Recherche appliquée
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- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
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- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Suivi par imagerie d’anticorps chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
8 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance légère. Le porteur les rend immunodéficientes, leur greffe des cellules de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique et injecte des anticorps marqués par fluorescence, suivis par quinze séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse. Il décrit une étude pilote de deux animaux par groupe sans analyse statistique et sans prélèvement, la mise à mort intervenant à la fin. Sur le remplacement, il se borne à affirmer que l'étude de la distribution des anticorps "impose d'avoir recours à des animaux".
Objectifs
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Elle reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie notamment par des anticorps. Les anticorps sont des immunoglobulines, protéines de structure complexe, réparties en plusieurs classes et sous-classes avec des activités biologiques spécialisées. Deux nouveaux anticorps monoclonaux ont été developpés, l'un est une immunoglobuline de type G (IgG), l'autre de type M (IgM). Nous souhaitons déterminer par imagerie, la localisation et la distribution des anticorps (marqués par un fluorochrome, la cyanine 7). Cette étude va nous permettre d’évaluer la capacité de ciblage tumoral des anticorps, évaluer s’il y a une liaison tissulaire non spécifique et ainsi déterminer un index thérapeutique correspondant au rapport entre la fixation des anticorps sur la tumeur et celle sur les tissus sains. Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma) qui est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, LB et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC.
Bénéfices attendus
L’avantage à court terme de cette étude est de permettre de voir la localisation, la distribution et l'affinité des anticorps chez nos souris greffées avec des cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC. Le bénéfice à plus long terme de l'étude est la poursuite du développement d'un ou des deux anticorps en clinique humaine.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux. Les souris seront soumis à des pesées (9 pesées réalisées sur animal vigile), chaque pesée durera moins de 30 secondes. Les autres gestes techniques, une injection sous-cutanée de cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC et une injection intraveineuse d'anticorps, seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin d'éviter du stress et de l'inconfort aux animaux. Les imageries de fluorescence des anticorps, un total de 15 imageries de 5 minutes maximum par souris sur toute la durée de la procédure seront également réalisées sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère. Du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, neuf pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J1; J2; J3; J4; J7; J9; J11 et J15), chaque pesée durant moins de 30 secondes. Du stress pourra également être généré au moment de l'anesthésie gazeuse, cette dernière dure environ 5 minutes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
L'objectif de ce travail est d’étudier la localisation, la distribution et l'affinité d'anticorps fluorescent chez la souris après une injection intraveineuse, ceci impose d'avoir recours à des animaux pour atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote avec un petit nombre d'animaux, 2 par groupes et il n'y a pas d'analyses statistiques.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors des pesées des animaux. La durée de la pesée est rapide moins de 30 secondes par animal. Afin favoriser le bien-être animal conformément à la règle des 3R, les injections de cellules et d'anticorps seront réalisée sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et de l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
Les rongeurs, et en particulier la souris, sont des modèles de référence pour l’évaluation des anticorps thérapeutiques pour les études précliniques. Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer en sous-cutanée les cellules mononuclées de sang périphérique de patients atteints de LLC et ainsi pouvoir mesurer l'index thérapeutique (rapport entre la fixation tumeur/fixation tissus sains). Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique pour rechercher des biomarqueurs pronostiques dans un modèle de traumatisme crânien chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur leur inflige un traumatisme crânien par percussion fluide après une craniectomie sous anesthésie, puis un unique examen IRM quatre semaines plus tard, avant l'euthanasie et l'analyse histologique du cerveau. Il indique que l'induction du traumatisme s'accompagne d'une mortalité pouvant atteindre 15 pour cent et d'une perte de poids d'environ 13 pour cent, et présente l'étude comme une faisabilité préalable à des projets de plus grande ampleur. Il conclut au recours au rat, dont il juge la structure cérébrale proche de celle de l'humain.
Objectifs
Chaque année, rien qu’en France métropolitaine, plusieurs centaines de milliers de personnes sont exposées à un traumatisme crânien (TC). Selon les estimations, 25 à 40 % des cas sont des TC avec des signes fonctionnels et/ou des séquelles neurologiques chroniques. La grande majorité des TC diagnostiqués sont des TC légers à modérés Il n’existe malheureusement pas, à ce jour de marqueurs, permettant de prédire et de suivre l’évolution des séquelles cérébrales de manière fiable pour ces types de TC, principalement par manque de moyens d’investigation suffisamment précis pour déceler les micro-lésions et micro-dysfonctionnements cérébraux post-traumatiques. La prise en charge des patients affectés ne peut donc pas être optimale. De nouvelles méthodes d’imagerie par résonnance magnétique (IRM) sont actuellement testées dans le domaine médical pour essayer de déceler les micro-déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré. Malgré des résultats encourageants, les conclusions de ces études sont limitées par l’impossibilité de comparer les résultats d’imagerie avec des mesures réalisées dans le tissu cérébral des patients. Ainsi, le projet proposé vise à évaluer si des méthodes d’IRM récentes, similaires à celles testées en clinique, permettent de détecter des lésions cérébrales chez des animaux après exposition à un TC léger-modéré. Si c’est le cas, nous pourrons comparer les résultats IRM avec des mesures tissulaires, qui sont accessibles chez les animaux, et compléter les études d’imagerie réalisées chez les patients. Ce projet représente ainsi une étude de faisabilité préalable à la mise en place de projets de plus grande ampleur. Les mesures IRM seront réalisées chez des rats adultes exposés préalablement à une procédure chirurgicale et un TC sous anesthésie générale par percussion fluide et comparées à celles réalisées chez des animaux contrôles. Cette technique d’induction du TC est utilisée et maitrisée par notre laboratoire depuis environ 10 ans. Le fonctionnement du cerveau repose sur de nombreux mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés qui ne peuvent pas à l’heure actuelle être modélisés de manière fiable, ni par le biais de cultures cellulaires, ni par des outils mathématiques et informatiques. Par ailleurs, l’imagerie IRM nécessite d’étudier le cerveau dans son intégralité. Ainsi, le recours au modèle animal ne peut pas être évité.
Bénéfices attendus
Si les résultats obtenus dans ce projet s’avèrent être favorables, nous serons à même de pouvoir mesurer par IRM les déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré chez un modèle expérimental de TC léger-modéré. Nous pourrons pour chaque anomalie détectée par IRM évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, ce qui n’est actuellement pas possible dans le domaine médical. Nos futures expérimentations animales pourront potentiellement permettre de découvrir de nouveaux biomarqueurs pathologiques basés sur des mesures IRM, dont la validité et la pertinence pourront par la suite être évaluées chez des patients. L’utilisation de l’IRM permettra également d’évaluer expérimentalement chez l’animal l’efficacité de nouvelles thérapies pressenties pour la prise en charge des patients traumatisés crâniens. Par ailleurs, nous pourrons évaluer de manière non-invasive des modifications cérébrales dans des paradigmes de TC pertinents restant à étudier (poly-trauma, répétition de TC, interaction entre TC et stress, …). D’un point de vue purement éthique, nous pourrons dans le futur utiliser l’IRM pour évaluer l’intégrité du cerveau chez les animaux traumatisés de manière non invasive et longitudinale, ce qui n’est pas le cas pour l’instant. Nous pourrons ainsi réduire les effectifs utilisés lors de nos prochains programmes expérimentaux.
