Recherche appliquée

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales puis de cellules CAR-T, avec suivi de la croissance de la tumeur par imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins, jusqu'à une ponction intracardiaque terminale. Le porteur reconnaît l'apparition de tumeurs et de possibles difficultés respiratoires liées à des métastases pulmonaires. Il présente ce modèle murin comme un "prérequis indispensable" avant un éventuel essai clinique, tout en reconnaissant qu'aucun modèle animal n'existe encore pour cette stratégie.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules tumorales. Après réinjection aux patients, ces cellules dites "CAR-T" sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Les CAR-T cells représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certains cancers du sang réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète au traitement par la thérapie CAR-T cell, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules CAR-T, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie CAR-T cell, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices des CAR-T pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Avant administration des cellules progénitrices CAR-ProT et évaluation de l’effet thérapeutique, il est nécessaire de valider dans un premier temps le modèle animal pour le développement de tumeur de lymphome et la régression tumorale en injectant des cellules CAR-T matures, connues pour leur capacité d’élimination de tumeur in vivo. Si cette 1ère étude est concluante, une 2è étude sera réalisée avec les cellules progénitrices CAR-ProT et fera l’objet d’une 2è demande d’autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Si le modèle animal, tel qu’il est décrit dans ce projet, permet de démontrer une réponse antitumorale avec une dose faible de cellules CAR-T classiques, nous pourrons ensuite continuer l’étude avec des cellules progénitrices CAR-ProTcell. Cette deuxième partie du projet fera l’objet d’une deuxième demande d’autorisation. A notre connaissance aucun modèle animal n’est établi à ce jour pour répondre aux besoins de nos études avec des cellules progénitrices humaines nécessitant de poursuivre leur différenciation in vivo en cellules effectrices. Le modèle doit être adapté à l’évaluation des fonctions anti-tumorales des progéniteurs des CAR-T génétiquement modifiés. Ce modèle murin représente par conséquent un prérequis indispensable afin de tester in vivo notre stratégie thérapeutique dans des conditions proches de celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable avant l’application éventuelle de notre stratégie thérapeutique innovante dans un essai clinique. Les résultats de ce projet permettront ainsi la validation du potentiel de notre plateforme et l’acquisition de données indispensables au développement clinique d’une thérapie innovante, à fort potentiel translationnel.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections par voie intraveineuse (1X à l'age de 8 semaines); - des injections par voie intrapéritonéale et des anesthésies sous isoflurane pour suivre laecroissance tumorale par imagerie (2X/semaine, sur une durée de 1 mois environ); - des prélèvements sanguins, toutes les 2 semaines (sur une durée de 1 mois environ, soit 3X maximum); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, sous anesthésie profonde, sub-léthale).

Impact sur les animaux

Les cellules CAR-T matures pourraient occasionner au long cours une réaction des lymphocytes humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules hématopoiétiques humaines. La durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet effet indésirable. Par ailleurs, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Par ailleurs, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations phénotypiques et moléculaires du produit final par des méthodes de type séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire et par cytométrie de masse. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les cellules T matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules souches hématopietiques avec des cellules stromales. Bien que ce modèle permette d’obtenir des cellules T exprimant des marqueurs CD3 de différentiation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénotransplantation, réceptif aux cellules hématopoïétiques humaines, permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs lymphoides dans l’environnement thymique. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet consiste à utiliser des cellules CAR-T matures et à valider le modèle tumoral avec une décision de poursuivre ou non à l’issue de cette étape avec les cellules progénitrices des CAR-T. Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal de base choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, y compris pour la greffe des progéniteurs lymphoïdes. D’autre part, le rendement de la reconstitution hématopoïétique est supérieur chez les souris femelles. Nous utiliserons donc de préférence des souris femelles dans nos protocoles permettant d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental en fonction de la différence relative attendue. En utilisant des tests statistiques non paramétriques de type Kruskal Wallis, Mann Whitney ou Wilcoxon, selon le design expérimental et le paramètre mesuré, nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux si ces différences existent.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes NOD/SCID/gc- (NSG) sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire des souris NSG permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris NSG, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules hématopoïétiques sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. L’étude de la thymopoïèse et de la régénération thymique humaine chez ces souris nous permettra ainsi d’évaluer les progéniteurs lymphoïdes greffés dans un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris NSG adultes de 8 semaines, permettant une bonne prise de greffe des cellules tumorales et des CAR-T matures.

