Recherche appliquée
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Etude de la transmission de Bordetella pertussis et de l’efficacité de protection de la souche vaccinale BPZE1P contre les Bordetellae chez le hamster.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 386 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie nasale par la bactérie de la coqueluche, hébergés avec des animaux sains pour étudier la transmission, puis tués pour prélever nez et poumons. Le porteur indique une surveillance quotidienne du poids et du comportement, une perte de plus de 20 % du poids pouvant déclencher la mise à mort. Il présente le hamster comme un modèle permettant, contrairement à la souris, d'étudier la transmission par aérosol, et revendique le recours à l'animal pour valider son vaccin vivant.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier une phase critique de la coqueluche qui est la phase de transmission et la potentialité de notre vaccin vivant à protéger contre l’infection bactérienne par aérosolisation naturelle.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’étudier et comprendre la phase de transmission de Bordetella pertussis dans un modele Hamster et de potentialiser notre vaccin vivant pour définir la protection médiée contre une infection par transmission naturelle par infection nasale.
Procédures
1) administration intranasal de Bordetella chez le hamster (5 min par animaux). Les animaux seront euthanasiés 0, 3, 7, 14,21, 28 et 56 jours post administration pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 2)exposition des animaux sains à l'infection par co-hebergement avec les animaux infectés. Le temps de co-hebergements est de 0, 7, 14, 28 et 56 jours, ensuite les animaux sains et infectés initialement seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons 3) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3h et 7j après ce challenge, les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons. 4) les hamsters seront vaccinés par instilation intranasal de Bordetella pertussis (5 min) ou injection sous cutanée de vaccin commercial (5 min). Un mois plus tard, le groupe ayant recu le vaccin commercial sera boosté par la même dose. 28 jours plus tard, les hamsters immunisés ou naifs seront mis en contact avec des hamsters préaleblement infectés par une souche virulente de Bordetella (5min). 3 heures, 14 jours, 28 jours et 56 jours après la mise en contact les hamsters seront euthanasiés pour prelevement post mortel de sang, du nez et des poumons.
Impact sur les animaux
Nous avons déjà démontré que l’infection nasale par BPZE1 dans un modèle hamster ne provoque aucun symptôme bien que les bactéries puissent coloniser le nez pendant 56 jours. En revanche bien que la littérature montre une résistance naturelle des hamsters à Bordetella bronchiseptica, nous ne connaissons pas la virulence des souches cliniques de Bordetella pertussis ni des souches de Bordetella parapertussis dans le modèle hamster.
Devenir
Les hamsters seront mis à mort à la fin de chaque expérience pour la récupération des nez et poumons ou à l'atteinte des points limites
Remplacement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. Les modèles in vitro ou in silico ne suffisent pas pour comprendre les phénomènes de colonisation et d’induction de l’immunité induits par l’infection. En outre, dans l’optique de positionner le vaccin BPZE1P comme protecteur contre une infection naturelle, son efficacité doit être validée par une expérimentation animale in vivo. D'autre part l'etude de la phase de transmission necessite de mettre en contact (cocconing) les animaux infectés avec des animaux sains pour tenter de mimer une infection naturelle, cette etape ne peut etre reproduite in vitro.
Réduction
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse.
Raffinement
Il nous tient à coeur d'appliquer au mieux la règle des 3R. nous serons extrêmement vigilants sur le respect de la notion de points limites. Chaque jour, les critères de souffrance seront évalués (changement comportemental, prostration, etc.) à l’aide d’une grille de cotation. Dans le cas où le score atteint le seuil limite fixé, l'animal sera mis à mort. Les résultats de la procedure 2 nous permettra d'affiner les points de prelevement d'organe pour la procedure 5 ce qui limitera le nombre d'animaux utilisés. Le bien-être animal sera vérifié quotidiennement au travers de : - Contrôle du poids de l’animal (si une perte de poids de plus de 20% était observée, nous procéderions à l’euthanasie des animaux concernés) - Comportement général de l'animal (prostration, isolement dans la cage ou au contraire hyperactivité) - Aspect physique, en particulier si le poil est hérissé ou si la respiration est rapide ou saccadée (puisque Bordetella pertussis responsable de la coqueluche est une maladie respiratoire).
Choix des espèces
Le modele animal utilisé pour étudier Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche chez l'humain, est depuis plus de 30 ans le modèle murin. En effet cette bactérie colonise transitoirement le nez et le poumon de la souris. Cependant, la pathologie humaine de la coqueluche met en évidence une infection des voies aériennes supérieures (nez, trachée, bronche) mais très rarement l’entièreté du poumon. Le mode d’infection utilisé pour le modèle murin semble être trop intrusif pour mimer complètement l’infection naturelle humaine. D’autre part, malgré de nombreux essais, le modèle murin ne permet pas d’étudier la phase de transmission car les souris ne toussent pas et n’aérosolisent pas la bactérie. En revanche, le modèle hamster a été mis en évidence comme permettant l’aérosolisation de particule virale du SARS-COV2 et permet l’infection d’animaux naïfs présents dans la même cage avec une séparation physique. l'age de 3 semaines et le sexe sont liés au fait que des hamsters males de 3 semaines ont deja ete utilisés dans un autre protocol APAFIS#27475-2020100514546435 v3 et nous voulons puvoir comparer les resultats experimentaux avec ces deux projets l'age de 3 semaines est aussi liée au fait que les animaux qui seront vaccinés a deux reprises par le vaccin acellulaire auront alors 11 semaines lors du challenge avec les souches de Bordetella
Evaluation in vivo de l’efficacité de bactériophages dans le traitement d’une infection à Klebsiella pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères. Elles reçoivent par gavage sans anesthésie des antibiotiques, une bactérie multirésistante puis des bactériophages, ce geste étant répété jusqu'à dix-neuf fois sur quinze jours, avec prélèvement quotidien de selles. Toutes sont tuées pour prélever leur tube digestif et mesurer l'effet du traitement. Le porteur affirme que la colonisation et le traitement n'induisent pas de symptôme et revendique un modèle vivant "indispensable", le microbiote intestinal ne pouvant selon lui être reproduit in vitro.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques des entérobactéries est telle que nombre d’infections sont devenues intraitables et la diffusion des bactéries multirésistantes expose à un risque de prescriptions d’antibiotiques inadaptés. La colonisation digestive à bactéries multi-résistantes est le principal facteur de risque d’infection qui augmente avec le niveau de colonisation. La décolonisation du portage digestif est une priorité pour lutter contre la dissémination et les conséquences de l’antibiorésistance. Klebsiella pneumoniae (Kp), impliquée dans les infections humaines joue un rôle majeur dans le maintien et la dissémination de cette multirésistance. La décolonisation du portage digestif par antibiotiques n’a pas montré son efficacité, il est donc essentiel de développer de nouvelles armes antibactériennes. Les bactériophages pourraient être une de ces armes puisque leur efficacité a été prouvée dans d’autres infections. Les phages sont des virus qui infectent les bactéries et il existe au moins un phage identifié pour chaque bactérie. Notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’un traitement par phages dans un modèle murin dont le tractus digestif est colonisé par une souche de Kp. Ce modèle va permettre de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des porteurs colonisés par des bactéries multi-résistantes. Nous testerons les conditions d’établissement de la colonisation par différentes Kp (n=10) et testerons l’efficacité de la décolonisation par le traitement par 1 jusqu’à 5 phages. Nous utiliserons donc 3 000 souris au total. Règle des 3R : - Remplacement: notre projet s'inscrit en amont d’étude de décolonisation sélective chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé ; - Réduction : le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables ; - Raffinement: La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.