Procédures
Les animaux seront exposés à un TC léger-modéré unique. Le TC sera induit par la technique de percussion latérale fluide. Le principe de la percussion fluide repose sur l’exposition du tissu cérébral à une onde de pression fluide dont les caractéristiques modélisent un TC léger-modéré, c’est à dire un TC ne créant pas de lésion aigue du tissu cérébral mais pouvant induire une hémorragie sous méningée non létale pouvant se résorber naturellement. Cette technique nécessite de réaliser une préparation chirurgicale préalable et en particulier la réalisation d’une craniectomie sous anesthésie générale et analgésie locale. La durée de la phase chirurgicale préparatoire et de l’exposition au TC ne dépassera pas 70 minutes. Deux groupes contrôles sont nécessaires pour comparaison avec les animaux traumatisés. Des animaux contrôles « naïfs » ne subiront aucune préparation chirurgicale. Des animaux contrôles subiront les mêmes étapes préparatoires mais pas le TC. Le groupe contrôle est nécessaire car la chirurgie préparatoire au TC dans le modèle utilisé peut entraîner des phénomènes inflammatoires au niveau du cerveau et pourrait ainsi modifier les mesures IRM réalisées. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC . Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Les animaux devront être euthanasiés pour la suite des recherches. 48 heures après leur passage à l’IRM,
Impact sur les animaux
L’exposition au traumatisme crânien s’accompagne d’un taux de mortalité de 15% au maximum, au moment de l'intervention. En règle générale, les animaux exposés au traumatisme crânien qui survivent perdent 13 % de leur poids initial au maximum et commencent à prendre du poids sous 2 à 4 jours. Ils ne montrent pas de signes chroniques de douleur (pas de prostration, pas d’atonie prolongée, pas de vocalisations lorsque la plaie chirurgicale est manipulée, pas d’agressivité). Les animaux contrôle perdent en général moins de 10% de leur poids initial, et commencent à prendre du poids sous 2 à 3 jours. Ils ne montrent pas non plus de signes chroniques de douleur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Leur cerveau sera étudié par histologie afin de compléter les analyses IRM.
Remplacement
L’utilisation de l’animal et non d’alternatives non vivantes s’explique par le fait que le fonctionnement du cerveau est complexe et que les effets du TC sur ce dernier ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être modélisés à l’aide de systèmes informatiques ou de systèmes cellulaires moins complexes. Le modèle choisi est le rat, qui est classiquement utilisé pour la modélisation du TC en laboratoire. Le rat est par ailleurs le modèle de choix pour étudier le fonctionnement du cerveau et ses perturbations, car la structure du cerveau du rat est proche de celle de l’Homme.
Réduction
L’objectif est de pouvoir comparer les résultats obtenus sur 5 animaux par groupe expérimental, comprenant des rats traumatisés et des rats contrôles (des animaux contrôles sains / « naïfs » n’ayant subi aucune préparation chirurgicale, et des animaux contrôles ayant subi les étapes chirurgicales préalables au TC mais n’ayant pas été exposés au TC). Ce nombre a été estimé grâce à nos expérimentations préalables et une analyse bibliographique. Le projet consistant essentiellement à vérifier si l’IRM peut générer des mesures fiables et reproductibles chez le rat, ce nombre semble cohérent et adapté. Aucun test statistique particulier n’est prévu car il s'agit une première approche exploratoire basées sur l'interprétation d'images radiologiques. Le taux de mortalité des rats Naïfs et contrôles étant nul, 5 animaux seront utilisés pour constituer chacun de ces groupes. En revanche, le taux de mortalité des rats traumatisés étant d’environ 15%, nous estimons qu’un animal supplémentaire pourrait être requis pour atteindre un nombre de 5 individus dans ce groupe expérimental au final. Ainsi, 5 animaux seront initialement exposés au TC, et un animal supplémentaire sera exposé en cas de nécessité.
Raffinement
Le modèle de TC choisi ainsi que les procédures d’hébergement, de médication (analgésie et anesthésie) et de soins sont parfaitement maitrisées par notre laboratoire depuis plus de 10 ans. Les étapes chirurgicales nécessaires à l’induction du TC seront réalisées sous anesthésie gazeuse et après une prémédication antalgique, ce qui assure une prise en charge optimale de la douleur infligée aux animaux. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux de manière à limiter leur angoisse (contact social, contact humain, enrichissement du milieu). Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de compléter les analyses IRM par des analyses histologiques du cerveau et des analyses sanguines.
Choix des espèces
Le rat Sprague Dawley est l’espèce/la souche utilisée dans la majorité des études pré-cliniques du TC et est une des espèces animales communément choisie pour les étudier le fonctionnement du cerveau. Son utilisation pour les études proposées est donc préconisée, car il est important de se fonder sur les connaissances existantes. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 8 semaines. Ils seront âgés de 10 semaines au moment de l’induction du traumatisme crânien/de la chirurgie, ce qui correspond au stade de jeune adulte, stade pertinent chez l’humain car correspondant à un âge particulièrement propice à l’exposition au TC. Ils seront soumis à des examens par IRM et seront mis à mort entre les 4ième et 5ième semaines post-TC, ce qui correspond, d’un point de vue pathologique, au stade chronique précoce.
Modification génétique des cellules B pour l’expression d’anticorps anti-tumoraux dans un modèle de souris immunodéficientes.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 648 dans des procédures classées en souffrance sévère et 72 en souffrance légère. Le porteur les rend immunodéficientes puis les soumet à un conditionnement par irradiation ou traitement chimique, avant de greffer des cellules B humaines modifiées puis des cellules tumorales, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires. Il indique que le développement tumoral peut affaiblir les animaux, surveillés pour la perte de poids et la léthargie, chacun étant ensuite mis à mort pour des analyses sur les organes prélevés. Il affirme que la survie à long terme de ces cellules "médicaments" exige un organisme vivant complet qu'aucun modèle in vitro ne reproduit.
Objectifs
Actuellement, l'immunothérapie avec des anticorps monoclonaux est réalisée par leur injection directe chez les patients. La contrainte majeure de cette approche réside dans la courte demi-vie des anticorps, qui n'est que de 21 jours au maximum. Être capable de produire ces anticorps en continu, sur le long terme et in vivo est un défi majeur. Notre projet est donc de mettre en place un processus de thérapie cellulaire basé sur la modification génétique de cellules B ayant la capacité de s'auto-greffer, de survivre et de produire à long terme des anticorps spécifiques. Ainsi, nous utilisons la capacité de production d'anticorps à grande échelle des plasmocytes en les forçant à sécréter un anticorps thérapeutique donné en utilisant la technique d'édition du génome CRISPR qui permet d'introduire un gène codant pour un anticorps thérapeutique de manière spécifique.
Bénéfices attendus
Développement une nouvelle thérapie cellulaire basée sur ingénierie des cellules immunitaires (lymphocytes B) d'un patient afin de produire un anticorps anti-cancéreux chez ce même patient. Le but étant d'empêcher la rechute d'un cancer. Cette approche pourra également être adaptée dans le cas d'une pathologie virale.
Procédures
Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes permettant la prise de greffes de cellules humaines ou bien de tumeur humaines, les souris devront recevoir un conditionnement (traitement chimique par injection ou irradiation) puis une greffe de cellules B humaines (modifiées génétiquement ou non) en intraveineuse. Pour évaluer l'efficacité de nos cellules B génétiquement modifiées à produire un anticoprs anti-cancéreux, ces souris recevrons une greffe de cellules tumorales (en intraveineuse ou en intrapéritonéale). Tout au long des expérimentations les souris seront prélevées de façon hebdomadaire afin d'élavuer la sécrétion in vivo de notre anticorps d'intérêt par nos cellules modifiées. De plus, après injection de tumeur bioluminescence les souris seront suivis à l'aide d'imagerie non invasive.
