Recherche appliquée

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.

Devenir

Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.

Remplacement

Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.

Choix des espèces

Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.

160 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou orale, gavés chaque jour avec des probiotiques, et subissent une perte de poids progressive avant un prélèvement sanguin intracardiaque terminal sous anesthésie et une autopsie. Le porteur teste l'efficacité de bifidobactéries contre l'infection et présente le hamster doré comme un "modèle de choix" par sa sensibilité au virus. La perte de poids attendue reste sous le seuil de 15 % fixé comme point limite.

Objectifs

L’intestin héberge naturellement des milliards de microorganismes, constituant le microbiote intestinal. Outre sa fonction dans la digestion, le microbiote exerce un rôle important dans la protection de l’organisme contre les pathogènes. Lorsque le microbiote intestinal est perturbé dans sa composition et/ou son fonctionnement, on parle de dysbiose. La dysbiose peut être due à un traitement antibiotique par exemple mais aussi liée à une pathologie. Chez certains patients atteints de la Covid-19, outre les symptômes classiquement observés, on peut constater parfois un tel déséquilibre de la biodiversité de la flore intestinale, associé à des symptômes gastro-intestinaux incluant des diarrhées. Par ailleurs, les analyses des selles de ces patients démontrent que le virus SARS-CoV2 peut survivre dans le tractus gastro-intestinal suggérant ainsi que ce dernier peut constituer un site extra-pulmonaire pour la multiplication et l’activité virale. De plus, le récepteur utilisé par le SARS-CoV2 pour infecter les cellules de l’hôte (fortement exprimé dans les cellules pulmonaires) est aussi présent dans les cellules épithéliales du tractus GI et joue un rôle essentiel dans le contrôle de l’inflammation intestinale et l'équilibre microbien. L’apport de probiotiques pourrait constituer une approche de traitement à 2 niveaux : 1/En exerçant un blocage du processus de fusion du virus aux cellules de l’hôte 2/en exerçant une activité de modulation des molécules de l'immunité. Le présent projet se propose d’évaluer l’efficacité de bifidobactéries sur l’infection à SARS-CoV2 chez le hamster doré. Deux probiotiques candidats (bifidobactéries) ont été retenus pour l'essai d'efficacité in-vivo.

Bénéfices attendus

Une activité immunomodulatrice des bifidobactéries associée à une activité de perturbation de la mutiplication du SARS-CoV2 permettraient de limiter l'infection par le SARS-CoV2 chez le hamster. Le bénéfice attendu est donc l'apport de la preuve que les bifidobactéries peuvent constituer un potentiel traitement contre l'infection au SARS-CoV2.

Procédures

Les hamsters vigiles seront traités par gavage oral quotidien (sonde) avec un volume de 200µL, soit 11 ou 13 gavages (durée = 2/3 secondes/gavage) selon les groupes Les hamsters de la procédure 1 seront infectés une seule fois par voie intra-nasale (40µl - animaux anesthésiés - durée = 15 secondes environ) Les hamsters de la procédure 2 seront infectés une seule fois par voie orale (200µl - animaux vigiles - 2/3 secondes environ) Les hamsters seront manipulés quotidiennement pour une pesée (11 à 14 pesées selon les groupes - durée = 10 secondes) Les hamsters seront anesthésiés (J+4 ou J+7) à l'isoflurane puis par injection de kétamine/xylazine afin de réaliser une prise de sang intracardiaque terminale avant autopsie (prooédure terminale de 15 minutes au total)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. La perte de poids prend généralement fin à J+6 et n'excède pas 15% du poids constaté le jour de l'infection.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort afin de réaliser une autopsie et une collecte d'organes/sang pour étudier différents paramètres de l'infection.

