Recherche appliquée

165 truites arc-en-ciel de plus de 200 grammes vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à trois ponctions du sinus veineux caudal le premier jour, une autre vingt-quatre heures plus tard, puis une par mois pendant trois mois. Tous les prélèvements se font sous anesthésie générale, le porteur ramenant la douleur à celle d'une piqûre d'aiguille. Il s'agit d'établir quel volume de sang peut être prélevé sur une truite et en combien de temps il se régénère, faute de consensus sur ce point. Ce référentiel est présenté comme un gain de raffinement et de réduction pour les protocoles à venir, les 165 poissons utilisés pour l'établir étant tués à la fin.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de déterminer les conditions à respecter pour mettre en place des suivis sanguins longitudinaux dans les protocoles d’expérimentation animale sur poissons (volume de sang à prélever, temps de régénération sanguine, qualité de la régénération sanguine). Ce travail permettra de proposer un référentiel quant à la réalisation de prélèvements sanguins pour la truite Arc-en-ciel, assurant un respect à la fois de la physiologie particulière de l’animal, de la qualité des résultats expérimentaux obtenus et du bien-être animal. Pour les futures procédures expérimentales impliquant des truites Arc-en-ciel, ce nouveau référentiel garantira à la fois une réduction du nombre d’animaux utilisés (les suivis longitudinaux nécessitant moins d’animaux) et un meilleur raffinement expérimental (influence de prises de sang répétés sur les résultats).

Bénéfices attendus

L’absence de consensus quant au volume de sang que l’on peut prélever sur une truite, et quant à la vitesse de régénération sanguine pour cette espèce, est une contrainte majeure pour rédiger des protocoles expérimentaux plus en phase avec les exigences actuelles de réduction du nombre d’animaux utilisés, et de raffinement des protocoles expérimentaux. Ce projet a vocation à répondre aux questions suivantes : (1) Quel volume de sang peut-on prélever chez la truite Arc-en-ciel, en prélèvement unique ? en prélèvement multiple ? (2) Quelle est la durée de régénération sanguine chez la truite Arc-en-ciel à 14 °C, en fonction de la quantité de sang prélevée ? (3) Comment évolue la composition sanguine (maturité, taille et quantité des hématies) au cours du temps suite à un prélèvement sanguin ? Cette étude participera à l’établissement de nouvelles recommandations pour les poissons en expérimentation animale.

Procédures

Les animaux seront soumis uniquement à des prélèvements sanguins répétés, tous effectués sous anesthésie générale, par un personnel qualifié et expérimenté. En fonction des groupes, il y aura de un à trois prélèvements sanguins le premier jour. Ensuite, tous les poissons seront prélevés une seule fois 24h plus tard, puis une fois tous les mois pendant 3 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont les ponctions de sang répétées dans le sinus veineux caudal, sous anesthésie générale. La douleur correspond à la piqure d’une aiguille.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L’objectif étant d’évaluer l’impact clinique, zootechnique et biologique de prélèvements de sang plus ou moins importants ou de prélèvements répétés chez la truite Arc-en-ciel, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’existe pas actuellement de modèle qui permettrait de s’affranchir de ces manipulations.

Réduction

Pour ce projet, nous avons calculé le nombre minimum de poissons nécessaires pour répondre à la question de recherche autour de la quantité de sang qui peut être prélevée chez la truite Arc-en-ciel. Pour ce faire, nous avons utilisé une méthode statistique paramétrique s’appuyant sur les données hématologiques obtenues lors d’une première expérimentation (permettant notamment une meilleure qualification de la variabilité des données). Chaque poisson sera identifié par puce électronique, ce qui permet de réduire le nombre de poissons qui seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation, par rapport à une approche qui ne s’appuierait que sur des moyennes de groupe. Par ailleurs, il n’y a pas de lots pour lesquels serait réalisé un prélèvement de sang délibérément excessif (pas de groupe témoin positif) : chaque procédure évaluée devrait permettre de conclure sur la durée de récupération des animaux, et l’absence d’effets significatifs sur leur santé.