Impact sur les animaux
L’utilisation d’animaux immunodéprimés dans ce projet expose à un risque plus élevé d’infections mais qui sera parfaitement maîtrisé par des précautions sanitaires adaptées, en hébergement protégé.Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de lymphome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).
Devenir
Sur un total de 720 souris, 648 subiront une procédure sévère (irradiation et/ou greffe de cellules tumorales). Seules 72 souris subiront une procédure légère correspondant à une implantation de cellules humaines ingénierées ou non. A l'issue de ces procédures, chaque animal sera mis à mort afin de réaliser des études ex vivo sur les organes prélevés pour le recueil de données scientifiques.
Remplacement
Le projet est basé sur l’utilisation de cellules « médicaments ». Seul un environnement complet (facteurs de croissances, signaux de survie…) permettra de déterminer les conditions idéales de survie à long terme de ces cellules modifiées. De plus, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo en terme de croissance, de dissémination, de résistance aux traitements et de capacité́ à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Aussi, l'évaluation du bénéfice de cette nouvelle approche thérapeutique nécessite également le développement de modèles précliniques intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été conçues de façon à utiliser le moins de souris possible tout en collectant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, ganglions, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Le maximum de validation in vitro a été et continuera d’être réalisé en préalable à toute injection à l’animal. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valide, à l’issue d’une expérimentation qui soit productive et ne nécessite pas de réédition.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées (locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum), avec un maximum de 5 animaux/cage (aucun animal maintenu seul dans sa cage). Les animaux recevront une anesthésie et/ou analgésie adaptée à chaque procédure expérimentale. Les points limites sont établis de façon à détecter le plus précocement possible les signes de souffrance des animaux. Une évaluation régulière du score de grimace des animaux, de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé. De plus, les souris seront aussi surveillées par la réalisation de technique d'imagerie in vivo non invasive (bioluminescence ou IRM) afin de permettre une détection précoce d'un éventuel envahissement tumoral.
Choix des espèces
Les souris immunodéprimées choisies pour ce projet sont dépourvues de cellules immunitaires ce qui permet d'obtenir une excellente prise de greffe de cellules humaines. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet. L’utilisation de ces animaux immunodéprimés expose par contre à un risque plus élevé d’infections mais celui-ci sera parfaitement maîtrisé par des précautions sanitaires adaptées avec un hébergement protégé. Seuls des animaux adultes se prêtent à ce type d’expérimentation, elle sera donc réalisée chez des animaux d'au moins 5 semaines et jusqu'à 5 mois. La durée de l’expérimentation n’excèdera pas 12 mois.
Réponse immunitaire antitumorale et scd1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur leur greffe des cellules cancéreuses en sous-cutané puis administre un traitement par voie intrapéritonéale chaque jour pendant vingt jours, pour étudier le rôle d'une enzyme dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Comme pour un projet voisin du même laboratoire, il indique que les souris sont maintenues sans antalgique afin de ne pas modifier la croissance tumorale, tout signe de souffrance entraînant la mise à mort. Il affirme que l'effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être évalué qu'in vivo et que le modèle murin est "nécessaire".
Objectifs
Ce projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme scd1 dans la régulation de la réponse immunitaire anti-cancéreuse et l’importance de cette enzyme dans la résistance à l’immunothérapie.
Bénéfices attendus
L’inhibition de l’activité Scd1 a montré une efficacité contre la progression tumorale. Cependant, cette réponse demeure limitée et la recherche de thérapies combinées à une thérapie anti-Scd1 pourrait améliorer la réponse. Nous attendons une réactivation bénéfique du système immunitaire anti-tumorale avec une immunothérapie anti-PDL1 à la suite d’une thérapie anti-Scd1 conduisant à une régression tumorale complète.
Procédures
Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 20 jours. Chaque contention et injection ne dureront pas plus de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections IP répétées peuvent entraîner un stress chez les souris vigiles au moment de la contention. La transplantation des cellules quant à elle, se fera sur souris anesthésiée à l’isoflurane. Les souris KO scd1 seront produites par le croisement de souris hétérozygotes scd1+/- sans phénotypes délétères pour les seules études expérimentales et ne seront jamais maintenues en colonies car elles présentent ont un phénotype délétère inflammatoire avec une adiposité réduite, une augmentation de la sensibilité à l’insuline et des lésions de la peau à un âge avancé. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.
Devenir
Après transfert des cellules cancéreuses par transplantation sous-cutanée, les souris seront maintenues 20 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elles seront ensuite mises à mort.
Remplacement
L'utilisation de ce modèle murin de cancer est nécessaire car l’effet du système immunitaire sur la tumeur ne peut être modélisé in vitro et ne peut donc être évalué que chez l’animal. De plus, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.
Raffinement
Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 180 souris femelles seront utilisées.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux Scd1 KO et WT requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses.
Gouttelettes lipidiques et traitements du cancer du sein
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur leur injecte des cellules de cancer du sein humain par voie intraveineuse pour induire des métastases pulmonaires, puis un inhibiteur enzymatique par voie intrapéritonéale tous les deux jours pendant cinq semaines. Il précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et la croissance tumorale, tout signe de souffrance conduisant à la mise à mort et au prélèvement des poumons. Il affirme que le processus métastatique ne peut être modélisé in vitro et que l'usage de la souris est "nécessaire".
Objectifs
Ce projet vise à démontrer l’importance de l’élongation des acides gras catalysée par l’enzyme Elovl5 et l’accumulation induite de gouttelettes lipidiques dans le développement de métastases pulmonaires dans un contexte de cancer du sein.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à définir le rôle de l’accumulation de triglycérides dans les gouttelettes lipidiques des cellules métastatiques et à démontrer que l’inhibition de leur formation pourrait être une stratégie thérapeutique en ciblant l’enzyme DGAT1 impliquée dans la synthèse des triglycérides.
Procédures
Les souris seront soumises à une unique injection caudale intraveineuse et des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant 5 semaines.
Impact sur les animaux
Les études précédentes utilisant le modèle de souris Nude NMRI injectées en i.v. avec des cellules MCF-7 shRNA ctrl ou Elovl5 n’ont pas montré de nuisance ou effets indésirables sur une période de 5 semaines si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal au moment de l’i.v. Dans ce nouveau projet, l’inhibiteur DGAT1 sera injecté en intrapéritonéal tous les deux jours pouvant occasionner un stress. Les animaux seront suivi quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée. Tout signe de souffrance conduira à la mise à mort des souris et aux prélèvements des tissus. Il est à noter que la littérature décrivant l’utilisation de cet inhibiteur ne fait pas apparaitre d’effets indésirables.
Devenir
Après transfert des cellules cancéreuses par i.v., les souris seront maintenues 5 semaines en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement des poumons
Remplacement
L'utilisation de ce modèle murin de cancer métastatique est nécessaire car la le processus métastatique est mécanisme complexe ne pouvant être modélisé in vitro. En effet, la capacité de dissémination des cellules cancéreuses par la voie sanguine et de colonisation des tissus pulmonaires ne peut s’observer que dans un modèle animal. Ainsi, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.
Raffinement
Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 80 souris femelles sur un fonds génétique Nude NMRI seront utilisées
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche Nude NMRI a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. De plus, l’injection de cellules humaines nécessite l’emploi de souris immunodéficiente de type Nude. D’un point de vue technique, les coûts limités de maintenance, et le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses par voie intra-veineuse.
