Recherche appliquée

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur, reçoivent des injections de cisplatine et, pour 72 d'entre elles, subissent sous anesthésie une lésion musculaire provoquée par le froid. Le projet se présente comme une contribution aux 3R, censé vérifier si des cultures cellulaires pourraient un jour remplacer la souris, mais le porteur précise que les souris ne seront pas remplacées ici et que la comparaison avec le modèle animal reste "nécessaire". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Il est évident que les cellules tumorales sont dans un environnement tridimensionnel dans les organismes vivants, recréer l’architecture correcte de tissu in vitro pour imiter l’effet du microenvironnement tumoral (TME) n’est pas une entreprise simple. Malgrès d'importants efforts qui ont été fait dans la création de modèle 2D et 3D dans ces analyses, ces methodes montrent encore d'importantes limitations. Les lignes directrices actuelles recommandent que les chercheurs qui utilisent l’expérimentation animale doivent se demander si et par quelle configuration alternative les animaux qu’ils envisagent d’utiliser pourraient être remplacés, si et comment leur nombre peut être réduit, et si et comment l’expérimentation animale pourrait être raffinée, c’est-à-dire être plus fiable avec la réduction du stress animale tout en obtenant une meilleure information avec un nombre inférieur d’animaux. Dans le but de fournir des bases empiriques à la recherche épistémologique, nous allons utiliser en parallèle des modèles animaux et cellulaires pour étudier la même question, c.a.d. comment le TME peut influencer la réponse tumorale aux agents chimiothérapiques. Nos resultats permettront de savoir si l'etude du TME des cellules cancereuses fait chez l'animale peut etre remplacer par des études in vitro.

Bénéfices attendus

La pertinence du TME pour les études cliniques et biologiques sur la pathophysiologie tumorale est maintenant établie, bien qu’étant une réalisation récente. En effet, le comportement des tumeurs et leur interaction avec l’hôte, allant de la réponse immunitaire à la cachexie induite par le cancer, sont si profondément affectés par le TME, que les études actuelles sur la progression du cancer et la réponse à la chimiothérapie ne peuvent plus ignorer cette question. Afin d'étudier la reproductibilité des modèles par des cultures cellulaires et tirer des conclusions de la comparaison de résultats issus de modèles in vitro et in vivo, nous avons la nécessité de l’utilisation des modèles animaux. Le but majeur de notre étude est de vérifier si les effets de la cisplatine sur la tumeur sont reproductible d'un modèle in vivo à un modèle in vitro, même en présence d’un microenvironnement tumoral assai réduit ou simplifié in vitro. La comparaison avec le modèle in vivo joue un rôle central dans les conclusions de l’étude et cela est le but premier de notre projet. Cela permettra d'établir des critères plus précis et spécifiques suivant les modalités des 3r, cad le remplacement (total avec le modèle in vitro), la reduction (nombre de souris), et le raffinement.

Procédures

Les souris seront soumis à differents types d'interventions: 1 injection de solution en SC sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 4 injections en IP (à jours 7,11, 14 et 17) sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 1 chirurgie, une blessure par le froid sous anesthesie à jours 14, la chirurgie est estimée à 6 min et le reveil entre 30 et 40 min. Elle concerne 72 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuissances attendus chez les souris sont: masse tumorale dans la region dorsale des souris, fatigue et un stress, toxicité de la cisplatine, douleur musulaire suite à la blessure par le froid dans les premiers jour suivant l'intervention. Ces effets indésirables seront surveillés quotidiennement selon nos critères de point limite afin de mieux gérer le bien-etre des animaux.

Devenir

Toute le souris sont mises à mort à la fin de la procédure 1. La mise à mort se fera selon la réglementions européenne en vigueur. Afin de valider l'hypothèse qui est de savoir si les études fait chez l'animale peut être remplacer par des études in vitro dans l’analyse du microenvironnement tumorale(TME) des cellules cancéreuses, l'analyse des diffèrent tissus post mortem obtenu sur ces animaux est nécessaire afin de les comparer aux résultats que nous obtiendrons sur les études de culture cellulaire.

