Recherche appliquée

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une septicémie leur est provoquée par injection intrapéritonéale de matière fécale, puis un candidat médicament est testé, avec cinq batteries de tests comportementaux mesurant force musculaire, équilibre, résistance à l'effort, exploration, dépression et mémoire. Le porteur indique une perte de poids et une chute de température attendues, une variation de deux degrés ou de 15 % du poids déclenchant la mise à mort. Il affirme qu'aucun essai sur culture cellulaire ne peut remplacer ce modèle pour évaluer l'efficacité des molécules.

Objectifs

L'objectif scientifique de l'étude est d'évaluer l'amélioration (ou l'absence d'amélioration) des capacités de récupération physiques, mentales et comportementales des souris suite à une septicémie grâce à un traitement pharmaceutique. La septicémie sera induite par injection intra-péritonéale de matière fécale. Nous pourrons également étudier, à différents temps, l'infiltration des cellules (quantification et identification des sous-populations leucocytaires) dans le péritoine après lavage de la cavité. Le sang et d'autres organes seront également prélevés en fonction des demandes du sponsor pour quantifier la synthèse de médiateurs cytokiniques ou lipidiques, telles que les lipoxines ou les résolvines. Le poids, le comportement et les capacités physiques des animaux seront évalués en fonction de la demande du sponsor tout au long de l’étude. Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un composé pharmaceutique à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus vont permettre d’étayer les mécanismes cellulaires et moléculaires fins controlant l’inflammation et sa résolution. L’étude de ces différents paramètres va également fournir des indications sur l’efficacité d’un médicament à mieux induire ou au contraire inhiber la résolution en association avec les capacitées physiques, mentales et comportementales des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées sur animaux vigiles pour l'induction de la septicémie (1) et le traitement de celle-ci (1 injection intra-péritonéale à 24h, 48, 72h post-induction et 1 injection sous-cutanée à 24h, 48h, 72h post-induction). Les animaux pourront être soumis selon la demande du sponsor à une procédure de gavage journalière pour l'administration du composé si besoin lors de l'étude principale. L'évaluation physique, mentale et comportementale des animaux sera réalisée à l'aide de 5 procédures de tests comportementaux standardisées selon les recommandations de la plateforme partenaire. Ces tests permettront d'évaluer la récupération physique des souris grâce aux 3 tests comportementaux physiques mesurant respectivement la force musculaire des 4 pattes, l'équilibre des souris et la résistance à l'effort. Et la récupération mentale grâce aux tests cognitifs et comportementaux, mesurant respectivement, entre autre, la capacité d'exploration des souris, la dépression et la mémoire. L'ensemble de la procédure durera 14 semaines, 7 pour l'étude pilote et 7 pour l'étude principale.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont une perte de poids et une baisse de la température corporelle. C'est pourquoi les souris seront surveillées toutes les 2 heures pendant 8h post induction, puis 2 fois par jour les jours suivants. La température corporelle ainsi que le poids des souris seront évalués quotidiennement. Une variation de 2 degrés de la température initiale et de 15% du poids de la souris entrainera la mise à mort des animaux concernés. Durant la septisémie induite par injection de matière fécale, les animaux seront traités 24h, 48h et 72h après injection par un antibiotique injecté en intrapéritonéal et une réhydratation par voie sous cutanée sera réalisée. De plus, on reportera l'aspect général de l'animal sous la forme d’un score prédictif de la douleur.

Devenir

A l'issue de l'ensemble du projet les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier les composés de l'inflammation et de la résolution de l'inflammation présent dans la plasma des animaux.

Remplacement

Le remplacement de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible dans ce modèle. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Au sein de cette étude, nous avons réduis le nombre d'animaux utilisés en utilisant un nombre très proche du nombre minimal de 15 nécessaire à une étude statistique.

Raffinement

Des soins et une observation accrue aux animaux suite à l'induction des maladies seront apportés, ceux ci comprennent une aide à l'alimentation et à la réhydratation. Ces pathologies étant basées sur l'inflammation, un traitement pharmacologique visant à réduire la souffrance de l'animal ne pourra être envisagé sans compromettre les résultats de l'étude. L'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon des critères d'apparence physique et comportementaux selon le tableau détaillé dans le paragraphe 3.4. L'enrichissement pourra être augmenté si nécessaire par l'ajout surnuméraire d'enrichissment.

