Recherche appliquée

Dès qu'une souris présente des signes importants de souffrance, elle est mise à mort : c'est le critère d'arrêt annoncé pour 14 730 souris infectées par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'aucune réutilisation ni remise en liberté n'est envisageable après exposition à des agents pathogènes. Les infections provoquent perte de poids, posture voûtée, hypothermie et déshydratation, et pour certaines atteintes fongiques du cerveau des troubles de la coordination et des mouvements anormaux, sur des souris pesées et traitées plusieurs fois par jour. Ces effectifs servent à cribler des candidats médicaments et à ajuster des schémas d'administration, une activité de sélection étalée sur cinq ans.

Objectifs

Le projet a pour objectif de développer et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques destinées au traitement des infections systémiques d’origine bactérienne ou fongique. Ces infections, souvent graves, peuvent évoluer rapidement et entraîner des complications importantes. Le développement de nouvelles options thérapeutiques est donc essentiel, en particulier dans un contexte d’augmentation des résistances aux traitements actuels. Dans ce cadre, des modèles murins d’infection systémique sont utilisés afin d’étudier l’efficacité de candidats thérapeutiques dans des conditions se rapprochant le plus possible de celles observées chez l’Homme. Ces modèles permettent d’évaluer la capacité des traitements à réduire la charge infectieuse, à limiter la propagation des agents pathogènes dans l’organisme et à améliorer l’état général. Le projet comprend plusieurs étapes complémentaires. Dans un premier temps, des modèles expérimentaux sont développés et optimisés afin de garantir leur fiabilité et leur reproductibilité. Dans un second temps, ces modèles sont utilisés pour tester différents composés, en mesurant leur efficacité et leur comportement dans l’organisme (distribution, durée d’action). Ces données permettent d’identifier les candidats les plus prometteurs et d’adapter les schémas d’administration. Les résultats attendus à court terme sont la sélection de composés présentant une activité thérapeutique significative. À moyen terme, ils permettent de mieux comprendre les relations entre la dose administrée et l’effet observé, afin d’optimiser les traitements. À long terme, ce projet contribue au développement de nouveaux médicaments susceptibles d’être évalués chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des infections systémiques d’origine bactérienne ou fongique, qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Ces infections peuvent être graves et difficiles à traiter, notamment en raison de l’augmentation des résistances aux traitements existants. À court terme, ce projet permet d’identifier et de sélectionner des candidats thérapeutiques prometteurs en évaluant leur capacité à réduire la présence des agents infectieux dans l’organisme et à limiter leur dissémination vers différents organes. Ces résultats contribuent à orienter les choix de développement des composés les plus efficaces. À moyen terme, les données générées permettent de mieux comprendre le lien entre la dose administrée, la distribution du traitement dans l’organisme et son effet thérapeutique. Cela contribue à optimiser les schémas d’administration et à améliorer l’efficacité des traitements étudiés. À long terme, ce projet participe au développement de nouvelles options thérapeutiques susceptibles d’être évaluées chez l’Homme. Il contribue ainsi à améliorer la prise en charge des infections systémiques, en particulier dans des situations où les traitements disponibles sont limités ou moins efficaces.

Procédures

Dans le cadre du projet, les animaux sont soumis à différentes interventions nécessaires à l’induction de l’infection, à l’administration des traitements et au suivi des paramètres biologiques. Les principales interventions incluent : • la pesée des animaux (plusieurs fois par jour, environ 30 secondes, sur animal vigile), • l’administration de composés (une à plusieurs fois par jour selon le protocole, environ 30 secondes à 2 minutes selon la voie), par voie orale (gavage), sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire ou intradermique. • l’inoculation de l’agent infectieux (1 fois, environ 30 secondes), réalisée par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée • des prélèvements sanguins de faible volume (environ 30 secondes), réalisés sur animal vigile ou anesthésié selon la fréquence et la technique, dans le respect des limites réglementaires. Dans certaines procédures spécifiques, des animaux peuvent être utilisés porteurs de cathéters implantés en amont par le fournisseur. Dans ce cas, des manipulations liées au maintien du dispositif (vérification, rinçage) sont réalisées par du personnel formé afin d’assurer son bon fonctionnement. La fréquence des interventions varie selon les objectifs de l’étude (évaluation de la charge infectieuse, paramètres pharmacocinétiques/pharmacodynamiques). Les procédures aiguës sont de courte durée (jusqu’à 3 jours), tandis que les modèles subaigus peuvent s’étendre jusqu’à 14 jours. L’ensemble des interventions est réalisé par du personnel qualifié, dans des conditions adaptées, afin de limiter la durée de contention, le stress et l’inconfort des animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en œuvre dans ce projet peuvent entraîner chez les animaux une altération légère à modérée de l’état général, principalement en lien avec l’infection systémique induite. Les effets observés peuvent inclure une perte de poids, une diminution de l’activité, une posture voûtée, un pelage modifié et une réduction de la prise alimentaire. Selon la progression de l’infection, des signes supplémentaires peuvent apparaître tels qu’une hypothermie, une déshydratation ou une fatigue accrue. Certains agents infectieux peuvent entraîner des effets spécifiques. Par exemple, certaines infections fongiques peuvent provoquer une atteinte de certains organes, comme le cerveau. Dans ce dernier cas, des signes neurologiques modérés tels que des troubles de coordination ou des mouvements anormaux peuvent être observés. Les manipulations nécessaires à l’étude peuvent également générer un inconfort temporaire. Les injections, prélèvements sanguins et manipulations répétées peuvent entraîner un stress lié à la contention, ainsi qu’une gêne ou une douleur locale de faible intensité. Dans le cadre de certaines études, l’utilisation d’animaux porteurs de cathéters peut également être associée à des effets locaux au niveau du site d’implantation (irritation ou inflammation). Lorsque des traitements modifiant le système immunitaire sont administrés, ils peuvent induire des effets transitoires tels qu’une perte de poids ou une diminution de l’état général. L’ensemble de ces effets reste généralement limité dans le temps et de sévérité légère à modérée grâce à une surveillance clinique rapprochée, à la mise en place de mesures de soutien et à l’application de critères d’arrêt précoces.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux sont systématiquement mis à mort. Aucune réutilisation, remise en liberté ou maintien en vie après la procédure n’est envisageable. En effet, les animaux ont été exposés à des agents infectieux potentiellement pathogènes et les procédures impliquent généralement des atteintes physiologiques incompatibles avec une récupération complète dans des conditions garantissant leur bien être. Le recours à la mise à mort permet également la réalisation de prélèvements terminales indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Cette approche garantit à la fois la qualité des données générées et le respect des exigences en matière de bien être animal, en évitant toute utilisation ultérieure inappropriée des animaux.

Remplacement

Avant de recourir à l’utilisation d’animaux, des méthodes alternatives sont systématiquement mises en œuvre afin de limiter leur utilisation. Les molécules testées sont d’abord étudiées en laboratoire, en dehors de l’organisme, grâce à des tests réalisés sur des micro organismes (bactéries ou champignons) et des cellules. Ces approches permettent de vérifier si les candidats traitements sont susceptibles d’être efficaces et d’éliminer ceux qui ne présentent pas d’intérêt. Des modèles informatiques et des analyses de données existantes sont également utilisés pour mieux comprendre le comportement des médicaments et sélectionner les doses appropriées avant toute expérimentation animale. Ces méthodes permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés en ne testant que les molécules les plus prometteuses. Elles sont systématiquement privilégiées dès que cela est possible. Cependant, certaines questions scientifiques ne peuvent pas être étudiées sans recourir à un organisme entier. Les infections étudiées impliquent des interactions complexes entre l’agent infectieux et l’ensemble de l’organisme, notamment la circulation du pathogène dans différents organes et la réponse globale de l’organisme. À ce jour, ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal reste donc nécessaire dans certaines situations, mais il est limité au strict nécessaire, et uniquement lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire grâce à plusieurs mesures mises en place dès la conception des études. Avant toute expérimentation, les chercheurs s’appuient sur les données déjà disponibles (littérature scientifique, résultats internes) afin d’éviter de répéter des études déjà réalisées. Des tests préalables en laboratoire permettent également d’identifier les conditions les plus adaptées avant d’utiliser des animaux. Les modèles sont d’abord optimisés avec un nombre réduit d’animaux afin de définir précisément les paramètres expérimentaux (dose d’infection, durée de l’étude). Ces informations permettent ensuite de concevoir les études de manière plus efficace et d’éviter d’avoir à les répéter. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Par ailleurs, les études sont organisées de manière à limiter le nombre de manipulations réalisées sur chaque animal. Lorsque les besoins expérimentaux sont importants, des groupes distincts d’animaux (appelés cohortes) sont utilisés afin d’éviter d’imposer un trop grand nombre de prélèvements ou d’injections à un même animal. Enfin, plusieurs types de données (par exemple observations cliniques et mesures biologiques) sont recueillis chez un même animal lorsque cela est possible, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. L’ensemble de ces approches permet de concilier la qualité scientifique des résultats avec une utilisation raisonnée et limitée des animaux.