Remplacement

L'objectif général du projet est d'étudier la reproductibilité du modèles souris par rapport au modèle de cultures cellulaire. Nos objectifs spécifiques sont de voir si on peut mesurer les mêmes effets d’un puissant agent chimio thérapeutique, la cisplatine, sur les cellules tumorales in vivo et in vivo, en comparant les résultats obtenus sur un modèle souris porteur de tumeur aux résultats sur une culture de cellules isolées. Pour cela, nous allons développer un système de cultures cellulaires C26 en 2D ainsi que 3D lesquelles permettront de se rapprocher le plus possible au microenvironnement tumoral in vivo. Les souris ne seront pas remplacées dans cette étude. En revanche, les résultats nous dirons si et jusqu’à quel point dans le future nous pourrons remplacer le modele animal, dans des études similaires futures

Réduction

Pour estimer le nombre minimum d'animaux nécessaire, nous avons effectué un calcul statistique réitératif. De plus, nous disposons de l’expérience préalable formalisé dans l’appréciation rétrospective avec ce même modèle animal. De cette approche, nous avions prévu que 18 souris pour chaque condition expérimentale pour un totale de 216 souris, avec un niveau de confiance du 95% et une puissance de 80. Les outils statistiques et informatiques que nous mettons en place sur la base de notre expérience avec ce type de modèle permettront de réduire le nombre de manipulations en exploitant au mieux les données obtenus par chaque expérience.

Raffinement

Pour améliorer les conditions de vie des souris et leur éviter le stress, les pratiques suivantes seront mises en place. Nous avons défini les variables et la méthode d’évaluation quantitative du point limite au-delà duquel les animaux recevront un analgésique ou seront euthanasiés : des intervention différentes (de l’administration d’analgésique jusqu’au l’euthanasie) seront mises en place selon le score obtenue. A savoir que ce modèle expérimental a une cinétique de développent de la pathologie très bien connue, permettant de programmer les expériences de maniere à ne pas arriver aux points limites. Pour des pratiques plus invasives, tel que la génération d’un dommage musculaire afin d’étudier la régénération , l’anesthésie totale sera pratiquée, suivie d’un traitement analgésique. L’expérimentation animale sera effectuée par une équipe entrainée à cette technique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité (3 souris par cage minimum). L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid. Afin de diminuer le stress des animaux, une maison en carton sera ajoutée dans la cage. Enfin, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer aux manipulations et ainsi diminuer leurs stress le jour des experimentations.

Choix des espèces

La souche BALB/c est la seule compatible avec la tumeur 26, qui a été sélectionné car non métastatique, et sur cette base nous avons privilégié cette souche.. La connaissance détaillée du modèle nous permet d’une part d’exploiter au maximum les informations expérimentales obtenues et d’autre parte d’avoir une sensibilité particulaire pour évaluer tout signe de souffrance ou malaise de ces souris en présence de tumeur.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection intrapéritonéale de la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, puis développe dans l'abdomen une masse parasitaire qui entraîne une prise de poids et des difficultés de locomotion, avec un risque d'ulcération de la peau par frottement contre la cage. Toutes sont tuées pour récolter cette masse parasitaire, l'objectif étant de maintenir la souche au laboratoire et de produire du matériel pour des outils de diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'existe et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser la souris.

Objectifs

L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires. E. multilocularis est l’agent causal chez l’Homme de l’échinococcose alvéolaire, maladie rare mais mortelle si non traitée. La transmission à l’Homme se fait exclusivement par voie orale, suite à l’ingestion d’œufs de parasites présents dans l’environnement sur des végétaux souillés, au contact du sol contaminé mais aussi de manière indirecte par ingestion d’œufs manuportés après contact avec le pelage souillé de carnivores porteurs du parasite. Le nombre de cas humains diagnostiqués chaque année en France reste faible, cependant on note une augmentation au cours des dix dernières années de ce nombre qui est passé de 15 à 30 cas en moyenne par an. Le maintien en laboratoire d’isolats d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires nous permettra de disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire au niveau de la masse larvaire des protoscolex (forme initiale du futur ver qui se développera dans l’intestin des hôtes principaux).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à l’exposition de l’homme à ce parasite. Les protoscolex produits permettront de reproduire sur des renards en captivité le cycle parasitaire d’ Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

Les souris vigiles ne recevront qu'une seule injection intrapéritonéale (intervention ne prenant que quelques secondes) de la forme larvaire du parasite (0,5 ml) sans anesthésie préalable.