Mise en place d’un modèle de modification du rythme circadien dans la maladie d’Alzheimer et étude de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 496 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection intracérébroventriculaire d'agrégats de peptide bêta-amyloïde par chirurgie stéréotaxique, puis reçoivent un candidat-médicament chaque jour pendant dix-sept jours, avant un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur mesure l'activité locomotrice pour évaluer les rythmes circadiens et indique que des effets indésirables comme une sédation peuvent apparaître. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne rend compte du comportement d'un "organisme vivant entier" et conclut à l'impossibilité de remplacer l'animal.
Objectifs
Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. Des études ont montré que le manque de sommeil peut augmenter de manière significative les taux de bêta-amyloïde dans certaines régions du cerveau. L’objectif de cette étude est 1) d'examiner si une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien chez le rat et 2) dans le cas où l'injection ICV d'agrégats Aβ (1-42) perturbe le rythme circadien, d’examiner l’effet d’une administration quotidienne de candidats médicaments sur ces perturbations préalablement observées.
Bénéfices attendus
Au cours du vieillissement normal, le sommeil se modifie et il peut être profondément altéré par certaines maladies neurodégénératives, tel que la maladie d’Alzheimer (MA). Les personnes souffrant de démences présentent à la fois des modifications de l’architecture de leur sommeil et des perturbations de leurs rythmes circadiens. 40 à 70 % des personnes ayant la MA éprouvent des problèmes de sommeil qui au fil du temps vont être amplifiés ; ce qui est épuisant pour la personne atteinte mais également pour son aidant. La prise en charge de ces troubles repose sur des traitements médicamenteux tels que des antipsychotiques ou des benzodiazépines. Mais ces médicaments ont souvent des effets indésirables inquiétants chez les personnes atteintes de la MA ; ils peuvent aggraver le déclin cognitif et accroître les risques de chute. Ainsi, ce modèle peut être utile pour le développement de cibles thérapeutiques pour traiter cette problématique.
Procédures
Dans un premier temps, les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (injection d'Aβ (1-42) par stéréotaxie) qui dure dans sa totalité environ 45 minutes (de l'anesthésie jusqu'au réveil). Ensuite, au moment du test de comportement (test de l'activité locomotrice), les animaux reçoivent une injection par jour du candidat médicament; et ceci durant 17 jours maximum. A la fin de l’étude, juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang et de cerveau est réalisé sur l'ensemble des animaux. Cette procédure est réalisée sous anesthésie générale et elle dure en moyenne 20 minutes (dans sa totalité). Le prélèvement de cerveau est une demande fréquente dans les études de recherche préclinique. Cela permet de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.
Impact sur les animaux
1) Chirurgie : injection ICV - Les rats sont anesthésiés avec de l’isoflurane et placés dans un appareil stéréotaxique. Puis, selon les groupes, une injection intracérébroventriculaire (ICV) d'agrégats du peptide bêta-amyloïde Aβ (1-42) ou de véhicule est réalisée. 2) Administration des candidats médicaments - Les administrations sont réalisées tous les jours et pendant toute la durée de l’enregistrement de l’activité locomotrice. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)
Devenir
Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle permettant d’évaluer le cycle circadien dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.
Raffinement
Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux reçoivent trente minutes, avant l’acte chirurgical, une administration en sous-cutanée d’’un analgésique (Opiacés ou AINS). Après la chirurgie, les animaux reçoivent 1 ml de solution de lactate Ringer en sous-cutanée. Une coupelle contenant du « Gel Diet Energy » (Safe) mélangé à de la nourriture mouillée est déposée sur le sol de la cage pour stimuler l’appétit et la mobilité gastro-intestinale de l’animal. 24h post-opératoire, les animaux reçoivent une administration en sous-cutanée ou voie orale (per os) d’analgésique (Opiacés ou AINS). Ils sont pesés et leur état général est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter tous signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rats correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. La lignée de rat utilisée est : Sprague-Dawley 9-10 semaines au moment de la chirurgie. Les molécules développées sont destinées à des patients adultes.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement cellules tumorales circulantes chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
635 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire, l'exérèse de cette tumeur, puis l'injection de radiopharmaceutiques à émetteurs alpha (astate 211, bismuth 213, actinium 225), avec des séances d'imagerie PET et des prélèvements sanguins répétés à huit dates. Le porteur décrit une escalade de doses qu'il qualifie de procédure potentiellement sévère, suivie selon une grille de points limites, la mise à mort intervenant au palier de douleur le plus haut. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour une pathologie aussi complexe.
Objectifs
L’objectif du projet est de supprimer les cellules tumorales résiduelles et circulantes après exérèse de tumeur mammaire chez la souris. Divers radiopharmaceutiques serons testés : nous disposons de différents anticorps et de 3 radioéléments émetteurs alpha (Astate 211, Bismuth 213, Actinium 225), L’évaluation de nos radiopharmaceutiques se déroulera en plusieurs étapes : 1-Isolement des cellules tumorales circulantes. Détermination et choix des cibles 2- Escalade de doses pour évaluer la tolérance des radiopharmaceutiques sur souris saines. 3- Biodistribution des radiopharmaceutiques sur les souris greffées. Le radiopharmaceutique est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier sa distribution dans un organisme vivant, et la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. 4- Radiothérapie interne vectorisée. Nous utiliserons le modèle de tumeur mammaire orthotopique syngénique 4T1 chez la souris BalbC. Puis nous procéderons à l’exérèse de la tumeur pour reproduire la situation clinique. Nous testerons ensuite nos radiopharmaceutiques pour traquer et supprimer les cellules tumorales résiduelles et circulantes. Deux schémas thérapeutiques seront évalués. Traitement monodose puis répétition de doses. Nous réalisons des images de ces souris en PET-Scan avant et après les radio-immunothérapies vectorisées qui nous permettent de mesurer l’efficacité du traitement et sa toxicité sur les tissus sains.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de déterminer une cible des CTC, de produire un radiopharmaceutique capable de les détruire dans un modèle de cancer mammaire après exérèse de la tumeur qui se rapproche de la situation clinique. En vu d'un transfert à la clinique future.
Procédures
La greffe des cellules tumorales pour induire le cancer métastatique du sein implique 20 souris sur 20 jours maximum (pour la procédure 1 plus 2), 75 souris sur une semaine maximum (pour la procédure 1 +3) , et 450 souris sur 150 jours maximum (pour les procédure 1+5 et 1+6). La greffe dure 10 minutes. L'éxérèse de la tumeur implique les 450 souris des procédures de thérapies 5 et 6. Elle dure 15 à 30 minutes. Les prélèvements sanguins impliquent 95 souris une fois en terminal (pour les procédure 2 et 3). Ils durent 1 minute Les prélèvements répétés de 100µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique et la présence de cellules tumorales circulantes impliquent 450 souris (procédure 5 et 6). Ils durent une minute.
Impact sur les animaux
Le modèle de tumeur mammaire (procédure 1) devrait causer une douleur modérée traitée avec les antalgiques adaptés (En palier 1 Méloxicam 2 ,5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 :Buprénorphine 0,05 mg/kg en sc matin et soir . La procédure d'isolement des CTC (procédure 2) est une procédure sans réveil donc sans effets indésirables. La procédure d'escalade de dose (procédure 3) est une procédure potentiellement sévère. Les animaux seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure 4 de biodistribution ne devrait pas entrainer d'effets indésirables. Les procédures de thérapie (5 et 6) pourraient entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (7) n'entraine pas d'effet indésirable.
