants synthétiques contenant des composés actifs sur le plan biologique et d’étudier leur efficacité dans le comblement osseux, nous envisageons tout d’abord de tester leur biocompatibilité et leur tumorigénicité en sous-cutané chez la souris, en vue de leur utilisation en préclinique. Les implants seront constitués d’une matrice fonctionnalisée ou non avec des molécules et/ou des cellules souches mésenchymateuses humaines. Trois sites d’implantation ont été choisis sous la peau du dos, du crâne et du genou. Les implants actifs seront fonctionnalisés avec des molécules et/ou des cellules souches, les implants inactifs sans cellules serviront de témoins. Notre objectif est donc d’optimiser le non-rejet des implants ainsi que l’absence de développement de tumeurs après une intervention chirurgicale en développant des implants contenant des molécules présentant des activités biologiques et/ou des cellules souches humaines (implants vivants de troisième génération). Après des études in vitro, notre projet consistera à étudier in vivo sur modèle animal les performances des implants en termes de biocompatibilité, de toxicité et d’efficacité. Nous devrons également optimiser des dispositifs approuvés par la FDA (Food and Drug Administration) qui est l’agence américaine des produits alimentaires et médicamenteux. Ce projet consiste donc à valider sur des modèles animaux des implants pouvant se résorber dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Nous espérons valider de nouveaux implants osseux pour les tester dans certaines pathologies comme l’arthrose. A terme, ces implants pourraient être utilisés dans le traitement régénératif de lésions articulaires (arthrose) ou osseuse.

Procédures

La procédure chirurgicale sous-cutanée est réalisée sous anesthésie générale et couverture antalgique et dure au maximum 30 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances prévisibles : douleur liée à la chirurgie, inflammation, infection au niveau du site d’implantation, gêne dans la locomotion, développement de tumeurs dues aux cellules souches humaines.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux implantés seront mis à mort pour la récupération des implants et des tissus (peau) pour des analyses complémentaires approfondies.

Remplacement

Après des études in vitro validant l'efficacité des implants comme la minéralisation, la survie des cellules, la différenciation…, il est nécessaire de passer à des études in vivo étant donnée la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…). Seuls les implants efficaces in vitro seront testés sur les animaux. Selon la règlementation, l’étude d’un éventuel développement de cancer par des implants est nécessaire sur animal vivant.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux a été évalué sur la base du nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, uniquement les implants validés in vitro seront testés en implantation sous-cutanée. Il n’y aura pas de tests statistiques, nous effectuerons des observations directes de type présence/absence. Par exemple, pour la biocompatibilité, nous regarderons en priorité le recrutement et l’infiltration éventuel de cellules inflammatoires.

Raffinement

Le raffinement prend en compte le bien-être des animaux. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés stérilement sous anesthésie générale avec une analgésie locale pour réduire la douleur post-opératoire au site implanté. Le réveil complet des animaux sera activement surveille le jour de l’intervention et le suivi journalier de leur bien-être sera ensuite mis en place. Les souris immunodéficientes seront hébergées dans des portoirs ventilés séparées des autres souris et l’aliment, l’eau de boisson et la litière seront autoclavés. Pour l’ensemble des animaux un enrichissement du milieu (tunnels, bâtonnets, nids, coton…) sera ajouté dans les cages. Des points limites adaptés ont été établis afin de pouvoir soustraire l’animal à la douleur.

Choix des espèces

La souris est un modèle validé et utilisé classiquement dans ce type d’études, et qui permettra de comparer nos résultats avec les travaux similaires. Pour tester la biocompatibilité nous utiliserons des souris contrôles pour des implants sans cellules ainsi que des souris immunodéficientes pour des implants contenant des molécules actives et/ou des cellules humaines et pour l’étude de la tumorigénicité de ces implants. Les animaux utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines minimum) pour présenter des systèmes physiologiques (notamment immunitaire) matures.

76 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 12 d'entre elles réutilisées ensuite pour la reproduction et les autres tuées. Des femelles gestantes reçoivent des composés déclenchant une inflammation, par gavage ou injection, puis passent une IRM sous sédation avant que leur descendance ne soit euthanasiée pour examen du cerveau. Le porteur cherche à reproduire un phénotype "de type autistique" chez les souriceaux et décrit les troubles obtenus comme légers. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne peut mimer l'interaction entre le foetus et la mère et retient la souris pour sa placentation proche de l'humaine.

