Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Décontamination de lignées murines originales
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
5 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 2 200 un niveau modéré. Elles servent à réimplanter des lignées de souris dans une nouvelle animalerie au statut sanitaire "propre", par superovulation de femelles donneuses, transferts d'embryons sous anesthésie chez des femelles receveuses et accouplement avec des mâles vasectomisés isolés. Le porteur indique que l'isolement des mâles génère de l'anxiété et que toutes les souris sont mises à mort en fin de procédure, les donneuses pour récolter leurs ovocytes et les receveuses parce qu'elles ne peuvent subir un second transfert. Il affirme qu'il n'y a "pas de remplacement possible", le transfert d'embryons étant présenté comme la seule méthode de redérivation.
Objectifs
Les équipes de recherche des instituts utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations d'assainissement et redérivation des lignées génétiques impliquées vise à préserver le statut sanitaire des animaux. Le statut sanitaire des colonies de rongeurs correspondantes conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. A l’occasion du peuplement d’une nouvelle zone d’élevage et d’expérimentation, un programme de redérivation de l’ensemble des lignées a été entepris, pour le peuplement d'une nouvelle zone dans un statut sanitaire "propre" : le statut dit SOPF (Specific and Opportunistic Pathogen Free). Ce projet a pour but l'introduction de nouvelles lignées murines originales au sein de ces nouvelles zones, en maintenant le statut sanitaire SOPF.
Bénéfices attendus
Le statut sanitaire des colonies de souris de laboratoire utilisées comme modèles animaux pour les recherches scientifiques et biomédicales conditionne à la fois leur état de santé, leur bien-être, et leur pertinence en tant que modèle. Les entrées de nouvelles colonies de souris au sein de l'animalerie doivent se faire par transfert d'embryons car il s'agit de la méthode de référence qui garantie le maintien d'un statut sanitaire "propre".
Procédures
+ 200 mâles seront herbergés en situation d'isolement sur 5 ans (40 mâles par an) + 3000 femelles donneuses seront soumises à une stimulation hormonale (2 injections intra-péritonéales (durée inférieure à 5 secondes) à 48h d'intervalle) : + 2000 femelles receveuses recevront des embryons par transfert d'embryons dans l'oviducte sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 10min)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement, ces accouplements n'ayant lieu que sur des périodes courtes (une nuit) pour permettre le contrôle et la synchronisation de l'initiation des pseudo-gestations. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent être sujettes à des douleurs post-chirurgie, suite à la réimplantation des embryons.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, les mâles vasectomisés doivent être mis à mort avant tout vieillissement. Les femelles pseudo-gestantes ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons (la structure maintenant l'oviducte ayant été modifiée par le premier transfert. Les femelles donneuses doivent être mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, le transfert d'embryon est la seule méthode possible pour la redérivation de lignées murines.
Réduction
Une seule série de transferts d'embryons sera réalisée dans un premier temps, et la deuxiéme série ne sera programmée qu'en cas d'absence de transmission aux issus du transfert des alléles à redériver. L'objectif est atteint lorsque les alléles sont redérivés dans le statut sanitaire assaini sous forme d'animaux respirants. La redérivation des lignées sera limitée aux lignées originales pour lesquels ces lignées ne sont pas disponibles sous une forme respirante dans le statut sanitaire SOPF auprés d'un centre de ressouces (JAX, hébergement Maximum barrier)
Raffinement
La technique chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. L'anesthésie est réalisée par injection intra-périonéale d'une combinaison de différentes molécules (sédation, myorelaxation, analgésie). L'analgésie per et post opératoire est réalisée par l'injection intrapéritonéale d'un analgésique.
Choix des espèces
La redérivation de lignées murines s'appuie sur l'intérêt et la justification pré-existants des modéles animaux disponibles pour répondre aux mulitples objectifs scientifiques des programmes de recherche concernés. Il s'agit ici d'un prolongement de leur utilisation dans le sens d'une utilisation plus pertinente dans un contexte sanitaire protégé. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses et les males vasectomisés, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubéres (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation.
Etude de faisabilité et de tolérance de traitement par ultrasons focalisés à haute intensité (HIFU) transcutané dans le foie chez le porc dans le cadre de traitement de tumeurs hépatiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
14 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal reçoit une anesthésie de deux heures pendant laquelle un traitement par ultrasons focalisés de haute intensité est appliqué sur le foie durant quatre-vingt-dix secondes, pour évaluer la faisabilité de détruire des tumeurs hépatiques sans incision. Le porteur indique que le traitement ne serait pas douloureux d'après les retours chez l'homme, et que tous les cochons sont mis à mort pour analyser leur foie. Il affirme qu'après des simulations informatiques et des tests in vitro et ex vivo il est "indispensable" de tester la sonde sur l'animal avant l'homme.
Objectifs
Les tumeurs hépatiques représentent un enjeu majeur de santé publique du fait de leur forte incidence et de leur mauvais pronostic. Bien que des techniques de destruction tumorales locales existent (radiofréquence cryothérapie, micro-ondes), elles présentent des limites communes que sont la nécessité d’implanter des sondes dans l’organe ce qui rend la procédure invasive et parfois impossible selon la zone à traiter. De plus, les traitements peuvent être altérés par la perfusion sanguine ce qui implique des taux de récidive locale parfois élevés. Les ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) ont l’avantage de détruire les tumeurs de manière totalement non invasive Ils sont délivrés par une sonde de traitement qui concentre les ultrasons dans une zone focale et permettent la destruction du tissu visé par augmentation de la température localement = jusqu’à plus de 80°C à distance de la sonde qui les émet sans abîmer les tissus qu’ils traversent. Les cellules de la zone cible sont détruites instantanément dès lors que la température dépasse les 60°C. Cette zone de cellules mortes est appelée lésion. Les HIFU sont utilisés dans la destruction de tumeurs depuis les années 90 et leur première application au traitement des cancers de la prostate. Il a été démontré précédemment qu’il est possible d’atteindre des parties du foie de façon totalement non invasive avec les HIFU sans causer de dommages aux autres organes. Le fait de ne pas ouvrir l’abdomen et de ne pas être en contact avec le foie permet de rendre ce traitement totalement non invasif mais ajoute des contraintes de taille sur la technologie. En effet, le foie est partiellement caché par la cage thoracique. Or la propagation des ultrasons est fortement altérée par les os. De plus, la distance entre la sonde de traitement et la cible (tumeur hépatique) est bien plus importante lors d’une approche non-invasive. La manière de délivrer l’énergie ultrasonore et la forme de la sonde ont donc été adaptées, en vue d’une application en clinique humaine. L’objectif de ce programme de recherche est de tester cette sonde ultrasonore au cours de traitements totalement non-invasifs (sans abord chirurgical) sur le modèle porcin afin d’évaluer la faisabilité de créer des lésions d’au moins 15 mm de diamètre sans atteinte des autres tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer les tests in vitro de validation de cette sonde dans un contexte in vivo dans le but de pouvoir proposer ce dispositif en clinique avec l’avantage d’envisager le traitement des tumeurs hépatiques sans incision ni ponction. En effet, la prise en charge à visée curative des tumeurs hépatique est essentiellement chirurgicale ou réalisée en ponctionnant une aiguille de radiofréquence de manière transcutanée. Cette approche par HIFU totalement non invasive, c’est-à-dire sans incision ni ponction, permettrait d’ouvrir une nouvelle approche thérapeutique d’intérêt pour les patients atteints de tumeurs hépatiques à condition de prouver qu’elle ne présente pas de risque non prévu, sa faisabilité et son efficacité.
Procédures
Les animaux subiront une injection intra musculaire pour débuter l’anesthésie puis, une fois anesthésiés, un cathéter sera mis en place au niveau de la veine de l’oreille. L’anesthésie durera 2h00 maximum avec traitement antidouleur durant le traitement HIFU qui durera 90 secondes maximum.
Impact sur les animaux
La prémédication (injection intramusculaire dans la cuisse) peut générer parfois du stress. D’après les retours chez l’homme, le traitement HIFU sur le foie ne génère pas de douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les foies qui seront analysés macroscopiquement et par histologie.
Remplacement
Les mises au point des techniques HIFU ont été évaluées au préalable par simulation informatique et testées in vitro et ex vivo ce qui a permis de repousser le passage à l’animal. Cependant, il est maintenant indispensable de tester la sonde de traitement sur l’animal avant de passer chez l’homme afin de vérifier les résultats in vitro. Les organes non prélevés dans ce projet seront proposés à d’autres chercheurs pour la réalisation de test ex vivo.