Devenir
Procédure 1 , les animaux sont gardés pour suivre les autres procédures 5 plus 7 ou ,6 plus 7 ou 4 ou 2 Puis ils sont sacrifiés.Procédure 3 , les animaux sont sacrifiés
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie
Raffinement
Raffiner : l’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. Le modèle de tumeur mammifère 4T1 est syngénique chez la souris Balb/c, et reflète donc l’impact du microenvironnement tumoral. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes.
Rôle du gène BAHCC1 dans la croissance in vivo de mélanome
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal porte une tumeur de mélanome mesurée deux fois par semaine jusqu'à un centimètre cube, suivie avec ses métastases par bioluminescence sous anesthésie gazeuse, pour caractériser le rôle du gène BAHCC1. Le porteur reconnaît un inconfort lié à la tumeur et aux métastases, avec perte de poids et d'appétit, et justifie la mise à mort de toutes les souris par la nature agressive du mélanome. Il décrit les objectifs et les bénéfices du projet en une seule phrase quasi identique, centrée sur la caractérisation de la croissance tumorale.
Objectifs
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 in vivo.
Bénéfices attendus
Caractérisation de la formation et de la croissance tumorale en présence ou en absence de BAHCC1 dans un contexte plus physiologique comparé aux conditions in vitro.
Procédures
Tous les animaux vivants seront suivis pour évaluer deux paramètres : 1- taille de la tumeur primitive au moins 2 fois par semaine pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : les animaux seront éveillés et la taille de la tumeur sera évaluée au pied à coulisse. Durée de intervention 5 minutes pour souris. 2- taille de la tumeur primaire et des lésions secondaires 2 fois par semaine par bioluminescence pendant tout le temps nécessaire à la tumeur pour atteindre la taille limité de 1cm3 : durant cette procédure les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse (2% d'isoflurane). Durée de intervention 15 minutes pour souris.
Impact sur les animaux
Inconfort généré par la présence de la tumeur primitive et des métastases pouvant entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés par la métastase tumorale.
Devenir
Lot A : 20 animaux subiront les procédures 1 et 2 pour caractériser la cinétique tumorale des 4 lignées cellulaires utilisées pour cette étude (5 souris pour la lignée cellulaire pour générer une étude statistique de base). Lot B : 120 animaux subiront les procédures 1 et 2 qui sont combinées pour analyser la croissance et la cinétique métastatique des tumeurs en présence ou en l'absence de BAHCC1. En raison de la nature agressive du mélanome, toutes les souris seront sacrifiées afin d'éviter tout type de souffrance et de douleur (par inhalation de CO2 ou dislocation cervicale).
Remplacement
Nous avons effectué l'inactivation de BAHCC1 dans des lignées cellulaires humaines in vitro, démontrant son importance pour la prolifération des mélanomes. Cependant, ce modèle a des limites et ne prend en compte ni la croissance dans des conditions tridimensionnelles, ni le rôle du microenvironnement tumoral. Ces caractéristiques ne peuvent être récapitulées que dans un modèle in vivo tel qu'une souris immunodéficiente, facile à manipuler et capable d'héberger des cellules humaines. De plus, notre xénogreffe de souris sera comparée à d'autres modèles de mélanome de souris utilisés par nos collaborateurs de laboratoire.
Réduction
Le nombre total de souris expérimentales sera de 140. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Par ailleurs, plusieurs expériences sont réalisées sur la même cohorte de souris afin de réduire le nombre total de souris nécessaires. L'analyse statistique sera effectuée avec le software GraphPad (Prism 9) avec unpaired t-test ou avec One-way ANOVA non-parametric.
Raffinement
Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale et confortera le résultat des expériences. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur au moins deux fois par semaine (lundi et vendredi plus éventuellement le mercredi) pour chaque lignée cellulaire injectée à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 1 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des quatre lignées cellulaires utilisées. Toutes les lignées expriment la luciférase, nous pourrons donc surveiller en parallèle le développement et la taille des métastases en mesurant l'activité de la luciférase avec le système IVIS tous les lundis et vendredis de la semaine. La mesure de l’activité luciférase sera effectuée tout au long de la cinétique tumorale avant d'atteindre la taille limite de la tumeur de 1 cm3. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. En cas de souffrance liée au phénotype, les animaux seront suivis régulièrement et des critères d'évaluation appliqués si nécessaire.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’importance de BAHCC1 dans des conditions de croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis. Nous utiliserons des souris adultes de 6 semaines qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc.
Approche thérapeutique de la leucodystrophie métachromatique chez le gros animal
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intraveineuse ou intrathécale d'un vecteur AAV et subit cinq à huit prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie, sur une période allant jusqu'à neuf mois, pour préparer un essai de thérapie génique chez des enfants atteints de leucodystrophie métachromatique. Le porteur indique des risques anesthésiques, infectieux et de fuite de liquide céphalo-rachidien. Les macaques sont euthanasiés en fin de projet pour prélever le cerveau, la moelle épinière et les organes.
Objectifs
Les vecteurs AAV sont parmi les vecteurs les plus efficaces pour transporter et intégrer des gènes d’intérêt dans des parties précises du système nerveux central, en particulier, le cerveau . Les AAV constituent une voie de thérapie pour des maladies neurodégénératives, notamment la leucodystrophie métachromatique. Le but de cette étude est de valider la capacité de transduction du vecteur AAVPHP.eB ARSA apres administration intraveineuse ou intrathecale chez le primate non humain, afin de realiser les étapes préclinique (efficacité et tolérance) et de de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation de l'efficacité et de la tolérance de l'approche permettant les étapes precliniques chez le primate non humain, afin de supporter le depot d'un CTA à l'agence du medicament en vue d'un essai clinique de phase I/II chez les enfants souffrants de leucodystrophie métachromatique et de pouvoir ainsi proposer un traitement alors qu'aujourd'hui il n'existe que des soins palliatifs et les enfants decedent avant l'age de 4 ans.
Procédures
Injections intraveineuse ou intrathécale et prelevement de sang et de liquide céphalo-rachidien. Toutes les procédures sont réalisées sur animaux anesthésié et sous analgésie. Il y a au total une procédure d'injection (IV ou IT) et 5 prelevements de sang et LCR si maintien pour 6 semaines ou 8 prelevements si maintien pour 9 mois. Toutes les anesthésies durent moins de 1h30.
Impact sur les animaux
Les 3 effets indesirables possibles sont: - un risque anesthésique - un risque infectieux pour l'injection intrathécale - un risque de fuite de LCR - la formation d'hématomes lors des prises de sang
Devenir
Euthanasie à la fin du projet afin de collecter cerveau, moelle epiniere et organes peripheriques et fluides biologiques afin de valider la biodistribution, l'expression et la tolérance du produit thérapeutique
Remplacement
Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAV. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de scale-up (efficacité, biodistribution, toxicité, etc) chez le gros animal (NHP). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique
Réduction
2 animaux par dose et approche est le minimum statistique pour repondre à l'objectif du projet soit 6 animaux au total Le projet va nous permettre de realiser les marquages pour evaluer l'expression et le coverage des zones ciblées ainsi que determiner la biodistribution. Il n'y a pas de statistiques faites sur les marquages. Nous nous basons aussi sur des résultast préalables obtenus sur d'autres projets pour pouvoir limiter le nombre d'animaux necessaires.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment l’intrathécale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. qui a déja posé le meme catheter d'injection chez des bébés achondroplastes (nain) ayant un rétrécissement du canal lombaire. Enfin, le nombre d'anesthesie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang, ponction lombaire) au sein de la meme anesthesie. Les animaux sont hebergés en groupe. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthesie, l'utilisation de buprecare pour les ponctions lombaires pour eviter tout inconfort et enfin des antibiotiques (amoxicilline) lors de l'intrathecale.