Objectifs

Les facteurs environnementaux, comme le stress maternel, les carences nutritionnelles et les infections pré- ou périnatales, sont désormais reconnus comme des agents facilitant l'apparition de maladies neurologiques. De nombreuses études épidémiologiques ont confirmé que les infections pendant la grossesse (virus, bactéries, parasites protozoaires) sont corrélées avec le risque accru de développer des troubles neurodéveloppementaux (schizophrénie, épilepsie, troubles du spectre autistique) ainsi que des maladies neurodégénératives. Dans le cerveau, les cellules microgliales sont particulièrement sensibles aux infections. Elles nettoient des agents pathogènes, aident à assembler les connexions neuronales et régulent de nombreux processus. Le dysfonctionnement microglial a été associé à certains troubles neurodéveloppementaux (spectre autistique et schizophrénie). Le premier objectif de cette étude est de vérifier si l’élimination transitoire de la microglie (sans présence d’une infection avec toute la complexité des mécanismes moléculaires associés) peut causer, elle-même, des troubles neurodéveloppementaux à l’âge adulte. Un aspect majeur lié aux infections pendant la grossesse est l'inflammation : 12 % des grossesses à terme ont des infections intra-utérines, qui exposent les mères à un niveau élevé d'inflammation tout au long de la grossesse. Les infections intra-utérines, donnent souvent naissance à des bébés avec une connectivité cérébrale anormale qui devient évidente à l'âge adulte. Le deuxième objectif de notre étude est de vérifier si l’inflammation, sans présence d’une infection, peut, elle-même, modifier le câblage cérébral précoce et causer des troubles neurodéveloppementaux à l’âge adulte. Les rongeurs sont de bons modèles animaux pour imiter cette condition pathologique car ils partagent certaines caractéristiques particulières de la grossesse humaine. Nous proposons d'étudier la connectivité cérébrale structurelle et fonctionnelle avec des enregistrements IRM et IRMf chez des souris ayant subi soit une déplétion de la microglie soit une inflammation transitoire avant la naissance, pour mieux comprendre les mécanismes de base à l’origine de trouble cognitifs, indépendamment du type d’infection pendant la grossesse. Ces modèles murins ont déjà été étudiés et n’ont pas montrés de signes cliniques important au niveau du comportement, uniquement des troubles légers de sociabilité, ne nécessitant pas d’études comportementales spécifiques.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre comment les infections causées par différents agents pathogènes pendant la grossesse, sont corrélées avec le risque accru de développer des troubles neurodéveloppementaux est crucial pour un diagnostic précoce chez les bébés, qui, à l'avenir, permettra d'identifier les nourrissons qui ont effectivement besoin d'une intervention précoce, afin de profiter de la période de plasticité cérébrale la plus élevée pour empêcher l'installation de la pathologie. De plus, les résultats de nos études précliniques ouvriront la possibilité de traiter ces enfants pendant la période fœtale, en bloquant l’inflammation, avec un impact tangible sur le chemin clinique. L'identification des paramètres diagnostiques associés à un risque élevé de développer des dysfonctionnements neurologiques chez le nouveau-né apportera une contribution facilement traduisible en clinique néonatale, permettant l'établissement de nouveaux biomarqueurs pour ces cas. L'établissement de nouveaux biomarqueurs est crucial pour favoriser les études sur de nouveaux médicaments visant à résoudre les anomalies cérébrales. Nous analyserons la connectivité cérébrale fonctionnelle, qui s'est avérée extrêmement efficace pour suivre les changements cérébraux, même subtils, chez des jeunes souris qui ont reçu des traitements mimant certains aspects spécifiques des conséquences des infections. Cela nous permettra de séparer et d'évaluer l'importance des différents mécanismes impliqués dans la réponse physiologique aux infections. De plus, comme les enregistrements IRM sont aussi réalisables chez l'homme, la traduction clinique de cette étude sera aisée.

Procédures

Les souris gestantes reçoivent des médicaments induisant une inflammation, soit sous forme de complément alimentaire, soit par injection (moins d'1mn). La principale source de stress pour les souris pendant ces injections est due à la nécessité de les manipuler et de les tenir pendant l'injection. Les souris seront ensuite scannées par IRM pendant maximum 3 heures et maximum 2 fois (la deuxième séance seulement en cas de mauvais qualité des données de la première séance). L’imagerie IRM nécessite que la souris soit immobile sous sédation. Comparée à l'anesthésie, la sédation est beaucoup plus douce en termes de temps de récupération. Cependant, nous laisserons les souris se reposer pendant au moins deux semaines, dans leur cage, après la séance d'IRM. L’étude nécessite des examens du cerveau ex vivo. Les animaux sont donc euthanasiés en fin d’étude. Cette procédure est réalisée sous anesthésie profonde et dure environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris basé sur notre traitement cause un phénotype de type autistique, léger, dans les descendants, comme l’hyperactivité et des déficits d’interactions sociales. Le modèle de souris est un modèle qui mime « une des causes potentielles du spectre autistique », à savoir les troubles du développement des neurones liés à l’état inflammatoire de la mère, lié ou non à une infection pendant la gestation. Le spectre autistique est très large en terme de phénotype chez l’humain et essentiellement diagnostiqué par des tests psychologiques, chez le très jeune enfant. Modifier l’état inflammatoire pendant la gestation chez la souris permettrait d’obtenir des souriceaux avec potentiellement des troubles du développement. Ce modèle murin est déjà décrit comme ne présentant que de légers troubles moteurs et sociétaux, n’empêchant en rien la vie en groupe. Ni souffrance ni perte de poids ne sont attendus. Les effets indésirables prévisibles sont liés à la sédation de longue durée, entrainant potentiellement un ralentissement de la respiration, laquelle est monitorée durant toute la session d’IRM. La pose du cathéter se fait sous antalgique et anesthésique et ne devrait pas causer d’inconfort. Cependant, une lésion cutanée peut perdurer au point d’implantation après l’imagerie. La température des animaux peut également chuter en fin de session IRM et les animaux peuvent être isolés en cage chauffée, le temps de récupérer et au maximum jusqu’à 24h.

