Recherche appliquée

1 000 poulets de chair mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés en cages individuelles et soumis à deux périodes de mise à jeun de dix-sept heures, pour mesurer la digestibilité de différents aliments. Tous sont tués en fin d'essai afin de prélever le contenu de leur intestin. Le porteur reconnaît que le stress de l'isolement demeure une contrainte et affirme qu'aucun modèle in vitro fiable ne remplace aujourd'hui la mesure sur animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir mesurer la digestibilité iléale et fécale de différents aliments et/ou matières premières chez le poulet de chair mâle. Cela permet de déterminer la valeur nutritionnelle des aliments et matières premières et ainsi de pouvoir constituer des références ou de pouvoir utiliser ces données dans de futurs projets, notamment pour formuler des aliments au plus près des besoins des animaux.

Bénéfices attendus

Les mesures de digestibilités permettent de déterminer la valeur nutritionnelle d'un aliment ou d'une matière première, c'est à dire quelle est la part de nutriments ingérés qui est absorbée au cours de la digestion pour ensuite être métabolisée. Ces critères permettent de caractériser des matières premières en donnant des valeurs de référence qui sont ensuite utiliser pour formuler des aliments dans de nombreux projets.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux périodes de mises à jeun de 17h chacune. Ces mises à jeun marquent le début et la fin de la période de collecte totale de fientes pour déterminer la digestibilité fécale.

Impact sur les animaux

Ce protocole de digestibilité est habituel et bien maîtrisé même si le stress de l'isolement demeure une contrainte . L’utilisation du dioxyde de titane n’a jamais entraîné d’effets indésirables sur le comportement, la santé et la croissance des animaux dans le cadre des essais de digestibilité.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de projet afin de collecter les contenus digestifs nécessaires à la mesure de la digestibilité iléale.

Remplacement

A l'heure actuelle, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet de déterminer les valeurs de digestibilité. Des travaux sont en cours pour le développement d'un modèle in vitro mais dans la mesure où ces mesures servent ensuite de référence nutritionnelles, elles doivent être précises et fiables ce qui n'est pour l'instant pas le cas avec des approches in vitro.

Réduction

Dans les études de digestibilité, on utilise généralement 12 animaux par traitement expérimentaux. Cela permet de réduire au maximum le nombre d'animaux, tout en conservant de la variabilité et une marge sécurité (mortalité ventuelle pendant la période d'élevage).

Raffinement

Les animaux sont élevés au sol avant une phase en cages individuelles, indispensable pour pouvoir enregistrer leur consommation d'aliment et réaliser une collecte totale de fientes. Les cages individuelles sont équipées de grilles permettant un contact visuel et olfactif avec les congénères, le sol des cages est adapté à la taille et au poids des animaux et les cages sont équipées de jouets suspendus à picorer. Les animaux sont visités au moins 2 fois par jour. Le calendrier des pesées et les mises à jeun nécessaires au bilan (collecte totale de fientes) et aux prélèvements terminaux sont pensés de manière à éviter les mises à jeun répétées.

Choix des espèces

L'espèce choisie correspond à l'espèce cible.

40 chats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous anesthésie, des injections sous-cutanées de produits vétérinaires, jusqu'à dix scanners par animal sous anesthésie volatile et des biopsies cutanées, pour évaluer la réaction inflammatoire au site d'injection de nouveaux produits. Dix chats de l'étude pilote sont tués pour des biopsies post-mortem, les trente autres sont réutilisés ou transférés vers un autre établissement selon l'avis vétérinaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle alternatif n'existe et que des données sur l'espèce cible doivent figurer au dossier de mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet évaluera l’inflammation sous cutanée de nouveaux produits vétérinaires chez le chat, destinés aux traitements préventifs ou curatifs de diverses pathologies de l’espèce. L’évaluation de la réaction inflammatoire au site d’injection est suivie par imagerie médicale (scanner rayon X et IRM). Ces études sur l’espèce cible ont pour but d’étudier les signes cliniques d’intolérance suite à une administration unique de différentes doses d’un produit donné. Ce modèle d’innocuité in vivo est représentatif des modalités d’administration du futur produit chez l’animal traité. En plus du scoring mis en place, l’imagerie médicale permettra de collecter des données morphologiques précises comme la volumétrie de l’inflammation des tissus du site d’administration. Ce type d’imagerie, qui est non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (soit 40 animaux – réduire des 3Rs). Des prélèvements sanguins ainsi que des biopsies cutanées complèteront ces analyses. Dans le cadre d'une étude pilote, les animaux seront transportés entre leur lieu d'hébergement et l’établissement utilisateur 2 uniquement pour les phases d’IRM à moins de 50 kilomètres de distance. Certains animaux de ce projet seront réutilisés si l'état général de l'animal le permet et après avis vétérinaire favorable. Les animaux seront hébergés dans des salles, en groupe sociaux, avec à disposition des perchoirs et divers jouets. Une habituation des animaux est mis en place pour les acclimater à leur nouvel environnement, aux conditions d’hébergement et aux procédures . Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel compétent. Des points limites sont appliqués pour qu’en cas d’apparition de signes cliniques ayant des répercussions significatives sur l’animal, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement : analgésique ou autre, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie). Tous les actes réalisés sur les animaux seront assurés par du personnel formés. Les acquisitions scanners seront réalisées sous anesthésie fixe sous intubation ou volatile et une période de réveil sera respectée. Une mise à jeun pourra être nécessaire avant l'anesthésie fixe pour éviter les vomissements (-6h min, 16h max). Ces études sont encadrées selon les exigences de la Directive Européennes 2010/63/EU. L'objectif final est la mise sur le marché de produits vétérinaire.