2 220 souris et 2 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, qui détruit le pancréas, pour reproduire une rétinopathie et une atteinte de la cornée, avec examens oculaires sous anesthésie et désépithélisation cornéenne. Le porteur décrit une soif et des urines accrues, une perte de tonus et un poids réduit, les rats malades ne pesant après un mois que 50 à 60 % du poids des rats témoins. L'objectif affiché est de mettre au point un "modèle expérimental" pour tester de futurs traitements, le recours à l'animal étant présenté comme "nécessaire" faute de pouvoir mimer la maladie autrement.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle expérimental de rétinopathie diabétique et également d’un modèle de cicatrisation cornéenne chez le rat ou la souris afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'oeil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une détérioration des capillaires sanguins de la rétine. Ils perdent leur étanchéité conduisant à des hémorragies et des exsudats, lésant la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète est également responsable d’une dégradation de la cornée, le tissu transparent en avant de l’oeil, il ralentit notamment la cicatrisation cornéenne en cas de blessure, causant l’apparition d’opacités qui altèrent la vision.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.

Procédures

L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritoneale de streptozotocine. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Pour la partie sur l'étude de la cicatrisation cornéenne, une désepithelisation cornéenne se fera sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les animaux sont rendus diabétiques par injection de streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.

Devenir

L'euthanasie des animaux est réalisée en fin d'étude pour analyse des tissus.

Remplacement

Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la rétinopathie ou de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. Bien que différentes souches de rat pigmenté ou albinos soient utilisées dans la littérature, les rats Brown Norway semblent avoir une sensibilité supérieure et plus durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète, et les souris C57bl6 semblent repondre le mieux à l'induction par la streptozotocine. Nous choisirons ces souches, mais n’excluons pas de modifier ce choix en fonction des résultats, des échanges avec collaborateurs extérieurs ou nouvelles données de la bibliographie, les rats Wistar, Sprague Dawley et long Evans sont également largement utilisés dans la bibliographie. De même pour l’étude de la cornée diabétique la souris pigmentée ou le rat albinos sont utilisés. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabètes conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 3 jours.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale des deux tiers du foie et des injections, pour étudier le contrôle de la division des hépatocytes en lien avec le cancer du foie. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer une gêne et une légère douleur, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'atteinte des points limites. Il affirme que le modèle murin est le "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 280 souris et sera mené pour une durée de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de RhoA, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, une injection intra-péritonéale (une fois, à 6 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (112 animaux). Par ailleurs, une hépatectomie partielle des 2/3 du foie (chirurgie) sera effectuée sur animal anesthésié (280 animaux). Enfin, une injection intra-péritonéale (une fois, à 8-10 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (280 animaux).

Impact sur les animaux

Du fait de la laparotomie nécessaire à la chirurgie du foie, les animaux pourraient resssentir soit une gêne au niveau de la zone chirurgicale (présence de sutures/agrafes) ou bien une légère douleur de par l'acte chirurgical. Par ailleurs, l’injection intrapéritonéale pourrait entrainer un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglemantaire) de l’ensemble des animaux (280).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires conduisant au CHC.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Pour cette étude, nous estimons que 280 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (hépatectomie partielle) sera précédée d’une anesthésie générale et d'une prise d'antalgique pré/post opératoire. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 à 10 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer du foie, elles reçoivent des traitements par gavage cinq jours sur sept ou par injection pendant huit semaines, des échographies sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable" des immunomodulateurs testés, alors que les souris portent une tumeur hépatique évolutive. Il conclut qu'aucun modèle ne reproduit ces interactions et parle d'un "passage obligatoire par le modèle animal".