Impact sur les animaux

L'infestation par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. Exceptionnellement, des cas d’ulcération cutanée liés aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage peuvent être constatés lors de la surveillance journalière. Dans ce cas, les animaux seront immédiatement mis a mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la massse paraistaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour produire des protoscolex en dehors de l’infection des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 60 souris par an, soit 300 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de developpement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de protoscolex qui est de 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des souches de répéter l’infestation tous les deux/trois mois sur des lots d’environ 10 souris. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'un projet concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois,..) dans les cages. Les animaux seront pesés mensuellement jusqu’à 4 mois puis à partir du 5eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 80 gr. De la nourriture sera diposée au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal. De même, un point limite de temps a été fixé à 6 mois, point au-delà du quel les animaux sont mis à mort même si le poids limite n'a pas été atteint.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement Arvicola terrestris, communément appelé Campagnol terrestre ou encore Rat taupier. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour produire des protoscolex, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire facilement utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'autres projets concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées et ne sont donc entrées dans aucune procédure. Les animaux utilisés peuvent donc avoir des poids compris entre 20 et 30 grammes.

27 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une souche atténuée de peste porcine africaine à visée vaccinale. Les animaux immunisés puis éprouvés avec une souche virulente subissent jusqu'à 22 prélèvements de sang sur huit à quatorze semaines, tandis que les cochons non immunisés développent une infection décrite comme "inexorablement fatale" et sont tués à six jours avant d'en mourir. Le porteur indique un épisode de fièvre et une baisse de croissance après inoculation de la souche atténuée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse du porc à l'infection et que seuls les suidés y sont sensibles.

Objectifs

Le laboratoire a découvert et breveté une souche atténuée de virus de la Peste Porcine Africaine (PPA) à potentiel vaccinal. Cette souche (ASFV-989) a été produite initialement sur cellules prélevées sur porcs (macrophages alvéolaires). En vue du développement de la souche ASFV-989 comme vaccin contre le PPA, il est indispensable de pouvoir produire cette souche sur lignée cellulaire (cellules se multipliant de manière continue). Nous avons donc entrepris l’adaptation de la souche ASFV-989 sur cellules de lignée immortalisées à partir de cellules de testicules de porcs (Swine-Testis ,ST). Après 20 passages sur cellules ST, la souche ASF-989 a montré une bonne adaptation sur ce support cellulaire. L’adaptation à ces nouvelles cellules a cependant conduit à des modifications génétiques de la souche. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer si l’adaptation de la souche ASFV-989 aux cellules ST n’a pas modifié ses caractéristiques en termes de sécurité et de protection vaccinale en étudiant : (i) d’une part les réponses cliniques et immunovirologiques induites par l’inoculation de la souche ASFV-989-ST chez le porc, par voie intramusculaire (IM) ou oronasale (ON), et la persistance à long terme de la souche atténuée chez les animaux inoculés, et d’autre part (ii) la protection vaccinale vis-à-vis d’un challenge infectieux avec la souche virulente Georgia 2007/1

Bénéfices attendus

La peste porcine africaine est une maladie virale qui se caractérise par des signes cliniques tels qu’une perte d’appétit rapide et un abattement des porcs en lien avec une forte fièvre, ainsi que des hémorragies cutanées, diarrhées, etc…, qui vont induire une forte mortalité chez les porcs domestiques comme chez les sangliers européens. Pour le moment, il n’existe pas de vaccin commercialisé contre la PPA. De ce fait, la gestion des foyers de PPA repose chez les porcs domestiques sur des mesures de restriction de mouvement des animaux et des abatta ges massifs. Chez les sangliers sauvages, la gestion des foyers est complexe et repose sur la mise en place de clôtures, de piégeages et d'abattages. D’un point de vue sociétal, ces mesures de gestion sont de plus en plus critiquées. La disponibilité d’un vaccin pourrait offrir une alternative plus acceptable. Si les résultats de notre projet sont conformes aux attendus en termes de sécurité et d’efficacité vaccinale, la souche ASFV-989ST pourrait être utilisée à terme comme vaccin, à la fois chez les porcs domestiques (après immunisation IM), mais aussi chez le sanglier (vaccination par voie orale par appâts).