Bénéfices attendus

Les dommages potentiellement infligés à un nombre restreint d’animaux lors de ces études sont justifiés au regard des futurs bénéfices chez un grand nombre d’animaux de compagnie (tolérance des traitements en cas de maladie) et éventuellement chez l’homme en cas de zoonose. L'étude pilote définira les modalités de réalisation des études principales : mise en place du modèle, protocole d’acquisition, sensibilité comparée des acquisitions IRM VS acquisitions CT, ajustement du scoring clinique. Elle validera le lancement du projet final au sein de l’EU1 sera la confirmation d’une meilleure sensibilité du canner CT pour le suivi de l’inflammation post-vaccination. Ce type d’imagerie non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (réduire des 3Rs).

Procédures

- 1 Puçage (SC) sous anesthésie volatile ou fixe si nécessaire. Tonte site d’administration si nécessaire - Prise de température rectale quotidienne durant 25 jours de suite maximum ou hebdomadaire - Prise de température par télémétrie : quotidienne - Pesée : quotidienne durant 25 jours de suite maximum ou hebdomadaire - Examens avant traitement : 1 scanner - Suivi clinique quotidien après traitement : observation de l’état général, signes cliniques généraux (diarrhée, comportement anormal, …) - Suivi du site d’injection : scoring* quotidien de l’inflammation après traitement durant 7 jours consécutifs ou plus si score différent de 0 - Traitement : Administration unique par voie SC de 1X à 3X (de 0,5 à 3mL) et/ou du véhicule (de 0,5 à 3mL). - Scanners (EU1) : sous anesthésie volatile environ 30min, 1x/semaine ou quotidien durant 5 jours maximum (cinétique de l’inflammation). La dose de rayon X reçues à chaque examen est d’environ 4-6mSv. L’effet sur l’organisme est considéré comme négligeable. 10 scanners maximum seront réalisés par animal /étude. - Sélection des chats allant à l’IRM selon degrés d’inflammation évalué par les observations cliniques et imageries préalables. - 2 Mise à jeun : la veille ou le matin avant les anesthésies fixe (6h minimum avant/16h maximum) - Etude pilote uniquement : Transport (environ 2h aller-retour) à l’EU2. Maximum 2 par animal / étude. - Etude pilote uniquement : IRM (moitié des animaux inclus) sous anesthésie fixe et intubation (à l’EU2 - environ 1h), 1 fois par semaine maximum avec 48h minimum de repos entre 2 acquisitions. Maximum 2 par animal / étude. - Prélèvements sang : 2x/jour maximum pendant 5 jours maximum ou hebdomadaire. Timepoints définis selon étude pilote et besoins scientifiques de l’étude (Baseline, PK…) - Prélèvement de peau post-mortem ou anesthésié avec réveil -antibiothérapie/analgésie pre (1x) et post (autant que nécessaire) biopsie - suture en condition d'aseptie (1x) Scoring de l’inflammation* : - Gonflement : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé - Rougeur : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé - Autre (à préciser selon l’étude) : 0 = nul, 1 = léger, 2= modéré, 3= élevé

Impact sur les animaux

Lésions cutanées dûes aux expositions répétées aux rayons X (moins de 42mSv sur le temps total des études). Transports jusqu'à l'EU2 et juusqu'au scanner puis jusqu'à l'établissement réutilisateur en fin de phase induisant un stress. Plusieurs anesthésies fixes + intubation. Anesthésies volatiles repetées. Mise à jeun entre 6h et 16h. Sutures (biopsie d'environ 8mm)