Réduction
Des tests in vitro, in sillico et ex vivo ont permis de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Le but étant de tester la sonde de traitement, un total de 14 lésions représente l’objectif. Au pire des cas une lésion sera faite par porc ainsi 14 porcs seront traités. Le nombre sera réduit si on arrive à effectuer plus de lésions par porc.
Raffinement
Bien que le traitement soit apparemment non douloureux, une analgésie est appliquée en combiné avec l’anesthésie. Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d'un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Ils sont régulièrement sortis de leur box pour pouvoir courir dans un plus grand espace de l’animalerie.
Choix des espèces
La sonde de traitement HIFU est adaptée à l’homme. Seul le porc présente une anatomie permettant ce test. De plus, le foie du porc a sensiblement le même ordre de grandeur que celui de l’homme. Afin que le foie soit suffisamment gros et que la paroi de l’animal soit suffisamment épaisse pour se rapprocher des conditions rencontrées en clinique, des porcs de 40 kg seront utilisés.
Étude de l’effet de la stimulation cérébrale profonde du noyau sous-thalamique sur les troubles de veille /sommeil dans un modèle macaque de la maladie de Parkinson.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Installés sur une chaise pour primates jusqu'à trois heures par jour, cinq jours sur sept pendant deux ans, deux macaques à longue queue effectuent une tâche de vigilance, puis sont rendus parkinsoniens par des injections d'une toxine, suivies chacune de 72 heures d'isolement. Jusqu'à 4 macaques vont être utilisés, dont 2 seulement en cas d'exclusion des premiers, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, et les deux premiers portent déjà un matériel d'enregistrement implanté dans un projet en cours. Ils subissent aussi des enregistrements cérébraux sous anesthésie et une stimulation électrique profonde du cerveau, réglée à 20 % sous le voltage qui provoque des effets secondaires. Le porteur écrit que le stress de la tâche est "rapidement dissipé" et que le syndrome induit est "progressif et maitrisé". Tous sont tués à la fin du projet, pour vérifier sur leur cerveau la position de l'électrode de stimulation.
Objectifs
Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la maladie de Parkinson où environ 70% des patients sont affectés. Ces troubles induisent une mauvaise qualité de l’éveil et du sommeil, ils altèrent fortement la qualité de vie des sujets atteints car ils empêchent la réalisation d’activités quotidiennes comme la conduite automobile. Seulement ces troubles sont mal pris en charge par les traitements actuels et il est important de trouver un traitement efficace. Il est établi que l’activité du cortex cérébral nous aide à déterminer les différents états de veille/sommeil. Ainsi, l’étude de l’activité du cortex et de sa modulation par la stimulation électrique de régions cérébrales profondes sont fondamentales pour mieux traiter ces troubles. Le macaque est un modèle de choix pour étudier les troubles du sommeil. Il présente des structures cérébrales et un comportement de veille/sommeil identique à celui de l’humain. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui sont des animaux nocturnes. Il est également impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Nous avons pour objectif de rétablir un comportement de veille/sommeil normal chez le singe parkinsonien. D’abord nous étudierons les états de sommeil du macaque sain et parkinsonien. Puis nous étudierons l’effet de la stimulation électrique d’une zone profonde du cerveau dans le but de restaurer un sommeil normal chez le singe parkinsonien. Le dispositif utilisé dans cette étude est déjà utilisé chez l’être humain. Cette étude permettra d’élargir son utilisation au traitement des troubles du sommeil. La plupart des expériences seront réalisées dans la cage d’hébergement des singes, ce qui diminue l’inconfort et le stress de l’animal. Leur état de santé sera surveillé tout au long des expériences. Ce qui permet d’intervenir immédiatement et de manière appropriée au moindre signe de souffrance. Cette étude nécessitera 2 animaux pour obtenir des résultats exploitables, mais deux autres animaux pourront être inclus dans cette étude si nécessaire. Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum mais est suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences.
Bénéfices attendus
D’après la littérature, environ 70% des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Donc, si il est possible de réguler les troubles du sommeil par la stimulation cérébrale profonde (SCP) du noyau sous-thalamique (NST), ce projet aboutirait à une meilleure prise en charge des troubles du comportement de veille/sommeil (V/S) chez les patients atteints de cette pathologie. Mais ceci permettrait aussi d’améliorer grandement leur qualité de vie car ces troubles empêchent la réalisation de tâches du quotidien qui demandent de l’attention comme la conduite automobile par exemple. Les bénéfices attendus de ce projet au niveau de la santé sont donc importants. Surtout que d’après la littérature, les troubles du sommeil semblent être des facteurs aggravants des maladies neurodégénératives. Au niveau scientifique ce projet va permettre de caractériser l’activité du noyau sous-thalamique (NST) dans les différents états de vigilance. Ceci permettrait une meilleure compréhension du comportement de veille/sommeil (V/S) au niveau cérébral. De plus. Des retombées technologiques sont aussi attendues de ce projet. En effet, de nouveaux paramètres de stimulation du NST par la SCP sont attendus afin de réguler le comportement de V/S..
Procédures
La phase 1 du projet est la chirurgie d’implantation, celle-ci sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude. Des enregistrements télémétriques de longue durée (24h) de l’activité du cortex et du noyau sous-thalamique se dérouleront sur 2 ans et seront effectués à raison de 10 fois par condition. C’est-à-dire 10 fois chez l’animal sain, 10 fois chez l’animal ayant reçu une stimulation thérapeutique et sain, 10 fois chez l’animal parkinsonien et 10 fois chez l’animal parkinsonien ayant reçu une stimulation thérapeutique. Les enregistrements se feront chez les 2 animaux implantés et à l’état vigile. Ils seront effectués dans la volière d’hébergement de l’animal sans manipulation. La tâche comportementale de vigilance sera réalisée au maximum 3h par jour, à heure fixe et 5j/7 pendant 2 ans. Elle se déroulera sur les 2 animaux implantés, à l’état vigile et sur une chaise pour primates. Les animaux seront progressivement entrainés à réaliser cette tâche et chaque progrès ou bonne réponse sera récompensée. Le test itératif de la latence d’endormissement (TILE) sera réalisé chez les 2 animaux. Ce test sera réalisé 14 fois par conditions décrites précédemment. Pour déterminer les paramètres de la stimulation thérapeutique, des enregistrements sous anesthésie générale et en état vigile seront réalisés pour une durée maximale de 1h. Les enregistrements seront effectués de 5x1h en état vigile dans la volière d’hébergement. Puis des gammes de stimulation seront effectuées de façon à pouvoir tester le voltage maximal à utiliser à fréquence fixe de 130Hz (fréquence de stimulation utilisée en clinique). Le voltage utilisé est de 20% en dessous du voltage laissant apparaitre des effets secondaires. Les enregistrements couplés à la stimulation seront effectués sous anesthésie générale et vigile à raison de 5x1h par condition, ces enregistrements détermineront la fréquence de stimulation à utiliser. Les paramètres de stimulation permettront ensuite de stimuler le singe durant toute une nuit. Les 2 animaux seront ensuite rendus parkinsoniens par des injections d'un produit chimique induisant la pathologie. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modérément sévère et stable. Cette phase dure 4 mois.
Impact sur les animaux
La chirurgie d’implantation peut induire des douleurs au niveau du matériel implanté jusqu’à maximum une semaine après l’implantation. Elle sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude.. Mais, au moindre signe de douleur un accompagnement de l’animal et un traitement médicamenteux est prévu pour réduire au maximum la douleur. La tâche de vigilance peut induire du stress chez l’animal mais celui-ci est rapidement dissipé par un apprentissage progressif à réaliser la tâche. De plus l’entrainement et la réalisation de la tâche sont couplé à un renforcement positif récompensant l’animal. Le test itératif de la latence d’endormissement ainsi que les enregistrements télémétriques de longue durée n’induisent pas d’effets indésirables chez les animaux car ils sont réalisés dans la volière d’hébergement des animaux. Ces derniers sont vigiles, libres de leur mouvement et aucune manipulation n’est effectuée sur ces derniers. Enfin l’induction du syndrome parkinsonien induira chez ces derniers un symptôme parkinsonien progressif et maitrisé. Ce syndrome induira des troubles moteurs semblables à la maladie de parkinson. Les animaux seront suivis et accompagnés durant cette procédure.
Devenir
A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour vérifier le bon positionnement de l’électrode de stimulation profonde.