Procédures

Au cours de la procédure 1, les animaux seront inoculés par voie intramusculaire ou oronasale par la souche ASFV-989ST puis seront challengés, 1 mois plus tard, par la même voie par la souche virulente Georgia. Le groupe de porc non-immunisé sera seulement inoculé par la souche Georgia par voie IM. Les inoculations intramusculaire ou oronasale sont des actes rapides qui prennent moins d'une minute. Les animaux immunisés seront soumis à un toltal de 15 prélèvements sanguins au cours des 8 semaines de l’étude. Les animaux non-immunisés seront soumis 4 prélèvements sanguins au cours de la période qui précède et suit le challenge par la souche Georgia. Les prises de sang sont réalisées par des animaliers pratiquant ces prélèvements très régulièrement, la durée des prises de sang n'excède donc pas 1 à 2 minutes Au cours de la procédure 2, le groupe immunisé sera inoculé avec la souche ASFV-989ST par voie IM (durée des inoculations de moins d'1 minute). Les animaux de ce groupe seront soumis à un total de 18 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi. Les animaux non immunisés seront soumis quant à eux à 22 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi (durée des prises de sang d'1 à 2 minutes).

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation de la souche ASFV-989ST (par voie IM ou ON), les porcs devraient présenter un épisode fébrile de quelques jours pendant lesquels leur consommation alimentaire et leur croissance devraient être diminuées. Chez les animaux non immunisés, le challenge avec la souche virulente Georgia conduit à des hyperthermies et à des sypmptômes cliniques caractéristiques de la maladie. L’issue de cette infection étant inexorablement fatale chez les animaux non-immunisés, ceux-ci seront mis à mort à J6 post-challenge avant que les animaux ne meurent de l’infection ou plus précocement si nécessité, en cas d’atteinte d’un point limite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de chaque procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.

Remplacement

Aucune méthode in vitro d’évaluation directe de la réponse du porc à l’infection ou à la vaccination par le virus de la PPA n’est disponible.

Réduction

Les lots immunisés / challengés seront constitués chacun de 6 porcs et les lots témoins et contrôle positif de 3-4 porcs. Cet effectif est le minimum nécessaire par groupe pour des analyses statistiques robustes compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés (croissance, virémie, réponses immunes, etc.). Les tests statistiques utilisés seront, pour une distribution normale : les tests ANOVA et de Student ; et pour une distribution ne suivant pas la loi normale : les tests de Kruskall-Wallis et Kolmogorov-Smirnov.

Raffinement

Hébergement des animaux en groupes stables et sociaux avec enrichissement du milieu. Pour les prélèvements sanguins : contention sans lasso tant que la taille des animaux le permet. Récompense (grenadine) distribuée après chaque prise de sang. Après inoculation par la souche ASFV-989ST et challenge avec la souche virulente Georgia : suivi clinique renforcé selon la grille de score clinique définie pour la PPA.

Choix des espèces

Etant donné que seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le virus de la PPA, il est indispensable d’avoir recours aux porcs pour cette étude (=espèce cible). Les animaux sont sevrés à 4 semaines d’âge. Les animaux auront 6 semaines d’âge au moment de la première inoculation. A 6 semaines, le porc présente d’un point de vue physiologique un système immunitaire mature.

5 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal sain subit six séances sous un dispositif d'assistance respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après, sous anesthésie générale. Le porteur cherche à vérifier l'absence de lésions pulmonaires comme des atélectasies avant de proposer le dispositif à des patients, et prévoit la mise à mort des cinq animaux pour confirmer les images par histologie des poumons. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des conditions cliniques et retient le porc pour la taille de ses poumons proche de celle de l'humain, jugeant leur prélèvement "indispensable".

Objectifs

De nombreuses pathologies respiratoires, telles que la mucoviscidose, la broncho-pneumapathie chronique obstructive ou les dilatations de bronches nécessitent une prise en charge pluridisciplinaire. La physiothérapie respiratoire est proposée aux patients souffrant d’affections respiratoires dans le but de gérer la dyspnée, contrôler les symptômes, améliorer la mobilité et la fonction, dégager les voies respiratoires et optimiser la toux. Un nouveau dispositif d’assistance en physiothérapie respiratoire a été développé. Avant de pouvoir le tester chez les patients, une étude sur l’effet du dispositif en utilisation intensive grâce à des données tomodensitométriques thoraciques avant, pendant et après traitement sur un modèle animal sain est nécessaire afin de s’assurer de l’absence de dommage sur le poumon notamment d’atélectasies, qui correspondent à un collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume.

Bénéfices attendus

Ce projet d'étude de la tolérance d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire permettra de s'assurer de l'absence d'effets délétères sur le poumon malgré une utilisation intensive. Les résultats de cette étude permettront de proposer sereinement ce dispositifs aux patients souffrant de pathologies pulmonaires chroniques.