Devenir

Biopsies sur chaque site (3cmx3cm) prélèvées post-mortem dans le cadre de l'étude pilote pour analyses histologiques des sites d'adminsitration du produit. Biopsies sur chaque site (environ 8mm de diamètre) prélèvées sous anesthésie avec réveil (étude définitive, n= 30) pour analyses histologiques des sites d'adminsitration du produit. Dans ce cas, la réutilisation d'animaux sera à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis. Les animaux aptes au transports ils seront transportés dans un autre établissement utilisateur après avis vétérinaire. Cela contribue à une réduction globale du nombre d'animaux devant être utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

Aucun modèle alternatif. Il est nécessaire de réaliser des études chez l’espèce cible du produit afin de pouvoir observer les interactions entre les organes impliqués et les effets physiologiques d’un futur produit vétérinaire chez l’animal. Il s’agit de l’espèce cible pour les produits vétérinaires étudiés. Des données concernant l’espèce cible doivent être fournies au dossier d’AMM.

Réduction

En plus du scoring mis en place, l’imagerie médicale permettra de collecter des données morphologiques précises comme la volumétrie de l’inflammation des tissus du site d’administration. Ce type d’imagerie, qui est non invasive, permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux utiles au projet (soit 40 animaux – réduire des 3Rs). Ces analyses seront complétées par des prélèvement sanguins ainsi qu’histologiques en fin de phase expérimentale.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés en volatile (isoflurane + 02) ou en fixe pour l’administration sous cutané du produit et les prélèvements de sang si nécessaire. L' anesthésie volatile sera priviligiée tout au long de la procédure (induction volatile comprise) et réduite au temps nécessaire pour réaliser l'acte. Le réveil se réalisera dans un endroit au calme et la lutte contre l'hypothermie sera assurée via des alaises, chauffage (monitoring de la température des salles de procédures). L'analgésie réalisée en amont des prélèvements de peau (biopsies) sera réalisée systématiquement avant l'acte et sous anesthésie générale; Une analgésie locale supplémentaire pourra être mise en place après le réveil pour assurer le bon rétablissement de chaque animaux (réadministration de méloxicam ou application d'agent anesthésiant local par exemple). Une grille de scoring de l'état général des animaux est utilisée selon les procédures interne de l'établissement (EU1). La prise de la température par télémétrie assure moins de stress chez l'animal que la prise de température rectale. Les points limites précis et adaptés à l'espèce seront appliqués tout au long de la procédure pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Il est nécessaire de réaliser des études chez l’espèce cible afin de pouvoir observer les interactions entre les organes impliqués et les effets physiologiques d’un futur produit vétérinaire chez l’animal. Il s’agit de l’espèce cible pour les produits vétérinaires étudiés. Des données concernant l’espèce cible doivent être fournies au dossier d’AMM. L’âge dépend des besoins pour les études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude et du produit final et répondent aux exigences expérimentales d’utilisation du produit mis sur le marché. Les animaux ont minimum 6 mois. Cet âge est représentatif d’un état physiologique stable et qui s’apparente à celui de l’adulte chez l’espèce cible.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections intraveineuses de traceurs radioactifs sous anesthésie, suivies d'imagerie et d'un prélèvement sanguin terminal, pour tester des peptides de ciblage du cancer de la prostate. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grâce à l'imagerie non invasive. Il indique recourir à des cultures cellulaires tant que possible et réserver la souris aux expériences in vivo.

Objectifs

Les tumeurs peuvent co-exprimer différents récepteurs, cibles de nouvelles stratégies de détection et traitements tumoral. Des peptides à deux parties distinctes peuvent se lier à ces différents récepteurs et présenter des avantages (meilleure affinité, rester plus longtemps sur la tumeur, augmenter les chances de visualiser le tissu malade indépendamment du stade de la maladie) par rapport à des peptides simples. Ainsi ce projet vise à étudier les propriétés de ciblage tumoral de ces nouveaux peptides, marqués par de la radioactivité, pour leur utilisation en imagerie et thérapie nucléaires.

Bénéfices attendus

Un peptide à deux parties, ciblant à la fois le récepteur de la gastrine (GRPR) et le récepteur membranaire spécifique de la prostate (PSMA) pourrait permettre de détecter puis de traiter une très large gamme de profils d'expression du cancer de la prostate (y compris les tumeurs PSMA négatives ou GRPR négatives) quel que soit le stade de développement de la maladie.