Remplacement

Des experimentations préliminaires in-vitro ont été réalisées en amont du projet afin de sélectionner les souches candidates et de valider leur activité anti-protéase et immunomodulatrice. Néanmoins, l'évaluation de l'efficacité des traitements par probiotique (évalution de multiplication virale, la distribution, lésions associées) ne peut se faire in-vitro et nécessite de passer par le modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été fixé à 16 afin d'avoir 8 animaux par point de mise à mort (J+4 et J+7) afin d'obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs.

Raffinement

Ces hamsters seront hébergés en cage de 2 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV2 utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur, reçoivent des injections de cisplatine et, pour 72 d'entre elles, subissent sous anesthésie une lésion musculaire provoquée par le froid. Le projet se présente comme une contribution aux 3R, censé vérifier si des cultures cellulaires pourraient un jour remplacer la souris, mais le porteur précise que les souris ne seront pas remplacées ici et que la comparaison avec le modèle animal reste "nécessaire". Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Il est évident que les cellules tumorales sont dans un environnement tridimensionnel dans les organismes vivants, recréer l’architecture correcte de tissu in vitro pour imiter l’effet du microenvironnement tumoral (TME) n’est pas une entreprise simple. Malgrès d'importants efforts qui ont été fait dans la création de modèle 2D et 3D dans ces analyses, ces methodes montrent encore d'importantes limitations. Les lignes directrices actuelles recommandent que les chercheurs qui utilisent l’expérimentation animale doivent se demander si et par quelle configuration alternative les animaux qu’ils envisagent d’utiliser pourraient être remplacés, si et comment leur nombre peut être réduit, et si et comment l’expérimentation animale pourrait être raffinée, c’est-à-dire être plus fiable avec la réduction du stress animale tout en obtenant une meilleure information avec un nombre inférieur d’animaux. Dans le but de fournir des bases empiriques à la recherche épistémologique, nous allons utiliser en parallèle des modèles animaux et cellulaires pour étudier la même question, c.a.d. comment le TME peut influencer la réponse tumorale aux agents chimiothérapiques. Nos resultats permettront de savoir si l'etude du TME des cellules cancereuses fait chez l'animale peut etre remplacer par des études in vitro.

Bénéfices attendus

La pertinence du TME pour les études cliniques et biologiques sur la pathophysiologie tumorale est maintenant établie, bien qu’étant une réalisation récente. En effet, le comportement des tumeurs et leur interaction avec l’hôte, allant de la réponse immunitaire à la cachexie induite par le cancer, sont si profondément affectés par le TME, que les études actuelles sur la progression du cancer et la réponse à la chimiothérapie ne peuvent plus ignorer cette question. Afin d'étudier la reproductibilité des modèles par des cultures cellulaires et tirer des conclusions de la comparaison de résultats issus de modèles in vitro et in vivo, nous avons la nécessité de l’utilisation des modèles animaux. Le but majeur de notre étude est de vérifier si les effets de la cisplatine sur la tumeur sont reproductible d'un modèle in vivo à un modèle in vitro, même en présence d’un microenvironnement tumoral assai réduit ou simplifié in vitro. La comparaison avec le modèle in vivo joue un rôle central dans les conclusions de l’étude et cela est le but premier de notre projet. Cela permettra d'établir des critères plus précis et spécifiques suivant les modalités des 3r, cad le remplacement (total avec le modèle in vitro), la reduction (nombre de souris), et le raffinement.

Procédures

Les souris seront soumis à differents types d'interventions: 1 injection de solution en SC sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 4 injections en IP (à jours 7,11, 14 et 17) sur animaux vigiles, elle durera 10 secondes. Elle concerne l'ensemble des 216 animaux. 1 chirurgie, une blessure par le froid sous anesthesie à jours 14, la chirurgie est estimée à 6 min et le reveil entre 30 et 40 min. Elle concerne 72 animaux.

Impact sur les animaux

Les nuissances attendus chez les souris sont: masse tumorale dans la region dorsale des souris, fatigue et un stress, toxicité de la cisplatine, douleur musulaire suite à la blessure par le froid dans les premiers jour suivant l'intervention. Ces effets indésirables seront surveillés quotidiennement selon nos critères de point limite afin de mieux gérer le bien-etre des animaux.