Procédures

Ce projet se déroule sur 5 jours après la semaine d'cclimatation des animaux. Chaque animal sera soumis à 6 sessions de 15 minutes de mise sous dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire avec des acquisitions tomodensitométriques avant, pendant et après l'utilisation du dispositif. Les 6 sessions seront réparties sur 3 jours (à J0, J2 et J4): une session en début de matinée et une en fin d'après-midi pour chaque journée expérimentale. La durée de chaque session sera d'environ 40minutes: 20 min de préparation de l'animal et 15 min de mise sous dispositif.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui pourraient survenir sont des lésions pulmonaires dont des atélectasies (collapsus du tissu pulmonaire avec perte de volume respiratoire). L'étude est menée pour s'assurer de leur absence. Les animaux seront imagés avant, pendant et après les sessions de physiothérapie respiratoire, ce paramètre sera évaluer tout au long de l'étude.

Devenir

Tous les animaux du projet (n=5) seront mis à mort à la fin de la procédure. Le prélèvement des poumons est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par les analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d'évaluer les effets sur le poumon d'un dispositif d'assistance en physiothérapie respiratoire. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit en veillant toutefois de travailler sur un nombre suffisant pour obtenir des résultats fiables. Les sessions d'assistance respiratoire seront de 6 par animal, ce qui permettra d'avoir 30 sessions au total. La plupart des analyses dépendront de données qualitatives, par expérience, un nombre de 30 permettra d'obtenir des résultats interprétables, en tenant compte de la variabilité interindividuelle et de l'effet de répétition sur chaque individu.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les gestes interventionnels seront toujours réalisés sous anesthésie générale, par du personnel formé, permettant un temps interventionnel réduit au maximun, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Le bien-être de l'animal sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. L'acclimatation des animaux sera d'une semaine avant d'entrer dans le protocole. Des observations quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles sont enregistrés et permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Des controles biquotidiens en postopératoire sur toute la durée de la procédure (5 jours) seront réalisés par une personne compétente avec évaluation du bien-être et de la douleur. L'évolution du score permet de noter l'amélioration ou l'aggravation de l'état de l'animal et de prendre des mesures appropriées (points limites). Chaque paramètre est ainsi quantifiable, les scores sont additionnés et l'atteinte d'un score supérieur ou égal à 6 définit un point limite et engendre la sortie de l'animal du programme et sa mise à mort après consultation du vétérinaire référent si nécessaire. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondis, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques, le recours à l'animal est donc nécessaire pour atteindre cet objectif. Le modèle animal choisi est le Porc qui présente l’avantage d'avoir des poumons et des bronches de taille comparable à ceux de l'Homme. Le dispositif médical testé ne serait pas compatible avec un animal de plus petite taille. De plus, l'anatomie et la physiologie de l'appareil respiratoire du Porc présentent de grandes similitudes avec l'Homme.

40 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est sédaté puis reçoit une injection intramusculaire unique d'un produit vétérinaire au fer, avant mise à mort et prélèvement du muscle pour mesurer l'absorption. Le porteur précise que ce test in vivo est exigé par la Pharmacopée Chinoise pour l'autorisation de produits déjà commercialisés en France, et qu'un de ses objectifs est de démontrer que les contrôles physico-chimiques français suffiraient pour s'en affranchir. Il conclut qu'aucune méthode substitutive n'existe et que le recours au lapin reste "nécessaire", tout en reconnaissant travailler à le rendre inutile.

Objectifs

Les injections de fer sont très souvent utilisées chez les jeunes animaux de rente (porcins, ovins, caprins, bovins…) dans le cadre de la prévention et du traitement de l’anémie ferriprive après la naissance. Dans le cadre de l’élevage porcin, les injections de fer sont presque systématiquement réalisées dans les 3 jours suivant la naissance. La Chine est le 1er producteur de porcs au monde et un marché important pour les industries pharmaceutiques vétérinaires. Ce projet est réalisé dans le cadre de demande d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) en Chine de produits vétérinaires injectables composés de fer, possédant déjà des AMM en France. A chaque libération d’un nouveau lot de ces produits en France, un contrôle qualité est réalisé à l’aide de différents tests physico-chimiques décrits dans la Pharmacopée Européenne. Pour la commercialisation sur le marché chinois, les autorités chinoises demandent la réalisation d’un test in vivo d’absorption du fer au point d’injection chez le lapin. Ce test fait partie des tests de contrôle qualité réalisés lors de la libération de lots de produits contenant du fer en Chine. Il permet de valider la qualité du lot en analysant l’absorption du fer après une injection unique et de s’assurer que la quantité de fer non absorbée au niveau du point d’injection ne dépasse pas 20% de la quantité injectée. Le but de cette vérification est de s’assurer que chaque lot commercialisé est conforme, et que le produit est sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. Ce projet a donc 2 objectifs : 1) la réalisation du test d’absorption de fer au point d’injection demandé par les autorités chinoises dans le cadre d’une demande d’AMM. 2) démontrer que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapins lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Bénéfices attendus