Raffinement

Le projet met en œuvre différentes mesures afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long des études. Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées et contrôlées, avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification, abris, tunnels) qui favorise leur bien être et leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils sont acclimatés avant toute expérimentation afin de réduire le stress lié au changement d’environnement. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour limiter l’inconfort et la durée de contention. Lorsque cela est nécessaire, une anesthésie est utilisée pour certaines procédures. Des traitements contre la douleur peuvent également être administrés si des signes de gêne apparaissent. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière (plusieurs fois par jour) afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Des grilles de suivi permet d’évaluer leur état de manière objective. Des mesures de soutien sont mises en place en cas de besoin, comme l’apport d’eau ou de nourriture facile d’accès, ou un environnement chauffé si les animaux présentent des signes de fragilité. Des critères d’arrêt précoces sont définis : dès qu’un animal présente des signes importants de souffrance, il est pris en charge ou mis à mort afin d’éviter toute dégradation de son état. Enfin, l’organisation des études permet de limiter le nombre de manipulations par animal, notamment grâce à l’utilisation de groupes distincts lorsque nécessaire. L’ensemble de ces mesures permet de réduire autant que possible l’impact des procédures sur les animaux tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie pour ce projet car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche médicale. Elle permet d’étudier de manière fiable le développement des infections et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme entier. De nombreuses connaissances scientifiques existent déjà sur ce modèle, ce qui facilite l’interprétation des résultats et permet de limiter la répétition d’expériences. L’organisme de la souris présente des similitudes importantes avec celui de l’Homme pour l’étude des infections, notamment en ce qui concerne la manière dont les agents infectieux se propagent dans le corps et la façon dont l’organisme réagit. Cela en fait un outil pertinent pour améliorer les connaissances et développer de nouveaux traitements. Les animaux utilisés sont des adultes. Ce choix permet de travailler sur un organisme dont les fonctions sont totalement développées et stables, ce qui garantit des résultats plus fiables et reproductibles. Chez les adultes, le système immunitaire et les caractéristiques physiologiques sont mieux établis, ce qui est essentiel pour étudier correctement les infections. Ce choix d’espèce et de stade de développement permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en utilisant le modèle le plus adapté et le mieux caractérisé.

Jusqu'à quatre-vingts administrations d'antibiotique par animal, une à deux fois par jour pendant deux mois : 5 604 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour compter les bactéries dans leurs organes. Elles sont d'abord infectées sous anesthésie par Mycobacterium abscessus ou Mycobacterium avium, le porteur cherchant à contourner l'élimination spontanée des bactéries par un "artifice" destiné à créer une infection chronique. L'infection provoque une perte de poids, et les administrations répétées peuvent causer microlésions, irritations et fausses routes. Sur le remplacement, le porteur affirme que le recours à la souris "ne peut être remplacé", les tests in vitro ne servant selon lui qu'à sélectionner en amont les composés les plus actifs.

Objectifs

Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium sont des mycobactéries pathogènes opportunistes responsables d'infections pulmonaires chroniques. Pour mieux comprendre l'impact de l'hôte, des modèles précliniques sont indispensables. Les modèles murins actuellement utilisés pour évaluer de nouveaux traitements antibiotiques, concernent soit des animaux immunodéprimés, ce qui ne reflètent pas la majorité des patients, soit des animaux immunocompétents mais qui éliminent spontanément les bactéries. Afin de contourner cette élimination, nous souhaitons mettre au point un modèle murin d’infection par Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium. Cet artifice va permettre de créer une infection chronique ressemblant à celle observée chez les patients. Une fois notre nouveau modèle d'infection validé, la deuxième partie de notre projet consistera à tester des nouvelles molécules mises sur le marché dans le traitement des infections mycobactériennes. En effet, les antibiotiques utilisés actuellement pour traiter les infections à Mycobacterium avium sont limités et quasiment inexistants pour Mycobacterium abscessus. Les composés les plus actif seront sélectionnés dans un premier temps in vitro et seuls les composés les plus efficaces seront testés in vivo.

Bénéfices attendus

En France, l’incidence annuelle estimée des nouvelles infections à Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium dans les infections pulmonaires humaines est de 1 pour 100 000, avec une prévalence de 6 pour 100 000. Les dépenses annuelles liées à l’infection sont coûteuses (environ 25 000 euros chez les patients infectés par ces bactéries, contre 3500 euros chez les patients contrôles). Les infections pulmonaires à ces bactéries sont associées à une morbidité chronique importante, à des difficultés thérapeutiques ainsi qu’à un risque élevé de rechute, nécessitant des traitements prolongés et complexes. Notre projet vise ainsi à trouver de nouvelles molécules ou de nouvelles associations de molécules afin d’améliorer le traitement des infections à Mycobacterium abscessus et Mycobacterium avium et la prise en charge des patients. En effet, les antibiotiques utilisés actuellement pour traiter les infections à Mycobacterium avium sont limités et quasiment inexistants pour Mycobacterium abscessus.

Procédures

Pour induire la maladie, les animaux sous anesthésie générale seront infectés par la bactérie responsable (durée: entre 30 et 60 secondes par animal, fréquence: 1 fois). Les antibiotiques seront administrés aux animaux vigiles (durée: moins de 30 secondes par animal; fréquence 1 à 2 fois par jour sur 2 mois soit au maximum 80 administrations). Un prélèvement sanguin sera effectué sur un groupe restreint d'animaux (durée: moins de 30 secondes par animal; fréquence: 1 fois par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure pour prélèvements et analyses bactériologiques.

Impact sur les animaux

L'infection chronique par les bactéries peut entrainer une perte de poids modérée. L’anesthésie pourrait engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les manipulations des animaux lors des contentions effectuées aux différentes étapes pourraient induire un stress de courte durée. Les traitements effectués pourraient induire des microlésions, des irritations, une fausse route ou une douleur de courte durée aux animaux. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.

Devenir

Afin d'évaluer l'efficacité des molécules dans le traitement des infections à mycobactéries, tous les animaux seront euthanasiées par une méthode réglementaire à l'issu de la procédure afin de récupérer les organes d'intérêt pour évaluer les charges bactériologiques.

Remplacement

Les études dans le modèle murin sont un prérequis indispensable à la compréhension de la maladie humaine. Il s'agit d'une étape indispensable pour pouvoir affiner au mieux les stratégies thérapeutiques qui seront évaluées chez l'homme dans un essai incluant le moins de patients possible. Notre projet s'inscrit en amont des études d'activités d'antibiotiques chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé. Les composés les plus actifs seront sélectionnés dans un premier temps in vitro et seuls les composés les plus efficaces seront testés in vivo afin de réduire le nombre d’animaux.