Devenir

Toute le souris sont mises à mort à la fin de la procédure 1. La mise à mort se fera selon la réglementions européenne en vigueur. Afin de valider l'hypothèse qui est de savoir si les études fait chez l'animale peut être remplacer par des études in vitro dans l’analyse du microenvironnement tumorale(TME) des cellules cancéreuses, l'analyse des diffèrent tissus post mortem obtenu sur ces animaux est nécessaire afin de les comparer aux résultats que nous obtiendrons sur les études de culture cellulaire.

Remplacement

L'objectif général du projet est d'étudier la reproductibilité du modèles souris par rapport au modèle de cultures cellulaire. Nos objectifs spécifiques sont de voir si on peut mesurer les mêmes effets d’un puissant agent chimio thérapeutique, la cisplatine, sur les cellules tumorales in vivo et in vivo, en comparant les résultats obtenus sur un modèle souris porteur de tumeur aux résultats sur une culture de cellules isolées. Pour cela, nous allons développer un système de cultures cellulaires C26 en 2D ainsi que 3D lesquelles permettront de se rapprocher le plus possible au microenvironnement tumoral in vivo. Les souris ne seront pas remplacées dans cette étude. En revanche, les résultats nous dirons si et jusqu’à quel point dans le future nous pourrons remplacer le modele animal, dans des études similaires futures

Réduction

Pour estimer le nombre minimum d'animaux nécessaire, nous avons effectué un calcul statistique réitératif. De plus, nous disposons de l’expérience préalable formalisé dans l’appréciation rétrospective avec ce même modèle animal. De cette approche, nous avions prévu que 18 souris pour chaque condition expérimentale pour un totale de 216 souris, avec un niveau de confiance du 95% et une puissance de 80. Les outils statistiques et informatiques que nous mettons en place sur la base de notre expérience avec ce type de modèle permettront de réduire le nombre de manipulations en exploitant au mieux les données obtenus par chaque expérience.

Raffinement

Pour améliorer les conditions de vie des souris et leur éviter le stress, les pratiques suivantes seront mises en place. Nous avons défini les variables et la méthode d’évaluation quantitative du point limite au-delà duquel les animaux recevront un analgésique ou seront euthanasiés : des intervention différentes (de l’administration d’analgésique jusqu’au l’euthanasie) seront mises en place selon le score obtenue. A savoir que ce modèle expérimental a une cinétique de développent de la pathologie très bien connue, permettant de programmer les expériences de maniere à ne pas arriver aux points limites. Pour des pratiques plus invasives, tel que la génération d’un dommage musculaire afin d’étudier la régénération , l’anesthésie totale sera pratiquée, suivie d’un traitement analgésique. L’expérimentation animale sera effectuée par une équipe entrainée à cette technique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum) et l'isolement est évité (3 souris par cage minimum). L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid. Afin de diminuer le stress des animaux, une maison en carton sera ajoutée dans la cage. Enfin, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer aux manipulations et ainsi diminuer leurs stress le jour des experimentations.

Choix des espèces

La souche BALB/c est la seule compatible avec la tumeur 26, qui a été sélectionné car non métastatique, et sur cette base nous avons privilégié cette souche.. La connaissance détaillée du modèle nous permet d’une part d’exploiter au maximum les informations expérimentales obtenues et d’autre parte d’avoir une sensibilité particulaire pour évaluer tout signe de souffrance ou malaise de ces souris en présence de tumeur.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection intrapéritonéale de la forme larvaire d'Echinococcus multilocularis, puis développe dans l'abdomen une masse parasitaire qui entraîne une prise de poids et des difficultés de locomotion, avec un risque d'ulcération de la peau par frottement contre la cage. Toutes sont tuées pour récolter cette masse parasitaire, l'objectif étant de maintenir la souche au laboratoire et de produire du matériel pour des outils de diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'existe et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser la souris.