Bénéfices attendus
La diffusion des bactéries multi-résistantes représente un problème majeur de santé publique. Dans un contexte de faible développement d’antibiotiques réellement innovants et face à des infections qui deviennent non traitables, des alternatives sont nécessaires. Le développement de cocktails de phages pour décoloniser des patients du portage intestinal de Klebsiella pneumoniae multi-résistantes ou diminuer la charge bactérienne, ouvre une perspective intéressante et innovante: diminution du risque de transmissions croisées donc réduction des infections liées aux bactéries multi-résistantes et diminution de la morbidité-mortalité associées. Ce type de modèle est pertinent cliniquement : il permet de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des personnes porteuses colonisées par des bactéries multi-résistantes. En effet, l’utilisation d’un modèle in vivo est ici indispensable et ne peut être remplacé car tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Procédures
Prélèvement de selles : la totalité des souris (3 000). Les selles sont récupérées dès émission chez les animaux tenus en contention manuelle. La procédure dure 20 secondes par animal, est effectuée 1 fois par jour pour un maximum de 14 jours. Gavage : (N=3 000 souris). Les animaux recevront des antibiotiques (clindamycine (8,6 mg/kg/jour), les bactéries K. pneumoniae, les bactériophages) dans un volume de 200 µl à l’aide d’une canule de gavage. L’animal est tenu en contention manuelle, sans anesthésie et la suspension lui est administrée à l’aide d’une canule de gavage. Aucune anesthésie n’est mise en place car la procédure consiste en une seule administration par voie orale et la mise en place d’une anesthésie serait plus traumatisante pour l’animal. Le geste de gavage dure en moyenne 15 secondes par animal. Selon les groupes, ce geste sera réalisé un minimum de 1 fois et un maximum de 19 fois sur 15 jours. Euthanasie : la totalité des souris (3000). L’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/mlpar souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). L’injection dure 5 secondes par animal. Contention manuelle : la totalité des souris (3 000)
Impact sur les animaux
Deux concentrations différentes de Kp seront inoculées aux animaux afin d’établir un modèle de colonisation stable du tractus digestif. De notre expérience et étude de la litérrature la colonisation par une souche de Kp, même hypervirulente, ne présente pas d’effet indésirable jusqu’à 28 jours post-colonisation (données isssues de la litérrature) voire 50 jours (communication personnelle d’un collaborateur). La deuxième étape de traitement par phages n’engendrera pas de préjudices aux animaux puisque le traitement est à visée décolonisante. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Devenir
A l’issue de la période de colonisation par Kp ainsi qu’à l’issue du traitement par les phages, tous les animaux sont euthanasiés afin de procéder au prélèvement de leurs tubes digestifs pour une mise en culture et visualisation de la localisation des bactéries le long du tube digestif. Ces méthodes vont permettre de voir l’efficacité de la colonisation par Kp ainsi que l’efficacité du traitement par les phages, comparativement au groupe témoins non traités et nécessite l’euthanasie des animaux
Remplacement
L’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable dans l’étude de l’efficacité du traitement par phages et ne peut être remplacé. En effet, tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, conduisant à un nombre total d’animaux de 3 000 pour ce projet. La taille des groupes a été estimée à partir de logiciel d’analyse statistique. L’utilisation de chaque animal sera optimisée en effectuant sur un même animal au cours du temps différents types d’analyses après prélèvement non invasifs des selles, suivi de coupes histologiques et microscopie en fin d’expérience.
Raffinement
Le projet a été construit en intégrant les mesures permettant de réduire le stress et si possible, la souffrance des animaux (raffinement). Il sera assuré par l'enrichissement mis à disposition des animaux (litière en copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids). Les animaux sont hébergés par groupe de 6 souris maximum (qui constituent les groupes expérimentaux) dans des cages de type IIL dont la surface répond aux normes de l’annexe II section B paragraphe 2.1 tableau 1.1 de l’arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles dans le cas de l’utilisation de souris. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée à l’arrivée des animaux avant le début des expériences. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Les gavages seront effectués par des personnes formées et compétentes. Lors du gavage, une surveillance accrue des animaux pendant 10 minutes permettra de détecter d’éventuels signes de souffrance. Si une difficulté respiratoire est observée, l’animal sera euthanasié par disclocation cervicale. La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance (animal prostré, ne se nourrissant plus, poil piqué, ne se servant plus de l’enrichissement mis à sa disposition). Si un des paramètres cité précédemment est observé, l’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/ml par souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). La mort des animaux est confirmée par une vérification de l'arrêt respiratoire et de l'arrêt cardiaque. La vérification de ces paramètres est réalisée pendant une minute.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin (souris SWISS) car celui-ci a prouvé son efficacité dans la mise en place de colonisation par des bactéries mais aussi dans la décolonisation par des phages. Nous avons choisi des souris femelles (afin d’éviter les conflits entre mâles) SWISS (souris immunocompétentes non consanguines). Les animaux seront utilisés à un âge de 7 -12 semaines ce qui permettra d’avoir une flore digestive mature. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Etude de l’efficacité anti-tumorale de différents formats d’anticorps anti-B7-H3
- Recherche appliquée
- Cancers
10 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 950 dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent des injections répétées et des greffes de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, pour tester différents formats d'anticorps anti-B7-H3 en cancérologie. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer nécrose, saignement, ulcération et perte de poids, et que les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou en fin de protocole par dislocation cervicale. Il conclut au "besoin de nouveaux traitements innovants" et affirme que l'efficacité ne peut être évaluée que dans un modèle vivant, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. L’immuno-oncologie est aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse. Sa particularité n’est pas uniquement de cibler la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques mais aussi d’aider le système immunitaire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. L’utilisation d’anticorps dans le traitement des cancers est l’une des stratégies approuvées et en continuel développement. Différents formats d’anticorps ont été approuvés en clinique : les anticorps monoclonaux présentant une action cytotoxique par ADCC via l’engagement des récepteurs Fc sur les cellules cytotoxiques (Rituximab, Cetuximab,…) ; les anticorps multi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices de l’immunité, favorisant l’élimination des cellules tumorales par les cellules immunitaires (Blinatumomab) ; les anticorps conjugués à un agent cytotoxique appelés ADC (Antibody Drug Conjugate) qui est libéré au niveau du site tumoral (Padcev, Enhertu..). Notre laboratoire travaille sur le développement d’anticorps thérapeutiques équivalents sur les formats monoclonaux (mAb), ADC mais également sur le format multi-spécifiques. Les anticorps multi-spécifiques développés par notre laboratoire engagent les cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale ainsi que les cellules tumorales (via un antigène tumoral). Dans le cadre de ce projet, l’antigène ciblé est une molécule que l’on retrouve exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène ainsi qu’à la surface de cellules tumorales. Des anticorps de la concurrence, dirigés contre cette molécule, sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Les premiers essais montrent des signes d’efficacité, ce qui nous conforte dans le choix de cibler cette molécule. L’objectif de ce projet consistera à évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps anti-antigène tumoral sous différents formats (ADCC, multi-spécifique ou ADC).
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, on dénombre plus de 9 millions de décès par an. Ce chiffre démontre le besoin de nouveaux traitements innovants. Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de l’efficacité anti-tumorale de nouveaux anticorps dans des modèles pré-cliniques, une meilleure connaissance de leur mode d’action et de leur potentiel d’efficacité en combinaison avec des traitements de références. Tout ceci afin d’amener ces anticorps dans des phases de tests cliniques sur des patients atteints de cancer. Le bénéfice à long-terme est le traitement et l’augmentation de l’espérance de vie de patients atteints de cancer exprimant la cible à la surface de leurs cellules tumorales.
Procédures
Pharmacodynamie / pharmacocinétique : a. 1 injection IV de composés thérapeutiques avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse. Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. 1 injection IP de composés thérapeutiques avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL. Test fonctionnel ex-vivo : a. 1 injection en IP de poly(I:C) avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL ; b. prélèvement de rate post-mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle sous-cutané (SC) : a. injection sous-cutané de cellules tumorales avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, une à deux injections SC par animal, volume ≤200 µL par injection ; b. prélèvement de tumeurs et/ou organes en post mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle intra-veineux (IV) : a. 1 injection intra-veineuse de cellules tumorales via veine caudale avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigile, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. prèlèvement de poumons et/ou foie post-mortem après dislocation cervicale ou surdosage chimique d’anesthésique. Test d’efficacité modèles SC et IV : a. injections IV de composés thérapeutiques ou de composés déplétant 1 population immunitaire avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL. A doses et fréquences variables. Si les injections IV sont réalisées via le sinus rétro-orbital, maximum de 1 injection par œil et par jour sera réalisé avec un maximum de 5 injections par œil ; b. injections IP de composés thérapeutiques ou de composés déplétant une population immunitaire avec aiguilles 30G 1/2 ou 26G, sur animaux vigiles. Doses et fréquences variables dans un volume ≤400 µL ; c. injections per os de composés thérapeutiques avec sondes de gavage, sur animaux vigiles. Volume ≤200 µL et pouvant aller jusqu’à 400 µL. A doses et fréquences variables. Etude de pharmacodynamie et pharmacocinétique + test d’efficacité dans modèles SC et IV : a. prélèvement de sang au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume de sang prélevé par animal < à 7.5% du volume sanguin total par semaine. Si prélèvements à la fin de la procédure expérimentale, volume prélevé pouvant aller jusqu’à 600µL et l’animal sera sacrifié par dislocation cervicale avant réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les composés thérapeutiques injectés dans études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une toxicité dans les jours suivant l’administration. Celle-ci se traduisant par une perte de poids sur 4-5 jours. Les animaux revenant en phase de prise de poids et donc à un état général normal au maximum 7 jours après l’injection. Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèles sous-cutané peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme).
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 2 doivent être sacrifiés pour prélèvement de rate post-mortem. Les animaux de la procédure 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de réduire les nuisances sur le bien-être des animaux et d’éviter tout effet indésirable. Les animaux exclus lors de la randomisation seront sacrifiés avant atteinte des points limites et pour certains un prélèvement d’organes/de sang sera effectué pour des analyses ex-vivo et de caractérisation du mode d’action du composé thérapeutique. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable.
Remplacement
Evaluer des stratégies d’immuno-oncologie implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept chez l’animal dans le processus de développement d’anticorps thérapeutiques. Le remplacement des animaux est donc impossible à mettre en place du fait de la nécessité d’étudier l’efficacité dans un modèle vivo complexe, impossible à mimer in vitro.