Réduction

5604 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les composés à tester seront réduits aux plus actifs grâce aux test in vitro préalablement réalisés. Ainsi, afin de réduire le nombre d’animaux, seuls les composés les plus efficaces seront testés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum). Ils ont un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement par des personnes compétentes. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les animaux sont manipulés par des personnes compétentes ce qui favorise le bien-être des animaux. Pour les inoculations et les traitements, le matériel a été choisi afin qu’il soit le plus adapté à la taille des souris (le plus petit possible). Pour les traitements, la voie d’administration a été choisie afin d’être la plus physiologique possible afin de limiter les nuisances. L’anesthésie nécessaire lors de l’infection a été choisie pour minimiser la durée d’endormissement des animaux et une récupération rapide. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèle murin est actuellement le modèle de référence utilisé pour l'évaluation de l’activité des antibiotiques dans les infections à mycobactéries avant un essai clinique chez l'homme. Il est nécessaire de garder le même modèle pour obtenir des résultats reproductibles et éviter les doublons d’expériences. Les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure à 5 semaines après avoir observés une semaine d'acclimatation. Dans la littérature, les animaux utilisés dans d’autres infections mycobactériennes ont habituellement 4 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature, c’est pourquoi nous utiliserons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature et d’être reproductibles.

Les souris utilisées sont d'une souche fortement immunodéficiente, donc plus exposées aux infections opportunistes, et reçoivent en plus une chimiothérapie avant la greffe. 128 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse du sang et des tissus. Sous anesthésie générale, des supports contenant des cellules de patients atteints de syndrome myélodysplasique leur sont implantés sous la peau, et si la greffe ne prend pas, les cellules sont injectées directement dans l'os. Le porteur présente ce changement de souche comme une correction : la précédente, écrit-il, "ne nous a pas permis de reproduire correctement les résultats obtenus dans nos travaux antérieurs".

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité d’un nouveau traitement contre une maladie grave du sang appelée syndrome myélodysplasique. Ce traitement repose sur des cellules immunitaires modifiées (appelées CAR-T cells) capables de reconnaître et détruire les cellules malades. Pour cela, nous utilisons des souris dans lesquelles nous greffons des cellules humaines provenant soit de patients, soit de lignées cellulaires. Cela permet de reproduire la maladie humaine chez l’animal et d’évaluer si le traitement est efficace dans des conditions proches de celles rencontrées chez les patients. Cette demande correspond à la poursuite d’un projet déjà autorisé, avec deux améliorations importantes : l’utilisation d’un nouveau type de souris, mieux adapté à l’implantation de cellules humaines ; l’ajout d’un traitement léger avant la greffe, afin de faciliter l’installation des cellules humaines. Ces modifications sont nécessaires car le modèle utilisé précédemment ne nous a pas permis de reproduire correctement les résultats obtenus dans nos travaux antérieurs. L’objectif est donc d’améliorer la fiabilité du modèle, afin d’obtenir des résultats pertinents tout en évitant l’utilisation inutile d’animaux.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de confirmer l’efficacité d’un nouveau traitement d’immunothérapie contre les cellules cancéreuses responsables des syndromes myélodysplasiques, dans un modèle animal. L’efficacité de ce traitement a déjà été démontrée en laboratoire sur des cellules (in vitro). Cette étape supplémentaire chez l’animal est nécessaire pour vérifier que le traitement fonctionne également dans un organisme vivant, dans des conditions plus proches de la réalité. En cas de résultats positifs, ce travail pourrait permettre le développement d’un essai clinique chez l’Homme (phase 1), première étape vers une utilisation thérapeutique chez les patients.

Procédures

Ils recevront tout d’abord une injection de chimiothérapie (30 sec) afin de préparer l’organisme à la greffe de cellules humaines. Une intervention chirurgicale, réalisée sous anesthésie générale (20 min), permettra ensuite l’implantation sous la peau de supports contenant les cellules humaines. Si la greffe ne prend pas correctement, une procédure alternative pourra être réalisée, consistant en une injection de cellules directement dans l’os, également sous anesthésie générale (10 min). Les animaux recevront ensuite une injection du traitement étudié ou d’un traitement contrôle. Au cours du suivi, des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie brève. Des examens d’imagerie non invasive seront également effectués pour suivre l’évolution de la maladie et l’effet du traitement. À la fin de l’étude, les animaux seront mis à mort afin de permettre l’analyse des tissus.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont limitées et principalement liées aux différentes procédures expérimentales. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent entraîner une douleur légère et un stress transitoire lié à la manipulation des animaux. La procédure d’implantation sous la peau de supports contenant les cellules humaines et d’injection dans l’os (réalisée pour la greffe ou son contrôle) peut provoquer une douleur légère à modérée. Enfin, en raison de l’immunodéficience des souris utilisées, le développement de la maladie (prolifération de cellules tumorales humaines) est attendu au cours de l’étude. Cette immunodéficience entraine également une sensibilité plus importante aux infections et aux agents pathogènes opportunistes.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin d’étude est nécessaire pour permettre la réalisation d’analyses indispensables, notamment l’étude des cellules sanguines, l’évaluation de l’efficacité du traitement et l’analyse de certaines cibles biologiques. Ces données ne peuvent pas être obtenues autrement et sont essentielles pour interpréter correctement les résultats du projet. Cette étape est réalisée dans le respect des règles éthiques, sous anesthésie appropriée, afin de limiter au maximum la souffrance des animaux. Elle permet également de ne pas prolonger inutilement l’expérimentation.

Remplacement

À ce jour, il n’est pas possible de reproduire en laboratoire (in vitro) l’ensemble des mécanismes impliqués dans les syndromes myélodysplasiques, notamment les interactions complexes entre les cellules malades et leur environnement dans la moelle osseuse. Ces interactions sont essentielles pour évaluer correctement l’efficacité du traitement étudié. Elles ne peuvent pas être modélisées de manière fiable par des systèmes expérimentaux simplifiés ni par des approches informatiques ou mathématiques. Des expérimentations in vitro ont déjà été effectués en amont avec des résultats encourageants. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour étudier l’efficacité du traitement dans des conditions biologiques représentatives de la maladie humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été limité au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables sur le plan scientifique. Ce nombre a été déterminé à partir d’hypothèses statistiques et des tests d’analyse prévus. L’utilisation de souris immunodéprimées favorise l’implantation et le développement des cellules humaines greffées, ce qui augmente la fiabilité du modèle expérimental. Cette meilleure prise de greffe réduit le risque d’échec des expériences et permet ainsi de limiter le nombre total d’animaux nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. L’efficacité du traitement sera évaluée grâce à une technique d’imagerie permettant de suivre l’évolution de la maladie chez les animaux. Le critère principal sera la diminution du signal mesuré, reflétant la réduction des cellules malades sous l’effet du traitement. Nous attendons une diminution importante de ce signal chez les animaux traités par la molécule d’intérêt, en comparaison avec les groupes contrôles.

Raffinement

Certaines procédures réalisées dans le cadre du projet peuvent entraîner une gêne ou un stress modéré chez les animaux. Afin de limiter au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse, une surveillance attentive de leur état de santé sera assurée tout au long de l’étude, permettant une prise en charge rapide et adaptée dès l’apparition du moindre signe d’inconfort. Les interventions telles que l’injection de cellules humaines, les prélèvements médullaires et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale afin de réduire la douleur et le stress. Les aiguilles d'injection utilisées seront de taille 27 gauge en 13mm de long et seront changées entre chaque animal. Le projet sera conduit dans un établissement autorisé à l’expérimentation animale, par du personnel formé et qualifié. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, en environnement enrichi et stérile pour limiter l'impact de l'immunodépression des animaux, avec un suivi quotidien permettant d’identifier précocement les critères d’arrêt définis pour préserver leur bien-être. La mise à mort des animaux sera réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

La souche de souris utilisée dans ce projet est fortement immunodéficiente, ce qui permet l’implantation et le développement de cellules humaines. Cette caractéristique est indispensable pour établir un modèle de xénogreffe pertinent à partir d’échantillons issus de patients. Les animaux seront utilisés à un âge compris entre 8 et 10 semaines, correspondant à une période optimale pour ce type de greffe. En raison du délai nécessaire à l’implantation et au développement des cellules humaines (environ 1 à 3 mois), les injections doivent être réalisées précocement afin de garantir la réussite du modèle expérimental.