1) Obtenir l’autorisation de mise sur le marché en Chine des produits testés. Ainsi, chaque lot commercialisé et autorisé sera conforme et sûr, aussi bien pour la santé animale que pour la consommation humaine. En effet, ce projet va permettre de valider en Chine des produits permettant de lutter contre l’anémie ferriprive rencontrée dans les élevages. 2) Prouver que les contrôles physico-chimiques réalisés en France sont suffisants pour pouvoir s’affranchir de l’utilisation de lapin lors de la libération de chaque lot de produit commercialisé sur le marché chinois.

Procédures

Les animaux utilisés seront sédatés avant de recevoir une injection unique de produit testé. La sédation va permettre de diminuer le stress de l’animal et faciliter sa contention. Ceci facilitera également l’injection qui doit être réalisée précisément dans le muscle vaste médial. Après euthanasie des animaux, des prélèvements du muscle étudié seront réalisés afin d’analyser ce muscle et obtenir les résultats du test d’absorption. Les interventions seront de courte durée et ne seront réalisées qu'une seule fois par animal puisqu'ils seront in fine euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la mise à jeun la veille de la sédation et stress dû à la contention pour la réalisation de la sédation.

Devenir

Les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir prélever et analyser le muscle injecté étudié. Ces prélèvements de muscle sont primordiaux pour répondre aux objectifs de ce projet.

Remplacement

Le test d’absorption du fer au point d’injection est une procédure expérimentale in vivo demandée par la réglementation chinoise, dans le cadre de la commercialisation sur le marché chinois de produits vétérinaires composés de fer. L’absorption de fer est un processus dynamique nécessitant le passage de la molécule étudiée du site d’absorption vers le sang pour pénétrer dans la circulation systémique. Ce type d’étude doit se réaliser sur animaux. Cependant, l’un des buts de ces études est de démontrer que les contrôles qualité réalisés en France sont suffisants pour permettre à terme de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour chaque nouvelle libération de lot. Afin de démontrer ceci, l’utilisation d’animaux est ici nécessaire et aucune méthode substitutive n’existe. En effet, l’utilisation des animaux dans le cadre de ce projet, ne peut pas être remplacée par des méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été calculé à partir des directives mentionnées dans la Pharmacopée Chinoise, dans laquelle il est stipulé qu’il faut utiliser 2 animaux par lot testé, et à partir des besoins pour le projet (estimation du nombre de lots à tester sur la durée du projet). Sur deux ans, il a été estimé que 20 lots seraient testés soit 40 lapins au total.

Raffinement

Méthodes de raffinement: 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (foin/paille, bois à ronger, chaînette, de quoi se cacher et grimper...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la contention pour l’injection, l’animal sera sédaté avec un produit adapté. Il est primordial dans ce projet que l’injection soit réalisée précisément au niveau du muscle vaste médial et pour cela l’animal ne doit pas bouger durant l’injection. 4) Surveillance accrue de l’animal durant la sédation et l’injection. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, la manipulation sera réalisée dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi pour ce projet car c’est cet animal qui est demandé et décrit dans la Pharmacopée Chinoise pour la réalisation de tests d’absorption du fer au site d’injection. Conformément à la Pharmacopée Chinoise, les animaux utilisés seront des adultes pesants entre 1,5 et 2,5 kg.

3 328 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes puis leur greffe, pour chaque patient, ses cellules immunitaires et sa tumeur, afin de constituer des cohortes dites "avatars" servant à tester des traitements. Il indique que l'injection de cellules humaines provoque invariablement une réaction contre les cellules de la souris, avec perte de poids, de poils et de mobilité sur un à deux mois, les animaux étant mis à mort à un stade avancé pour récupérer les tumeurs. Sur la réduction, il se contente d'écrire que le nombre d'animaux "sera à évaluer au cours des expériences", justification sommaire pour un effectif de plus de trois mille souris.