Réduction
Le nombre nécessaire de souris a été calculé afin de couvrir les différentes études qui permettront d’investiguer les effets anti-tumoraux des anticorps développés par notre laboratoire et de fournir des résultats statistiquement significatifs. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités seront comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre moyen de 10 souris par groupe a été préalablement déterminé sur la base des moyennes et déviations mesurées pour chaque paramètre. C’est le nombre minimum de souris nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement interprétables. Si plusieurs composés candidats ou plusieurs doses du même composé doivent être testés dans le cadre de la même série expérimentale, les groupes contrôles ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. Les schémas d’injections des traitements de déplétion de populations immunitaires seront établis et l’absence de toxicité vérifiée lors de mise au point préalable sur un petit nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, des aiguilles de diamètre 30G 1/2 seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains composés thérapeutiques peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 6 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. De plus, dès l'atteinte de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. De plus, si l’aspect général et le comportement de l’animal se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessitant pas son euthanasie, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La majorité des modèles animaux en immuno-oncologie ont été développés chez la souris. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité d’anticorps thérapeutiques et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches. Dans les souches de souris immuno-déficientes : xénogreffes pour tester le candidat médicament sur des cellules tumorales humaines. Le système immunitaire de ces souris bien que déficient, possède tout de même des macrophages ainsi que des cellules NK permettant l’évaluation de nos molécules. Dans les souches de souris immuno-compétentes : modèles syngéniques via la greffe de cellules tumorales murines exprimant l’antigène humain permettant ainsi de tester le candidat médicament en évaluant l’impact de la réponse immunitaire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Nouvelles associations thérapeutiques dans le traitement du cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du pancréas sous anesthésie, puis des gavages et des injections dans le ventre deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester une association de chimiothérapie et d'un inhibiteur de réparation de l'ADN. La tumeur est laissée croître jusqu'à un volume de 1 500 mm³, seuil déclenchant la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable dû au traitement" et conclut qu'aucune méthode alternative ne remplace ces expériences de preuve de concept in vivo.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de therapies sont proposées, seulement la gemcitabine et deux combinaisons de chimiothérapie (FOLFIRINOX et Gemcitabine/Nabpaclitaxel) sont disponibles. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie (présence d’un microenvironnement très dense) ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de surive des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement, dont des inhibiteurs de la réparation de l’ADN suite à des cassures induites par la chimiotherapie. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti tumorale de l’association du FOLFIRINOX, à un inhibiteur de réparation de l’ADN dans des modèles de co-culture cellules tumorales pancréatique et cellules du micro environement. L’efficacité de cette association est étudiée in vitro lors de test de viabilité et confirmé in vivo sur différents modèles de souris avec ou sans système immunitaire. Les mécanismes impliquées dans cette réponse anti-tumorale sont étudiées au niveau de la mort cellulaire, du dialogue (protéines) entre les différents types cellulaires et des cellules immunitaires. Ce projet, qui est important pour le devenir des patients atteints de cancer du pancréas, est réalisé en collaboration avec les services cliniques de l’ICM notamment la chirurgie et l’anatomopathologie
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré in vitro l’efficacité de l’association du FOLFIRINOX avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN (ATR) dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Il s’agit maintenant de démontrer cette synergie dans 2 modèles de souris nudes xénogreffées chacun avec une tumeur de cancer pancréatique issues de tumeur de patient (PDX : Patient-Derived Tumor Xenografts) et 2 modèles de souris immuno compétentes greffées avec une tumeur murine pancréatique, ces derniers modèles permettront de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie générale courte pour la procédure chirurgicale de greffe de PDX (15 minutes maximum / souris). Les traitements à raison de deux fois par semaine sur 4 semaines seront des injections intrapéritonéales ( 5 secondes/ injection/souris, contention comprise) et des gavages (10 secondes/gavage/souris, contention comprise). Les prélévements seront uniquement des prélèvement terminaux sur animaux eutanashiés.
Impact sur les animaux
De nombreuses études ayant déjà été élaborés dans notre institut et dans d'autres, nous maitrisons les doses administrées aux animaux et de ce fait n'attendons aucun effet indésirable dû au traitement. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
Les animaux en sortie de procédure 1 seront directement intégrées dans la procédure 2. A l'issue de celle ci les niamaux seront euthanasié et les tumeurs seront récupéré pour des tests d'immunohistochimie, immunophénotypage et western blot.
Remplacement
Ces associations de drogues ont montré une efficacité in vitro. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Des modèles précliniques sur souris immunodéprimées et compétentes sont impératifs pour valider l’efficacité de nos traitements, ceci afin d’envisager la translation vers la recherche clinique.
Réduction
D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux. L’analyse statistique sera réalisée avec une Unité de Biométrie. L’étude de l’effet des traitements sur la croissance tumorale permettra de faire deux types d’analyse. 1 : Modélisation de la croissance tumorale et comparaison entre les groupes en utilisant un modèle linéaire mixte. 2 : Analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre une taille de tumeur de 1500 mm3. Le point limite est donc une taille de tumeur de 1500 mm3. Les courbes de survie seront ensuite estimées par la méthode de KaplanMeier et comparées par le test du logrank. Pour confirmer le nombre de souris nécessaire, nous avons calculé la puissance statistique en utilisant le logiciel STATA 13. La puissance a été vérifiée en se fondant sur des hypothèses posées à partir de résultats in vivo et selon une des méthodes proposées par Frison et Pocock (1992) qui considère des résultats de mesures continues répétées. Sous les hypothèses alpha:0,05, delta:1,5 (à J17:moyenne du groupe contrôle attendu ~17 et moyenne du groupe traite attendu ~15,5), écart type : 1,6, la prise en compte de 8 mesures répétées, une corrélation de 0,5 entre ces mesures, et une taille d'échantillon égale a 10 pour chaque groupe, la puissance statistique estimée est de 80%.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée dans des conditions
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés , et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymic nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétente gréffées avec une tumeur murine. Age 5 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après la greffe.
Evaluation de l’impact d’approches thérapeutiques sur la force musculaire de modèles murins de maladies neuromusculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
180 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles proviennent d'un autre projet où elles ont reçu par voie intramusculaire ou générale des molécules candidates ou une solution saline, puis subissent une mesure de la force musculaire de vingt à trente minutes avant d'être tuées pour prélever leurs muscles. Le projet vise à trier des candidats-médicaments contre la myopathie de Duchenne, un "réel bénéfice thérapeutique" pour les patients restant renvoyé au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet aujourd'hui de tester le bénéfice fonctionnel de ces traitements sur la fonction musculaire.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques pour des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement du corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le coeur et le système nerveux central (aspect cognitif) représentent aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques, les stratégies thérapeutiques et les outils moléculaires développés se doivent de répondre efficacement à ce défi. L’évaluation générale de ces différentes approches sur les modèles murins de maladies neuromusculaires fait l’objet d’une autre demande d’autorisation préalablement acceptée. Cette autorisation regroupe notamment la description des procédures d’administration des molécules thérapeutiques (par voie locale ou systémique).
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la DMD. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique permettant une amélioration significative de la fonction musculaire chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients DMD traités.
Procédures
Dans le présent projet, les animaux subiront une procédure unique (d’une durée de 20 à 30 minutes), classée sans reveil. Cependant, les animaux seront ré-utilisés d’un autre projet dans lequel les souris auront reçu les molecules thérapeutiques ou la solution saline contrôle par voie intramusculaire ou systemique (procédures modérées).
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une procédure sans réveil pratiquée depuis de nombreuses années dans l’établissement utilisateur (pour d’autres projets). Par expérience, les effets indésirables associés sont très limités. Lors de la procédure, les animaux seront sous profonde anesthésie gazeuse ainsi que sous analgésie. Les risques ou nuisances possibles liés à cette procédure sans réveil sont des risques anesthésiques et incluent un possible réveil ou une détresse respiratoire. »
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet (notmament muscualire) et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos outils thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro des modèles cellulaires afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses et qui permettent d’envisager un reel beenfice thérapeutique chez les futurs patients traités. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro permettant de tester le bénéfice fonctionnel (notamment sur la fonction musculaire) de ce type de traitement.
Réduction
Seules les molécules ayant démontré une efficacité à la fois in vitro dans des modèles cellulaires et dans des analyses préliminaires in vivo (études pilotes sur un nombre d’animaux réduits (n=3-4) afin de valider la restauration de protéine dystrophine dans les muscles traités (projet « Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies neuromusculaires »), seront utilisées dans le présent projet visant à mesurer la fonction musculaire. Les évaluations fonctionnelles réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=10 par groupe, soit un nombre total de 180 animaux au maximum).
Raffinement
Le personnel expérimental vérifiera que les animaux se portent bien dès leur arrivée dans l’Etablissement utilisateur et ce jusqu’au début de la procédure sans réveil (à la suite de laquelle les animaux seront directement euthanasiés). Si jamais un point limite était atteint, l’animal serait immédiatement euthanasié. Lors de la procédure, les animaux seront sous analgésie et profonde anesthésie gazeuse. Si l'animal se réveille ou est mal endormi, l'expérimentateur procèdera une nouvelle fois à une induction mais plus importante (3% par exemple). Il vérifiera qu'il n'y ait aucune réponse à stimulation tactile avant de procéder à la chirurgie. En cas de détresse respiratoire due à l'anesthésie, le flux d'isoflurane sera coupé 15 secondes. Lorsque la respiration redevient normale, l'isoflurane sera relancé et baissé à 2%. Après quelques minutes, les réponses à la stimulation tactile seront vérifiées à nouveau. En cas de réveil survenant lors de l'opération, l'animal sera euthanasié immédiatement.