Greffées avec des adipocytes bruns, puis exposées jusqu'à quatre fois à une température de 4 degrés pendant vingt-quatre heures, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements sanguins répétés, des chirurgies sous anesthésie et un isolement pouvant durer deux semaines en cage métabolique. L'objet est de tester si une greffe de tissu adipeux brun corrige les troubles métaboliques et reproductifs du syndrome des ovaires polykystiques, que le porteur dit toucher 13 % des femmes en âge de procréer. Cent soixante femelles et cinquante-quatre mâles passent d'une procédure à l'autre et sont réutilisés pour les tests de fertilité avant d'être mis à mort, le porteur indiquant que le prélèvement des organes interdit de les garder en vie.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer les effets de la transplantation d’adipocytes bruns, obtenus à partir de tissu adipeux murin ou d'adipocytes bruns humains obtenus in vitro en 3 dimensions (BAToïdes), sur les altérations métaboliques, hormonales et reproductives associées au syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le SOPK est une pathologie fréquente, touchant environ 13 % des femmes en âge de procréer. Elle se caractérise par des troubles métaboliques, hormonaux et reproductifs, souvent associés à une altération de la qualité de vie. À ce jour, il n’existe pas de traitement curatif, et la prise en charge repose principalement sur des approches symptomatiques. L’objectif est de déterminer si cette approche de thérapie cellulaire permet de moduler les déséquilibres physiopathologiques observés dans cette pathologie, en particulier au niveau des interactions entre les systèmes métaboliques, endocrinien et reproducteur. Le recours à un modèle animal est indispensable à ce stade afin d’évaluer, dans un organisme entier, la faisabilité, la tolérance et les effets de cette approche. En effet, la complexité des interactions systémiques impliquées dans le SOPK ne peut pas être reproduite de manière fiable par des approches in vitro ou in silico. Cette étape préclinique constitue un préalable nécessaire à l’évaluation de la pertinence de cette stratégie dans une perspective translationnelle. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’explorer une stratégie innovante visant à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués et à identifier de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les troubles métaboliques et endocriniens, tels que ceux observés dans le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur prévalence, de leur impact sur la qualité de vie et des coûts socio-économiques associés. Le SOPK est notamment caractérisé par des altérations métaboliques (dont la résistance à l’insuline) et des dysfonctionnements de la reproduction, pour lesquels les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Dans ce contexte, ce projet vise à améliorer la compréhension des interactions entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur, en particulier le rôle du tissu adipeux brun dans la régulation de ces fonctions. En explorant les effets de la transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin pertinent de SOPK, ce travail permettra d’identifier de nouveaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette pathologie. Les connaissances générées pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles d’intervention et ouvrir des perspectives pour le développement de stratégies innovantes dans la prise en charge des troubles métaboliques et de la fertilité. Plus largement, ce projet s’inscrit dans les priorités actuelles de recherche en santé, notamment en lien avec la santé des femmes, et pourrait participer à l’amélioration de la prise en charge de pathologies chroniques ayant un impact important sur la qualité de vie et le bien-être à long terme.

Procédures

Pour l’ensemble des gestes décris dans les 3 procédures, nous aurons recours à l’utilisation d’anesthésiques (uniquement dans une procédure) et d’analgésiques aussi souvent que cela sera nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par voie gazeuse. Une injection d’analgésique adapté sera réalisée avant la chirurgie et/ou après si nécessaire. Les injections n’excèderont jamais 20 μl/g de poids corporel. Les animaux feront l'objet d'administration de traitements et de prélèvements selon les volumes et fréquences recommandées par la littérature et dans le respect de la réglementation en vigueur. Des prélèvements sanguins par différentes voies réalisés au cours des procédures de phénotypage seront effectués avec des fréquences et volumes inférieurs aux recommandations bibliographiques et à la réglementation en vigueur. Un isolement de maximum 2 semaines (sans rupture du lien olfactif ou visuel) sera nécessaire pour une partie des animaux afin de pouvoir mesurer des caractéristiques de manière individuelle.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations expérimentales sont susceptibles d’induire un stress, une fatigue ou un inconfort transitoire chez les animaux. Afin de limiter ces effets, l’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et compétent, et les animaux seront préalablement habitués aux manipulations. Certaines interventions, telles que les injections, les prélèvements sanguins ou les procédures chirurgicales, peuvent entraîner des douleurs de courte durée. Celles-ci seront systématiquement limitées par l’utilisation de protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés, ainsi que par une surveillance attentive des animaux pendant et après les interventions. Dans le cadre de certaines analyses, notamment en cages métaboliques, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant une durée limitée. Cet isolement sera restreint au strict nécessaire et réalisé dans des conditions permettant le maintien d’interactions sensorielles (contacts visuels, olfactifs et auditifs) avec les congénères, afin de réduire le stress associé. Plus généralement, une surveillance régulière de l’état général, du comportement et du poids des animaux sera mise en place tout au long du protocole, permettant d’identifier précocement tout signe de mal-être et d’adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Afin d’étudier l’influence de la température sur la réponse métabolique, les animaux seront exposés à une température de 4°C (atteinte progressivement) pour une durée maximale de 24h et sous surveillance constante. Cette exposition sera effectuée au maximum 4 fois.

Devenir

Les animaux décrits en procédure 1 seront transférés en procédure 2 ou 3 et seront mis à mort à la fin de ces dernières. Les 160 femelles et 54 mâles du projet seront réutilisés pour les tests de fertilité en procédure 3 puis seront mis à mort à l’issue de celle-ci. La nécessité de prélever les organes pour analyses ne nous permet pas de les garder en vie.

Remplacement

Dans la mesure du possible, des approches alternatives seront utilisées afin de réduire le recours à l’expérimentation animale. Celles-ci incluent notamment des cultures cellulaires, des modèles dérivés de cellules souches ainsi que des modèles tridimensionnels de type organoïdes ou adipocytes bruns différenciés in vitro. Dans le cadre de ce projet, des adipocytes bruns humains générés in vitro seront également utilisés afin de limiter le recours à des tissus animaux. Par ailleurs, certains tissus et cellules issus des animaux utilisés dans les procédures expérimentales pourront être exploités ex vivo pour la réalisation de cultures primaires et d’analyses fonctionnelles, permettant ainsi de réduire le nombre de composés et d’expérimentations complémentaires à réaliser in vivo. Cependant, l’étude des interactions complexes entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur dans le contexte du syndrome des ovaires polykystiques nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme entier. Les effets attendus de la transplantation d’adipocytes bruns sur le métabolisme, la fonction hormonale et la fertilité impliquent des communications multi-organes (tissu adipeux, cerveau, gonades, foie) qui ne peuvent actuellement pas être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro ou in silico. Bien que des modèles cellulaires et computationnels soient en cours de développement et puissent contribuer à certaines étapes exploratoires, ils ne permettent pas à ce jour de reproduire la complexité des régulations systémiques étudiées dans ce projet. Ainsi, le recours au modèle animal demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les connaissances générées pourront néanmoins contribuer au développement futur de modèles alternatifs et à la réduction progressive du recours à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’effectif de chaque groupe par procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques spécifiquesen tenant compte de (i) la définition de la taille minimale des groupes expérimentaux à utiliser pour obtenir des résultats probants, qui seront ajustés en fonction des différentes variables, elles-mêmes évaluées dans chaque expérience et (ii) la coordination des études à leur conception afin de permettre la collecte de plusieurs échantillons / tissus chez les mêmes individus ou d'entreprendre des analyses multiples chez des animaux individuels chaque fois que possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement définis par la réglementation. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). Les périodes d’isolement sont limitées, justifiées et un enrichissement adapté est apporté. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement, en portant l’attention aux différentes procédures expérimentales appliquées aux animaux afin de minimiser la peur, l'angoisse (ex: regroupement et enrichissement de l'environnement) ou la souffrance (ex : soins péri-opératoires, asepsie, anesthésie et analgésie) qu'ils pourraient endurer. Toutes les procédures potentiellement invasives sont réalisées sous anesthésie adaptée, associée à une analgésie préventive et postopératoire lorsque nécessaire, afin de prévenir toute douleur. Une observation continue des animaux est assurée jusqu’au réveil complet après toute intervention nécessitant une anesthésie. Par la suite, une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long des procédures expérimentales, incluant l’évaluation de l’activité, de la posture, de l’aspect du pelage, de la prise alimentaire et hydrique ainsi que du poids corporel. Des critères d’arrêt sont définis et appliqués. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre les différents organes afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé en physiologie intégrée, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. De plus, le modèle que nous utilisons dans ce projet est un modèle établi dans le laboratoire (présentant l’avantage d’une durée de gestation courte dans le cadre de notre étude) et validé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux. Des souris mâles et femelles seront utilisées à deux stades de développement correspondant aux greffes : P21 (post sevrage) et 6 semaines (jeunes adultes), afin d’évaluer l’impact du timing de transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin de SOPK.