Raffinement

Les animaux sont observés chaque jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont : (1) les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. La qualité de l’eau (pH, teneurs en nitrites et en nitrates) est vérifiée chaque semaine ; (2) la santé des poissons. L’application d’une grille de score clinique adaptée permettra d’évaluer la santé des poissons chaque jour. En cas d’atteinte significative, les animaux seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés. Dans les bacs, la densité en poissons sera limitée. Par ailleurs, chaque bac est enrichi de structures permettant aux poissons de se cacher. Une période d’acclimatation longue permet de s’assurer d’une bonne adaptation des poissons à leur environnement, d’un ordre hiérarchique stable et défini, et ainsi d’une meilleure résilience des animaux face aux procédures expérimentales (notamment les cycles pêches/anesthésies) qui pourraient biaiser les résultats. Pour améliorer les conditions de vie des poissons, le recours à des bacs de taille importante, permettant de loger un plus grand nombre d’animaux en même temps a été privilégié, car une population trop petite exacerbe les comportements de prédation entre poissons. De même, un travail sur la réduction de l’intensité de l’éclairage au-dessus des bacs permet d’obtenir des animaux plus calmes (une lumière trop forte est une source de stress pour les poissons). Enfin, le choix des volumes de sang que l’on pourrait prélever chez la truite a été défini en s’appuyant sur des travaux antérieurs sur le poisson et les mammifères. Concernant les procédures expérimentales, des précautions particulières seront mises en œuvre pour limiter tout stress aux poissons (ce dernier pouvant impacter les paramètres hématologiques notamment) : réalisation de pêches calmes et lentes, mise en place d’une sédation des animaux dans des bassins intermédiaires , réalisation d’une anesthésie profonde pendant la réalisation de prises de sang, réalisation des prises de sang par un personnel expérimenté, surveillance attentive pendant toute la procédure de chaque animal par un personnel compétent et expérimenté.

Choix des espèces

La truite Arc-en-ciel est l’espèce modèle de notre structure d’expérimentation animale. C’est un salmonidé d’eau douce. Les salmonidés sont les espèces piscicoles les plus fréquemment rencontrées en aquaculture en Europe. La truite est également un modèle habituel dans les laboratoires d’expérimentation animale. Les truites utilisées pèseront plus de 200g, un poids conforme à ce qui est habituellement rencontré en expérimentation animale pour la réalisation de prise de sang. A ce poids (200g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proches des animaux d’un poids plus élevé (hors période de gamétogenèse).

Irradiées puis greffées, à trois jours de vie, avec des cellules souches prélevées sur des patients atteints de mastocytose, ces souris développent un système immunitaire humain et des tumeurs de mastocytes. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une anémie possible, des ulcérations sur les tumeurs sous-cutanées, un rejet des nouveau-nés par leur mère après manipulation et des chocs anaphylactiques faisant chuter la température corporelle de plus de huit degrés. Il écrit que "100 %" des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mastocytose est une maladie rare due le plus souvent à des mutations activantes d’un récepteur entraînant une différentiation et une prolifération aberrante de cellules immunitaires appelées mastocytes. La mastocytose est classée en trois types principaux selon le degré de sévérité et les organes atteints: la mastocytose cutanée (MC), qui affecte uniquement la peau ; la mastocytose systémique (MS), allant des formes indolentes aux formes sévères ou agressives, dans lesquelles au moins un organe extra-cutané est atteint ; et le sarcome mastocytaire, caractérisé par la présence d'une tumeur solide composée de mastocytes malins présentant une capacité d’infiltration destructrice et un potentiel métastatique. Selon la localisation tissulaire et la sévérité de la maladie, les symptômes peuvent inclure une irritation cutanée, des symptômes allergiques tels que l’anaphylaxie, ainsi que des déficits cellulaires, organomégalies (augmentation du volume des organes), et de l’ostéoporose. La forme la plus grave de mastocytose est la mastocytose agressive, dans laquelle il y a formation de tumeurs de mastocytes dans de nombreux tissus et dans la moelle osseuse et, dans la majorité des cas la survie des patients atteints de mastocytose agressive n’excède pas 3 à 5 ans après le diagnostic. Au-delà des traitements mis en place permettant de réduire les symptômes associés tel que les réactions allergiques, l’ostéoporose ou les atteintes cutanées, les thérapies visant à la destruction des mastocytes tumoraux induisent de nombreux effets secondaires et présentent un manque de spécificité, ce qui limite leur utilisation aux formes les plus graves de la mastocytose. Il n’existe pas à l’heure actuelle de solution thérapeutique satisfaisante dans cette pathologie. Ce programme de recherche a pour but de développer de nouvelles approches d’immunothérapie dans la mastocytose. Les résultats attendus des expériences que nous projetons de réaliser contribueront à mieux comprendre le développement de cette pathologie grave et à identifier de nouvelles approches d’immunothérapie pour soigner cette maladie.