Choix des espèces
Seuls des modèles murins sont utilisés dans ce projet de recherche. Les modèles murins mdx, mdx52 et mdx5CV sont les modèles les plus couramment utilisés pour l’évaluation préclinique de molécules thérapeutiques pour la DMD car ils reproduisent le défaut génétique observé chez les patients, à savoir une mutation dans le gène DMD invalidant la production de protéine fonctionnelle. Ces modèles permettent une évaluation de l’efficacité de nos outils au niveau moléculaire comme fonctionnel. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent.
Rôle de l’oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d’occlusion veineuse du foie
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
61 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent sous anesthésie une chirurgie du ventre avec occlusion des veines du foie et prélèvement d'une partie de l'organe, puis quatre prélèvements de sang à la queue. Le porteur indique qu'une hémorragie, une insuffisance du foie ou une ouverture de la cicatrice sont possibles, et que les rats perdant plus de 20 % de leur poids seront mis à mort. L'ensemble de l'effectif est tué pour prélever le tissu du foie, le porteur revendiquant chez le rat un patrimoine génétique proche de l'humain et une taille facilitant la chirurgie des vaisseaux.
Objectifs
Le projet est intitulé « Rôle de l'oxygène dans les mécanismes de régénération hépatique : étude de deux modèles d'occlusion veineuse du foie ». Le foie est capable de se régénérer, c’est à dire de renouveler le volume et la fonction qu’il perd lorsqu’on enlève une quantité trop importante de foie. L’embolisation portale pré-opératoire (occlusion de la veine porte qui perfuse le foie) est la procédure la plus pratiquée pour faire grossir le foie avant une intervention au cours de laquelle une partie importante de foie doit être enlevée. La mortalité après l’intervention par dysfonction du foie est ainsi beaucoup diminuée en faisant compenser le foie, avant l’opération de résection hépatique. La technique de déprivation veineuse du foie : embolisation portale pré-opératoire et veineuse sushépatique du foie (occlusion de veines de drainages du foie) en un seul temps est une nouvelle procédure faisant augmenter le volume du foie, réalisée chez l’homme depuis peu, avec des résultats de l’ordre du double d’efficacité en deux fois moins de temps. Les mécanismes sous-jacents de ce gain d’augmentation de volume ne sont pas élucidés. Elle représente donc un nouveau modèle de compréhension d’une science du foie appelée régénération hépatique qui étudie la capacité du foie à renouveler son volume et sa fonction après agression. Cette science permet les avancées sur les traitements des maladies hépatiques. L'objectif principal du projet est de valider un modèle expérimental animal de déprivation veineuse du foie chez le rat. Le second objectif est de répondre à la question suivante : le niveau d’oxygène dans le foie après une procédure visant à faire augmenter le volume du foie prédit-il son efficacité à faire grossir le foie ?
Bénéfices attendus
Notre objectif est de développer un modèle expérimental fiable et exploitable de déprivation veineuse du foie afin d’étudier davantage cette technique prometteuse dont la pratique internationale est récente. En effet cette technique représente un nouveau modèle de compréhension de la régénération hépatique. Une fois validé, ce modèle pourra être exploité pour la compréhension d’autres phénomènes : immunitaires, tumoraux ou hémodynamiques par exemple. Ici, nous tentons d’investiguer le rôle que joue l'oxygène dans cette technique. Si le manque d'oxygène permet un gain de volume plus important que dans la technique classique alors nous pourrions cibler le manque d'oxygène comme une thérapie possible dans de multiples maladies du foie. La compréhension scientifique de la régénération hépatique permet d'avancer dans le domaine du traitement des maladies du foie, aigues ou chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types de procédures sous anesthésie générale : - Ligature portale (40 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Déprivation veineuse (50 minutes) : Occlusion de la veine de perfusion du foie (veine porte), occlusion de la veine de drainage du foie (sushépatique) et prélèvement d’une partie du foie (biopsie) par voie chirurgicale par une incision du ventre sous anesthésie générale suivi de l’administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. - Simulation occlusion (40 minutes) : Groupe contrôle servant de référence de comparaison : incision du ventre, simulation d’une occlusion de la veine porte du foie sans l’occlure, puis administration systématique d’antidouleurs sur le site opératoire et par voie générale. Les animaux subiront 4 prélèvements sanguins de 200 µL sur site de la queue : 1 prélèvement la veille de l’opération puis 1 prélèvement par jour les trois premiers jours pour l’analyse de la fonction hépatique ainsi que de la phosphorémie. Ils recevront peu avant le sacrifice, pour 44 animaux, après injection d’antidouleurs, une injection unique dans le ventre d’un produit révélant l’oxygénation des tissus nécessaires aux analyses réalisées Une imagerie de type scintigraphie (30 minutes) visant à évaluer l’oxygénation du foie sera réalisée sur 8 animaux. Une imagerie de scanner (20 minutes) nécessaire à l’analyse des volumes du foie sera réalisée sur 17 animaux.
Impact sur les animaux
La fiche d’évaluation clinique utilisée en routine au sein de notre institut de recherche a été adaptée aux procédures réalisées afin de pallier au mieux aux éventuels effets indésirables. 1) La douleur est la première nuisance possible aux animaux. 2) L’anxiété de l’animal sera diminuée grâce à l’aide d’un environnement enrichit en coton avec un abri. 4) Il est habituel de constater une perte de poids après embolisation portale de l’ordre de 5 à 10 % en 5 jours. Ce pour quoi la perte de poids < 20% ne constituera pas un point limite dans cette étude. Au-delà de 20% de perte de poids une mise à mort sera réalisée par dislocation cervicale sous anesthésie générale à l’isoflurane. 5) Une hémorragie est possible après l’opération chirurgicale 6) Une insuffisance du foie est possible en tant que complication qui causerait une somnolence de l’animal et diminution de ses mouvements. 7) Des troubles de cicatrisation sont possibles en tant que complication. 8) Une extériorisation des organes du ventre par la cicatrice du ventre est possible en cas de lâchage de la suture de parois qui conduirait à une mise à mort de l’animal sous anesthésie générale.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être sacrifié afin de pouvoir prélever les échantillons de tissus hépatiques à analyser. Le prélèvement de tissus hépatique permet : - D’analyser la composition du foie en cellules immunitaires et cellules spécifiques du foie. - D’analyser l’oxygénation du tissu après occlusion d’une ou deux veines du foie afin de comprendre s’il existe un lien avec le gain d’augmentation du volume du foie dans la nouvelle procédure d’occlusion des deux veines du foie étudié dans ce projet. - L’analyse de données concernant les messagers envoyés par les cellules du foie pour recruter de nouvelles cellules et se reconstruire.
Remplacement
Les méthodes de culture in vitro ne peuvent simuler les effets mécaniques que sont la privation d’apports nutritifs sanguins veineux ainsi que l'oedème induit par l'occlusion de la veine de perfusion et de la veine de drainage du foie. Le processus d'augmentation de volume du foie s’appuie également sur des messagers qui ne dépendent pas que du foie, ainsi que sur une mécanique vasculaire de débit, de pression et de recrutement de cellules en provenance d'autres organes que le foie. L'analyse du foie et de son oxygénation après l'occlusion d'une ou deux veines du foie chez l'Homme nécessiterait de faire des prélèvements de foie de façon répétée au cours du temps, ce qui serait difficilement concevable car trop risqué pour la santé des patients. Le rat constitue une espèce animale dont le génome est le plus proche de l’être humain, largement étudié en science du foie et dont la taille, plus importante que celle de la souris, permet la réalisation de contrôles des vaisseaux du foie et notamment des veines de drainage .
Réduction
Dans une logique de réduction, le nombre de sujets nécessaire par groupe est calculé selon la bilbiographie dans laquelle des résultats significatifs peuvent être mis en évidence avec des effectifs de 5 rats par groupe en considérant une mortalité post-opératoire d'environ 10%. Le nombre d’animaux nécessaire pour notre étude est de 61. Nous réaliserons dans un premier temps, une étude de l'oxygénation du foie par une méthode non invasive de scintigraphie afin de déterminer quel est le moment où la baisse d'oxygène dans le foie est la plus importante.