Cinq chocs électriques de 0,4 mA et deux secondes, espacés d'une à deux minutes, sont infligés à chaque souris lors d'un test de conditionnement, après six semaines de gavage œsophagien quotidien. 360 souris porteuses de mutations liées à la myopathie de Duchenne sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme qu'"aucune souris n'a présenté de troubles suite à ce type d'intervention", à propos de tests qu'il décrit lui-même comme comprenant des stimuli anxiogènes et des chocs électriques, et dont il ne nomme que celui de conditionnement. Toutes sont tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et des muscles squelettiques.

Objectifs

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 naissances. En plus d’une dégradation progressive des muscles, des troubles cognitifs, comportementaux et neuropsychiatriques touchent une grande partie des patients. Les thérapies géniques développées pour traiter cette maladie ont des effets limités sur les troubles du comportement. Des études récentes suggèrent qu’une partie de ces déficits pourraient être compensés par des traitements anti-inflammatoires ou antioxydants. Ce projet a pour but de tester les effets d’un traitement anti-inflammatoire et antioxydant chez des souris modèles de cette maladie présentant des troubles comportementaux. Le projet est donc important pour le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le cerveau dans la DMD.

Bénéfices attendus

Les troubles comportementaux sont un symptôme commun des patients atteints de myopathie des souris modèles de cette maladie. Ce projet permettra de déterminer si les troubles comportementaux peuvent être améliorés par un traitement anti-inflammatoire. Ceci permettra de savoir s’il y a un bénéfice potentiel pour les patients à recevoir un traitement de type.

Procédures

Contention manuelle (10-15s) et gavage oesophagien (

Impact sur les animaux

La contention par la peau du cou et du dos peut provoquer une douleur de courte durée (10-15s) et un stress transitoire. Le gavage oesophagien peut également causer une douleur. Les souris seront plusieurs fois confrontées à des tests de comportement comprenant des stimuli stressants, ceci pendant une courte durée (5 min max) et une seule fois dans la journée, avec au moins 24h entre deux tests de ce type. Dans le test de conditionnement, les souris recevront 5 petits chocs électriques (0.4mA, 2s) espacés de 1 à 2 min.

Devenir

À la suite des expériences, les souris seront mises à mort pour prélèvements post-mortem du cerveau et muscles squelettiques.

Remplacement

Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles de cette maladie, chez lesquelles nous avons préalablement identifié les troubles comportementaux qui vont servir ici de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique donc d’effectuer des tests fonctionnels (comportementaux) qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et pouvant se comporter librement.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base des publications utilisant des méthodes similaires d’analyse du comportement, la réussite des expériences nécessite 15 souris par groupe. Les groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles non traités indispensables aux analyses statistiques. Notre étude, dans laquelle les souris seront soumises à plusieurs tests, permet de réduire le nombre total d’animaux. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.

Raffinement

Les tests comportementaux induisant de l’anxiété sont très courts (

Choix des espèces

D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les recherches pour cette maladie sont donc généralement menées sur ces souris, chez lesquelles nous avons préalablement identifié les troubles comportementaux qui vont servir à évaluer l’efficacité des traitements. Les traitements commenceront à l’âge de 6-8 semaines et le comportement évalué 4 semaines plus tard, donc vers l’âge de 3 mois. En effet, les phénotypes qui serviront de marqueurs pour tester l’efficacité des traitements ont été préalablement évalués à cet âge.

6 000 poulets de chair vont être utilisés, chacun pesé puis transféré à treize jours en cage individuelle ou collective, et privé de nourriture jusqu'à dix-huit heures d'affilée autour des trois jours de collecte des excréta. Ils sont tués entre vingt et vingt-quatre jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et le porteur écrit qu'ils le sont, "les prélèvements post mortem ne permettant pas de les revaloriser". L'hébergement en cage, individuel pour une partie d'entre eux, limite les interactions sociales, et la mise à jeun est décrite comme un stress métabolique modéré. La finalité est industrielle : mesurer la valeur nutritionnelle de matières premières et l'effet d'additifs sur la formulation des aliments, sur des souches identiques à celles des élevages commerciaux.

Objectifs

L'objectif principal du projet est d'évaluer la digestibilité de différentes matières premières et aliments destinés aux volailles de chair afin d'améliorer la connaissance de leur valeur nutritionnelle réelle et leur utilisation dans les formulations alimentaires. Le projet vise également à étudier l'effet de diverses solutions additives (enzymes, émulsifiants, probiotiques, acides organiques ou autres additifs nutritionnels) sur l'utilisation digestive des nutriments par les animaux. Les travaux permettront de quantifier l'impact de ces stratégies nutritionnelles sur la digestibilité de l'énergie, des protéines, des acides aminés, des lipides et d'autres constituants alimentaires d'intérêt. Les résultats obtenus contribueront à optimiser les performances zootechniques des volailles, à améliorer l'efficacité alimentaire et à réduire les rejets de nutriments dans l'environnement, participant ainsi au développement de systèmes de production plus durables et plus respectueux des ressources. Les évaluations seront réalisées à partir de mesures de digestibilité fécale et iléale, deux méthodes complémentaires permettant d'estimer précisément l'absorption des nutriments et de mieux comprendre leur utilisation par l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à produire des données fiables de la valeur nutritionnelle des matières premières et leurs interactions avec les additifs alimentaires afin d'améliorer la formulation des aliments pour volailles. Cette optimisation permet d'adapter plus précisément les apports nutritionnels aux besoins des animaux, d'améliorer l'efficacité alimentaire et de réduire les rejets dans l'environnement. Les données obtenues contribueront également au développement de méthodes alternatives et de modèles prédictifs de la digestibilité, offrant des outils de diagnostic directement utilisables en élevage. Enfin, le projet cherche à mieux comprendre les interactions entre l'alimentation, les fonctions digestives et le microbiote intestinal, afin d'identifier des stratégies de supplémentation innovantes favorisant une meilleure valorisation des ressources alimentaires, ainsi que la santé digestive et le bien-être des volailles.

Procédures

Jusqu'à l'âge de 13 jours, les animaux sont hébergés collectivement dans de grands parquets au sol. À l'âge de 13 jours, les animaux sont soumis à une mise à jeun de courte durée (2 à 4 heures), puis pesés individuellement afin d'être répartis en lots homogènes selon leur poids. Ils sont ensuite transférés dans des cages individuelles ou collectives, où ils sont hébergés pour phase d'adaptation aux logements et aux régimes alimentaires témoins et expérimentaux pendant 1 semaine. Cette phase est suivie d'une période de collecte des excréta de 3 jours (jours 21 à 23), encadrée d'une mise à jeun de 16 à 18 heures maximum. Les animaux sont pesés à nouveau à l'issue de cette période. Pendant toute la durée de l'étude, les consommations alimentaires ainsi que les principaux paramètres zootechniques (poids, gain de poids et indice de consommation) sont enregistrés. Les interventions sont limitées aux manipulations nécessaires au suivi expérimental et à la collecte des échantillons destinés aux analyses de digestibilité.

Impact sur les animaux

La mise à jeun nécessaire à la collecte des excreta induit un stress métabolique modéré, indispensable à la standardisation des conditions de mesure de la digestibilité. L'hébergement en cage, notamment individuel, limite temporairement les interactions sociales et certaines expressions comportementales. Enfin, les manipulations liées aux pesées et aux changements de logement peuvent entraîner un stress transitoire.

Devenir

Les animaux en fin de projet sont mis à mort, les prélèvements post mortem ne permettant pas de les revaloriser.