Bénéfices attendus

La preuve de l’efficacité des anticorps déplétant les mastocytes in vivo dans les modèles murins décrits ci-dessous représente une étape essentielle pour la validation thérapeutique dans le traitement de la mastocytose et la justification du démarrage d’essais précliniques.

Procédures

L’irradiation n’aura lieu qu’une fois par animal (25 sec). Chaque injection des traitements (de 2 à 4 ; une fois par semaine) se fera sur animal vigile et sous contention (20 sec), alors que d'autres ainsi que le rasage de la zone d’injection se feront sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; injection : 30 sec). L’imagerie non-invasive se fera sous anesthésie gazeuse (induction/perte de conscience : 2min ; prise de l'image : 5 min). Les prélèvements de sang seront réalisés également sous anesthésie gazeuse au minimum 1 fois par semaine (induction/perte de conscience : 2min ; prélèvement : 30 sec).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont en premiers liés à la douleur des aiguilles et à l’inconfort induits par les injections des traitements qui sont de courte durée (5 secondes). Des nuisances supplémentaires peuvent-être associées : L’irradiation peut entrainer une perte de poids transitoire, une léthargie et/ou alopécie. Le développement d’un système immunitaire humain chez la souris peut entrainer une anémie. Les données existantes suggèrent que ces effets apparaissent plus de 20 semaines après ce développementet se manifestent par des symptômes d’anémie, incluant pâleur des extrémités, baisse importante de l’activité et perte de poids rapide. Outre les effets indésirables décrits ci-dessus qui s’appliquent également dans le cas de souris humanisées à partir de nouveaux nés, la manipulation de ces animaux avant sevrage peut entrainer un rejet de la part de la mère. De plus, il est impossible d’évaluer le développement des cellules souches hématopoïétiques dérivées de patients mastocytose in vivo et on ne peut exclure la survenue de symptômes liés à une prolifération anormale des mastocytes et des atteintes comparables aux symptômes observés chez l’Homme. Les traitements ciblant les mastocytes peuvent induire des réactions allergiques de type choc anaphylactique se traduisant par une perte de température corporelle rapide et transitoire, supérieure à 8°C. Le développement de tumeurs solides sous cutanées dans les souris humanisées peut mener à l’apparition d’ulcérations cutanées et une potentielle perte de poids. Une perte de température corporelle rapide, transitoire et supérieure à 8°C peut survenir lors d’in modèle d’anaphylaxie systémique passive

Devenir

100% des animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes post mortem.

Remplacement

Devant la complexité de cette pathologie, due notamment à l’implication de différents organes, le recours aux modèles animaux est indispensable. Toutes les études préliminaires visant à sélectionner les anticorps déplétant les mastocytes ont été réalisés in vitro dans des modèles de cultures de mastocytes humains. De ce fait, seuls les anticorps présentant le meilleur potentiel thérapeutique seront testés dans ce projet dans des modèles murins. De plus, l’utilisation d’un modèle in vivo pour tester les effets thérapeutiques d’anticorps déplétant les mastocytes nous permettra d’évaluer leur efficacité dans les différents tissues (bio-distribution), et leur capacite à induire la déplétion des mastocytes médiée par les cellules du système immunitaire inné.