Choix des espèces
La capacité des vecteurs AAV à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée. Les organes du NHP en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de vecteurs AAV chez le NHP est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. NHP : macaques (1-10 ans) (2 à 12kg) Les mâles NHP atteignent la maturité sexuelle à 6 ans et les femelles à 4 ans, de plus le cerveau est bien formé à ces âges-là. Sachant que nous travaillons sur une pathologie qui apparaît dans l'enfance, nous realiserons nos procédure sur un cerveau formé et myelinisé et non pas avant l'âge d'un an.
Etude du microbiote et du métabolome chez le poulet de chair co-infecté par Campylobacter et Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
205 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont infectés par voie orale avec les bactéries Campylobacter et Salmonella, seules ou combinées, pour étudier leur effet sur le microbiote intestinal. Le porteur affirme que ces bactéries sont asymptomatiques chez le poulet et qu'aucun effet indésirable n'est attendu. Tous les animaux sont pourtant tués, par dislocation cervicale pour les poussins et par électronarcose puis saignée pour les plus âgés, afin de prélever leurs organes.
Objectifs
Campylobacter et Salmonella sont responsables des deux zoonoses bactériennes d’origine alimentaire majoritaires en Europe, avec respectivement, 220 682 et 87 923 cas humains en 2019 et la viande de volaille est identifiée comme principale source de contamination. Par ailleurs, au cours d’un précédent travail mené par le laboratoire, il a été montré in vitro que la présence de Salmonella permettait d'améliorer la survie de Campylobacter en condition aérobie. A notre connaissance, l'impact de la présence simultanée des deux bactéries n'a jamais été évalué chez le poulet de chair. Par ailleurs, si le microbiote gastro-intestinal est modifié lors de la contamination des poulets par l’une de ces deux bactéries, aucune étude n’a décrit sa modulation au cours d’une co-infection Salmonella / Campylobacter. Plusieurs études ont aussi démontré des modifications au niveau de l’ensemble des métabolites (petites molécules) présents dans le sérum de l’hôte à la suite d’une infection intestinale, en partie causées par l’altération du microbiote, mais aucune donnée n'est disponible pour le poulet de chair lors d'une infection ou co-infection par ces bactéries. Les objectifs de ce projet sont donc : (1) d'étudier si une interaction peut exister entre ces deux bactéries dans le tube digestif des poulets, et impacter les niveaux de colonisation de chacune d'elles ; (2) d'étudier l'effet d'une co-infection sur la composition et la structure du microbiote intestinal ; (3) explorer les modifications d’expression l’ensemble des métabolites présents dans le sérum de l’hôte en réponse à ces bactéries seules ou en co-infection.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de générer des données sur le comportement de Campylobacter et Salmonella en co-infection et leur impact sur le microbiote intestinal et l’ensemble des métabolites présent dans le serum du poulet de chair. Ces données n’ont jusqu’alors jamais été décrites, mais sont nécéssaires pour l’acquisition de connaissance sur leur comportement dans un système complexe prenant en compte leur niche écologique, afin d’adapter ou donner lieu au développement de nouveaux moyens de lutte. Plus précisément, les données nouvelles porteront sur : - le comportement de Salmonella et Campylobacter en co-infection chez le poulet de chair, et leur potentielle interaction. - la modulation du microbiote intestinal ainsi que les modifications de l’ensemble des métabolites sériques induites par une co-infection de Salmonella et Campylobacter chez le poulet de chair. - l’analyse conjointe des données hétérogènes issues de l’analyse du microbiote intestinal et des métabolites présents dans le sérum dans ce contexte de co-infection. -l'identification de potentiels biomarqueurs spécifiques aux infections par Salmonella et Campylobacter mais aussi à leur co-infection chez le poulet de chair
Procédures
Inoculation (per os) de Campylobacter jejuni contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 1 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella thyphimurium contenu dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 2 à J1 Inoculation (per os) de Salmonella typhimurium et Campylobacter jejuni contenus dans 100 µl de trypsone-sel pour le lot 3 à J1 Administration per os 100 µl de tryptone-sel pour le lot 4 à J1
Impact sur les animaux
Chez le poulet, Campylobacter jejuni est considérée comme une bactérie commensale, et est à ce titre asymptomatique. Il en est de même pour la souche de Salmonella typhimurium selectionnée. Par ailleurs, ces deux souches ont déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo au sein de notre laboratoire et aucun effet indésirable n’a jusqu’alors été observé. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, nous limiterons la manipulation d’animaux vigiles en réalisant les prélèvements de sang lors d’une saignée à la veine jugulaire après mise à mort. Il n’est donc attendu aucun effet indésirable tout au long de l’essai.
Devenir
Les prélèvements d’organes nécessitent la mise à mort des animaux. C’est pourquoi tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, par dislocation cervicale les jeunes poussins (poids < 250 g) et pour les poussins plus âgés et les poulets adultes après une anesthésie par électronarcose suivie d’une saignée à la veine jugulaire.
Remplacement
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec les bactéries du microbiote intestinal et leur conséquence sur l’ensemble des métabolites (petites molécules dosées dans le sang) produits par l’hôte. Dans ce contexte, et en l’absence de lignée cellulaire ou d’organoïdes pouvant mimer l’intéraction des bactéries de la flore commensale aviaire avec Campylobacter et Salmonella, et leur impact sur l’ensemble des métabolites produits par l’hôte, l’utilisation de test in vitro ou in silico n’est pas possible. C’est pourquoi il est nécessaire de travailler sur un modèle intégré que seule le modèle in vivo permet. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Le poulet de chair est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.
Réduction
Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En raison de la variabilité interindividuelle importante du microbiote intestinale, et afin d’évaluer au mieux l’évolution de ce microbiote caecal au cours du temps, il a été déterminé qu’un minimum de 10 animaux par groupe était nécessaire pour chaque temps donné. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.
Raffinement
Dans nos expériences précédentes, d’inoculation avec ces souches de Campylobacter jejuni et Salmonella Typhimurium utilisées, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés. Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation vigile. Ainsi l’inoculation des bactéries à la pipette par voie orale et les pesées seront réalisées par le personnel expérimenté qui apportera la même attention à chaque inoculation de sorte à éviter/limiter les inconforts au moment de l’administration. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux et non sur animaux vivants. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter. Le raffinement des conditions d’hébergement visera à assurer des conditions d’hébergement limitant l’inconfort potentiel des animaux. Quatre animaleries de type A2 seront utilisées en dépression (légère ou moyenne). Chaque lot de poulets sera installé dans des parcs au sol de 4 m² entourés par des panneaux grillagés en inox de 1 m de haut. La litière sera composée de copeaux de bois (qui sert d’enrichissement du milieu puisque les animaux grattent et picorent cette litière). Les paramètres d’ambiance utilisés sont préconisés pour les élevages de poulets de chair. Les installations sont équipées de lumières électriques programmables, d'un chauffage électrique automatisé et d'une ventilation. Les animaux recevront à volonté, de l’eau et de l’aliment réservé aux poulets de chair spécifiques à leur âge. Afin de stimuler les poussins à s’alimenter dans leurs premières heures de vie, des alvéoles en carton de plateaux d’oeufs seront disposés sur les copeaux de bois avec de l’aliment et des cartons seront apposés sous les mangeoires. Les alvéoles en cartons servent également d’éléments de grattage et de picotage. L’évolution pondérale sera obtenue par des pesées individuelles à l'installation des animaux dans les animaleries, et au moment des mises à mort.