Remplacement

À ce jour, les méthodes alternatives disponibles, telles que les approches in vitro ou les modèles de simulation, sont qualifiées pour faire du screening et permettent de mettre en oeuvre des phases de pré-tests de l'efficacité de solutions de supplémentation mais elles ne permettent pas de reproduire fidèlement l'ensemble des interactions biologiques ni de prédire avec un niveau de fiabilité suffisant les réponses observées in vivo. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est nécessaire car la mesure de la digestibilité des matières premières et l'évaluation de l'efficacité des additifs alimentaires reposent sur l'étude de phénomènes physiologiques complexes impliquant l'ensemble du tractus digestif, les sécrétions endogènes, le microbiote intestinal, et les mécanismes d'absorption notamment.

Réduction

Le nombre d'animaux est déterminé de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables tout en respectant le principe de réduction. Il est calculé en tenant compte de la variabilité biologique des animaux et de la variabilité des analyses réalisées. Les effectifs sont définis à partir de données historiques afin de maintenir une faible variabilité expérimentale. Un effectif de 12 animaux par matière première ou traitement évalué a été identifié comme le minimum nécessaire pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux et les témoins, tout en permettant d'exclure d'éventuelles valeurs aberrantes sans compromettre la validité des résultats.

Raffinement

Les mesures sont réalisées chez des animaux âgés de 20 à 24 jours afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant leur maintien en élevage et les contraintes associées. Une période d'acclimatation d'une semaine est prévue après le transfert en cage afin de limiter le stress lié au changement de logement et d'alimentation. Les cages offrent un espace permettant l'expression des comportements naturels et des interactions sociales, et sont enrichies avec des objets et jouets stimulant les interactions animales et des tapis de fond de cages. Lors des phases de mise à jeun, l'intensité lumineuse est progressivement diminuée afin de réduire l'activité locomotrice et d'apaiser les animaux. Cette mesure permet de limiter les interactions entre congénères et les comportements liés à la recherche de nourriture, contribuant ainsi à améliorer le bien-être des poulets pendant cette période. Les animaux font l'objet d'une surveillance individuelle plusieurs fois par jour afin de détecter précocement tout signe d'inconfort ou de stress et de mettre en œuvre les mesures appropriées si nécessaire.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce est représentatif de l'espèce élevée dans les élevages d'animaux de rente. Ils sont donc issus de souches génétiquement identiques à celles des animaux en élevages commerciaux. Les bénéfices attendus tels que décrits dans ce projet seront ainsi directement applicables et utiles à l'amélioration des systèmes d'élevages. Au cours des premières semaines de développement du poussin, le tractus gastro-intestinal, les sécrétions enzymatiques digestives et le microbiote intestinal sont encore en phase de maturation. C'est à partir d'environ trois semaines d'âge que les principales fonctions digestives sont suffisamment stabilisées pour limiter cette variabilité et à la fois l'âge pivot d'intérêt zootechnique durant lequel l'efficacité d'utilisation des matières premières et des additifs nutritionnels constituent un enjeu majeur. Ainsi, le stade physiologique choisi pour la réalisation des mesures de digestibilité correspond à des poulets de chair âgés de 20 à 24 jours.

420 souris d'une lignée reproduisant la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal concerné reçoit une substance par voie orale puis subit trois prélèvements sanguins par incision, espacés d'une heure dans la même journée, séquence répétée à sept, dix et quinze mois. Les tests portent sur la mémoire sociale, la reconnaissance et la localisation d'objets et la mémoire spatiale, l'un d'eux obligeant la souris à nager quatre essais par jour pendant cinq jours. Tout cela pour mesurer les effets d'une roue d'exercice laissée en cage, que le porteur décrit comme une approche "simple et accessible".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer et, plus largement, certaines formes de vieillissement du cerveau s’accompagnent souvent d’une baisse progressive de la mémoire et d’autres capacités de réflexion. Aujourd’hui, les solutions thérapeutiques restent limitées. De nombreuses études chez l’humain et chez l’animal indiquent que l’activité physique est une approche simple et accessible, qui peut aider à préserver les fonctions cognitives. En revanche, comment l’exercice produit ces effets reste incompris, notamment via des mécanismes qui impliquent l’ensemble de l’organisme. Des travaux récents suggèrent que l’intestin pourrait jouer un rôle important dans la communication avec le cerveau. Les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) peuvent influencer des substances circulant dans le sang, qui à leur tour pourraient agir sur l’inflammation et sur certaines cellules du cerveau impliquées dans la protection et l’équilibre du tissu cérébral. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le lien entre activité physique, fonctionnement de l’intestin et évolution des troubles de la mémoire dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer. Plus précisément, nous voulons déterminer si l’exercice volontaire peut modifier des signaux venant de l’intestin et si ces changements sont associés à une meilleure préservation des fonctions de l’hippocampe (une région clé pour la mémoire). À terme, ce travail vise à identifier des pistes biologiques pouvant expliquer pourquoi certaines personnes résistent mieux que d’autres au déclin cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera d’abord des bénéfices scientifiques à court terme en améliorant la compréhension des liens entre l’intestin et le cerveau au cours de la maladie d’Alzheimer. Il cherchera à préciser comment les micro-organismes naturellement présents dans l’intestin (le microbiote) et certaines molécules circulant dans le sang peuvent influencer l’inflammation et le fonctionnement du cerveau, notamment dans une région essentielle pour la mémoire (l’hippocampe). Grâce à un suivi à plusieurs moments de l’évolution de la maladie et à des mesures complémentaires (tests de mémoire, analyse dans le sang, étude du microbiote, observation de cellules impliquées dans la défense du cerveau, et évaluation de dépôts caractéristiques de la maladie), l’étude pourra identifier des profils biologiques associés à une plus grande vulnérabilité, ou au contraire à une meilleure résistance du fonctionnement cognitif. Le projet évaluera aussi l’effet d’une intervention simple et accessible, l’activité physique volontaire, afin de déterminer si elle peut favoriser des changements bénéfiques du côté de l’intestin et du sang, et s’ils sont associés à une meilleure préservation de la mémoire. L’étude intégrera également des indicateurs du fonctionnement intestinal (par exemple le transit et la perméabilité), pour mieux comprendre le rôle possible de la barrière intestinale et de l’inflammation générale dans la communication intestin–cerveau. À plus long terme, l’identification et la mise à l’épreuve de molécules candidates pourrait aider à repérer des marqueurs de progression de la maladie ou de réponse à l’exercice, et ouvrir des pistes pour de futures stratégies de prévention ou d’accompagnement combinant hygiène de vie et actions ciblant le métabolisme.

Procédures

Certains animaux recevront une substance par voie orale, la procédure dure moins de 30 secondes et est réalisée sur animal vigile. Ces mêmes animaux auront 3 prélèvements sanguins espacés de 1h chacun, réalisés sur animal vigile sans anesthésie mais avec une analgésie locale, et ceci se répètera 3 fois à au moins 3 mois d'intervalle. Pour certains animaux 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus dans ce projet sont limités et seront surveillés tout au long de l'étude. Activité physique volontaire (roue en cage) : chez certains animaux, elle peut s'accompagner d'une légère diminution du poids, transitoire et d'intensité faible. Administration orale de substances : certains animaux recevront ponctuellement des substances par voie orale. La manipulation est brève (environ 15 secondes) et peut provoquer un inconfort ou un stress transitoire d'intensité légère lié à la contention. Prélèvements sanguins: ces prélèvements nécessitent une petite incision. Elle peut entraîner une douleur brève au moment du geste (environ 10 secondes) et une gêne locale temporaire d'intensité légère (petite plaie, sensibilité) jusqu'à cicatrisation, généralement en quelques jours. Chaque prélèvement est répété 3 fois dans la même journée à une heure d'intervalle. L'ensemble « administration orale + prélèvements » est réalisé à 7, 10 et 15 mois, avec plusieurs mois entre les séances, ce qui permet une cicatrisation complète et limite les effets cumulatifs. Tests comportementaux : ces tests peuvent générer un stress léger car ils reposent sur la nouveauté et l'exploration, mais ils sont de courte durée (sur 1 à 3 jours). Un des tests de mémorisation peut induire un stress modéré car l'animal doit nager ; le protocole est réparti sur 6 jours (4 essais/jour pendant 5 jours, puis 1 essai le 6ème jour).