Choix des espèces

La souris est largement décrite pour être une espèce de choix dans ce modèle compte tenu des outils cellulaires et moléculaires existants. La majorité des expériences seront réalisées chez la souris C57BL/6 fonction des souhaits des sponsors. Ce modèle a déjà été utilisé dans des publications similaires étudiant la récupération physique et le comportement des animaux suite à une septicémie. Ce modèle répond parfaitement au besoin scientifique du projet qui est d'évaluer l'effet de la molécule du sponsor sur la récupération physique et comportementale des animaux suite à une septicémie. Les animaux utilisés seront adultes (7-12 semaines) car il est nécessaire que leur système de défense immunitaire soit mature. Selon demande du sponsor, nous utiliserons des animaux plus agés (10-14 semaines).

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur nerf sciatique est sectionné puis suturé, avant l'application locale ou l'injection de tacrolimus pour tester la régénération nerveuse, avec un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Le porteur indique que la section du nerf peut entraîner l'automutilation de la patte et que le tacrolimus peut provoquer perte de poids, léthargie et diarrhée, les rats perdant 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut se substituer à ces travaux, les études ex vivo ne reproduisant pas les propriétés d'un "organe entier".

Objectifs

Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt du Tacrolimus (molécule immunosuppressive, avec de potentielles propriétés de régénération des nerfs) sur la régénération des nerfs périphériques après lésion. L'objectif est d'évaluer la réparation du nerf sciatique (après section transversale) chez le rat après suture et (a) application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) injection sous-cutanée d'une solution de Tacrolimus. Cette évaluation sera réalisée pendant une période maximale de 12 mois (période de suivi des animaux après chirurgie), et permettra de mettre en évidence l’intérêt d’une délivrance locale et prolongée du Tacrolimus sur la régénération des nerfs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider au niveau préclinique que la délivrance locale prolongée de Tacrolimus a un effet supérieur à son administration sous-cutanée répétée pour la régénération des nerfs périphériques. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement d’un traitement local pour la régénération des nerfs, dans un modèle rongeur de section et réparation du nerf adapté aux cas cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure : Après anesthésie et analgésie de l'animal, le nerf sciatique sera sectionné puis réparé par suture épineurale. Ensuite, chaque animal recevra soit (a) une application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) une injection sous-cutanée journalière d'une solution de Tacrolimus pendant un mois (injection sous-cutanée ou délivrance du Tacrolimus à l’aide d’une pompe osmotique). La durée de la procédure chirurgicale sera d’environ 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’automutilation de la patte lésée est un effet indésirable potentiel résultant de la section du nerf sciatique chez le rat. Néanmoins, l’automutilation apparait à court terme (dans un délai de quelques jours après chirurgie) ainsi que potentiellement à 1 mois après chirurgie (en cas d’absence de sensation de la patte, due à une absence de régénération de l’influx nerveux). Par la suite, l’arrêt de l’automutilation permet la bonne cicatrisation de la patte et donc de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude. Aussi, compte tenu de la forte activité du Tacrolimus, les animaux pourraient manifester des signes de perte de poids, malaise, léthargie et/ou perte de poils, typiquement associés à l'administration systémique de Tacrolimus. De plus, les animaux seront surveillés pour tout signe de diarrhée et de déshydratation. Toutefois, le suivi quotidien des animaux ainsi que la complémentation de leur alimentation permettront de prendre toute disposition afin de palier à de tels événements et de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L'absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la SBEA, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la DDPP.

Remplacement

Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité du Tacrolimus pour la régénération du nerf sciatique et permettra son développement optimal pour la clinique

Réduction

Le nombre d’animaux (200) a été rationnalisé au maximum en tenant compte des analyses statistiques qui seront effectuées. Aussi, le nombre d’animaux par groupe (10) a été défini en se basant sur les études faites en interne, pour lesquelles 10 animaux par groupe ont été/sont considérés. Ce nombre tient compte des mutilations engendrés par l’animal lui-même suite à la chirurgie (perte de sensation dans la patte ; effets secondaires documentés pour toute lignée de rats), ainsi que d’une éventuelle mortalité lors de la chirurgie

Raffinement

Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des boules et/ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. À la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systématique sera administré. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20% par rapport au poids maximum mesuré ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 200.