Objectifs

L’objectif du projet est de maintenir au laboratoire un isolat d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires. E. multilocularis est l’agent causal chez l’Homme de l’échinococcose alvéolaire, maladie rare mais mortelle si non traitée. La transmission à l’Homme se fait exclusivement par voie orale, suite à l’ingestion d’œufs de parasites présents dans l’environnement sur des végétaux souillés, au contact du sol contaminé mais aussi de manière indirecte par ingestion d’œufs manuportés après contact avec le pelage souillé de carnivores porteurs du parasite. Le nombre de cas humains diagnostiqués chaque année en France reste faible, cependant on note une augmentation au cours des dix dernières années de ce nombre qui est passé de 15 à 30 cas en moyenne par an. Le maintien en laboratoire d’isolats d’Echinococcus multilocularis sur hôtes intermédiaires nous permettra de disposer facilement d’un matériel parasitaire de bonne qualité. La maîtrise de l’infection des hôtes intermédiaires en captivité permettra : 1/ De fournir du matériel larvaire de référence pour la mise au point de nouveaux outils diagnostiques. 2/ De produire au niveau de la masse larvaire des protoscolex (forme initiale du futur ver qui se développera dans l’intestin des hôtes principaux).

Bénéfices attendus

L’ensemble des prélèvements récoltés permettra de produire du matériel de référence pour le développement d’outils de diagnostic qui contribueront à une meilleure connaissance de la répartition/ circulation des pathogènes étudiés et à une meilleure compréhension des mécanismes qui aboutissent à l’exposition de l’homme à ce parasite. Les protoscolex produits permettront de reproduire sur des renards en captivité le cycle parasitaire d’ Echinococcus multilocularis pour obtenir des vers adultes et des œufs de parasite.

Procédures

Les souris vigiles ne recevront qu'une seule injection intrapéritonéale (intervention ne prenant que quelques secondes) de la forme larvaire du parasite (0,5 ml) sans anesthésie préalable.

Impact sur les animaux

L'infestation par le parasite, entraine une prise de poids progressive des souris, en raison du développement de la masse parasitaire dans l’abdomen, qui à terme entraine des difficultés de mobilité/locomotion. Exceptionnellement, des cas d’ulcération cutanée liés aux frottements de l’abdomen sur les parois de la cage peuvent être constatés lors de la surveillance journalière. Dans ce cas, les animaux seront immédiatement mis a mort.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort afin de récolter la massse paraistaire.

Remplacement

Il n'existe actuellement pas de méthode alternative in vitro pour produire des protoscolex en dehors de l’infection des hôtes intermédiaires.

Réduction

Le projet utilisera environ 60 souris par an, soit 300 sur 5 ans. Cela se justifie par un temps de developpement de la forme larvaire qui est de 5 mois minimum et par un succès du maintien de la forme productrice de protoscolex qui est de 66%. Ces paramètres nous obligent pour assurer le maintien des souches de répéter l’infestation tous les deux/trois mois sur des lots d’environ 10 souris. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'un projet concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées.

Raffinement

Les souris seront surveillées tous les jours et bénéficieront d’un enrichissement (carton, abris plastique et cellulose, bâton de bois,..) dans les cages. Les animaux seront pesés mensuellement jusqu’à 4 mois puis à partir du 5eme mois les pesées seront hebdomadaires afin de contrôler si les animaux atteignent le poids limite de 80 gr. De la nourriture sera diposée au sein même de la cage en cas de problème d’accès à la mangeoire située sur la grille. Si toutefois, les souris montrent des signes de mal-être, des problèmes locomoteurs trop importants, alors les animaux seront mis à mort. L'observation d'une pathologie intercurrente qui ne peut être soignée (ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée) entraîne la mise à mort compassionnelle de l'animal. De même, un point limite de temps a été fixé à 6 mois, point au-delà du quel les animaux sont mis à mort même si le poids limite n'a pas été atteint.