Remplacement
Le singe Macaque fascicularis, qui ne constitue pas une espèce menacée d’extinction, est un animal qui présente une neuroanatomie, notamment du cortex et du noyau sous-thalamique, très proche de celle de l'humain. Il présente aussi un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains. De plus ce modèle animal a permis l’élaboration de la stimulation cérébrale profonde du noyau sous-thalamique ainsi que son transfert aux patients. Enfin, c’est un modèle de choix validé par la littérature pour l’étude neurophysiologique et comportementale de la maladie de Parkinson induite par injection de neurotoxine. C'est donc pour toutes ces raisons que le Macaque fascicularis est un modèle de choix pour l'étude de l’efficacité de la stimulation cérébrale profonde sur le comportement de veille/sommeil dans la maladie de Parkinson. Cette étude préclinique sur le comportement de veille/sommeil nécessite des animaux ayant de fortes similitudes avec l’humain, il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle rongeur qui est un animal nocturne, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.
Réduction
Le nombre de d’animaux a été déterminé avec un test statistique appliqué pour l’étude. Il permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Les animaux seront leur propre contrôle car les tests seront effectués sur les animaux sains puis rendus parkinsoniens. Pour que cette étude soit exploitable il faut enregistrer des signaux de courte durée (au moins 1h) et de longue durée (au moins 24h) à raison de 10 fois chez un seul animal. Ces durées permettent d’obtenir des données statistiquement exploitables. Les analyses spectrales de ces signaux seront comparées à l’aide de tests statistiques adaptés. Dans la définition du nombre d’animaux prévus, nous prenons en compte le risque de rupture de vaisseaux pouvant créer une hémorragie silencieuse pendant la chirurgie, mais s’aggravant en post opératoire ; la mauvaise implantation car le noyau ciblé est très petit. Ceci nous conduit à inclure 100% d’'animaux en plus, soit 2 animaux supplémentaires qui seront opérés uniquement en cas d’exclusion des premiers, ce qui fait un total de 4 animaux maximum pour cette étude. Une étude préliminaire a permis d’enregistrer les signaux corticaux et du NST d’un animal pendant les différents états de veille/sommeil ainsi que de valider la faisabilité des enregistrements. 2 animaux impliqués dans cette étude sur lesquels les expérimentations sont réalisées sont issus d’un projet autorisé en cours de réalisation ce qui réduit le nombre de nouveaux animaux impliqués dans cette étude de moitié.
Raffinement
Des actions sont mises en place pour limiter les risques chirurgicaux : l’imagerie anatomique préopératoire, la ventriculographie et une vérification électrophysiologie per opératoire sont prévues. De plus, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux avant et pendant l’opération chirurgicale afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Afin de diminuer le stress des animaux soumis à ce contexte expérimental un programme d’habituation aux conditions expérimentales (tâche de vigilance) est mis en place dans l’animalerie. Ces entrainements se font selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assurent par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Durant la phase 5, étant donné que l’administration du produit induisant la pathologie se fera en même temps pour les deux animaux dans une pièce adaptée, ils ne seront donc pas séparés car l’isolement des animaux est généralement un standard dans le protocole d’administration de ce produit. Deux animaux sont réutilisés pour cette étude et ont reçu une implantation de matériel d’enregistrement, ce matériel sera utilisé pendant cette étude ce qui dispense cet animal de la chirurgie d’implantation.
Choix des espèces
Le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui ne constitue pas une espèce de primate menacée d’extinction et qui sont issus d’élevage fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain, notamment au niveau des structures impliquées dans le comportement de veille/sommeil, ce qui permet de mettre en place la stimulation cérébrale profonde dans les mêmes conditions que chez l’humain, chose impossible à faire avec des animaux plus petits tels que les rongeurs. Ils permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce modèle animal est d’autant plus pertinent que le comportement de veille/sommeil de ce dernier est très similaire à celui de l’être humain. Aussi, la complexité du comportement de veille/sommeil ainsi que l’impact de la stimulation cérébrale profonde sur ce dernier rend impossible le remplacement de ce modèle animal par un modèle cellulaire ou par une simulation informatique. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.
Role de la dérégulation de la voie BMP dans l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
560 rats âgés de quatre semaines vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons et de leur cœur. Ils passent trois semaines dans un air à 10 % d'oxygène pour induire une hypertension artérielle pulmonaire, reçoivent une injection quotidienne dans l'abdomen pendant deux ou trois semaines, et sont anesthésiés pour une échocardiographie puis, en fin de traitement, pour un cathétérisme. Les molécules testées ont donné de "premiers résultats in vitro" que le porteur dit "encourageants", et il qualifie de "bénins" les effets de l'hypoxie. Il annonce trois méthodes complémentaires d'induction de la maladie et n'en décrit qu'une, sans nommer le produit de l'injection sous-cutanée prévue.
Objectifs
L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme). Les rats seront en hypoxie à 10% d’oxygène pendant 3 semaines consécutives afin de mimer l’air ambiant en altitude. Les traitements effectués seront en intrapéritonéales et seront de la fréquence suivante : 1 fois par jour pendant 2 semaines pour la procédure 1 ; 1 fois par jour pendant 3 semaines pour la procédure 2.
Impact sur les animaux
Les procédures appliquées à ce projet nécessitent d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Ces injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'une crème lidocaïne. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie et cathétérisme. L'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. Le modèle implique une exposition à 3 semaines d'hypoxie (10% d'oxygène) afin de mimer l'effet de l'altitude. Ces effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce.
Devenir
Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique. L'HTAP est une maladie multifactorielle où plusieurs organes sont impliqués dont le coeur et le poumon. C'est pourquoi, le recours à des modèles animaux, différents et complémentaires, sont indispensables pour établir une preuve de concept avec cette molécule.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Egalement, nous réutiliserons les animaux non malades traîtés avec les différentes molécules d'un projet en cours pour ne pas réutiliser des rats similaires dans cette demande. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche en cours.
Raffinement
Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure. Les rats seront anesthésiés 2 fois pour valider le modèle et les traitemants avec de l'isoflurane. Lors des traitements, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.
Contribution à la chirurgie pancréatique de traitements ondes-énergies par écho-endoscopie
- Recherche appliquée
- Cancers
66 cochons vont être utilisés et tués, 45 opérés sous anesthésie sans être réveillés et 21 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du pancréas de six heures avec traitements thermiques par écho-endoscopie puis ablation partielle de l'organe, une partie des cochons survivant de deux à sept jours sous surveillance avant leur mise à mort. Le porteur indique que les complications possibles incluent pancréatite, ulcère, hémorragie et péritonite, et que l'autopsie sert à analyser les effets du traitement. Il affirme qu'après des tests sur organes isolés il est "nécessaire" d'étudier un "organisme entier", et présente le cochon comme l'espèce de choix pour la chirurgie abdominale.
Objectifs
Le but du projet est d’améliorer le traitement chirurgical du cancer du pancréas, en testant de nouvelles approches mini-invasives écho-endoscopiques. Le cancer du pancréas est une maladie grave avec un pronostic sombre qui est la quatrième ou cinquième cause de mortalité par cancer dans les pays occidentaux. C’est un cancer agressif, difficile à diagnostiquer précocement, avec des chances de survie ou de guérison faibles. Seule la chirurgie (possible pour environ 20% des patients), associée à la chimiothérapie, peut améliorer la survie et permettre une rémission. Mais la chirurgie pancréatique présente encore un haut risque de morbidité et mortalité périopératoire pour les patients. Il s’agit d’un organe complexe, difficile d’accès, et dont l’ablation nécessite des anastomoses techniquement difficiles. Notre objectif est d’évaluer sur le modèle porcin l’apport de techniques complémentaires « ondes-énergie », délivrées dans le pancréas par écho-endoscopie (EUS), et pouvant être optimisées par une navigation guidée par l’intelligence artificielle, pour faciliter ensuite la résection chirurgicale de la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer par cette étude que la chirurgie pancréatique assistée de l’EUS/Onde-énergie permettra de réduire la morbidité́ et la mortalité chez les patients qui présentent : -un cancer du pancréas localement avancé, afin d’en améliorer la résécabilité (chirurgie) ; -un cancer du pancréas métastatique non résécable (non opérable), en traitant les lésions pancréatiques localement avancées, voire les adénopathies et les métastases hépatiques ; -un cancer du pancréas résécable mais avec contre-indication à la chirurgie dans le cas de sujets âgés ou présentant des comorbidités majeures. En complément, l’intelligence artificielle permettrait de guider le chirurgien dans ce geste thérapeutique complexe en apportant une représentation 3D du site opératoire
Procédures
Les animaux seront soumis à un examen gastroscopique puis une intervention chirurgicale sous anesthésie générale de 6 heures. Durant l’anesthésie, seront réalisés des prises de sang, des examens d’imagerie non invasifs (IRM, scanner), une procédure écho-endoscopique avec des injections et traitements thermiques dans le pancréas, suivie d’une ablation partielle du pancréas. Les animaux ne seront pas réveillés après la chirurgie. Certains animaux recevront le traitement thermique EUS du pancréas quelques jours avant la chirurgie d’ablation, la procédure echo-endoscopique dure environ une heure. Puis ils auront 2 à 7 jours de survie sous surveillance rapprochée avec des contrôles de 30 minutes sous anesthésie générale, espacés de 48h, incluant un scanner et un prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés à l’anesthésie (nausée, désorientation, hypothermie, irritation trachéale), au traitement thermique du pancréas (pancréatite, ulcère gastrique) et à l’intervention chirurgicale dont les complications peuvent être des saignements (hémorragie, hématome) ou une infection (pancréatite, péritonite).