Raffinement
Pour tenir compte des contraintes liées à la chirurgie, les animaux pourront être hébergés à raison de deux rats par cage. L’environnement du rongeur sera enrichi avec du coton, un abri et un accès illimité à la nourriture et l’eau. L'alimentation sera enrichie en protéines pour limiter l'impact de l'intervention et limiter une perte de poids. La température de la pièce sera contrôlée à 22°C avec un rythme jour nuit de 12h/12h et contrôle du taux d'humidité. Les procédures ne débuteront que 7 jours après réception des animaux pour permettre leur acclimatation à leur nouvel environnement. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté et les procédures réalisées à heures fixes. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane). Une injection d'anti-douleurs morphiniques (buprénorphine) sera réalisée par voie sous-cutanée 0.05 mg/kg lors de l'anesthésie puis toutes les douze heures pendant les 2 premiers jours puis adaptée en période post-procédure. Une injection d'anesthésique local sous-cutanée sera également réalisée en fin de procédure. Si la douleur n'est pas soulagée par la prise de mesures antalgiques, une mise à mort sera envisagée pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous avons choisi, conformément à la littérature, d’étudier les rats mâles adultes car ils ne sont pas soumis aux variations hormonales des animaux en croissance ce qui pourrait interférer avec l'augmentation du volume du foie, du fait de stades de développement différents ou de vitesses de croissance différentes d’un animal à l’autre et d’un nuage hormonal complexe. Les rats possèdent un patrimoine génétique très proche de l’espèce humaine tout en conservant une taille supérieure à la souris, ce qui augmente la faisabilité de la dissection des vaisseaux sushépatiques.
Etudes de digestibilités iléale et fécale chez le poulet de chair mâle
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
1 000 poulets de chair mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés en cages individuelles et soumis à deux périodes de mise à jeun de dix-sept heures, pour mesurer la digestibilité de différents aliments. Tous sont tués en fin d'essai afin de prélever le contenu de leur intestin. Le porteur reconnaît que le stress de l'isolement demeure une contrainte et affirme qu'aucun modèle in vitro fiable ne remplace aujourd'hui la mesure sur animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir mesurer la digestibilité iléale et fécale de différents aliments et/ou matières premières chez le poulet de chair mâle. Cela permet de déterminer la valeur nutritionnelle des aliments et matières premières et ainsi de pouvoir constituer des références ou de pouvoir utiliser ces données dans de futurs projets, notamment pour formuler des aliments au plus près des besoins des animaux.
Bénéfices attendus
Les mesures de digestibilités permettent de déterminer la valeur nutritionnelle d'un aliment ou d'une matière première, c'est à dire quelle est la part de nutriments ingérés qui est absorbée au cours de la digestion pour ensuite être métabolisée. Ces critères permettent de caractériser des matières premières en donnant des valeurs de référence qui sont ensuite utiliser pour formuler des aliments dans de nombreux projets.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux périodes de mises à jeun de 17h chacune. Ces mises à jeun marquent le début et la fin de la période de collecte totale de fientes pour déterminer la digestibilité fécale.
Impact sur les animaux
Ce protocole de digestibilité est habituel et bien maîtrisé même si le stress de l'isolement demeure une contrainte . L’utilisation du dioxyde de titane n’a jamais entraîné d’effets indésirables sur le comportement, la santé et la croissance des animaux dans le cadre des essais de digestibilité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet afin de collecter les contenus digestifs nécessaires à la mesure de la digestibilité iléale.
Remplacement
A l'heure actuelle, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet de déterminer les valeurs de digestibilité. Des travaux sont en cours pour le développement d'un modèle in vitro mais dans la mesure où ces mesures servent ensuite de référence nutritionnelles, elles doivent être précises et fiables ce qui n'est pour l'instant pas le cas avec des approches in vitro.
Réduction
Dans les études de digestibilité, on utilise généralement 12 animaux par traitement expérimentaux. Cela permet de réduire au maximum le nombre d'animaux, tout en conservant de la variabilité et une marge sécurité (mortalité ventuelle pendant la période d'élevage).
Raffinement
Les animaux sont élevés au sol avant une phase en cages individuelles, indispensable pour pouvoir enregistrer leur consommation d'aliment et réaliser une collecte totale de fientes. Les cages individuelles sont équipées de grilles permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, le sol des cages est adapté à la taille et au poids des animaux et les cages sont équipées de jouets suspendus à picorer. Les animaux sont visités au moins 2 fois par jour. Le calendrier des pesées et les mises à jeun nécessaires au bilan (collecte totale de fientes) et aux prélèvements terminaux sont pensés de manière à éviter les mises à jeun répétées.
Choix des espèces
L'espèce choisie correspond à l'espèce cible.
Evaluation de la réaction inflammatoire du site d’injection suite à la vaccination chez le chat (1/2)
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
40 chats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous anesthésie, des injections sous-cutanées de produits vétérinaires, jusqu'à dix scanners par animal sous anesthésie volatile et des biopsies cutanées, pour évaluer la réaction inflammatoire au site d'injection de nouveaux produits. Dix chats de l'étude pilote sont tués pour des biopsies post-mortem, les trente autres sont réutilisés ou transférés vers un autre établissement selon l'avis vétérinaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif n'existe et que des données sur l'espèce cible doivent figurer au dossier de mise sur le marché.
Objectifs
Ce projet évaluera l’inflammation sous cutanée de nouveaux produits vétérinaires chez le chat, destinés aux traitements préventifs ou curatifs de diverses pathologies de l’espèce. L’évaluation de la réaction inflammatoire au site d’injection est suivie par imagerie médicale (scanner rayon X et IRM). Ces études sur l’espèce cible ont pour but d’étudier les signes cliniques d’intolérance suite à une administration unique de différentes doses d’un produit donné. Ce modèle d’innocuité in vivo est représentatif des modalités d’administration du futur produit chez l’animal traité. En plus du scoring mis en place, l’imagerie médicale permettra de collecter des données morphologiques précises comme la volumétrie de l’inflammation des tissus du site d’administration. Ce type d’imagerie, qui est non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (soit 40 animaux – réduire des 3Rs). Des prélèvements sanguins ainsi que des biopsies cutanées complèteront ces analyses. Dans le cadre d'une étude pilote, les animaux seront transportés entre leur lieu d'hébergement et l’établissement utilisateur 2 uniquement pour les phases d’IRM à moins de 50 kilomètres de distance. Certains animaux de ce projet seront réutilisés si l'état général de l'animal le permet et après avis vétérinaire favorable. Les animaux seront hébergés dans des salles, en groupe sociaux, avec à disposition des perchoirs et divers jouets. Une habituation des animaux est mis en place pour les acclimater à leur nouvel environnement, aux conditions d’hébergement et aux procédures . Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel compétent. Des points limites sont appliqués pour qu’en cas d’apparition de signes cliniques ayant des répercussions significatives sur l’animal, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement : analgésique ou autre, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie). Tous les actes réalisés sur les animaux seront assurés par du personnel formés. Les acquisitions scanners seront réalisées sous anesthésie fixe sous intubation ou volatile et une période de réveil sera respectée. Une mise à jeun pourra être nécessaire avant l'anesthésie fixe pour éviter les vomissements (-6h min, 16h max). Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européennes 2010/63/EU. L'objectif final est la mise sur le marché de produits vétérinaire.
Bénéfices attendus
Les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices chez un grand nombre d’animaux de compagnie (tolérance des traitements en cas de maladie) et éventuellement chez l’homme en cas de zoonose. L'étude pilote définira les modalités de réalisation des études principales : mise en place du modèle, protocole d’acquisition, sensibilité comparée des acquisitions IRM VS acquisitions CT, ajustement du scoring clinique. Elle validera le lancement du projet final au sein de l’EU1 sera la confirmation d’une meilleure sensibilité du canner CT pour le suivi de l’inflammation post-vaccination. Ce type d’imagerie non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (réduire des 3Rs).