Devenir

A la fin des procédures expérimentales, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des prélèvements terminaux indispensables pour répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Le projet a pour objectif d’étudier, chez l’animal, l’effet d’une activité physique volontaire puis de l’administration de certaines molécules d’intérêt sur l’évolution de troubles de la mémoire et sur la communication entre l’intestin et le cerveau dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer. Une partie essentielle du projet repose sur l’évaluation de capacités complexes (mémoire sociale, reconnaissance/localisation d’objet, apprentissage et mémoire spatiale). Ces fonctions ne peuvent pas être mesurées de façon pertinente avec des méthodes sans animal (cellules en culture, tissus isolés, ou modèles informatiques). De plus, l’étude porte sur des interactions entre plusieurs organes et sur des mécanismes qui évoluent dans le temps : intestin et microbiote, substances circulant dans le sang, réponses immunitaires, puis effets sur le cerveau. Ces échanges, qui dépendent du fonctionnement global de l’organisme et de différents stades de la maladie, ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des approches alternatives. Conformément à la démarche des 3R, lorsque des molécules ou des voies biologiques prioritaires seront identifiées, des approches complémentaires hors de l’animal pourront être utilisées (par exemple sur des cellules) pour préciser certains mécanismes. Toutefois, ces méthodes ne peuvent pas remplacer l’étude in vivo nécessaire pour établir le lien entre l’intervention (exercice/administration), les changements dans l’organisme et les effets sur le cerveau et le comportement.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé au plus juste à partir de nos données antérieures dans ce modèle et des informations disponibles dans la littérature. Il est fixé entre 10 et 15 animaux par groupe. Ces effectifs correspondent au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, notamment pour comparer les groupes entre eux et analyser l’évolution de la maladie au cours du temps chez les mêmes animaux. Le choix des effectifs tiennent également compte de la variabilité naturelle entre individus, pour les tests de comportement, du désintérêt de certains animaux à utiliser la roue d’exercice placée dans la cage et enfin à une mortalité plus élevée de la lignée de souris alzheimer au cours du vieillissement. Intégrer ces facteurs dès la planification évite d’avoir à constituer de nouvelles cohortes en cours d’étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et les pratiques de manipulation sont conçues pour réduire au maximum le stress et le risque de blessures. Les souris seront hébergées en groupes stables de 2 à 4 dans des cages enrichies avec du matériel de nidification et un élément d’enrichissement (bûchette), afin de favoriser les comportements naturels (repos, exploration, construction du nid). L’activité physique se fera via une roue en cage, permettant à l’animal de choisir librement l’intensité et la durée. Afin de préserver les périodes de repos et d’éviter une activité excessive, les roues pourront être retirées pendant la phase d’inactivité (journée), ce qui encourage le repos. Les mâles peuvent parfois présenter des comportements d’agressivité. Pour limiter ce risque, les groupes seront constitués le plus tôt possible (après le sevrage et dès que le génotype est connu) afin de stabiliser les relations sociales. Les animaux seront surveillés régulièrement pour détecter rapidement tout signe de tension (poursuites répétées, morsures, plaies, perte de poils, amaigrissement). Si un risque de blessure apparaît, une adaptation de l’hébergement sera mise en place, pouvant aller jusqu’à l’hébergement individuel du ou des animaux concernés, uniquement si nécessaire pour prévenir les blessures, réduire la nuisance et maintenir les animaux tout au long de la procédure. Les tables de suivi de soins des animaux comportent des points limites stricts et spécifiques au projet, définis en concertation avec le vétérinaire référent, permettant une prise de décision rapide et standardisée en cas d'altération de l'état général.

Choix des espèces

Le choix de la souris est justifié car elle constitue un modèle de référence pour étudier la mémoire et les fonctions de cérébrales: l’organisation du cerveau est largement conservée chez les mammifères. Les connaissances disponibles chez la souris sur les mécanismes liés à l’inflammation cérébrale et aux modifications observées dans la maladie d’Alzheimer permettent d’établir, dans des conditions contrôlées, des liens entre changements dans le cerveau et performances de mémoire. De plus, les tests de comportement utilisés dans ce projet sont bien validés chez la souris et sont connus pour être influencés par des interventions de mode de vie, comme l’activité physique. La souris est également une espèce de référence pour étudier le rôle de l’intestin et des micro-organismes intestinaux (microbiote) dans la communication intestin–cerveau. L’activité physique peut modifier la composition et le fonctionnement du microbiote. Le choix d’une roue en cage permet une activité volontaire, où l’animal choisit lui-même l’intensité et la durée, ce qui limite le stress par rapport à des méthodes plus contraignantes. Nous utiliserons un modèle murin bien établi de la maladie d’Alzheimer, qui présente avec l’âge des changements caractéristiques et des troubles de la mémoire, ainsi que des modifications rapportées du microbiote. Ce modèle est donc adapté à une étude dans la durée des liens entre intestin, sang et cerveau, et des effets potentiels de l’exercice. Seuls des animaux jeunes adultes à âgés seront inclus, afin d’étudier l’évolution liée à l’âge : les plus jeunes auront 4 mois (âge où les animaux sont adultes) et les plus âgés 15 mois (âge correspondant à un stade avancé de vieillissement chez la souris). Cette plage d’âges est nécessaire pour suivre la progression des troubles au cours du temps et évaluer l’effet d’une intervention mise en place précocement.

Prélever du sang, des urines, de la salive, du sperme, du liquide cérébrospinal ou des biopsies d'organes, non pour une expérience mais pour vérifier que les méthodes de dosage des laboratoires fonctionnent : 360 macaques à longue queue sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La contention dure jusqu'à une heure en chaise, la mise à jeun jusqu'à dix-huit heures, et le recueil de sperme passe par un léger courant électrique. Le porteur présente ces prélèvements comme un apport aux "3R", au motif que des méthodes plus sensibles réduiront plus tard les volumes prélevés et le nombre d'animaux non-humains utilisés. Le champ structuré annonce 356 macaques réutilisés et 4 rendus à l'élevage, quand la narration prévoit qu'un vétérinaire délivre une autorisation exceptionnelle de mise à mort pour ceux qui ne peuvent être ni réutilisés ni réhabilités, leurs organes allant alors aux laboratoires.

Objectifs

Aujourd’hui, un nombre croissant de candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques ou des molécules biologiques plus ou moins complexes. Le primate non humain constitue souvent la seule espèce pertinente pour évaluer leur toxicité ou leur activité pharmacologique, en raison de fortes homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’être humain. Ces études d’évaluation sont requises par les autorités réglementaires, et des lignes directrices définissent les modalités de leur conduite. Elles incluent généralement un ensemble étendu d’analyses de laboratoire destinées à mesurer la concentration plasmatique (ou dans d’autres matrices) du composé testé et à la corréler à son activité pharmacologique ou toxique. Compte tenu des enjeux scientifiques et réglementaires, il est essentiel que les résultats obtenus soient fiables et robustes. Cette fiabilité ne peut être garantie qu’après la démonstration documentée des performances analytiques des méthodes au cours de leur qualification et/ou validation. Toutefois, la composition des échantillons peut influencer les résultats et la performance analytique d’un essai. Il est donc indispensable d’évaluer ces paramètres dans des échantillons biologiques de même nature que ceux qui seront analysés dans les études réglementaires. Par conséquent, la réalisation de prélèvements biologiques provenant de primates non humains, en amont ou en parallèle des études, est nécessaire pour valider les méthodes analytiques utilisées lors de l’analyse des échantillons d’étude. Par ailleurs, le développement et la validation réglementaire de nouvelles méthodes ou de techniques plus sensibles et plus précises contribuent directement aux principes des 3R. Elles permettent notamment de réduire les volumes de matrices biologiques requis et d’obtenir des données plus détaillées, améliorant ainsi l’interprétation scientifique tout en limitant l’utilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de collecter des échantillons biologiques (comme du sang ou du plasma) nécessaires pour développer et vérifier la fiabilité des tests utilisés dans nos laboratoires. Ces tests sont indispensables pour obtenir des données fiables et reconnues par les autorités, ce qui est essentiel pour développer de futurs médicaments. Le projet apporte deux types de bénéfices : 1. Un bénéfice scientifique et réglementaire (à court et moyen terme) Les laboratoires auront accès à des échantillons de bonne qualité, prélevés directement sur place. Cela évite les problèmes liés au transport ou à la conservation, qui peuvent dégrader la qualité des analyses. Ces échantillons permettent de mettre au point et de valider les méthodes nécessaires aux études de toxicologie et au développement de nouveaux médicaments. 2. Un bénéfice important pour le respect des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer) Les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises. Cela permet : • d’utiliser des volumes beaucoup plus faibles d’échantillons, • d’analyser plus de paramètres en même temps, • d’obtenir des résultats plus détaillés. En conséquence, il est souvent possible de réduire le nombre d’animaux nécessaires dans les études futures. Par exemple, des techniques comme les analyses multiparamétriques (Multiplex Luminex®, électrochimiluminescence, PCR digitale) permettent de mesurer plusieurs éléments différents dans un seul petit échantillon de plasma.