Réduction

Les expériences décrites dans ce projet de recherche (incluant le nombre d’animaux par groupe) ont été élaborées sur les bases de travaux antérieurs et sur la base de notre expérience et de nos données préliminaires dans le domaine des mastocytes et des souris humanisées. Ceci dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de données statistiques robustes permettant de répondre aux questions scientifiques. Nous utiliserons une moyenne de 5 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs, le test statistique le plus approprié sera utilisé.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet sont maintenus dans un département de zootechnie dédié (environnement stérile), et soumis à une surveillance journalière. Les soins sont prodigués par des personnels spécialisés, avec une connaissance des procédures animales et des projets scientifiques que nous menons, dont la priorité est le bien être animale et le respect des lois bioéthiques en vigueur. Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cage en portoir ventilé dans un environnement contrôlé. L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour, permettant une détection précoce de toute altération de l’état de santé et une adaptation rapide des mesures nécessaires, contribuant ainsi à la réduction de la souffrance animale. Pour chaque procédure, des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera mis à mort s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier les maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif, nécessite peu de place, et il existe de nombreux modèles bien établis grâce aux progrès scientifiques réalisés ces dernières années. Les lignées transgéniques nécessaires pour ce projet sont d’ailleurs principalement disponibles chez la souris, avec un contrôle précis de leur fond génétique. De plus, la physiologie de la souris, en particulier dans les modèles « humanisés » que nous utiliserons, présente de fortes similarités avec celle de l’être humain. Cela permet de reproduire de manière fiable des maladies proches de celles observées chez les patients. Les animaux seront utilisés entre 0 (injection des cellules souches hématopoïétiques dérivés de patients mastocytose) et 20 semaines (immunisation vaccin à ARNm, regreffe de lignées de cellules tumorale, traitement avec des anticorps déplétant) après la naissance. Pour maximiser le succès de la regreffe des souris avec des cellules souches humaines, des souris nouveaux-nés (jour 3 après la naissance) seront regreffées, avant que le système immunitaire murin ne soit trop développé. Les souris sont dites « humanisées » lorsque leur système immunitaire humain est composé de plus de 25% de cellules immunitaires humaines (dans la circulation) entre 12 et 16 semaines après l’injection des cellules souches hématopoïétiques ; c’est pourquoi, les animaux seront utilisés entre 0 et 20 semaines.

Vérifier qu'un modèle de souris prédit l'efficacité d'un futur vaccin contre le paludisme, avant qu'un essai chez des volontaires humains ne le dise: 1 500 souris immunodéprimées et greffées de globules rouges humains ou de singe vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur foie. Chacune reçoit jusqu'à vingt injections de globules rouges en vingt et un jours et subit jusqu'à dix-neuf prélèvements de sang sur animal vigile, puis une infection par Plasmodium vivax. Le porteur signale un risque de péritonite lié aux injections répétées, une anémie liée à la fréquence des prélèvements et une sensibilité accrue aux infections du fait de l'immunodépression. Il écrit qu'un test in vitro développé en parallèle pourrait, à terme, permettre de ne plus recourir à ce modèle murin.