Procédures
- 1 Puçage (SC) sous anesthésie volatile ou fixe si nécessaire. Tonte site d’administration si nécessaire - Prise de température rectale quotidienne durant 25 jours de suite maximum ou hebdomadaire - Prise de température par télémétrie : quotidienne - Pesée : quotidienne durant 25 jours de suite maximum ou hebdomadaire - Examens avant traitement : 1 scanner - Suivi clinique quotidien après traitement : observation de l’état général, signes cliniques généraux (diarrhée, comportement anormal, …) - Suivi du site d’injection : scoring* quotidien de l’inflammation après traitement durant 7 jours consécutifs ou plus si score différent de 0 - Traitement : Administration unique par voie SC de 1X à 3X (de 0,5 à 3mL) et/ou du véhicule (de 0,5 à 3mL). - Scanners (EU1) : sous anesthésie volatile environ 30min, 1x/semaine ou quotidien durant 5 jours maximum (cinétique de l’inflammation). La dose de rayon X reçues à chaque examen est d’environ 4-6mSv. L’effet sur l’organisme est considéré comme négligeable. 10 scanners maximum seront réalisés par animal /étude. - Sélection des chats allant à l’IRM selon degrés d’inflammation évalué par les observations cliniques et imageries préalables. - 2 Mise à jeun : la veille ou le matin avant les anesthésies fixe (6h minimum avant/16h maximum) - Etude pilote uniquement : Transport (environ 2h aller-retour) à l’EU2. Maximum 2 par animal / étude. - Etude pilote uniquement : IRM (moitié des animaux inclus) sous anesthésie fixe et intubation (à l’EU2 - environ 1h), 1 fois par semaine maximum avec 48h minimum de repos entre 2 acquisitions. Maximum 2 par animal / étude. - Prélèvements sang : 2x/jour maximum pendant 5 jours maximum ou hebdomadaire. Timepoints définis selon étude pilote et besoins scientifiques de l’étude (Baseline, PK…) - Prélèvement de peau post-mortem ou anesthésié avec réveil -antibiothérapie/analgésie pre (1x) et post (autant que nécessaire) biopsie - suture en condition d'aseptie (1x) Scoring de l’inflammation* : - Gonflement : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé - Rougeur : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé - Autre (à préciser selon l’étude) : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé
Impact sur les animaux
Lésions cutanées dûes aux expositions répétées aux rayons X (moins de 42mSv sur le temps total des études). Transports jusqu'à l'EU2 et juusqu'au scanner puis jusqu'à l'établissement réutilisateur en fin de phase induisant un stress. Plusieurs anesthésies fixes + intubation. Anesthésies volatiles repetées. Mise à jeun entre 6h et 16h. Sutures (biopsie d'environ 8mm)
Devenir
Biopsies sur chaque site (3cmx3cm) prélèvées post-mortem dans le cadre de l'étude pilote pour analyses histologiques des sites d'adminsitration du produit. Biopsies sur chaque site (environ 8mm de diamètre) prélèvées sous anesthésie avec réveil (étude définitive, n= 30) pour analyses histologiques des sites d'adminsitration du produit. Dans ce cas, la réutilisation d'animaux sera à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis. Les animaux aptes au transports ils seront transportés dans un autre établissement utilisateur après avis vétérinaire. Cela contribue à une réduction globale du nombre d'animaux devant être utilisés à des fins scientifiques.
Remplacement
Aucun modèle alternatif. Il est nécessaire de réaliser des études chez l’espèce cible du produit afin de pouvoir observer les interactions entre les organes impliqués et les effets physiologiques d’un futur produit vétérinaire chez l’animal. Il s’agit de l’espèce cible pour les produits vétérinaires étudiés. Des données concernant l’espèce cible doivent être fournies au dossier d’AMM.
Réduction
En plus du scoring mis en place, l’imagerie médicale permettra de collecter des données morphologiques précises comme la volumétrie de l’inflammation des tissus du site d’administration. Ce type d’imagerie, qui est non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (soit 40 animaux – réduire des 3Rs). Ces analyses seront complétées par des prélèvement sanguins ainsi qu’histologiques en fin de phase expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés en volatile (isoflurane + 02) ou en fixe pour l’administration sous cutané du produit et les prélèvements de sang si nécessaire. L' anesthésie volatile sera priviligiée tout au long de la procédure (induction volatile comprise) et réduite au temps nécessaire pour réaliser l'acte. Le réveil se réalisera dans un endroit au calme et la lutte contre l'hypothermie sera assurée via des alaises, chauffage (monitoring de la température des salles de procédures). L'analgésie réalisée en amont des prélèvements de peau (biopsies) sera réalisée systématiquement avant l'acte et sous anesthésie générale; Une analgésie locale supplémentaire pourra être mise en place après le réveil pour assurer le bon rétablissement de chaque animaux (réadministration de méloxicam ou application d'agent anesthésiant local par exemple). Une grille de scoring de l'état général des animaux est utilisée selon les procédures interne de l'établissement (EU1). La prise de la température par télémétrie assure moins de stress chez l'animal que la prise de température rectale. Les points limites précis et adaptés à l'espèce seront appliqués tout au long de la procédure pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Il est nécessaire de réaliser des études chez l’espèce cible afin de pouvoir observer les interactions entre les organes impliqués et les effets physiologiques d’un futur produit vétérinaire chez l’animal. Il s’agit de l’espèce cible pour les produits vétérinaires étudiés. Des données concernant l’espèce cible doivent être fournies au dossier d’AMM. L’âge dépend des besoins pour les études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude et du produit final et répondent aux exigences expérimentales d’utilisation du produit mis sur le marché. Les animaux ont minimum 6 mois. Cet âge est représentatif d’un état physiologique stable et qui s’apparente à celui de l’adulte chez l’espèce cible.
Etude de l’immunogénicité de pseudo-particules virales de SARS-COV2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, réparties entre un niveau de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent un candidat vaccin à pseudo-particules virales de SARS-CoV-2 par voie sous-cutanée ou nasale à trois reprises, avec quatre prélèvements sanguins à la veine sub-mandibulaire, avant mise à mort pour prélever les organes lymphoïdes. Le porteur indique n'avoir jamais observé de signe clinique avec des protocoles similaires. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne mime la complexité de la réponse immunitaire des mammifères.
Objectifs
La disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Les pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs)ont montré dans de nombreux modèles d'infection leur grande qualité d'antigène vaccinal. Le vaccin candidat composé de ces VLPs doit permettre de générer une réponse immunitaire humorale et cellulaire contre l'ensemble des protéines de structure du coronavirus (protéines S, E, M, N) contrairement aux vaccins actuellement disponibles ne contenant que l'antigène ou des séquences codant la protéine SPIKE à l'exception des vaccins basés sur des virus inactivés. Pour cela, notre équipe a développé des pseudo-particules virales de SARS-COV2 contenant la protéine S du variant delta ainsi que les protéines M, N et E de la souche originelle de Wuhan. En effet, ces trois dernières protéines structurales sont beaucoup moins sujettes à l'apparition de mutations et peuvent donc induire des protections croisées. Notre objectif est d'évaluer l'immunogénicité humorale et cellulaire de ce candidat vaccin de seconde génération en évaluant deux voies d'administration : sous-cutanée et nasale.
Bénéfices attendus
En cette période de pandémie de COVID-19 , la disponibilité d'un vaccin efficace et permettant une cross-protection contre les variants de SARS-CoV-2 reste une urgence. Ce projet va permettre de valider l'immunogénicité de notre candidat vaccin basé sur des pseudo-particules virales (virus-like particles ou VLPs) selon deux voies d'administration, l'une classique, la voie sous cutannée et l'autre plus adaptée à des pathogènes respiratoire, la voie nasale.
Procédures
Les animaux seront soumis à des : 1/ Prélèvements sanguins à J0 , J14, J28 et J45 à la veine sub-mandibulaire avec un volume cible de 200 μL 2/ Injections sous-cutanées du candidat vaccin sous un volume de 200 μl à J0, J7 et J28 3/ Instillations nasales du candidat vaccin sous un volume de 20 μl (10 μl par naseau) à J0, J7 et J28
Impact sur les animaux
Des protocoles similaires que ce soit d'immunisation sous-cutanée ou nasale ont été mis en oeuvre au sein de notre laboratoire et n’ont jamais montré de signes cliniques ou de changement de comportement suite à la vaccination. Les animaux seront tout de même surveillés de manière quotidienne pour détecter toute nécrose au point d'injection (groupe recevant les immunogènes par voie sous cutanée), tout inconfort respiratoire (groupe recevant les immunogènes par voie nasale). Tout animal présentant un de ces signes cliniques sera euthanasié. Toutes les procédures sont effectuées sous le controle d'un expérimentateur/concepteur expérimenté qui saura limiter ou le cas échéant évaluer le stress et/ou la douleur engendrée par la procédure.
Devenir
A J42, fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes lymphoïdes secondaires.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution pour mimer la complexité de la réponse immunitaire chez les mammifères.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature et de notre expérience.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives en vigueur et bénéficient d'un enrichissement social (3 animaux /cage) et physique (maisonnette en plexiglas, papier absorbant, boîte à oeuf en carton) dans la zone d'hébergement définie par la SBEA de l’établissement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites (prostration des animaux, poils hérissés). Tout traitement pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt en lien avec les points limites sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus.
Choix des espèces
La souris Balb/c est la souris la plus utilisée pour valider l'immunogénicité d'un candidat vaccin. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire humorale et cellulaire chez la souris. Ce modèle murin permettra de faire la preuve concept de l’induction d’une réponse immunitaire avant de passer sur un modèle d’infection comme la souris K18-hACE2 et le hamster. 7 semaines incluant une semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Exploration d’une nouvelle stratégie vaccinale par thérapie cellulaire pour les patients immunodéprimés
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 444 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent selon les groupes une greffe de peau sous anesthésie, des traitements immunosuppresseurs répétés et jusqu'à douze prélèvements sanguins, pour tester une stratégie vaccinale par thérapie cellulaire chez des patients immunodéprimés. Le porteur indique que l'immunosuppresseur employé peut provoquer une toxicité rénale, suivie par la perte de poids. Il affirme que la production d'anticorps ne peut avoir lieu qu'au sein d'un ganglion ou de la rate, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Afin d'éviter les rejets de greffe, les patients transplantés sont traités avec des immunosuppresseurs. Malheureusement, ces traitements affaiblissent l'ensemble du système immunitaire, les patients sont plus sujets aux infection et cancers et ils répondent moins éfficacement aux vaccinations. L'objectif de ce projet est de mettre en place une nouvelle statégie vaccinale par thérapie cellulaire. Il est prévu de vacciner les animaux avec des schéma vaccinaux classiques (injection sous cutanée de l’antigène avec adjuvant), ou par l’injection de cellules T vaccinales modifiées par voie intraveineuse après anesthésie. Différentes souches de souris, présentant des défauts plus ou moins importants du système immunitaire seront utilisées. Ces modèles de souris permettront de répondre sur les interactions entre différentes populations immunitaires, présentes ou non dans ces modèles. Afin d’évaluer les doses d’immunosuppresseurs optimales, une expérience de greffe de peau sera réalisée. La greffe de peau a été choisi dans un premier temps comme modèle de transplantation car elle est beaucoup moins invasive que le greffe d’organe tel que cœur ou rein. La production d’anticorps ainsi que les différentes populations immunitaires seront étudiées chez les souris receveuses., c’est-à-dire ayant recu les cellules vaccinales.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle approche vaccinale par thérapie cellulaire permettrait de surmonter les effets délétères des immunosuppressions chez les patients transplantés mais aussi de manière plus générale chez les patients présentant des défauts de réponse immunitaire, et qui ne répondent pas aux stratégies de vaccnations conventionnelles.