Procédures

Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements et selon des recommendations de vétérinaire. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile : sang (unique ou répété) par les voies veineuses périphériques, urines, selles, frottis vaginal, nécessitent une contention de courte durée, manuelle (moins de 5 minutes) et/ou en chaise de contention (jusqu’à 30 minutes ou 1 heure maximum). Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex jeune animal) ou sous sédation (des animaux matures) : salive, larmes, sécrétions nasales, recueil du sperme ; si une sédation est requise, elle sera de courte durée (environ 5-15 minutes) Les prélèvements réalisés sous anesthésie générale : biopsie cutanée ou d’organes, cytoponction, liquide cérébrospinal, liquide synovial, humeur aqueuse Dans certains cas particuliers les prélèvements exigent des contraintes d’hébergement particulières : • Mise à jeun (préalablement à une anesthésie, maximum 18 heures) ; • Hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés, pour recueil d’urine/fèces en cage à diurèse, en vue d’une analyse individuelle, maximum 18 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont minimes et correspondent essentiellement au stress et douleurs liés à la contention et aux types de prélèvements : Prélèvements sur animaux vigiles : hématome transitoire sur le site de prélèvement sanguin, légère douleur provoquée par la ponction à l’aiguille, stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant, de l’éjaculation par un léger courant pour prélevement de sperme Sédation/Anesthésie générale : effets cardiorespiratoires, hypothermie, stress provoqué par les manipulations liées à l’anesthésie Prélèvements plus invasifs comme les biopsies : douleurs au niveau du site de biopsie, stress provoqué par l’intervention post-opératoire comme la contention pour les soins post-opératoires et les injections répétées. Stress lié à des contraintes occasionnelles d’hébergement : notamment lors d’un hébergement individuel, ainsi que lors des contentions manuelles, en chaise lorsque nécessaire, ou par collier. De légères gênes ou frottements peuvent survenir en lien avec ces méthodes de contention.

Devenir

Après avoir pris en compte les effets subis par l’animal, notamment lors de sa participation à des projets ou procédures antérieurs, et en tenant compte de l’ensemble des paramètres sanitaires, le vétérinaire émettra un avis sur sa réutilisation potentielle. Si, selon cet avis, l’animal ne peut être ni réutilisé dans un autre projet ni réhabilité, une autorisation exceptionnelle d’euthanasie pourra être délivrée par le vétérinaire. Dans ce cas, différents matrixes pourront être prélevés en post‑mortem et mis à disposition des laboratoires. Sous réserve de satisfaire aux critères de réutilisation définis par la réglementation, ces animaux pourront être réaffectés au présent projet ou à un autre projet autorisé. Leur suivi sera assuré conformément aux procédures institutionnelles et en stricte conformité avec les exigences réglementaires applicables (Directive 2010/63/UE, référentiel AAALAC, ainsi que les autres recommandations éthiques internes).

Remplacement

Les lignes directrices de validation de méthodes recommandent que les essais soient validés dans les mêmes matrices que les échantillons d’étude (même espèce), afin de s’assurer de la performance des essais dans leur utilisation réelle. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques en raison de la complexité des matrices biologiques utilisés dans ce projet, et les matrices primates ne peuvent pas être remplacées par des matrices d’autres espèces du fait de la règlementation et de la nature des candidats testés (ex : protéines thérapeutiques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera déterminé strictement selon les besoins des laboratoires et la réglementation en vigueur en termes de validation d’essais. Les prélèvements seront effectués pour les analyses prévues en utilisant le nombre d’animaux minimum requis. Par ailleurs, le développement de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles dans les laboratoires permet de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, contribuant ainsi à la réduction (3R) ultérieurement.

Raffinement

Les techniques et les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises, ce qui renforce l’efficacité des analyses. Les essais ex vivo réalisés en amont des études précliniques in vivo s’inscrivent dans une stratégie 3R (réduction et raffinement en particulière) car ils permettent de caractériser le candidat médicament (sélection du meilleur candidat, connaissance du profil métabolique, pharmacologique et toxicologique) avant de démarrer les essais sur l’animal. Les méthodes développées et validées dans ce projet permettent en particulier d’optimiser les doses utilisées ensuite pour les études vivo, et de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, ex : approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®) et techniques plus sensibles et plus précises (électrochimie luminescence ou PCR digitale permettant des interprétations plus fines). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté (multimodale) le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site de prélèvement, amaigrissement) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

Aujourd’hui, de nombreux candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques ou des biomolécules complexes. Le primate non humain est souvent la seule espèce pertinente pour étudier leur toxicité ou leur activité pharmacologique, en raison de sa proximité génétique, immunologique et physiologique avec l’être humain. Ces études sont exigées par les autorités réglementaires et suivent des lignes directrices précises. Elles nécessitent de nombreuses analyses permettant de mesurer la concentration du composé dans le plasma (ou d’autres matrices) et de la relier à ses effets pharmacologiques ou toxiques. Pour garantir la fiabilité des résultats, les méthodes analytiques doivent être qualifiées ou validées. Or, la composition des échantillons peut influencer la performance des essais. Il est donc essentiel d’utiliser des échantillons provenant de primates non humains, identiques à ceux analysés dans les études. Ainsi, des prélèvements biologiques doivent être réalisés en amont ou en parallèle des études. Les animaux utilisés sont généralement des juvéniles d’au moins 22 mois, âge auquel ils arrivent dans l’établissement et sont inclus dans les études réglementaires. Pour certains types de prélèvements, des animaux matures (sexuellement ou immunologiquement) peuvent être nécessaires, en fonction des besoins scientifiques et de leur disponibilité.

2 181 souris vont être utilisées, chacune greffée de cellules tumorales ovariennes humaines chimiorésistantes puis transportée entre deux sites distants de trois kilomètres pour environ 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'elles le seront "pour récupération et valorisation des tissus". Les procédures d'un niveau de souffrance modéré comprennent l'injection de radiotraceurs, des prélèvements sanguins à la veine saphène sous contention, et une irradiation localisée possible des organes où les traceurs s'accumulent, le seul suivi comportemental décrit étant une inspection quotidienne notant la prostration, la rupture du lien social et une grimace scale. Les retombées annoncées pour les patientes atteintes de cancer de l'ovaire séreux de haut grade sont formulées dans "l'espoir d'augmenter leurs perspectives de survie", quand le projet en est encore à vérifier où se distribuent quatre familles de molécules.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeurs ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d’intérêt étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphèene) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - stress de la préhension des souris pour l'implantation des tumeurs : environ 2 minutes - inconfort associé au développement tumoral : légère gêne au niveau moteur : maximum 2 semaines - au moment du tranfert des animaux : stress du au changement d'environnement : environ 3 jours - injection des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de celui de la préhension pour sédation - imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévu, car non invasif et réalisé sous anesthésie. Les signes de toxicité possibles des radio ligands sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.