Choix des espèces

L'utilisation d'un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des nerfs périphériques. De plus, la composition de la matrice extracellulaire des humains et rongeurs est très similaire pour plusieurs organes. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l'étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Les animaux seront bagués sur l'oreille dès leur arrivée dans l'animalerie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq injections hebdomadaires d'un agent chimique, l'HOCl, provoquant une fibrose de la peau et des poumons, ainsi que des injections d'un traitement testé, avant prélèvement du sang, de la peau, des poumons et de la rate. Le porteur décrit des effets possibles de gêne respiratoire et de rigidification cutanée, tout en affirmant n'attendre "aucun signe clinique majeur". Le modèle induit une sclérodermie systémique pour évaluer un candidat thérapeutique.

Objectifs

Les résultats obtenus sur un modèle de fibrose de peau ex vivo montrent qu’en plus de son action anti-inflammatoire, le surnageant de HuMoSC serait efficace dans le traitement de la fibrose. L’objectif de ce projet est de compléter et de confirmer l’intérêt thérapeutique du surnageant de HuMoSC, dans un modèle de fibrose induite par l’injection d’HOCl chez la souris.

Bénéfices attendus

En s’appuyant sur les résultats de nos précédentes études et après avoir identifié la meilleure posologie concernant l’administration du surnageant de HuMoSC, nous pouvons nous attendre à une diminution de l’inflammation ainsi qu’une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire induite par l’HOCl. Aucun traitement curatif n’existe aujourd’hui pour les patients atteints de ScS et la réduction de la fibrose reste un enjeu thérapeutique majeur puisqu’elle représente la principale cause de décès des patients.

Procédures

Les animaux recevront 5 injections d’HOCl en intradermique par semaine durant toute la durée de l’étude, ainsi que 3 injections de surnageant de HuMoSC en sous cutané, par semaine, durant 3 semaines. La fréquence des injections de surnageant de HuMoSC pourra être augmentée jusqu’à 5 fois par semaine, selon les résultats obtenus lors de la première phase de mise au point. L’épaisseur de la peau des souris pourra être mesurée 2 fois par semaine maximum, à l’aide d’un pied à coulisse. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ni aucune procédure chirurgicale ne sont prévus dans cette étude.

Impact sur les animaux

Les éventuels effets indésirables sont les suivants : - Risque de lésions au niveau du site d’injection de l’HOCl - Légère difficulté respiratoire possible dû à la fibrose pulmonaire - Légère fatigue possible en lien avec l’inflammation - Inconfort lié à la rigidification de la peau en bas du dos (localisé) - Stress induit par les injections répétées Aucun effet indésirable n’est décrit dans la littérature, il n’y a donc pas de signe clinique majeur attendu.

Devenir

A l’issue de la procédure, c’est-à-dire au bout des 6 semaines d’expérimentation, les animaux seront sacrifiés. Leur sang, la peau, les poumons ainsi que la rate seront prélevés. La régression de la fibrose sera évaluée en comparant les souris traitées avec du surnageant de HuMoSC et celles avec du sérum physiologique.

Remplacement

Nous avons en amont étudié l’effet du surnageant de HuMoSC sur un modèle in vitro de fibrose. Ces résultats préliminaires sont prometteurs et nous incitent à passer dans un modèle plus complet. De nombreux articles scientifiques ont démontré que les injections d’HOCl permettent de mimer chez la souris ce qu’il se passe chez les patients atteints de ScS. Les modèles in vitro disponibles ne permettent pas de reproduire fidèlement la physiopathologie complexe de cette maladie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en diminuant au maximum la taille des groupes sans négliger quelques étapes de mise au point pour adapter la meilleure posologie du traitement.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe afin de pouvoir exprimer leur comportement social naturel. Pour leur bien-être les cages comprennent des éléments d’enrichissements (tunnels, nids). Une période d’acclimatation est prévue pour réduire le stress des animaux (arrivée dans les locaux, manipulations régulières…) ainsi qu’un suivi quotidien de l’état général des animaux. La douleur sera anticipée au maximum par l’application d’un gel anesthésiant sur la peau avant les injections. Néanmoins, si l’animal manifeste de la douleur, celle-ci sera immédiatement prise en charge par un traitement médicamenteux.

Choix des espèces

L’espèce choisie est la souris BALB/c. Nous utiliserons de jeunes souris femelles adultes, âgées de 6 semaines. Dans ce modèle, les injections d’HOCl permettent d’obtenir des effets similaires (inflammation et fibrose) à ceux que l’on retrouve chez les patients atteints de sclérodermie systémique. Ce modèle est largement documenté dans la littérature