Choix des espèces

Les hôtes intermédiaires d'Echinococcus multilocularis sont les rongeurs sauvages et plus particulièrement Arvicola terrestris, communément appelé Campagnol terrestre ou encore Rat taupier. Comme il n'existe pas de méthode alternative in-vitro pour produire des protoscolex, il est nécessaire d'utiliser le modèle souris, pour obtenir du matériel parasitaire larvaire facilement utilisable pour le développement des outils diagnostiques et pour l’infestation des hôtes définitifs en captivité. Notre expérience a montré que le stade de développement n'avait pas d'influence sur la sensibilité du parasite et le developement de la forme larvaire. Les souris sont issues pour une part importante d'animaux commandés dans le cadre d'autres projets concernant la détection d’agents de la menace dans des échantillons d’eau potable contaminée accidentellement ou intentionnellement. Ce type de projet n'étant mis en oeuvre que lors d'évènements de contamination, les souris commandées pour ce projet ne sont donc pas systématiquement utilisées et ne sont donc entrées dans aucune procédure. Les animaux utilisés peuvent donc avoir des poids compris entre 20 et 30 grammes.

27 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une souche atténuée de peste porcine africaine à visée vaccinale. Les animaux immunisés puis éprouvés avec une souche virulente subissent jusqu'à 22 prélèvements de sang sur huit à quatorze semaines, tandis que les cochons non immunisés développent une infection décrite comme "inexorablement fatale" et sont tués à six jours avant d'en mourir. Le porteur indique un épisode de fièvre et une baisse de croissance après inoculation de la souche atténuée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue la réponse du porc à l'infection et que seuls les suidés y sont sensibles.

Objectifs

Le laboratoire a découvert et breveté une souche atténuée de virus de la Peste Porcine Africaine (PPA) à potentiel vaccinal. Cette souche (ASFV-989) a été produite initialement sur cellules prélevées sur porcs (macrophages alvéolaires). En vue du développement de la souche ASFV-989 comme vaccin contre le PPA, il est indispensable de pouvoir produire cette souche sur lignée cellulaire (cellules se multipliant de manière continue). Nous avons donc entrepris l’adaptation de la souche ASFV-989 sur cellules de lignée immortalisées à partir de cellules de testicules de porcs (Swine-Testis ,ST). Après 20 passages sur cellules ST, la souche ASF-989 a montré une bonne adaptation sur ce support cellulaire. L’adaptation à ces nouvelles cellules a cependant conduit à des modifications génétiques de la souche. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer si l’adaptation de la souche ASFV-989 aux cellules ST n’a pas modifié ses caractéristiques en termes de sécurité et de protection vaccinale en étudiant : (i) d’une part les réponses cliniques et immunovirologiques induites par l’inoculation de la souche ASFV-989-ST chez le porc, par voie intramusculaire (IM) ou oronasale (ON), et la persistance à long terme de la souche atténuée chez les animaux inoculés, et d’autre part (ii) la protection vaccinale vis-à-vis d’un challenge infectieux avec la souche virulente Georgia 2007/1

Bénéfices attendus

La peste porcine africaine est une maladie virale qui se caractérise par des signes cliniques tels qu’une perte d’appétit rapide et un abattement des porcs en lien avec une forte fièvre, ainsi que des hémorragies cutanées, diarrhées, etc…, qui vont induire une forte mortalité chez les porcs domestiques comme chez les sangliers européens. Pour le moment, il n’existe pas de vaccin commercialisé contre la PPA. De ce fait, la gestion des foyers de PPA repose chez les porcs domestiques sur des mesures de restriction de mouvement des animaux et des abatta ges massifs. Chez les sangliers sauvages, la gestion des foyers est complexe et repose sur la mise en place de clôtures, de piégeages et d'abattages. D’un point de vue sociétal, ces mesures de gestion sont de plus en plus critiquées. La disponibilité d’un vaccin pourrait offrir une alternative plus acceptable. Si les résultats de notre projet sont conformes aux attendus en termes de sécurité et d’efficacité vaccinale, la souche ASFV-989ST pourrait être utilisée à terme comme vaccin, à la fois chez les porcs domestiques (après immunisation IM), mais aussi chez le sanglier (vaccination par voie orale par appâts).