Objectifs

Notre projet est d’évaluer l’intérêt de l’immunomodulation dans le CHC, et pour se faire il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de CHC immunocompétent. Nous proposons d’utiliser un modèle de souris transgénique (ASVB) développant un carcinome hépatocellulaire évoluant en trois stades bien définis : dysplasie, nodulaire, et diffus (Dupuy, et al., 2003 ; Contreres, et al., 2006 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). Ce modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain) (Dupuy, et al., 2003 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). De plus, des résultats préliminaires ont montré une augmentation de l’expression de PD-1 et PD-L1 au cours du développement du CHC (Tijeras-Raballand, et al., abstract accepté ILCA 2019). Toutes ces caractéristiques en font un excellent modèle d’étude pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seul 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti- PDL1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. Ce projet tend donc à proposer des méthodes combinatoires, permettant à la fois d’augmenter l’efficacité des thérapies proposées, ainsi que d’éviter l’apparition de résistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 type d'intervention en étant vigiles: L'administration du traitement soit par gavage 5 jours sur 7 soit en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 8 semaines. Ils seront ensuite anesthésiés pour être soumis à un échodoppler qui n'est pas une précédure invasive, donc non douloureuse 3fois (à 8 12 et 16 semaines). Enfin, ils seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale où les animaus ne seront pas réveillés à 16semaines.

Impact sur les animaux

Il n'y a aucun effets indésirables attendus avec l'utilisation d'immunomodulateurs. Aussi, la dose sélectionnée de Sorafenib (traitement contrôle dont on connaît les effets) a été choisie pour ne pas induire d'effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après l’échographie de la 16ème semaine par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti-PD-L1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. A ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, tout en étant statistiquement valide, le nombre d’animaux par groupe (10) a été déterminé grâce aux expérimentateurs (personnel en charge de l’échographie, anatomo-pathologistes, pharmacologues et chercheurs) qui participent à ce projet et qui ont de l’expérience avec ce modèle. De plus, dans la mesure du possible, plusieurs groupes de traitements seront testés en parallèle afin de ne pas multiplier le groupe contrôle (ou placebo), pour un total de 360 animaux sur 36 mois. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes de monothérapie et les groupes de monothérapie avec les combinaisons.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (qui ne sera jamais pris en compte individuellement dans la mesure où l’accroissement du volume hépatique peut provoquer une légère prise de poids), le gonflement de l’abdomen (signe de développement tumoral trop important) et la survenue d’une gêne pour se déplacer (signe de douleur possible au niveau hépatique). Le comportement et l’apparence physique feront aussi l’objet d’observations. Les dispositions retenues pour stopper ou atténuer les problèmes liés à l’apparition de points limites seront prises dès constatation. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC). Ce modèle est un des rares modèles immuno-compétents de CHC, disponibles pour l’étude de nouvelles thérapies. Le modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain). Les anomalies vasculaires observées sont également les mêmes que celles observées chez l’homme et permettent d’analyser les effets anti-angiogéniques attendus des molécules, en plus de leurs effets antitumoraux. Enfin, ce modèle possède un stroma immun riche et complexe, à l’image de celui observer dans les tumeurs issues de patients. Le début de l’administration des médicaments aura lieu à l’âge de 8 semaines. En effet, dans ce modèle, 3 stades de carcinogenèse bien définis ont été mis en évidence. Une hyperplasie (8 semaines), stade nodulaire (12 semaines) et carcinome diffus (à partir de la semaine 16). En oncologie, les patients commençant à être traités une fois leur pathologie déclarée, cela explique pourquoi nous attendons également le début de la carcinogenèse dans les animaux.