Devenir

Les souris gestantes utilisées pour générer les souris imitant les malformations prématurées, après l'accouchement, seront utilisées pour produire d'autres souris nécessaires à d'autres projets de recherche dans l’établissement de recherche. En l'absence de besoin, elles seront euthanasiées. Toutes les souris subissant les enregistrements IRM fonctionnelle seront euthanasiées pour récupérer leur cerveau.

Remplacement

Afin d'étudier l'effet de l'infection, ou la réponse inflammatoire, pendant la période de gestation, il est nécessaire d'utiliser des animaux. Cette recherche examine l'interaction entre l'embryon/le fœtus et la femelle gestante suite à une réponse inflammatoire ; aucune approche in vitro ou in silico ne pourrait mimer cette condition physiopathologique. Aux fins de l'étude, il est également essentiel de mener des expériences sur des animaux qui ont une placentation de type humain. Cette caractéristique du modèle animal sélectionné nous permettra d'étendre les résultats obtenus dans cette recherche à l'homme. La souris constitue donc l'espèce animale au développement neurologique le plus utile à l'étude décrite.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été calculé avec des statistiques basées sur des études antérieures. Pour induire le phénotype désiré en prénatal, il faudra utiliser un certain nombre de souris pour former les couples : ces souris, une fois devenues inutiles pour ce projet, seront mises à la disposition d'autres études nécessitant de tels animaux dans l’établissement. Nous réduirons davantage le nombre de souris nécessaires en imageant deux fois la même souris en cas de problème lors de l'acquisition de données IRM, au lieu d'utiliser une autre souris.

Raffinement

Les embryons de souris connaîtront soit un état inflammatoire, soit l'épuisement des cellules cérébrales anti-inflammatoires pendant un temps limité. Il est connu que cela ne cause aucune douleur. Les séances d'IRM seront sous sédation, avec un protocole déjà testé et publié par des équipes de recherche du monde entier. Avec la sédation, nous évitons le stress causé par la configuration contrainte du berceau d’IRM, tout en utilisant peu d'anesthésiques. Dans les cages, aucune restriction d'eau ou de nourriture n'est requise et des enrichissements, tels que des tubes en plastique et des roulettes pour courir seront fournis. Une inspection quotidienne plus précise que l’inspection habituellement faite en regardant les souris à l'intérieur de la cage, sera immédiatement commencée en cas de blessure, de maladie ou des signes de douleur. Dans ce cas, un score de santé a été défini, avec des points limites qui, s’ils sont atteints pour une souris, déclencheront automatiquement l'euthanasie. Seul le personnel formé à la manipulation des animaux réalisera les expériences et les souris seront inspectées par un vétérinaire en cas de besoin.

Choix des espèces

Pour les besoins de l'étude, il est essentiel de mener des expériences sur des animaux qui ont une placentation très proche celle de la femme. La présence d'une placentation « humaine » chez l'animal modèle sélectionné nous permettra d'étendre les résultats obtenus dans cette recherche, selon une approche translationnelle, à l'homme également. La souris constitue donc l'espèce animale au développement neurologique convenant le plus à l'étude décrite. Nous voulons évaluer l'effet de l'inflammation aiguë prénatale après le développement des animaux (souris de plus de 2 mois de ce fait).

660 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de tumeur colique sous anesthésie, des traitements par voies multiples, parfois une irradiation, et des mesures répétées de tumeur, la croissance tumorale pouvant provoquer occlusion, ascite et perte de poids. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, propose ces modèles à des clients pour sélectionner des molécules anticancéreuses avant essais chez l'humain. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction 3D de tumeurs reste marginale.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers colorectaux. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Identification des animaux par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (1 fois, moins de 1 minute). Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieur à 30 min). Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée (sous anethésie pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités sous anesthésie générale par voie : - intra-veineuse -intrapéritonéale -sous cutanée -intra-musculaire ou intra-dermique avec analgésie Les animaux sont traités vigile par voie : - per os faite sous contention La palpation et la mesure au pied à coulisse des tumeurs nécessite la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) Des prélèvements de sang pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Des prélèvements d’urine peuvent être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux recevront des traitements par voie intra-musculaire, intradermique, sous cutané, intra-veineuse, orale, per os ou intra-péritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 9 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux sont pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral est estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids supérieur à 10% sera observée. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.