Procédures

Les animaux du projet seront soumis à différents actes, en premier lieu acte 1 des greffes de cellules tumorales au niveau sous cutanée réalisées sous anesthésie qui vont permettre une croissance tumorale pendant 7 à 8 semaines au cours desquelles tous les animaux recevront sous anesthésie des injections intraveineuses de radiotraceurs qui permettront un suivi des tumeurs par imagerie non invasive TEP/TDM et enfin suite à la dernière imagerie un prélèvement sanguin sous anesthésie sera réalisé suivi d'une euthanasie par une méthode réglementaire. L'acte 2 s'étalera au maximum sur 3 semaines. L'acte 3 aura lieu environ entre 7 et 8 semaines après l'acte 1 de greffe tumorale soit lorsque les souris auront entre 12 et 14 semaines.

Impact sur les animaux

D’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir d'effets indésirables attendus sur les animaux. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure pour des prélèvements post mortem.

Remplacement

Des cellules de cancer de la prostate en culture seront utilisées tant que les expériences le permettent et le modèle de souris de xénogreffe tumorale pour les expériences nécessaires in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux, 160 au total, sera limité au maximum par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Le nombre d'animaux a également été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive pour suivre des modèles in vivo uniques parfaitement décris dans la littérature (modèle de greffe sous-cutanée de cancer de la prostate).

Raffinement

Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maison de type igloo en plastique) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Pour chaque procédure, des points limites ont été fixés et des méthodes prévues (anesthésie) pour éviter toute souffrance ou douleur aux animaux, qui resteront sous surveillance tout au long du projet.

Choix des espèces

Des souris immunodéprimées sont utilisées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.

6 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une semaine d'habituation, ils reçoivent des composés par voie orale puis subissent des prélèvements sanguins rapprochés jusqu'à 24 heures par la veine caudale, avant euthanasie au pentobarbital. L'étude, commanditée par une société cliente, vise à caractériser deux candidats médicaments anti-obésité avant essais cliniques. Le porteur indique que la répétition des prélèvements est source de stress et d'angoisse, et justifie le choix du rat par un volume sanguin supérieur à celui de la souris.

Objectifs

Le projet vise à étudier deux composés en développement chez le rat sain. L'objectif est de sécuriser le développement de composés d'intérêt thérapeutique avant leur passage sur l'animal pathologique et avant le stade d'études cliniques. Cette étude est commanditée par une de nos sociétés clientes, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser les paramètres pharmacocinétiques des composés en développement. Ainsi, les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination seront déterminés. Il s'agit ici de sécuriser le développement d'un candidat médicament anti-obésité, notamment en priorisant les composés les plus prometteurs avant passage aux études d'efficacité et aux études clinique. Les données obtenues permettront également de définir les doses a utiliser dans la suite des études.

Procédures

Pendant 7 jours (de D-7 à D-1), les animaux seront soumis à des administrations du véhicule (composé de référence) per os quotidiennement dans le but de les habituer à ce type d'administration. A D1, des prélèvements sanguins de 150µL par la veine caudale seront effectuées avant l'administration per os puis à 15min, 30min, 1h, 3h1 8h et 24h après.

Impact sur les animaux

La répétition rapprochée de certains prélèvements sanguins sera la source de stress et d'angoisse de l'animal même si l'animal aura été préalablement habitué au tube de contention. Aucune nuisance n'est attendu sur l'administration des composés et les animaux ayant subi une phase d'habituation seront donc acclimatés à l'administration par voie orale et au tube de contention pour prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection intraperitonéale de solution de pentobarbital (Euthasol, 250mg/kg)

Remplacement

L'utilisation d'animaux à des fins scientifiques se justifie ici car pour étudier l'effet de l'organisme sur le composé à visée thérapeutique, il est nécessaire d'utiliser un modèle vivant. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de déterminer ce que l'organisme fait au médicament et donc les paramètres d'absorption, de distribution et d'élimination. Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ainsi, le nombre d'animaux utilisé a donc été réduit en comparaison avec la souris.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les phases d'acclimatation (de D-12 à D-8) et d'habituation (de D-7 à D-1) permettent d'éviter tout angoisse de l'animal pendant la phase d'expérimentation. Les rats seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de tubes en carton et de briquettes. Les expérimentateurs en charge des administrations orales et des prélèvements sanguins sont rodés à ce type de pratique.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat comme modèle animal car il s'agît d'un modèle bien documenté dans la littérature scientifique, qui nous permet de récolter un volume sanguin plus important que chez la souris. Ce modèle a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés sont de jeunes rats adultes (201-225g à réception correspond environ 7-8 semaines). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte.

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).