Objectifs

Il est proposé d’utiliser un modèle de souris immunodéficiente afin de constituer, pour chaque patient atteint d’une tumeur, une cohorte de souris doublement humanisée/greffée (système immunitaire et tumeur) qui sera utilisée pour évaluer l’activité de thérapies, dans un délai compatible avec les contraintes cliniques, typiquement 1 mois. Les souris présentent des mutations entrainant une déficience en cellules immunitaires murines. Ces souris ont montré être des bons modèles de greffe de cellules tumorales humaines ainsi qu’un bon réservoir pour une reconstitution de système immunitaire humain. La mise en place d’une cohorte de souris porteuse de tumeur dérivée de patient (PDX) est un projet ambitieux à forte valeur ajoutée pour la recherche sur les cancers permettant d’évaluer l’activité des traitements les ciblant. Ces souris sont greffées avec des fragments de tumeur fraiche et la tumeur peut se développer dans l’environnement murin en absence de système immunitaire pouvant le reconnaitre comme étranger. Cependant, des obstacles sont présents pour optimiser l’établissement de cette cohorte : taux de prise de greffe des PDX très faible et/ou variable, temps avant apparition de la PDX (plusieurs semaines, voire mois), instabilité génétique amplifiée au cours des passages successifs des PDX dans une souris à l’autre et absence d’un système immunitaire autologue. Afin de palier à ces obstacles, les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) du patient ainsi que des fragments tumoraux, du même patient seront greffés, dans les souris sans passer par l’étape d’établissement d’une tumeur macroscopique de type PDX classique. La détection précoce de ces cellules, par les techniques d’imagerie, permettrait d’évaluer l’efficacité des traitements afin de comprendre notamment les mécanismes de résistance mais aussi d’évaluer le traitement le plus efficace parmi le choix possible actuellement et dans un futur proche.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer la pertinence et la corrélation clinique des réponses aux traitements chez le patient au regard de de la réponse observable dans la cohorte avatar aux patients. En cas, de corrélation positive, cela permettre d’obtenir une preuve de concept de la pertinence d’une méthodologie comme outil de diagnostic afin de proposer aux cliniciens le traitement le plus adéquat pour chaque patient, dans des contraintes temporelles acceptables pour les cliniciens et les patients.

Procédures

Injection de thérapie deux à trois fois par semaine sur animaux vigiles ou endormis, chaque injection demande une contention de 15 à 30 secondes ; Echographie une à deux fois par semaine sur animaux endormis, le temps d'acquisition par échographie (et donc de l'anesthésie) est compris entre 10 et 20 min par souris ; Prélèvement de sang une fois au cours de la procédure sur animaux endormis, le prélévement dure entre 15 et 30 secondes (l'anesthésie environ 3 minutes). La durée pendant laquelle les animaux subiront ces interventions sera de 5 semaines à 2 mois.

Impact sur les animaux

L’injection de PBMC humain dans une souris immunodéficiente entraine, invariablement, une réaction des cellules immunitaires humaines injectées contre les cellules murines reconnues comme étant étrangères. Cette réaction entraine une perte de poids des animaux, une perte de poil et une perte de mobilité des animaux dans un délai pouvant aller d’un mois à deux mois. A un stade avancé de la maladie, les animaux doivent être sacrifiés. Aucun autre effet indésirable n’est attendu notamment par l’injection des traitements.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort car les tumeurs doivent être récupérées

Remplacement

Les méthodes actuelles permettant d’évaluer l’efficacité de thérapie personnalisé sont inefficaces, actuellement, par absence de biomarqueur fiable, permettant de choisir le traitement le plus adapté à chaque patient.

Réduction

Le nombre de souris par groupe de traitement est évalué, en fonction de la variabilité des modèles animaux. Ce nombre sera à évaluer au cours des expériences en fonction de cette variabilité.