Choix des espèces
La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose et de salmonellose pour l’homme. Afin de lutter au mieux contre ces zoonoses, il est indispensable de mieux comprendre leur interaction avec le microbiote intestinal et leur conséquence sur les métabolites sériques produits par l’hôte. Afin de se rapprocher au maximum des conditions du terrain il convient de réaliser cette étude sur le poulet de chair qui est le premier réservoir de Salmonella et Campylobacter. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 35 jours (âge d’abattage des poulets de chair pour la consommation). Le but est de suivre la modulation du microbiote et l’influence sur le métabolome à la suite d’une infection à J1 par Campylobacter, par Salmonella ou d’un coinfection Campylobacter + Salmonella
Caractérisation d’un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire liée à SPG4 en vue d’une thérapie.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées à l'issue et une partie conservée pour la reproduction de la lignée. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur AAV censé rétablir la protéine spastine, avec des prélèvements de muscles et de sang sous anesthésie, pour caractériser un modèle de paraplégie spastique héréditaire. Le porteur indique que l'injection n'est pas censée nuire, mais qu'une bulle d'air pourrait provoquer une mort instantanée et que l'effet des vecteurs reste mal connu. Les animaux sont ensuite tués par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque pour les analyses.
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires (PSH) sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par une spasticité et une faiblesse des membres inférieurs. Ce groupe de maladies, a une prévalence dans le monde de 5 pour 100 000 personnes et est lié à des mutations sur plus de 90 gènes qui peuvent avoir de fonctions et localisations différentes au sein de la cellule. La majorité des cas (40%) de PSH à transmission autosomique dominante sont dû à des mutations d’un gène nommé SPG4 qui code pour la protéine spastine dont la fonction principale est de couper les microtubules. Le gène SPG4 grâce à deux codons d’initiation, code pour deux isoformes de la protéine : une forme longue et une forme courte avec différentes localisations subcellulaires. Les défauts d’expression de la spastine, dus à ses mutations, se traduisent par une axonopathie des motoneurones supérieurs au niveau de la moelle épinière qui cause la pathologie. Bien que le mécanisme moléculaire de la spastine soit bien documenté les véritables causes qui amènent à la pathologie ne sont pas connues. A ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible. Le but de ce projet est de développer une approche de thérapie génique afin de rétablir l’expression d’une protéine spastine fonctionnelle qui permettrait de corriger les symptômes de la maladie.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun traitement n’existe pour les paraplégies spastiques héréditaires. Les objectifs ainsi que les bénéfices de ce projet sont multiples : tout d’abord éclaircir sur l’implications d’autres protéines partenaires de spastine dans l’évolution de la maladie. En absence d’un traitement efficace pour corriger les symptômes, le deuxième objectif est de développer une stratégie thérapeutique qui rétablirait une expression de la spastine fonctionnelle à l’aide d’un vecteur AAV. Le bénéfice pourrait se traduire par l’amélioration des signes pathologiques chez le modèle murin SPG4-KO ce qui apporterait une preuve de l’efficacité de cette approche pour traiter des patients et améliorer leurs conditions de vie.
Procédures
Dans la PE1: mise à mort par dislocation cervicale. Dans la PE2: une seule injection intraveineuse d’AAV via la veine caudale. Au cours de la PE2 des prélèvements ante-mortem des muscles et du sang seront effectués sous effet anesthésique de la souris. Mise à mort par dislocation cervicale pour les analyses biochimiques et moléculaires et perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe pour les analyses histochimiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors du projet sont liés à l’acte de l’injection nécessaire pour administrer la thérapie mais cette procédure n’est pas censée induire d’effets négatifs. Néanmoins, dans le cas où l’injection comporte l’introduction imprévue d’un bulle d’air comme effet indésirable, il pourrait y avoir une mort instantanée de l’animal. Un autre effet indésirable pourrait être causée par l’expression de la protéine spastine par le biais des deux vecteurs administrés dont nous n’avons pas des informations.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les animaux seront gardés pour d’autres accouplements ou mis à mort si les accouplements ne sont plus nécessaires. A la fin de la procédure 2, tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale ou perfusion intracardiaque à l'aide d'une pompe afin d’effectuer les prélèvements des organes et faire les analyses post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas de moyen de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’étude d’une stratégie thérapeutique dont l’administration ne peut faire que par voie systémique et qui peut avoir des conséquences sur son efficacité à traiter correctement les symptômes. Une étude sur des cultures primaires de neurones issus de souris SPG4-KO ou d’autres modèles cellulaires déficient en spastine, peuvent permettre uniquement une meilleure compréhension de la physiopathologie et la confirmation/identification de certains marqueurs moléculaires pour cette pathologie. Ces marqueurs ont été préalablement identifiés à la fois dans des modèles cellulaires d’origine humaine ou la protéine spastine a été réduite/supprimée par siRNA et ainsi que dans le cerveau et la moelle épinière des modèles murins.
Réduction
Les souris hétérozygotes (SPG4-HE) issues des croisements seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien de l’élevage. Les paraplégies spastiques héréditaires affectent indifféremment les hommes et les femmes : des souris des deux sexes seront donc utilisées. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés par groupe, le nombre de souris nécessaire a été estimé à 224 souris par une étude statistiques prédictive (test paramétrique unilatéral de comparaison des moyennes) suite à la compilation des données en littérature avec des expériences précliniques issues de notre équipe. Des tests in vitro ont été préalablement réalisés afin de tester plusieurs cassettes d’expression et de n’en sélectionner que 2 pour l’application in vivo. A notre connaissance, notre étude serait la première à tester la piste thérapeutique avec AAV pour les PSH-SPG4 et permettrait non seulement de valider la stratégie de thérapie génique mais aussi de vérifier l’absence d’effets secondaires inattendus. Nous avons aussi décider de réduire à deux temps d’analyses notre étude afin de regarder les effets à court terme (3 mois post injection) et à plus long terme (11 mois post injection).
Raffinement
Raffinement pour les animaux injectés avec des vecteurs viraux. Les procédures ne sont pas censées induire d’effets négatifs. Cependant, c’est la première fois qu’une injection de vecteurs pour remplacer l’expression de la protéine Spastine sera faite dans ce modèle. C’est pourquoi l’observation et le suivi de poids sera effectué deux fois par semaine pendant 15 jours post-injection puis une fois par semaine. Concernant les prélèvements de muscles et de sang dans la PE2 , les prélèvements seront anticipés par l’administration d’une anesthésie et la profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Pour l’infusion cardiaque, elle sera précédée d’une injection par voie sous-cutanée d’un mélange de deux anesthésiques à raison de 100µl/20g de poids: la kétamine (aux propriétés anesthésiques et analgésiques (100 mg/kg,Virbac, Carros)) et la xylazine (aux propriétés anesthésiques, sédatives, myorelaxantes et analgésiques (10 mg/kg, Rompun® 2%, Bayer)). La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée avec le début de l’acte chirurgical (absence de réflexe palpébral, absence de réflexe de retrait ou pincement de la queue et présence d’une respiration affaiblit (fréquence respiratoire 55-65/min) et essentiellement abdominale). Nous estimons qu’il faut environ 2 minutes pour l’installation de l’animal sur le plan de travail. Puis le temps passé entre l’ouverture de la cage thoracique et le début de la perfusion est estimé à 1 minute suivi par une perfusion intracardiaque d’une solution au PBS puis du fixateur au PFA, qui sera réalisée dans les 5 minutes selon la taille de la souris. L’opérateur pourra suivre l’efficacité de la procédure via l’observation de l’animal : la correcte fixation de l’aldéhyde aux nerf et aux muscles sera évidente par un tremblement des extrémités. Pour l’ensemble de la PE2: avant toute anesthésie, un examen préopératoire sera effectué pour vérifier l’état de l’animal qui sera ensuite pesé afin de calculer la dose exacte d’anesthésiant/analgésique à injecter. De plus le stress des animaux en attente sera évité car ces procédures seront réalisées dans une pièce à part.