Procédures

Au cours de la procédure 1, les animaux seront inoculés par voie intramusculaire ou oronasale par la souche ASFV-989ST puis seront challengés, 1 mois plus tard, par la même voie par la souche virulente Georgia. Le groupe de porc non-immunisé sera seulement inoculé par la souche Georgia par voie IM. Les inoculations intramusculaire ou oronasale sont des actes rapides qui prennent moins d'une minute. Les animaux immunisés seront soumis à un toltal de 15 prélèvements sanguins au cours des 8 semaines de l’étude. Les animaux non-immunisés seront soumis 4 prélèvements sanguins au cours de la période qui précède et suit le challenge par la souche Georgia. Les prises de sang sont réalisées par des animaliers pratiquant ces prélèvements très régulièrement, la durée des prises de sang n'excède donc pas 1 à 2 minutes Au cours de la procédure 2, le groupe immunisé sera inoculé avec la souche ASFV-989ST par voie IM (durée des inoculations de moins d'1 minute). Les animaux de ce groupe seront soumis à un total de 18 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi. Les animaux non immunisés seront soumis quant à eux à 22 prélèvements sanguins au cours des 14 semaines de suivi (durée des prises de sang d'1 à 2 minutes).

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation de la souche ASFV-989ST (par voie IM ou ON), les porcs devraient présenter un épisode fébrile de quelques jours pendant lesquels leur consommation alimentaire et leur croissance devraient être diminuées. Chez les animaux non immunisés, le challenge avec la souche virulente Georgia conduit à des hyperthermies et à des sypmptômes cliniques caractéristiques de la maladie. L’issue de cette infection étant inexorablement fatale chez les animaux non-immunisés, ceux-ci seront mis à mort à J6 post-challenge avant que les animaux ne meurent de l’infection ou plus précocement si nécessité, en cas d’atteinte d’un point limite.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Des prélèvements de tissus (pour recherche virologique) sont prévus à la fin de chaque procédure, la mise à mort des animaux est donc indispensable.

Remplacement

Aucune méthode in vitro d’évaluation directe de la réponse du porc à l’infection ou à la vaccination par le virus de la PPA n’est disponible.

Réduction

Les lots immunisés / challengés seront constitués chacun de 6 porcs et les lots témoins et contrôle positif de 3-4 porcs. Cet effectif est le minimum nécessaire par groupe pour des analyses statistiques robustes compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés (croissance, virémie, réponses immunes, etc.). Les tests statistiques utilisés seront, pour une distribution normale : les tests ANOVA et de Student ; et pour une distribution ne suivant pas la loi normale : les tests de Kruskall-Wallis et Kolmogorov-Smirnov.

Raffinement

Hébergement des animaux en groupes stables et sociaux avec enrichissement du milieu. Pour les prélèvements sanguins : contention sans lasso tant que la taille des animaux le permet. Récompense (grenadine) distribuée après chaque prise de sang. Après inoculation par la souche ASFV-989ST et challenge avec la souche virulente Georgia : suivi clinique renforcé selon la grille de score clinique définie pour la PPA.

Choix des espèces

Etant donné que seuls les suidés sont sensibles à l’infection par le virus de la PPA, il est indispensable d’avoir recours aux porcs pour cette étude (=espèce cible). Les animaux sont sevrés à 4 semaines d’âge. Les animaux auront 6 semaines d’âge au moment de la première inoculation. A 6 semaines, le porc présente d’un point de vue physiologique un système immunitaire mature.