Objectifs

Le paludisme reste un défi majeur en santé publique, avec environ 250 millions de cas cliniques chaque année et près de 600 000 décès. Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax sont les deux espèces de parasites les plus répandues. Bien que P.vivax soit moins mortel que P.falciparum, il touche plus d'un tiers de la population mondiale à cause de sa capacité à former des hypnozoïtes, des formes dormantes dans le foie. En effet, les formes sporozoïtes injectées par les moustiques gagnent le foie puis, certaines infectent rapidement les globules rouges (paludisme) alors que d'autres restent inactives pendant des mois ou des années dans le foie. Leur réactivation provoque des rechutes de la maladie, compliquant ainsi la lutte contre l'infection. Actuellement, il n'existe aucun vaccin contre P. vivax. Une grande initiative Européenne vise à développer des vaccins de nouvelle génération offrant une protection contre ce parasite. L'objectif de ce projet est donc d'évaluer la protection apportée par les anticorps produits après vaccination chez un modèle spécifique de souris et chez les volontaires humains. Ce projet représente une opportunité précieuse de déterminer si ce modèle de souris peut prédire l'efficacité des futurs vaccins avant qu'elle ne soit évaluée chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet offrira une occasion unique d’évaluer la pertinence prédictive de modèles de souris humanisées/simianisées pour les globules rouges en comparant directement la protection conférée par les anticorps générés par le vaccin chez les participants humains et dans ces modèles animaux. Les résultats permettront de mieux apprécier la fiabilité et les limites de ces modèles comme référence pour l’évaluation préclinique de futurs candidats vaccinaux.

Procédures

Pour ce projet, certains animaux recevront des injections pour moduler leur statut immunitaire (animal vigile, 7 fois, 1 minute). Tous les animaux recevront une injection de globules rouges (animal vigile, 20 fois maximum sur 21 jours, 1 minute) qui servira également de compensation des fluides prélevés. Tous les animaux auront des prélèvements sanguins de petit volume (animal vigile, 19 fois maximum, 5 minutes). Un lot d'animaux recevra un sérum par deux voies différentes (animal anesthésie 45 minutes,1 fois, 5 minutes par acte OU animal vigile, 1 fois, 1 minute). Tous les animaux seront infectés (animal anesthésié 45 minutes ou animal vigile suivant le site d'injection, 1 fois, 5 minutes par acte). Tous les animaux auront un prélèvement sanguin de volume plus élevé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute) qui interviendra juste avant l'euthanasie des animaux par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux sont immunodéprimés, par conséquent ils sont plus sensibles aux infections. L'infection avec le parasite du Plasmodium au stade sanguin uniquement pourra engendrer une réponse inflammatoire et une perte de poids. Les animaux pourront avoir des administrations qui pourront engendrer une douleur légère de courte durée au point d'injection et des douleurs abdominales ou une péritonite pour les injections répétées. Les animaux seront soumis à des administrations et à un prélèvement sanguin sous anesthésie : l’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Plusieurs prélèvements sanguins seront effectués sur animal vigile, cela pourra engendrer une douleur légère de courte durée lors du prélèvement et dans de rares cas un hématome. La fréquence des prélèvements pourrait engendrer une anémie et une perte de poids. Les animaux étant immunodéprimés, il y a un risque d'infection lors des injections et des prélèvements. Les différentes manipulations des animaux pourront engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés par une méthode réglementaire car il est nécessaire de prélever différents organes et principalement le foie afin de vérifier la présence et le stade de développement du parasite.

Remplacement

Plasmodium vivax étant un parasite strictement specifique à l'homme, il n'est pas possible, à l'heure actuelle, de remplacer les modèles de souris. Cependant, pour ce qui est de la prediction de protection, la réalisation d'expériences in vitro en parallele avec celles in vivo nous permettra de determiner si le modèle in vitro que nous developpons est tout aussi efficace que le modele in vivo de souris humanisée pour prédire la protection. En conséquence, ces études pourraient éventuellement permettre de ne plus avoir recours à ce modèle murin dans ce contexte spécifique à l'avenir.