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin de la procédure. Une autopsie et des prélèvements post mortem sont nécessaires pour analyser les effets du traitement « onde-énergie » sur le pancréas opéré.
Remplacement
L’intérêt des techniques d’ablation thermique par délivrance de différents types d’énergie a été démontré sur des modèles alternatifs (organes isolés). Il est à présent nécessaire d’étudier la faisabilité et la sécurité de ces approches chirurgicales dans un organisme entier qui intègre la complexité des rapports anatomiques du pancréas et sa vascularisation.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été réduit au minimum afin d’obtenir les résultats scientifiques souhaités. 3 lots de 22 animaux sont requis pour tester 3 techniques de traitement echo-endoscopique « onde énergie ». Chaque utilisation est justifiée. Le nombre d’animaux ne peut être réduit, un seul sera utilisé par condition. Les pancréas prélevés chez les animaux contrôles seront utilisés pour évaluer ex vivo de nouvelles solutions d’ablation thermique. Les interventions seront réalisées successivement, un animal après l’autre, afin de permettre une amélioration constante des techniques selon les résultats cliniques observés.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation leur permet de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés avant d’être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute l’opération. Les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et durant les jours suivant l’opération. Une videosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est l’espèce de choix pour les approches abdominales et les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. Un cochon de 4 à 5 mois, qui pèse entre 35 à 50 Kg, nous permet d’avoir un modèle pancréatique pertinent pour réaliser des interventions chirurgicales dans les mêmes conditions que chez le patient (anatomie du pancréas, taille des instruments, voies d’abord, ergonomie, orientation…).
Etude in vivo d’inhibiteurs de prolifération cellulaire ciblant le métabolisme du cuivre : une approche innovante en cancérologie pulmonaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 90 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 500 un niveau modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs pulmonaires sous la peau, dans le poumon ou la mamelle, puis des injections répétées de molécules ciblant le cuivre encapsulées dans des liposomes, avec suivi par imagerie. Le porteur indique que les souris, immunodéprimées, subissent les douleurs des injections, le stress des contentions et le développement de tumeurs et de métastases, et qu'elles sont mises à mort pour des analyses histologiques. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle non biologique ou in vitro" permettant d'obtenir les données de biodistribution recherchées, l'intérêt clinique des molécules restant à démontrer.
Objectifs
Selon l’OMS, on estime à 19 millions le nombre de nouveaux cas de cancer et à 10 millions le nombre de décès liés au cancer survenus en 2019. Il est établi que le cancer du poumon est la principale cause de mortalité par cancer dans le monde, avec 1,8 million de décès en 2020. Avec une incidence de 525 000 nouveaux cas par an en France. De nouvelles options thérapeutiques ont été développées ces dernières années, il reste nécessaire d'améliorer et de développer de nouvelles les chimiothérapies. Le ciblage du métabolisme du cuivre est une stratégie thérapeutique extrêmement innovante en cancérologie, et l’on assiste à un vif intérêt de la communauté scientifique internationale sur cette thématique depuis 2018. En effet le cuivre est un élément chimique indispensable à la croissance et la survie cellulaire des cancers, et il est extrêmement pertinent de cibler le métabolisme du cuivre pour perturber le développement des cancers. Cependant, aucune molécule ciblant spécifiquement le cuivre ne possède à ce jour une indication dans le traitement des cancers. C’est pourquoi des molécules chimiques ciblant le cuivre ont été développées. Elles inhibent fortement la prolifération des cellules tumorales d’origine pulmonaire, in vitro. Nous souhaitons caractériser les effets de cette molécule in vivo. Les lignées de cellules cancéreuses étudiées auront été au préalable modifié afin d'exprimer une protéine bioluminescente. Nous pourrons ainsi les suivre dans l’organisme de façon non invasive par imagerie de bioluminescence. Les molécules seront tout d’abord testées in vitro sur cellules tumorales en culture. Seules les molécules validées in vitro seront évaluées in vivo. Le modèle murin semble le plus approprié, il permet de se rapprocher d'un grand nombre des caractéristiques de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de l’oncologie, l’intérêt médical de développer de nouveaux composés chimiques capables d’interférer avec la prolifération cellulaire est évident. De nombreux cancers solides voient leur métabolisme du cuivre perturbé. Ces perturbations passent par des protéines spécifiques de ce métabolisme, ce qui en fait non seulement des biomarqueurs utilisables à des fins de diagnostic et ou de pronostic, mais également des cibles thérapeutiques intéressantes. À ce jour, plusieurs essais cliniques visent à évaluer l’efficacité de molécules "anti-cuivre". Compte tenu des pronostics encore médiocres de pathologies comme le cancer du poumon ou le cancer du pancréas, il reste une grande place pour le développement de molécules chimiques originales capables d’interférer avec les mécanismes de l’homéostasie du cuivre, et qui pourraient faire partie des chimiothérapies de demain. Ainsi notre nouvelle classe de molécules, ionophores de Cu(I), a un potentiel important en cancérologie. C’est pourquoi notre brevet vise à protéger l’application de cette famille de composés pour des applications en cancérologie.
Procédures
Injection des composés contenue dans les liposomes (Les injections dureront moins de 10 sec, sous anesthésie gazeuse) : Etude de toxicité : Nous effectuerons une injection intraveineuse (IV) hebdomadaire (durant 3 semaines = 3 injections) des composés intégrés à des liposomes sur 90 souris (durée maximale de la procédure 5 semaines). Dans le cadre de l’étude toxicité nous effectuerons 2 prélèvements bilans sanguins/animal sous anesthésie (1 bilan avant injection du traitement et 1 réalisé avant l’euthanasie). Etude d’efficacité tumorale : le nombre sera compris entre 200 et 400 souris Nous effectuerons une injection hebdomadaire de traitement (durant 3 mois = 12 injections) soit un total de 500 souris maximum (durée maximale de chaque procédure estimée à 4 mois par animal). Les composés seront injectés en IV (200 souris, soit 100 pour les tumeurs sous cutanées, 50 pour l’orthotopique, et 50 pour les métastatiques) En cas d’échec, 200 souris seront utilisées pour tester la voie IP : (200 souris, soit 100 pour les tumeurs sous cutanés, 50 pour l’orthotopiques, et 50 pour les métastatique) En cas d’échec, 200 souris seront utilisées pour tester la voie péri-tumorale ((200 souris, soit 100 pour les tumeurs sous cutanés, 50 pour l’orthotopiques, et 50 pour les métastatique) En cas d’échec, 200 souris seront utilisées pour tester la voie intratumorale ((200 souris, soit 100 pour les tumeurs sous cutané, 50 pour l’orthotopiques, et 50 pour les métastatique) Implantation tumorale : Implantation de cellules cancéreuses pulmonaires en sous-cutané. Implantations orthotopiques intra pulmonaire de cellules cancéreuses pulmonaires bioluminescentes, via un système ad hoc, sous anesthésie. Implantation orthotopiques mammaires dans le coussinet graisseux sous la mamelle sous anesthésie gazeuse. 21 jours post injection des cellules tumorales nous retirerons la tumeur mammaire sous anesthésie gazeuse. Après l’implantations orthotopiques intrapulmonaire ou orthotopiques mammaires, une injection sous-cutanée de buprénorphine sera réalisée.Suivi de croissance tumorale : pour les tumeurs sous cutanées, la croissance tumorale est mesurée 3/semaine avec un pied à coulisse sur animal vigile. Les procédures d’imagerie se feront sous anesthésie. Nous suivrons la croissance tumorale par bioluminescence 1 fois/semaine, nécessitant 1 injection de luciférine par voie IP sur animal vigile.De la tomographie rayons X sera effectuée avant l'euthanasie des animaux dans les procédures 3 et 4.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sont : immunodéficience des souris, douleurs et conséquences des injections sous-cutanées, intra-peritoneale et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies,tumeurs orthotopiques et metastases.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés puis des études histologiques des tissus (organes, tumeur métastase) après euthanasie des souris seront réalisées. Ces études sont absolument fondamentales. Elles permettront de vérifier in situ (dans les tumeurs des animaux, récupérées après euthanasie) l'efficacité de notre nouvelle classes de molécule ainsi que la non inocuité du processsus de vectorisation des molécules via des liposomes. De plus cela ces procédures, nous permettrons également d'investiguer le mécanisme d’action de nos composés. Nous réaliserons différents marquages immunohistochimiques de cible du métabolisme du cuivre et de cibles couramment étudié en cancérologie. Nous évaluerons les niveaux de cuivre cellulaires en intra tumoral, et en péri tumoral sur tissu ex vivo.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre de composés à évaluer, beaucoup d'essais in vitro visant à évaluer les caractéristiques chimiques et antiproliferatives de cette nouvelle classe de molécules ciblant le cuivre ont été effectués. De plus l’ensemble des liposomes contenant ou non les molécules d'intérêt ont été testées et validés in vitro en 2D sur des cultures de cellules tumorales.Seules les composé vectorisés dans des liposomes les plus performantes seront testées chez l’animal. Cette étape d’expérimentation animale permet de progresser dans la mise au point de nouvelles thérapies anti-tumorales et de procéder à leur évaluation pré-clinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail. La stratégie de réduction a été réalisée grâce aux études préliminaires in vitro. De plus, nous avons choisi de réaliser les etudes de pharmacocinétiques et d'efficacités avec 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats statistiquement fiables (ANOVA). Afin d'employer au mieux les animaux, les protocoles présentés ont été optimisés afin d'obtenir le maximum d'informations sans augmenter la douleur infligée aux animaux. La collection d'échantillons post-mortem permettra notamment des études à postériori des organes/tumeurs.