28 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, gardés vivants puis réutilisés pour des travaux d'enseignement ou proposés à l'adoption. Une inflammation douloureuse est provoquée à la patte par injection de kaolin sous anesthésie, avec un pic de douleur autour de 24 heures, pour tester un candidat vaccin anti-NGF censé soulager les douleurs d'arthrose. Les chiens subissent aussi jusqu'à huit prélèvements sanguins et l'administration du vaccin ou d'un traitement de comparaison. Le porteur affirme que le modèle est "complètement réversible" au bout de huit semaines et justifie l'étude par la "nécessité" de tester la réponse de l'"organisme entier" chez l'espèce cible.

Objectifs

Le NGF (Nerve Growth Factor) est un polypeptide impliqué dans la croissance, la prolifération et la survie des neurones et d'autres cellules. Le NGF semble aussi jouer un rôle important dans la sensiblisation des nocicepteurs après une blessure tissulaire. Il a été montré que l'inhibition par un anticorps monoclonal de la signalisation cellulaire médiée par le NGF permet de soulager les douleurs ostéoarticulaires. Un nouvel anticorps monoclonal, le bedinvetmab, est récemment disponible en médecine vétérinaire pour soulager ces douleurs ostéoarticulaires chez le chien. Un nouveau candidat vaccin est également à l'étude pour sa capacité à favoriser la production d'anticorps anti-NGF endogènes. Les objectifs de notre projet sont: (1) de tester chez le chien, l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin sur la réduction de la douleur dans un modèle de douleur inflammatoire au kaolin, (2) de comparer l'efficacité de ce nouveau candidat vaccin à celle du bedinvetmab (Librela®), (3) de quantifier les concentrations en anticorps monoclonaux aux cours du temps après administration du candidat vaccin, (4) de vérifier que l'inhibition de la signalisation cellulaire médiée par le NGF ne perdure pas quand une nouvelle douleur apparait à distance de la vaccination.

Bénéfices attendus

L'arthrose est un maladie dégénérative, incurable et douloureuse dont la prévalence chez le chien est supérieure à 20%. Ce chiffre est par ailleurs en constante augmentation du fait de l'allongement de la durée de vie des animaux et de facteurs aggravants comme l'obésité. Cette pathologie entraine une douleur et un handicap majeur avec perte de mobilité et état dépressif de l'animal. Les premiers résultats des thérapies impliquant des anticorps monoclonaux sont prometteurs quand à l'amélioration de la qualité de vie de nos animaux. Cependant, la nécessité de renouveller les administrations de bedinvetmab régulièrement (en général tous les mois) présente le risque d'une mauvaise observance par le propriétaire de l'animal. Il est intéressant de déterminer ici si la mise en place d'un vaccin permettant l'activation d'anticorps endogènes pourrait permettre de prolonger la durée d'efficacité du traitement et d'espacer les administrations.

Procédures

1) Administration du candidat vaccin ou du placebo à 14 animaux; 2 administrations; 1 minute maximum; 2) Administration du bedinvetmab ou de meloxicam à 14 animaux; 1 seule administration; 1 minute maximum; 3) Prélèvements sanguins pour sérologie; 3 prélèvements sur 14 animaux et 8 prélèvements sur les 14 autres animaux; 1 minute maximum; 4) Administration de kaolin en sous-cutanée sous anesthésie générale; 1 seule fois pour 14 animaux et 2 fois pour les 14 autres animaux; 30 minutes/animal; 5) Pesée hebdomadaire de tous les animaux; 5 à 10 minutes/animal; 6) Mesures des paramètres pharmacodynamiques; 1h/jour/animal au minimum pour chaque jour de mesure.