Choix des espèces
Le modèle murin SPG4-KO reproduit des phénotypes pathologiques spécifiques qui ont été aussi observés chez l’homme. Ce modèle ainsi que d’autres, selon les données en littérature disponibles à ce jour, reproduisent des signes tels que l’apparition des dilatations axonales au niveau de la moelle épinière, des défauts de comportement moteurs ainsi qu’une augmentation de nombre de cellules gliales dans le cortex. La correction de l’ensemble ou d’une partie des défauts pathologiques pourra être utile pour estimer l’avantage de ce type d’approche thérapeutique pour le traitement de paraplégies spastiques liées au gène SPG4. Dans la première procédure expérimentale nous allons mettre en accouplement des souris hétérozygotes pour SPG4 (SPG4-HE). Les souris seront mises en accouplement entre l’âge de 6 semaines et de 6 mois. Il n’y a pas de point limite à prendre en compte car les souris SPG4-HE ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans la deuxième procédure expérimentale nous allons utiliser des souris SPG4-KO âgées de quatre semaines, avant l’apparition des premières manifestations pathologiques (4 mois) afin d’étudier l’expression de la protéine spastine, leur bio-distribution et le niveau d’expression de la protéine SPG4 dans les tissus d’intérêt mais aussi sélectionner la dose optimale des vecteurs afin d’avoir un niveau d’expression physiologique de la protéine d’intérêt. Le phénotype de ces animaux n’est pas dommageable mais les points limites seront surveillés dans le cadre des injections.
Etude de l’activité thérapeutique de deux anticorps pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique
- Recherche appliquée
- Cancers
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections intraveineuses de deux anticorps sous anesthésie gazeuse, avec des pesées, puis un prélèvement sanguin terminal, pour confirmer in vivo un bénéfice thérapeutique contre la leucémie lymphoïde chronique. Le porteur indique que les nuisances se limitent au stress des pesées et de l'injection d'anesthésiques. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés au long terme et à la poursuite du développement de l'anticorps en clinique.
Objectifs
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une maladie touchant des cellules du sang appelées les lymphocytes B (LB). Comme toutes les cellules, les lymphocytes B ont normalement une durée de vie limitée, de l’ordre de quelques jours à quelques mois. Au cours de la LLC, une partie des LB ne meurt plus. Leur cycle de vie est en quelque sorte bloqué lorsqu’ils parviennent à maturité. Comme leur production se poursuit, ces LB finissent par s’accumuler dans le sang, dans les ganglions, la rate et la moelle osseuse. La LLC reste une maladie fréquente avec 4500 nouveaux cas chaque année. Pour les patients, le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie et l’immunothérapie notamment par des anticorps monoclonaux anti-CD20. En effet, l’antigène CD20, qui est exprimé sur les cellules B normales et malignes, s'est avéré être une cible utile pour les approches immunothérapeutiques de la LLC. Actuellement plusieurs anticorps, dont l'Obinutuzumab, sont utilisés comme traitements thérapeutiques pour soigner la LLC. Certains patients ne répondent pas au traitement initial et d’autres rechutent après l'administration des anticorps. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire pour pallier aux mécanismes d'échec et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association d'un nouvel anticorps à l'Obinutuzumab renforce l'activité cytotoxique direct de l'Obinutuzumab. Ce projet a pour objectif de montrer que la combinaison de l'Obinutuzumab à un nouvel anticorps thérapeutique améliore l'activité cytotoxique directe de l'Obinutuzumab. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma) comme modèle. Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, LB et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules primaires de patients atteints de LLC chez la souris pour modéliser cette pathologie. Nous évaluerons à J5 la maladie résiduelle (nombre de cellules malignes persistant après traitement et qui est le critère le plus puissant pour prédire la rémission ou la rechute après traitement). Les résultats permettront de savoir si la combinaison des deux anticorps permet de détruire plus efficacement les cellules de LLC.
Bénéfices attendus
A cours terme, la réalisation de ce projet permettra de recueillir des données in vivo et confirmer que l'injection des deux anticorps confère un bénéfice thérapeutique pour le traitement de la LLC, synergie observée in vitro. A long terme, ce projet va permettre la poursuite du développement de l'anticorps en clinique humaine. Ce dernier pourra venir renforcer l'activité de l'Obinutuzumab déjà utilisé en clinique chez l'homme mais qui présente des limites d'efficacité.
Procédures
Les souris seront soumis à 3 pesées (réalisées sur animal vigile), à 3 injections intraveineuses réalisées sous anesthésie gazeuse (l'anesthésie dure maximum 5 minutes) puis elles seront repositionnés dans leur cage. La récupération après l’anesthésie est très rapide, en moins de 2 minutes les souris retrouvent le réflexe de marche dans la cage. A la fin de la procédure, un prélèvement sanguin unique et terminal sera réalisé sur animaux anesthésiés et analgésiés, ce prélèvement dure maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). La durée de la pesée est de 30 secondes par animal. Du stress pourra également être généré lors de l'injection intrapéritonéale d'anesthésiques/analgésiques nécessaire pour le prélèvement sanguin terminal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Afin de réaliser les analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes et de sang terminaux seront effectués sur les souris.
Remplacement
La LLC est une maladie multifactorielle impliquant les cellules circulantes et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à l'activité des anticorps thérapeutiques nécessitent la mise en place de protocoles in vivo car il n’est pas possible aujourd'hui de reproduire la LLC par l’utilisation de modèles in vitro. Cependant, l'activité des anticorps a été au préalable évaluée in vitro sur des cellules cancéreuses, sur cellules primaires de LLC de patients et sur cellules saines. Nos études préliminaires in vitro sur cellules de patients ont montré que l'association de notre anticorps à l'Obinutuzumab renforce l'activité cytotoxique direct de l'Obinutuzumab. De plus, ces études ont permis de déterminer les posologies optimales qui seront utilisées dans le projet in vivo chez la souris.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote avec un petit nombre d'animaux, 5 par groupes. Nous vérifierons que les moyennes suivent la loi normale par un test de Bartlett puis les moyennes des 4 groupes seront ensuite analysés par un test ANOVA.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Il s'agit d'une procédure de classe légère, du stress pourra être généré lors de la pesée des animaux, trois pesées seront réalisées durant le suivi (J0; J2 et J5). La durée de la pesée est rapide moins de 30 secondes par animal. Les injections intraveineuses sur animal vigile pouvant générer du stress et de l'inconfort, nous avons fait le choix de les réaliser sous anesthésie gazeuse afin de favoriser le bien-être animal conformément à la règle des 3R. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins.
Choix des espèces
Nous utiliserons comme modèle, la souris NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ communément appelée NSG (NOD Scid Gamma). Cette souris est immunodéficiente et caractérisée par une absence de lymphocytes T, lymphocytes B et de cellules tueuses (NK). Cette immunodéficience nous permet de greffer des cellules humaines primaires de LLC et modéliser cette pathologie. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules primaires humaines de LLC.