Raffinement
Des mesures de raffinement ont été prises afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse notamment en mettant en place des points limites. Dans le cadre de la réduction de la douleur, des injections d'analgésiques tels que la buprénorphine seront effectués. Nous pourrons également ajouter du paracétamol dans l'eau de boisson. Enfin les souris immunodéficientes seront hébergées dans un environnement adapté à leur déficience immunitaire c'est dire dans des armoires ventilées en pression positive, protégeant les souris en évitant la présence de pathogène. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation notamment via l’injection d’analgésique tel que la buprénorphine. Les souris immunodéficientes seront hébergées dans un environnement adapté à leur déficience immunitaire c'est dire dans des armoires ventilées en pression positive, protégeant les souris en évitant la présence de pathogène. De plus, toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effectuées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation notamment via l’injection d’analgésique tel que la buprénorphine. Les souris immunodéficiences seront hébergées dans un environnement adapté à leur déficience immunitaire c'est dire dans des armoires ventilées en pression positive, protégeant les souris ainsi les souris immunodéficiences évitant ainsi la présence de pathogène.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ce modèle de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo. Souris nudes de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale, avant le pic de production de leucocytes NK (natural killer) à l’âge de 8 semaines.
Evaluation de l’effet de molécules à visées thérapeutiques dans le modèle de souris autoimmune MRL/lpr
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée qui développe spontanément une maladie proche du lupus, elles subissent une lymphoprolifération, une insuffisance rénale et des lésions cutanées, puis reçoivent des prélèvements sanguins et une injection de molécules candidates sous anesthésie. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort à treize semaines au plus tard pour des analyses biochimiques, la souffrance sévère venant de la maladie que la lignée développe d'elle-même. Il affirme qu'étudier un "organisme entier" est "nécessaire", qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale et que la souris est la "meilleure et seule stratégie" disponible.
Objectifs
Le lupus érythémateux disséminé est une maladie auto-immune. Dans cette maladie, le système immunitaire qui en principe protège contre les microbes ou les substances étrangères à l'organisme, se dérègle et se retourne contre les propres cellules de l'organisme. L'inflammation chronique qui se produit dans le lupus peut virtuellement affecter de nombreux organes (articulations, peau, sang, cœur, vaisseaux sanguins, tractus gastro-intestinal, cerveau, poumons, etc.), ce qui rend ce syndrome parfois difficile à diagnostiquer et surtout à traiter. Il n'existe à ce jour aucun traitement du lupus. Les traitements disponibles ne traitent que les symptômes et pas les causes. En plus, leur administration provoque souvent des effets secondaires indésirables à moyen ou long terme (infections à répétition, troubles cardiaques, cancer). Il y a quelques années, une molécule a été découverte qui se comporte comme un puissant régulateur bénéfique de la réponse auto-immune dans le lupus. Cette molécule présente une activité protectrice chez des souris-modèles qui développent une maladie qui miment la maladie lupique. Ce candidat-médicament a montré des effets bénéfiques dans des essais cliniques chez des patients atteints de lupus. Son mécanisme d’action a été identifié au laboratoire. Ce n’est pas une molécule immunosuppressive qui réduit sans discernement toutes les réponses immunitaires. Il n’empèche pas l’organisme de développer une réponse immunitaire normale contre un pathogène, par exemple un virus. Il réduit seulement et très précisemment la réponse autoimmune. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouvelles molécules capables, comme ce premier candidat, de modifier l'évolution de la maladie de manière bénéfique et non immunosuppressive. Ces molécules que l’on espère plus puissantes et administrables par des voies naturelles (peau, muqueuses, voie orale), sont préalablement sélectionnées dans des tests cellulaires. Leur non-toxicité cellulaire est testée avant de les injecter à des souris modèles.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet auront un impact scientifique et clinique pour les patients touchés par le lupus. La découverte de nouveaux moyens d'intervention thérapeutique pour traiter une maladie incurable comme le LED améliorerait considérablement la qualité de vie et la durée de vie des patients en réduisant les effets secondaires causés par les médicaments symptomatiques (non ciblés sur un mécanisme moléculaire comme dans notre cas), les seuls disponibles à l'heure actuelle.
Procédures
Les souris recrutées pour l'étude pharmacologique subiront : - deux prélèvements de sang, avant le traitement et à jour 5, sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes) - une unique injection du traitement contrôle ou des molécules candidates ou de NaCl sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes).
Impact sur les animaux
Le modèle murin MRL/lpr développe une maladie auto-immune ressemblant au LED en raison d'une mutation du gène lpr. Généralement après l'âge de 11-12 semaines, les souris femelles et mâles commencent à développer progressivement une lymphoprolifération, une insuffisance rénale, une lymphadénopathie et des lésions cutanées. Ces effets associés à la maladie du lupus ont un impact sur le bien-être des souris. Les effets secondaires dus au prélèvement sanguin et à l'injection intraveineuse sont exceptionnels (œdème, inflammation, rougeur).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'âge de 13 semaines maximum pour analyse biochimiques et moléculaires.
Remplacement
L'utilisation de modèles de souris dans ce projet est cruciale car l'hypothèse selon laquelle le Lupus Erythémateux Diffus est une maladie multi systémique est plus que bien établie. Afin de comprendre le rôle joué par les différents organes, tissus et compartiments de l'organisme et les mécanismes qui sous-tendent leur communication au cours de la détermination et de la progression de la maladie, il est nécessaire d'étudier un organisme entier, une étude intégrée qu’il n'est évidemment pas possible de réaliser en utilisant des systèmes cellulaires (cellules isolées en culture ou organoïdes). Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané de MRL/lpr, représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. Il n'y a pas d'alternative disponible à un modèle non-animal qui puisse répondre à nos questions. Le modèle de la souris représente la meilleure et seule stratégie actuellement disponible pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour les humains.
Réduction
Le nombre d'animaux dans le projet est estimé selon les calculs de puissance considérant la nécessité de réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d'animaux est de n=10 souris/groupe et elle a été calculée en utilisant un logiciel. Les triplicats sont envisagés pour assurer la validation statistique des données. Si les résultats sont homogènes, ou tout à fait négatifs après un duplicat, un triplicat ne sera pas effectué, ceci afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un groupe social, pendant l'accouplement (1 mâle et 2 femelles) et pendant le traitement dans un groupe (5 souris/ cage). Les cages seront enrichies avec matériaux de nidation et tubes. Nous avons défini des points critiques de souffrance pour l'animal. Toutes les opérations invasives (injections et saignées) seront réalisées sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané MRL/lpr représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. D’autres modèles existent mais ils sont beaucoup plus lents à se développer et rendent les études de tests de médicaments très allongées (1 an-1,5 an en moyenne). Les animaux pour la reproduction seront recrutés à l'âge de 6-7 semaines (maturité sexuelle). Les animaux destinés à l'essai du médicament seront recrutés à l'âge de 11-12 semaines (souris adultes). A cet âge, la maladie a débuté mais les souris ne sont pas encore à un stade où leur système immunitaire est gravement altéré.