Impact sur les animaux

Vu les très bons résultats d'innocuité obtenus après administration d'anticorps monoclonaux exogènes, il y a très peu de risque de réaction au vaccin. La nuisance majeure va résider dans la création d'une inflammation à la patte par administration de kaolin en sous-cutanée. Cependant, ce modèle a déjà été utilisé par la passé et présente l'avantage d'induire une inflammation limitée dans le temps et totalement réversible, ce qui permet de replacer les chiens sans sequelles après ce type d'étude. En effet, le pic de douleur survient autour de 24h après l'administration de kaolin. Cette douleur plus aiguë disparaît ensuite rapidement (autour de 48-72h) même lors d'un traitement placebo. Des paramètres moins critiques comme une diminution d'oedème au niveau de la patte (altérant peu les déplacements du chien mais permettant tout de même de mesurer l'efficacité d'un anti-inflammatoire) perdurent ensuite jusqu'à 10-15 jours après l'administration de kaolin. Enfin, le modèle est complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens. Il est à noter également que le candidat vaccin étant administré avant induction de l'inflammation, le pic de douleur devrait être plus faible pour ce groupe.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure. Ils pourront être réutilisés pour des travaux d'enseignement (procédures légères) après accord du vétérinaire référent de l'Etablissement Utilisateur ou seront proposés à l'adoption. Le modèle étant complétement réversible au bout de 8 semaines sans séquelle pour les chiens, la réutilisation ou le placement des animaux pourra intervenir dès les 2 mois suivant la dernière inflammation au kaolin.

Remplacement

Le but de ce projet étant de tester la réponse de l'organisme entier à un vaccin (efficacité contre une douleur inflammatoire, cinétique d'anticorps, absence de réaction au vaccin), il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. Cependant, les études sont menées sur l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché.

Réduction

Nous souhaitons déterminer si le nouveau candidat vaccin est au moins aussi efficace que le bedinvetmab pour réduire une douleur d'origine inflammatoire chez le chien. Pour déterminer le nombre n d'animaux par groupe, un calcul de puissance a été donc effectué à partir de données de la littérature sur l'effet du bedinvetmab sur la réduction de la douleur chez des chiens atteints d'ostéoarthrose. Le calcul de puissance utilisé était le suivant: nA=2x(s2/Δ2)x(za/2-zpuis)2, avec nA le nombre de sujets par groupe, s2 la variance du paramètre à mesurer, Δ la différence minimale attendue pour ce paramètre, zα/2=1.96, zpuis=-0.842. De plus, la résistance à/la sensation de douleur étant un paramètre qui peut être influencé par le sexe, le nombre d'animaux par groupe a été doublé afin d'avoir n mâles et n femelles dans chaque groupe. Enfin, un animal par groupe a été ajouté au cas où un des animaux devrait être exclu de l'étude pour cause de traitement concomitant visant à réduire une douleur trop importante causée par l'administration de kaolin.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés aux conditions du laboratoire puis entraînés aux manipulations pendant 25 jours avant l'administration du vaccin, et le seront aussi entre l'administration du vaccin et la réalisation de l'inflammation. Cela permettra de les habituer en douceur aux différents manipulateurs et d'obtenir des mesures de paramètres fiables tout au long du projet. De plus, les deux principaux expérimentateurs qui seront en charge des animaux tout au long du projet sont formés en éducation canine ainsi qu'aux différentes techniques de medical training. Les animaux seront hébergés en groupe dans des boxs comportant des jouets et auront accès quotidiennement à des courettes extérieures.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est l'espèce cible pour laquelle le vaccin souhaite être mis sur le marché. Les animaux seront âgés de 8 mois à leur arrivée, leur jeune âge facilitant leur capacité d'apprentissage et d'entrainement aux différentes mesures qui seront effectuées. Il ne faut pas d'animaux de moins de 6 mois car leur système immunitaire n'est pas encore totalement mature et différe trop de celui des chiens adultes voire plutôt âgés pour lesquels le vaccin souhaite être développé. L'étude sur des animaux âgés ou souffrant de problèmes ostéoarticulaires sera effectué par la suite en fonction des résultats obtenus au cours de ce projet.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.