Procédures
IV : intraveineux/ SC : sous-cutané / IP : intrapéritonéal Procédure 1 : injection IV de cellules à des souris anesthésiées puis 1 seul prelevement sanguin avec anésthésique local en fin de procédure. Durée 24-48h. Procédure 2 : les souris subiront 2 injections SC et 5 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 3 : greffe de peau sous anesthésie gazeuse + analgésie morphinique, traitements immunosuppresseurs 2 à 3 fois par semaine par injection IP sous isoflurane, 7 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 42 jours. Procédure 4 : les souris seront sous traitements immunosuppresseurs (ou contrôle placebo) (2 à 3 fois par semaine par injection IP) et vaccinées par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle. 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée 98 jours. Procédure 5 : injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse et 10 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 42 jours. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP) Procédure 6 : les souris seront vaccinées soit par 2 injections SC à 28 jours d’intervalle soit par injection de cellules par voie IV sous anesthésie gazeuse. Un groupe sera en plus sous traitements immunosuppresseurs (2 à 3 fois par semaine par injection IP). Au total, 12 prelevements sanguins (avec anésthésique local) sur une durée de 102 jours. Prélèvement sang total sous anesthésie générale à la fin de plusieurs procédures, juste avant mise à mort. Les injections durent moins d'1 minute, la greffe de peau environ 20 minutes, un prelevement de l'ordre de 30 Secondes (contention comprise).
Impact sur les animaux
Les doses d’immunosuppresseurs utilisées dans ce projet sont décrites dans la littérature. L’immunosuppresseur (appelé tacrolimus ou FK506) que nous utiliserons peut engendrer une toxicité rénale chez les patients. Nous avons pu montrer au laboratoire que, chez la souris, la perte de poids est un bon indicateur de cette toxicité rénale, les pesées sont donc adaptées dans les procédures ad hoc. Nous n’attendons pas d’effets indésirables dus aux injections : intrapéritonéales, sous cutanées ou intraveineuses) ni lors prélèvements repetés au niveau du sinus retro-orbital ou par voie submandibulaire. La greffe de peau est un geste bien documenté, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie (non reveil de l'animal malgré des doses d'analgésie et anésthésie adaptées). De manière générale, les procédures ne doivent pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux (hormis la greffe de peau). Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Des points limites propres à chaque procédure ont été définis pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les souris de la procédure 1 seront mises à mort avec une méthode reglementaire en fin de procédure pour récupération des organes lymphoïdes Les souris des 5 autres procédures seront anesthésiées pour un prélèvement de sang maximum puis mises à mort avec une méthode reglementaire pour récupération des organes lymphoïdes. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite seront mises à mort avec une méthode reglementaire.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent à la production d’anticorps ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro.
Réduction
Des expériences préliminaires seront réalisées pour établir les paramètres optimaux, le nombre de cellules, ou encore les doses d’immunosuppresseurs. Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs. Les procédures dites « pilotes » permettront d’établir les conditions / protocoles optimaux pour les procédures suivantes, afin de réduire égaiement le nombre de groupe. Les groupes controles comporteront 3 animaux alors que les groupes experimentaux seront de 5 ou 10 selon les procédures. (10 animaux pour les groupes d’interet, 5 pour les groupes controles). Nous prévoyons des duplicats experimentaux pour valider la reproductibilité des transferts de cellules, cellules qui sont au préalable modifiées, ce qui peut augmenter la variabilité des transferts adoptifs de cellules thérapeutiques. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 480 souris (mus musculus). Les analyses statistiques se feront par un test non paramétrique de mann -whitney.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Les douleurs attendues dans ce protocole sont anticipées et devront etre évitées grâce à l’administration d’analgésiques lors des gestes tels que greffe de peau ou prélèvements, les points limites ont tout de même été définis afin d’intervenir en cas de nécessité. Différents traitements seront administrés : anesthésie gazeuse pour l’injection intraveineuse des cellules et la greffe de peau et pour le suivi du greffon . Analgésie (morphinique) pour la greffe de peau, local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. La taille du greffon cutané, couleur, necrose seront des indicateurs de la perte de greffe et l’infection éventuelle du greffon sera considéré comme point limite. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (Si un animal prend pour habitude de retirer les bandages de ces congenères, alors cet animal sera isolé, de meme s'il présente des signes d'agressivité sur les autres souris.)
Choix des espèces
Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature capable de répondre aux vaccinations. Il n'y a pas de variabilité liée au sexe attendue dans ces protocoles. Mais pour éviter les rejets liés à l’antigène mineur d'histocompatibilité sexuel (HY), toutes les souris donneuses utilisées seront des femelles. Les receveuses pourront être des mâles ou des femelles.
Biodistributions nouveaux de vecteurs radiomarqués sur des modèles tumoraux de souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et une injection intraveineuse de produits radiomarqués, puis une imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la distribution de nouveaux radiopharmaceutiques anticancéreux. Le porteur décrit l'arme du projet comme le radioélément destiné à détruire la cellule tumorale et affirme n'attendre aucune douleur. Il indique qu'aucune méthode alternative n'existe à ce jour pour cette pathologie complexe.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Divers radiopharmaceutiques élaborés par notre équipe serons testés : nous disposons de différents vecteurs et de différents radioéléments. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon «toxique» pour cette cellule. Le radioélément est lié à un vecteur spécifique de la tumeur afin de former un radiopharmaceutique, qui doit cibler et détruire la tumeur, tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. L’objectif de l’étude de la biodistribution de nos radiopharmaceutiques est d’appréhender leur distribution dans l’organisme au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre le développement de nouveaux radiopharmaceutiques ciblant les tumeurs, utilisables soit en thérapie soit en imagerie.
Procédures
810 souris vigiles reçoivent une injection sc de cellules tumorales (100µl) : douleur légère Ces mêmes souris vigiles reçoivent une injection iv de radiopharmaceutique dans la veine latérale de la queue : douleur légère. Puis elles sont anesthésiées sous isoflurane pour 10 minutes d’imagerie (dans cellule d’imagerie chauffante avec du gel de protection occulaire), sans douleur. A la fin de la cession d’imagerie les souris endormies subissent un prélèvement sanguin (200µl) dans le sinus orbital puis sont mises à mort. L'ensemble de la procédure durera 2 semaines à 3 semaines et demi. (pousse tumorale 2 à 3 semaines, biodistribution du traceur 72h maximum, imagerie 10 minutes).
Impact sur les animaux
Ce projet ne devrait pas engendrer de douleur. La procédure 1 : greffe de tumeur en sous cutané n’entraine pas de douleur. On ne laisse pousser la tumeur que jusqu’à 100mm 3 (équivalent d’un petit kyste sur le flanc qui n’entraîne pas de gène ni de douleur). La procédure 2 d’injection du radiopharmaceutique en iv pour la biodistribution n’est pas douloureuse. Enfin la procédure 3 d’imagerie TEP/CT sous anesthésie gazeuse et lit chauffant est sans douleur. Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Devenir
Les 810 souris de la procédure 1 (greffe de cellules tumorales) sont toutes gardées en vie pour la procédure 2 (injection du radiopharmaceutique) et la procédure 3 (imagerie de la biodistribution du radiopharmaceutique injecté). Il s’agit des 3 étapes nécessaires pour quantifier la distribution du radiopharmaceutique dans la tumeur et les différents organes des souris.
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism.
Raffinement
L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. Par ailleurs, les animaux seront anesthésiés pendant la procédure 3.
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. Les souris sont utilisées à 7 semaines, au stade jeune adultes.
Ciblage spécifique de cellules de la rétine à l’aide du système CRISPR Cas9 et évaluation d’une immunité dirigée contre la protéine Cas9 pour la maladie de Stargardt.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
142 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 132 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections sous la rétine ou dans le vitré des deux yeux sous anesthésie, une imagerie rétinienne répétée et des prélèvements sanguins, avant une ponction intracardiaque terminale, pour tester une édition génique CRISPR-Cas9 contre la maladie de Stargardt. Le porteur indique aussi que le projet sert à mettre au point des gestes techniques et à valider les compétences des personnels. Il affirme qu'il est impossible de reconstituer la rétine in vitro.