Développement d’une stratégie thérapeutique ciblant le métabolisme des cellules cancéreuses de prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
1 785 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur de prostate sous la peau puis des injections répétées pendant quatre à six semaines, pour tester des nanoformulations à base de carbone ciblant le métabolisme des cellules cancéreuses. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une douleur au site d'incision, une infection et une inflammation, et que toutes les souris sont mises à mort pour collecter des tissus. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement "pertinente" n'existe et qualifie la xénogreffe d'"indispensable", les retombées cliniques étant renvoyées au potentiel.
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) représente 1 276 000 nouveaux cas et 360 000 décès dans le monde par an (57 000 cas, 9 000 décès en France). Il est dépisté par mesure du PSA (Antigène Spécifique de la Prostate) et toucher rectal. Aux stades localisés, des traitements curatifs existent : la chirurgie, la radiothérapie et la Curiethérapie, et des ultrasons. Au stade métastatique, l’hormonothérapie est le traitement de 1ère ligne, avec cependant une problématique de taille, l’échappement hormonal, qui fait que le cancer reprend son développement. Il s’agit d’un cancer complexe et hétérogène pour un même patient et entre les patients, et impliquant de multiples processus moléculaires permettant aux cellules tumorales d’échapper à la mort, rendant les traitements difficiles. Pour améliorer la survie des patients de nouvelles avancées sont nécessaires, tant pour le diagnostic que pour le traitement de la maladie. Dans ce projet ciblé sur le cancer de la prostate, nous allons développer des molécules chimiques innovantes qui permettent de combiner de la chimiothérapie et de la thérapie génique qui permet d’éteindre un gène d’intérêt important pour le développement tumoral.
Bénéfices attendus
Notre projet va optimiser au niveau préclinique l’utilisation de nanoformulations à base de carbone pour un double ciblage cellulaire du métabolisme. Les retombées de notre projet ont des implications potentielles très importantes pour la clinique. Nos résultats permettront ainsi d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate. Du fait que les patients deviennent résistants aux thérapies anti-tumorales classiques dans ce cancer, il y a un besoin urgent de découvrir, de développer et valoriser de nouvelles alternatives thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients aux stades avancés de la maladie. Récemment, de nouvelles opportunités ont émanées de laboratoires de recherche travaillant sur des composés ciblant le métabolisme cellulaire et l’apport en oxygène des cellules tumorales. Nos résultats antérieurs supportent largement notre hypothèse et valident le rationnel de ce projet. Ainsi, nous pourrons apporter de nouveaux outils pour cibler le métabolisme des cellules cancéreuses grâce à ces propriétés uniques des nanoformulations à base de carbone.
Procédures
Les animaux recevront un implant tumoral sous-cutané au cours d’une intervention chirurgicale sous anesthésie générale. La chirurgie durera 5 minutes. Le volume tumoral sera suivi par mesure hebdomadaire à l’aide d’un pied à coulisse électronique. Ils recevront des injections sous anesthésie générale répétées sur 4 à 6 semaines, à raison de 2 injections par semaine durant environ 15 secondes.
Impact sur les animaux
Comme il s’agit de greffer des petits morceaux de tissus tumoraux, il est possible qu’il y ait une douleur au site d’incision, et une infection au point de suture. Une inflammation au site d’injection est aussi possible.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expérimentations afin de collecter un maximum de tissus afin de procéder à des analyses complémentaires et soulager les douleurs éventuelles.
Remplacement
Le cancer de la prostate, comme beaucoup de cancer, se caractérise par une grande variabilité cytogénétique entre les individus et hétérogénéité au sein même de la tumeur. La réalisation d'études précliniques fiables nécessite l'utilisation de modèles reproduisant fidèlement ces caractéristiques des tumeurs humaines. Or, les modèles d'étude se basant sur les lignées cancéreuses clonales ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. De même, pour les systèmes de culture 3D en cours de développement qui ne permettent pas encore d’obtenir des résultats projetables à l’homme. Par conséquent, aucune méthode de remplacement pertinente n'existe à ce jour. Il est donc indispensable d’utiliser le modèle de xénogreffe de tumeur de patients, seul capable de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les différentes étapes du projet, notamment en réduisant le nombre de réimplantation lors de la stabilisation des modèles de xénogreffe et en réalisant des études pilotes pour valider les voies d’administration des traitements. Le nombre d’animaux a été calculé statistiquement (calcul de puissance) afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs seront atteints, ou en absence d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus permettant de réduire encore les effectifs.
Raffinement
Le raffinement sera assuré par un enrichissement des cages pour le confort des animaux (des bâtons à ronger pour limiter les querelles ; des carrés de coton pour une nidification ; des igloos, permettant le jeu et le repos). Les souris seront nourries et hébergées en groupe ; elles ne seront séparées qu'en cas de comportement agressif avec induction de plaies. Nous diminuerons la douleur et l'angoisse liées à la xénogreffe en opérant sous anesthésie générale, avec une anesthésie locale au site d’implantation, et en appliquant une analgésie péri- et post-opératoire. Les animaux seront maintenus au chaud sur un tapis chauffant pendant la phase de réveil, phase pendant laquelle les animaux seront surveillés en continu. De plus, nous avons établi des points limite qui mettront fin à l’expérimentation en cas de souffrance et d’inconfort des animaux.
Choix des espèces
Les pathologies cancéreuses en général se caractérisent par une grande variabilité cytogénétique (variation de l’ADN des cellules tumorales) entre les individus et sont généralement hétérogènes au sein même de la tumeur. Or, jusqu'à présent, les modèles d'étude en oncologie se basent sur les lignées cancéreuses clonales qui ne reflètent pas l'hétérogénéité de la tumeur in situ. Par ailleurs, les modèles expérimentaux in vitro ne prennent pas en compte le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. Ainsi, malgré le développement de cultures 3D dont la mise en place reste difficile, les modèles animaux s'avèrent donc indispensables pour la recherche translationnelle en oncologie. Le modèle expérimental décrit dans ce projet nécessite l'utilisation d'animaux immuno-déprimés pour permettre la greffe d'un tissu étranger. Les greffes seront réalisées sur des souris jeunes âgées de 5 à 6 semaines afin d’avoir un système immunitaire encore très peu mature, permettant d’assurer une prise de greffe optimale.
Identification du rôle d’une hormone dans la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées par injection, pour étudier le rôle d'une hormone du fer dans la maladie du greffon contre l'hôte, complication fréquente des greffes de moelle. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau, et que les souris sont mises à mort pour prélever peau, intestin et foie. Il affirme qu'il est impossible de reproduire le système immunitaire in vitro et conclut que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet, les retombées thérapeutiques restant formulées au conditionnel.
Objectifs
La greffe de moelle est un traitement majeur de nombreux cancers du sang. Dans certaines formes de leucémies aiguës notamment, il s’agit du seul traitement permettant potentiellement d’obtenir la guérison. L’efficacité de la greffe de moelle est limitée par les complications de ce traitement. En effet, dans près de 50% des cas, la greffe de moelle se complique d’une réaction immunitaire appelée maladie du greffon contre l’hôte. La maladie du greffon contre l’hôte est caractérisée par une toxicité de certains organes : principalement la peau, le tractus gastro-intestinal et le foie. Cette complication est parfois gravissime puisqu’elle entraîne le décès du patient dans environ 15% des cas. Il s’agit de la principale cause de décès après greffe de moelle. De manière intéressante, il a été montré que la surcharge en fer chez les patients exacerbait la maladie du greffon contre l’hôte, suggérant un rôle du fer dans la pathogenèse. L’hormone clé de régulation du fer est principalement secrétée par le foie mais peut être exprimée localement dans la peau et intestin et joue un rôle majeur dans le recrutement de cellules immunitaires. Des données montrent l’expression de cette hormone dans la peau et l’intestin de patients souffrant de la maladie du greffon contre l’hôte. Le projet visera à comprendre le rôle de cette hormone et du fer dans le développement de cette maladie.