Raffinement

Le raffinement de l’étude est : surveiller les animaux pour l’apparition de la réaction immunitaire des cellules immunitaires humaines injectées vis-à-vis des cellules murines de l’hôte qui sera monitoré deux fois par semaine.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes sont les seules modèles animaux correctement validés ayant montrés une prise de greffe de tumeurs humaines et de système immunitaire humain. Les animaux seront des adultes à partir de 6 semaines, stade qui a montré de bons résultats pour prise de greffe tumorale et immunitaire.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur les rend immunodéficientes et leur greffe des cellules tumorales marquées par fluorescence, par injection sous-cutanée ou intraveineuse, pour suivre la croissance des tumeurs et leur capacité à métastaser. Il indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements, que la peau peut s'ulcérer en provoquant une douleur modérée et que des métastases au foie ou aux poumons peuvent dégrader l'état des animaux, tous mis à mort en fin de procédure. Il affirme que ces cellules doivent être implantées dans un "organisme entier" et que le modèle souris est "nécessaire".

Objectifs

Le but du projet est de réaliser des expériences de suivi de pousse tumorale chez la souris immunodéficiente à partir de cellules cancéreuses modifiées pour qu'elles expriment plus ou moins une protéine au niveau de leur noyau. La quantité présente de cette protéine dans les cellules jouerait un rôle dans le comportement des cellules cancéreuses. Ces cellules cancéreuses seront également marquées par fluorescence en fonction de la quantité de la protéine exprimée. Ainsi cette fluorescence nous permettra de visualiser les différents types de cellules cancéreuse et d'observer leur évolution dans les tumeurs. Nous nous intéresserons à la corrélation entre le type de cellules retrouvées dans les tumeurs, la vitesse de croissance des tumeurs et l'agressivité des cellules cancéreuses à travers leur capacité à métastaser.

Bénéfices attendus

Nous serons en mesure d’analyser l'impact du niveau d’expression de TRa1 sur la croissance des tumeurs. Nous pourrons étudier si ce niveau d'expression module la capacité de croissance, de migration ou de mort cellulaire ainsi que l’agressivité du développement tumoral. A terme, une meilleure compréhension des mécanismes du développement des cancers permettra de mieux adapter les traitements et/ou d'envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les souris du projet seront greffées avec des cellules tumorales marquées par fluorescence, soit par injection ou implantation sous-cutanée soit par injection intra-veineuse. Ces greffes se dérouleront sous anesthésie, l'opération ne durant que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris immunodéprimées. Ces animaux, par leur système immunitaire défaillant, sont hébergés dans une pièce dédiée avec toutes les barrières sanitaires permettant de garantir leur bon état de santé pendant toute la durée de leur vie. Les souris subiront chacune une unique injection ou implantation de cellules tumorales. Les souris seront donc amenées à développer des tumeurs. Ces tumeurs pourraient éventuellement les gêner dans leurs déplacements. Si la peau venait à s’ulcérer au niveau d’une tumeur, cela provoquerait une douleur modérée à l’animal. Des métastases pourraient également apparaître, notamment sur le foie ou dans les poumons. L’état des souris pourraient alors se dégrader : amaigrissement, difficultés à respirer, troubles moteurs… Il y a 3 types possible d’injection dans ce projet ; une injection sous-cutanée au niveau du flanc, une injection intra-veineuse à la veine de la queue et une implantation sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux, des souris, seront mis à mort en fin de procédure. En effet, ils développeront des tumeurs sur le flanc et potentiellement des métastases. De plus, des analyses doivent être menées sur plusieurs de leurs tissus afin d'étudier la distribution des différents types cellulaires dans les tumeurs et d'analyses les organes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité de plusieurs types de cellules cancéreuses à former des tumeurs et à métastaser. Pour cela, ces cellules doivent être implantées dans un organisme entier afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles elles se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à ce projet est de 90 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet. Nous mesurerons pour chaque animal engagé le nombre de tumeurs primaires et métastases ainsi que leur taille.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin d'identifier au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. De plus, les procédures se feront sous anesthésie générale. Les souris seront maintenues sur tapis chauffant toute la durée de l'anesthésie. Une couverture analgésique est mise en place afin de prendre en charge toute douleur potentielle qu'impliquerait l'implantation des cellules tumorales. Un développement tumoral est attendu, un suivi de poids et de taille des tumeurs sera réalisé 3 fois par semaine. Des points limite qui auront pour effet l'arrêt de la procédure ont été déterminés.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (inflammation et cancer du côlon). Nous avons l'expertise au laboratoire sur ce modèle animal et nos données précédentes sur le rôle de TRa1 dans des études in vivo ont été générées chez la souris. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. En effet, dans notre projet, les études de pousse tumorale ne peuvent se faire que dans des organismes complets prenant en compte l’influence de la physiologie de l’animal et du microenvironnement. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte jeune.