Objectifs
Parmi les vecteurs viraux, ceux qui dérivent du parvovirus humain Adéno-Associé (AAV) sont aujourd’hui considérés comme les plates-formes les plus performantes pour le traitement par thérapie génique des maladies génétiques. Parmi les différents sérotypes d’AAV connu, le sérotype AAV2/8 avec les ITRs d’AAV2 encapsidés dans la capside d’AAV8 montre une grande efficacité en termes de tropisme et de niveau d’expression dans les photorécepteurs de la rétine. Par ailleurs, les vecteurs AAV pouvant donner lieu à une réponse immunitaire suite à une pré-exposition au virus, nous souhaitons également tester les nanoparticules lipidiques (LNP) afin de délivrer la nucléase Cas9. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel d’une stratégie d’édition génique en ciblant l’intégration d’un minigène correctif dans un site de coupure d’ADN double-brin induit par la nucléase Cas9. Ce minigène permet la correction des mutations du gène ABCA4 qui impactent le fonctionnement de la protéine ABCA4, transporteur essentiel pour le métabolisme des rétinoïdes dans les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine. Avec une preuve de concept déjà établie in vitro et avec des résultats préliminaires in vivo, la valeur thérapeutique de cette approche est réalisable. L’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. Pour cela, les praticiens et concepteurs en recherche sur la cécité doivent acquérir les compétences nécessaires à la réalisation de leurs projets de recherche impliquant des animaux selon la Directive Européenne (arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques). C’est dans ce cadre que nous souhaitons mettre au point les techniques d’injections sous rétinienne et intravitréenne sur le modèle rat. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce.
Bénéfices attendus
L’immunogénicité de la protéine Cas9 a été décrite dans quelques études. Il est cependant à noter qu’en transfert de gène, plusieurs facteurs peuvent influencer l’initiation d’une réponse immune ; parmi eux, la dose de vecteur, la nature du transgène ou encore la voie d’administration. Dans cette étude, le but est d’étudier la présence d’une réponse immune après transfert de gène dans l’œil qui est un site décrit comme immunoprivilégié et ce, à une dose cliniquement pertinente. Concernant la détection d’une réponse immune dirigée contre la protéine Cas9, les techniques d’analyse décrites dans la littérature ne sont pas standardisées et aucun kit n’est, à ce jour, commercialisé. Notre étude permettra d’établir un protocole adéquat pour la détection de la réponse immune anti-Cas9. De plus, l’utilisation d’une stratégie d’édition génique est en essai clinique pour une autre dystrophie rétinienne et donne l’espoir pour le futur développement de thérapies basées sur CRISPR/Cas9 pour la cécité. L’évaluation in vivo de notre stratégie d’édition génique nous permettra de statuer sur la faisabilité et les bénéfices d’une telle approche chez les patients. En effet, l’utilisation d’un minigène codant plusieurs exons à la fois, si efficace, permettra de corriger une large partie du gène, ce qui sera utile pour de nombreux patients, même avec des mutations différentes. Enfin si notre approche se révèle efficace, elle pourrait être utilisée pour soigner les pathologies liées à d’autres gènes de la famille ABCA.
Procédures
Phases 1 et 2 : (i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 à 3 µL injectés dans les 2 yeux des animaux, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis une fois par mois, soit au maximum 4 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’examen 20 minutes maximum. (iii) Imagerie rétinienne (ERG) : Geste réalisé sous anesthésie générale, 1 fois avant l’injection dans l’œil puis avant l’euthanasie de l’animal, soit 2 fois au total. Durée de l’examen 30 minutes maximum. (iv) Prélèvements sanguins (Phase 2) : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection puis toutes les deux semaines post-injection, soit au maximum 7 fois pour les animaux gardés 3 mois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Phase 3 (v) Injection sous cutanée de 50μg de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund : Geste réalisé sous anesthésie générale, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vi) Injections en intramusculaire : 1 semaine après l’injection SC. Geste réalisé sous anesthésie générale, 200μL de vecteur en 4 sites d’injection, durée de l’anesthésie 15 minutes maximum. (vii) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. En pré-injection SC, soit une fois. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. (viii) Ponction intracardiaque terminale : Geste réalisé sous anesthésie générale avec renforcement analgésique. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection sous-rétinienne ou intravitréenne : A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs AAV chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Une pommade ophtalmique composée de dexaméthasone et d’oxytétracycline est appliquée à la suite de l’intervention pour minimiser l’irritation de la cornée. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT et ERG) : Aucune douleur n’est attendue lors des examens d’imagerie (non invasifs). En effet, afin que l’animal soit immobilisé, cet examen est fait sous anesthésie générale n’entrainant pas de stress ou de douleur que pourrait entrainer une contention physique de l’animal et permettant ainsi d'assurer une qualité optimale d'acquisition des images. (iii) Prélèvements sanguins : un volume sanguin correspondant à 7,5% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire ou de la veine caudale après anesthésie gazeuse de l'animal. (iv) Injection sous cutanée de protéine et de l’adjuvant incomplet de Freund et injections en intramusculaire : afin de limiter le stress de ces injections et que l’asepsie soit optimale, ces gestes seront réalisés sous anesthésie général de l’animal. Aucune douleur n’est attendue suite à ces injections. (v) Ponction intracardiaque terminale : Une ponction intracardiaque terminale sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera l’euthanasie des animaux. De plus, les anesthésies répétées seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements (sang, yeux, foie, rate, nerf optique, cerveau) sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.
Remplacement
La rétine est une structure complexe composée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières. Il n’est pas possible de reconstituer parfaitement cet organe complexe in vitro. L’utilisation de modèles animaux est donc la seule option pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine avant de commencer des études cliniques chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire, nous utiliserons au maximum des animaux de réforme pour la phase 1. Nous avons calculé nos estimations sur les séances précédentes d’injections sous rétiniennes. D'après une revue des publications d'études similaires ainsi que l’expérience du laboratoire notamment sur la reproductibilité des ERG, 8 animaux par groupe seront suffisants pour réaliser des analyses statistiques pertinentes (comparaison des groupes à l’aide d’un test non paramétrique ‘one-way ANOVA’). Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques de type Mann-Whitney U pour analyser les données générées par l’expérience. Pour réduire le nombre d’animaux au minimum nous avons mis en place des mesures pour limiter la variabilité des données, y compris l’effet de la lumière. La luminosité est normalisée entre toutes les cages (mesurée par luxmètre chaque semaine). La détermination du nombre d’animaux pour l’évaluation de l’immunogénicité de Cas9 a été réalisée par approche statistique et sur la base de l'expérience d'études similaires en thérapie génique des maladies de la vision. Une analyse de puissance été effectuée avec le logiciel R et le package pwr en utilisant l'écart-type que nous observons dans les mesures d’ERG chez nos rats WT. De là, nous avons sélectionné une taille d’échantillon n=8 animaux/lot comme maximum.
Raffinement
Les études antérieures de notre équipe ont été faites sur d’autres modèles pour des études précliniques. Pour l’étude de certaines pathologies de la rétine et pour des études de recherches fondamentales nous serons amenés à travailler sur le modèle rat avant de pouvoir passer à une plus grosse espèce. Toutes les interventions sur animaux se feront sous anesthésie générale et locale renforcée si nécessaire par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires appropriés, pour réduire la contrainte imposée aux animaux. Les animaux sont observés quotidiennement et le vétérinaire de l’installation sera alerté dès l’apparition de signes cliniques afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Pour leur bien-être, les animaux sont hébergés à plusieurs par cage (dans la limite réglementaire) dans un milieu enrichi comprenant des frisottis de papier, buchettes de bois et tunnels. L’enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. Les animaux auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum L'application de critères d'arrêts nous permettra d'intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en utilisant des traitements antalgiques appropriés ou de décider d'une euthanasie
Choix des espèces
Le modèle rat est un très bon modèle préclinique pour l’évaluation d’un traitement par thérapie génique. De plus, les modèles utilisés ici sont des rats transgéniques pour la maladie de Stargardt : la lignée, issue de rats Sprague Dawley, que nous utilisons ici, a été créée par la technologie de CRISPR/Cas9. Cette technologie nous a permis de produire, lors du même projet de transgénèse, des rats « knock-out » pour ABCR4 (ABCR-/-). Nous avons validé que ce modèle montre le phénotype attendu avec des défauts métaboliques des rétinoïdes dans la rétine. L'augmentation du niveau de bis-rétinoïdes est mis en évidence dès l'âge de 3 mois et augmente avec l'âge comme le montrent nos résultats préliminaires par HPLC et spectrométrie de masse. Il semble donc pertinent de commencer le traitement entre l'âge de 2 et 3 mois : à cet âge le risque de décollement de la rétine est faible et on se situe dans la fenêtre thérapeutique. Pour l’évaluation de la réponse immunitaire, nous souhaitons évaluer celle-ci sur des animaux ayant un système immunitaire mature, donc sur des rats adultes de 3 mois.