Bénéfices attendus
Dans la peau et l’intestin, l’hormone du fer pourrait avoir un rôle inflammatoire en induisant d’une part la surcharge en fer dans les cellules de ce tissu et d’autre part en activant les cellules immunitaires. Ce projet pourrait avoir des retombées en recherche fondamentale (meilleure connaissance des processus de la GVH) mais également en recherche appliquée en proposant de cibler l’hepcidine ou le fer en thérapeutique dans cette pathologie.
Procédures
Sur animaux vigiles : - Les souris seront irradiées pendant 3 minutes 30 (quelques secondes de contention pour les placer dans les boites d’irradiation). - 3 heures après irradiation: les souris subiront une injection intraveineuse caudale (100 ul ; temps de contention de 20 secondes). - 14 jours post-greffe : prélèvement sanguin de 50 ul via la veine mandibulaire par simple contention (20 secondes) à l’aide d’une lancette. - 1 mois post-greffe : Injection sous-cutanée (100 ul Buprénorphine à 0,1mg/kg) avec une aiguille de 26G 1⁄2 (temps de la réalisation impliquant la contention: 20 secondes). 30 minutes après, sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (1 minute par souris) à 4% avec un mélange d’air, 500ul de sang sera prélevé par voie rétro-orbitale à l'aide de capillaires héparinés (Hirschmann TM).
Impact sur les animaux
L’irradiation (sans transplantation) provoque (aux cinétiques étudiées) une rougeur de la peau. La maladie du greffon contre l'hôte va induire une perte de poids, une alopécie et une desquamation de la peau (formation « d’écailles »).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever la peau, l’intestin et le foie ainsi que le sang afin de mesurer différents paramètres biologiques.
Remplacement
Des tests in vitro sur des cellules de la peau ont été effectués en amont pour déterminer le rôle de l’hormone du fer dans l’inflammation. Nous avons en parallèle accés à des biopsies de patients atteints de la maladie du greffon contre l'hôte. Les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d'obtenir un modèle pathologique proche de celui développé chez l’homme. Au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » de nombreuses cellules immunitaires sont impliquées et leurs interactions ont un rôle fondamental dans le développement de la maladie. De plus, cette réaction du greffon congre l'hôte est caractérisée par le déclenchement de symptômes, uniquement observables in vivo. Il est donc impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des études in vitro. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
La durée et la dose de traitements utilisées seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les souris sont mises sous antibiotique pour éviter tout risque d’infection. Des analgésiques et anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin et en cas de mal être. Les animaux sont en groupes sociaux et disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.
Choix des espèces
Les réactions observées au cours de la « maladie du greffon contre l’hôte » chez la souris sont les mêmes que celles observées chez l'homme. Des souris adultes de de 8 à 12 semaines seront utilisées, car à cet âge, le système immunitaire est mature ce qui est indispensable à l’étude de la « maladie du greffon contre l’hôte ».
Etude des mécanismes de l’atteinte musculaire dans des modèles de titinopathies
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux implantations de pastilles sous la peau par une canule et trois prélèvements sanguins, pour tester si l'activation de l'autophagie par la rapamycine améliore une dystrophie musculaire d'origine génétique. Le porteur indique que les souris seront euthanasiées à la fin pour prélever leurs organes, et que l'insertion des pastilles peut provoquer une douleur ainsi qu'une sécheresse oculaire pendant les anesthésies. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier cette maladie, décrivant les cultures cellulaires comme incapables de reproduire une pathologie qui se développe trop lentement.
Objectifs
L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches thérapeutiques pour des maladies génétiques rares, les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Les dystrophies musculaires sont des maladies dégénératives du muscle qui conduisent à une perte progressive des fonctions motrices telle que la marche. La dystrophie musculaire étudiée dans ce projet est la dystrophie musculaire tibiale (TMD) qui est due à une mutation dans le gène de la titine. Bien que les mécanismes pathogéniques moléculaires de cette maladie ne soient pas entièrement compris, un certain nombre d’éléments suggèrent qu’une activation du mécanisme de nettoyage cellulaire appelé autophagie pourraient être bénéfique pour améliorer le phénotype. Notre étude vise à déterminer l’effet d’une activation de l’autophagie sur le phénotype de souris modèle de la TMD afin de comprendre si une modulation de l’autophagie pourrait consister en une approche thérapeutique pour les patients TMD.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous proposons de définir si l’activation de l’autophagie a un effet bénéfique sur la pathologie TMD. La molécule utilisée, la rapamycine (Sirolimus, Rapamune®) est une molécule ayant déjà l’autorisation d’utilisation chez l’homme. Il sera donc possible à la fin du projet de préparer un essai clinique chez les patients TMD pour valider son usage dans cette pathologie qui n’a pas de traitement à ce jour.
Procédures
Les interventions sur les animaux comprennent l'insertion des pastilles par une canule deux fois au cours du protocole et les prélèvements sanguins trois fois au cours du protocole.
Impact sur les animaux
Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont liées à la nature des actes réalisés: douleur liée à l’insertion des pastilles par la canule deux fois au cours du protocole et aux prélèvements sanguins. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Aucun modèle alternatif à des modèles animaux ne nous permet d’étudier les symptômes typiques des dystrophies musculaires pour répondre aux questions posées. Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro de la pathologie étudiée dans ce projet d’autant que les symptômes se développe lentement sur une période qui dépasse la durée possible de maintenance de cellules en culture.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Vu l’âge des animaux et la durée du protocole, nous réaliserons un maximum de prélèvements après la mort des animaux, plus que ce qui serait nécessaire pour la réponse à la question de ce projet. Ces prélèvements seront conservés et seront donc disponibles pour répondre à des questions qui pourraient émerger des résultats obtenus ou d’autres sources comme la littérature. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le critère choisi est une réduction du niveau des fibres musculaires ayant subi au moins un cycle de dégénérescence. Le test statistique utilisé donne N=10 par groupe.
Raffinement
Nous avons choisi d’administrer la molécule à l’aide de pastilles sous cutanées qui permettent la délivrance de la molécule pendant une période de 60 jours. Cette méthode permet un contrôle de la quantité de produit administré en assurant une distribution continue et une stabilité du produit et donc une meilleure reproductibilité. Cette méthode permet de limiter drastiquement la manipulation des animaux avec 2 implantations sur 4 mois au lieu de manipulations quotidiennes, évitant par la même du stress aux animaux.
Choix des espèces
Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car le modèle existant de la pathologie étudiée est sur cette espèce Les animaux seront utilisés au stade adulte à un âge permettant l’observation d’une atteinte histologique bien installée à la fin du protocole pour des souris non traitées avec la molécule.
preuve de concept thérapeutique dans les maladies glomérulaires prolifératives et liées à l’hypertension artérielle chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un anticorps, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, subissent pour certaines une néphrectomie ou la pose de pastilles induisant une hypertension, et passent en cage métabolique, avant d'être tuées pour analyser les reins. Le porteur décrit une douleur minime aux injections intrapéritonéales et les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension induites. Il affirme que les analyses in vitro et in silico ne conviennent pas à l'étude des maladies glomérulaires, testée ici avant un éventuel usage chez l'humain.
Objectifs
Les glomérulopathies sont un groupe de maladies touchant le glomérule. Le glomérule fait partie du rein et est à la base de la filtration du sang et de la production de l'urine. Les glomérulopathies conduisent donc rapidement à l'insuffisance rénale. Un type de cellule du glomérule, les cellules épithéliales pariétales (CEP), joue un rôle majeur dans ces glomérulopathies. En effet, l'activation des CEP est à l'origine des lésions du glomérule qu'on retrouve dans les glomérulopathies. Nous avons à disposition un anticorps bloquant l’activation de ces CEP. Nous voulons tester cet anticorps dans des modèles murins de glomérulopathies afin d’évaluer sa capacité à prévenir l’apparition de l’insuffisance rénale avant une éventuelle utilisation comme médicament chez l'humain.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra mettre en évidence l'efficacité d'un nouveau traitement dans deux types de glomérulopathies qui sont deux causes majeures d'insuffisance rénale terminale. Il permettra également de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques de ces glomérulopathies et notamment le rôle des CEP dans celles-ci.
Procédures
104 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti-claudin 1 humaine dans un modèle de glomérulonéphrite proliférative extra-capillaire, le modèle NTS" subiront une injection de l'anticorps d'interêt ou de son contrôle en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 2 ou 3 semaines en fonction de la procédure, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces 104 mêmes souris subiront trois injections en rétro-orbitaire de NTS 3 jours de suite aprés anésthésie à l'isoflurane, cette injection dure 30 secondes. Ces souris seront également mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures et enfin subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, qui dure 2 minutes. Ces 104 souris de la P1 subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 104 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention. 58 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti claudin 1 humaine dans un modèle d'HSF, le modèle DOCA salt" subiront une uni-néphrectomie et la mise en place de pellet doca salt sous anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, cette intervention dure 25 minutes. Ces 58 souris subiront une injection de l'anticorps anticlaudin 1 humaine ou de son isotype en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 58 jours, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces mêmes 58 souris seront mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures pendant 6 semaines et subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine. Ce prélèvement dure deux minutes. Enfin, ces 58 souris subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 58 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention.
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress d'être isolées pendant le passage en cage métabolique. Elles subiront une douleur minine lors des injections intra péritonéales. Lors des procédures plus invasives comme les injections rétro orbitaires, la néphrectomie ou la mise en place des pellets DOCA, elles seront anesthésiées à l'isoflurane et analgésiées. Enfin, elles subiront les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension artérielle induites par les modèles expérimentaux
Devenir
Etant donné que les reins de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.
Remplacement
le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l'étude des maladies glomérulaires car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu. Des tests in vitro ont été réalisés afin de sélectionner les clones d'anticorps, ces tests ont permis de mettre en évidence leur spécificité et leur efficacité d'anticorps bloquant.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un risque alpha de 5%, une puissance de 95%, une moyenne du groupe contrôle de 12, une moyenne pertinamment différente attendue de 8 dans le groupe traité, une déviation standard de 4 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 26 animaux par groupe requis. 3 animaux de plus sont prévus pour pallier les risques du modèle expérimental (mortalité liée à la chirurgie odans le modèle DOCA salt).
Raffinement
Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises: 1)Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bi-hebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse + buprénorphine . 3)Les procédures invasives tel que les injections retro-orbitaires seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et les souris recevront un traitement analgésiques qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel. 5) une double litière sera mise en place pour pallier à la production excessive d'urine par les souris du modèle DOCA salt, et les cages seront changées 3 fois par semaine.
Choix des espèces
Les mécanismes des maladies du rein sont similaires chez l'homme et la souris et ce sont dans les maladies du rein qu'il existe un interet à bloquer l'activation des cellules appelées CEP et donc à utiliser l'anticorps anti claudin 1. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 à 6 mois car il faut des adultes au système immunitaire mature (>2 mois) et suffisamment jeunes pour ne pas observer des maladies du rein liées au vieillissement.
Evaluation de la protection des poulets vis-à-vis de la colibacillose au moyen d’autovaccins administrés aux poulets ou aux poules reproductrices
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
693 poulets et poules reproductrices vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Les oiseaux sont inoculés avec la bactérie Escherichia coli, l'infection pouvant provoquer un abattement, un retard de croissance et, dans les cas graves, une septicémie mortelle, avant qu'ils soient tués pour autopsie et réisolement bactérien. Le porteur indique surveiller les animaux quatre à cinq fois par jour et tuer tout individu prostré incapable de se déplacer. Il affirme que le vaccin commercial existant est peu efficace et que l'évaluation des autovaccins "nécessite" le recours aux oiseaux.
Objectifs
La colibacillose aviaire, due à certaines souches d’Escherichia coli appelées APEC (Avian pathogenic E. coli) est la pathologie bactérienne la plus fréquente chez les volailles. Elle entraine une utilisation fréquente d’antibiotiques, contribuant ainsi à la sélection et à la diffusion de gènes de résistance chez l’animal et dans l’environnement. Actuellement, en France et dans le monde, un vaccin commercial existe mais son utilisation sur le terrain semble souffrir d’une efficacité limitée. Une problématique importante de la colibacillose tient à la diversité des souches APEC. Plusieurs auteurs ont tenté d’identifier des marqueurs de virulence pour différencier les souches APEC des E. coli non pathogènes, dans un but diagnostic. Cependant, à date, il n’est pas possible de diagnostiquer toutes les souches APEC, aucun gène particulier ne permettant de les caractériser. Dans deux saisines précédentes, nous avons mis au point des modèles de reproduction de la colibacillose chez le poussin et apporté un début de preuve de l’intérêt de l’immunisation passive des poussins (i.e au travers d’autovaccins administrés à leur mère; un autovaccin est un vaccin fabriqué à la demande à partir d'E. coli isolée d'un élevage et apliqué dans cet élevage; dans une définition plus large, c'est un vaccin fabriqué à la demande à partir d'E. coli caractérisée à des fins de recherche). Dans le présent projet, nous voulons capitaliser sur ces résultats et aller plus loin dans l’utilisation des autovaccins. Des essais seront réalisés en conditions protégées afin d’évaluer l’efficacité d’autovaccins (une ou plusieurs souches) sur des animaux autres que des poussins (poulets de 5 semaines). Pour cerner les mécanismes de protection, l’impact de la vaccination sur le portage de E. coli sera analysé. De plus, des oiseaux reproducteurs seront auto-vaccinés (ou non) et leur réponse immunitaire et sa persistance, ainsi que la transmission des anticorps vaccinaux aux poussins, et la protection conférée vis-à-vis d‘une inoculation des poussins par E. coli seront étudiés. Différentes conditions expérimentales pourront être testées.
Bénéfices attendus
La colibacillose aviaire est la pathologie bactérienne la plus fréquente chez les volailles. Elle entraine une utilisation fréquente d’antibiotiques, contribuant ainsi à la sélection et à la diffusion de gènes de résistance chez l’animal et dans l’environnement. Du fait de la diversité génétique des bactéries responsables (E. coli), aucun moyen de prévention efficace n’existe car le vaccin commercial est peu efficace. Les autovaccins peuvent contribuer à améliorer cette situation, à condition de bien caractériser et maitriser les souches d’E. coli qu’ils contiennent. Ce projet vise à mieux évaluer l’efficacité d’autovaccins, utilisés soit pour protéger directement les poulets, soit indirectement via l’immunisation passive (vaccination des poules pour protéger les poussins). Il vise également à mieux cerner les mécanismes de protection en analysant l’impact de la vaccination sur le portage de E. coli.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront : - Inoculations d’E. coli par voie sous cutanée (poussins) ou intra-trachéale (poulets). - Prélèvement de sang d’1 ml sur 20 poules - Pesée des animaux avant inoculation d’E. coli et en fin de période de suivi
Impact sur les animaux
Les inoculations d’E. coli aux poulets, surtout dans les groupes ne recevant pas d’autovaccins, sont susceptibles de les rendre malades. Les symptômes peuvent se manifester par un retard de croissance, un abattement de l'animal (léthargie) et, dans les cas les plus graves, par une septicémie entrainant la mort.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort parce que des autopsies doivent être pratiqués pour constater des lésions et effectuer des réisolements bactériens
Remplacement
La colibacillose aviaire, due à certaines souches de la bactérie Escherichia coli (E. coli), est la pathologie bactérienne la plus fréquente chez les volailles. Elle entraine une utilisation fréquente d’antibiotiques, contribuant ainsi à l’aggravation de la résistance aux antibiotiques. Du fait de la diversité génétique des bactéries responsables, aucun moyen satisfaisant de prévention n’existe car le vaccin commercial disponible est peu efficace. Les autovaccins (vaccin inactivé produit à partir d’E. coli sélectionnées) peuvent contribuer à améliorer cette situation. Ce projet vise à mieux évaluer l’efficacité d’autovaccins, utilisés soit directement pour protéger les poulets, soit indirectement via l’immunisation passive (vaccination des poules pour protéger les poussins). Il nécessite, de fait, l’utilisation d’animaux.
Réduction
Au total, 693 animaux (52 poules, 6 coqs et 635 poulets) seront utilisés dans les quatre procédures du projet. Le nombre de poulets a été fixé au minimum acceptable pour atteindre les objectifs du projet, à partir de données obtenues de deux précédents projets. Quant au nombre de poules, il a été fixé pour produire suffisamment d’œufs et donc de poussins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages (poules) ou en isolateurs (poussins et poulets) et bénéficieront d’enrichissements appropriés (plateformes et éléments de perchage). Nous n’attendons pas d’effets indésirables des autovaccins administrés aux animaux. Les inoculations aux poussins sont susceptibles de les rendre malades. Pour détecter une éventuelle souffrance des animaux, ils seront surveillés de près (4 à 5 passages par jour en plus d’observations par caméra) pour détecter des comportements anormaux (abattement ou prostration par exemple). Tout animal prostré ne pouvant se déplacer après sollicitation sera mis à mort.
Choix des espèces
Le poulet est la production cible de la colibacillose aviaire Poussins d’un jour (en fait, d’un à deux jours en fonction du rythme d’éclosion), poulets de 5 semaines et poules reproductrices