Réduction

1500 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet dont 420 pour valider le modèle de souris et 1080 pour tester 12 sérums et anticorps sur les 5 ans du projet. Les tests d'efficacité des vaccins seront réalisés uniquement si le modèle murin est validé. Sur la base d'autres études réalisées avec le même type de modèle de souris, des groupes expérimentaux de 5 souris sont suffisants pour répondre aux questions posées. A la fin du projet, différents organes seront prélevés afin de valoriser au maximum l'utilisation des animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour limiter l'expression du phénotype dommageable des animaux qui sont immunodéprimés, tout le matériel en contact avec eux est stérilisé. Les administrations qui pourraient stresser modérément les animaux sont réalisés sous anesthésie. Lors des anesthésies, les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie. Le réveil des animaux est réalisé dans un environnement chaud avec un accès facilité à l'eau et la nourriture. Les yeux sont protégés avec un gel ophtalmique jusqu'au réveil. Les prélèvements sanguins seront compensés par les administrations de globules rouges. Le poids des animaux sera controlé régulièrement pour limiter la perte de poids par la mise en place d'actions. Par ailleurs, le personnel impliqué est formé et expérimenté, les actes techniques et le matériel utilisé pour chaque type d'injection sera toujours le plus adapté afin de réduire au maximum l’inconfort des animaux. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris est le modèle le mieux développé et connu pour les greffes de cellules hétérologues. Les lignées immunodéficientes et transgéniques pour les gènes d'intérêt permettant la greffe de globules rouges hétérologues n'existent que chez la souris. Les souris sont utilisées à partir de 2 mois car elles doivent être adultes pour supporter la transplantation des globules rouges nécessaire au projet.

Seul le macaque à longue queue a réagi au candidat médicament lors des essais préliminaires en laboratoire, la souris, le rat, le lapin et le chien n'ayant montré aucune réaction. Six macaques, un par dose et par voie d'administration, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit douze prélèvements de sang et sept mesures du temps de saignement, obtenues par micro-incision de la peau, avec des contentions sur chaise allant jusqu'à vingt-cinq minutes. Aucun des six n'est tué pour raison scientifique, le porteur les déclarant gardés en vie et réutilisables pour d'autres protocoles.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir d’un nouveau candidat médicament à trois doses différentes et selon deux voies d’administration chez le singe cynomolgus dans le cadre du développement d’un traitement contre les maladies thrombo-inflammatoires chez l’Homme. Ce projet permettra d’établir comment il circule dans le corps, combien de temps il reste actif, quels effets il produit et quelle est la relation entre sa dose et son effet. Cette étude préliminaire est donc nécessaire pour déterminer les caractéristiques principales du produit une fois administré dans un organisme entier. Elle permettra également de déterminer la dose et la voie d’administration qui seront utilisées dans de futurs projets précliniques (chez l’animal) et cliniques (chez l’Homme). Il est attendu que l’anticorps réduise de manière sûre et efficace l’activité plaquettaire excessive liée à la formation de caillots sanguins nocifs, sans provoquer de problèmes de saignement ni d’autres effets secondaires. L’objectif final est d’offrir une nouvelle option de traitement pour les maladies causées par une coagulation et une inflammation anormales. Des prélèvements de sang ainsi que des mesures du temps de saignement seront réalisés à différents délais avant et après administration de la molécule test. Différents paramètres physiologiques seront également suivis (ex : température corporelle, poids, état général). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de déterminer la dose toxique. C’est pourquoi, les doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques (d’après des études préliminaires in vitro et in vivo). Enfin, aucune mise à mort n’est prévue pour raison scientifique dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

La thrombose artérielle est un trouble courant chez l’Homme qui est généralement causé par l'érosion ou la rupture d'une plaque d'athérosclérose (dépôt lipidique dans les vaisseaux sanguins) pouvant provoquer des lésions ischémiques. Lorsque qu’une plaque se rompt et provoque une occlusion dans les artères coronaires ou cérébrales, elle peut entraîner respectivement un infarctus du myocarde ou un accident vasculaire cérébral (accidents vasculaires représentants les principales causes de décès dans le monde). Plusieurs médicaments sont maintenant disponibles pour traiter la thrombose artérielle. Cependant, ces médicaments ciblent des mécanismes communs à la thrombose et à l'hémostase. Leur utilisation entraîne donc un risque accru de complications hémorragiques non contrôlées en parallèle de leur efficacité antithrombotique. Dans ce contexte, il existe une réelle nécessité de développer de nouveaux traitements sûrs et efficaces sans effets secondaires systémiques tels que l'hémorragie. D’après différentes études réalisées in vitro et in vivo, le candidat médicament testé dans le cadre de ce projet semble avoir le potentiel de fournir une activité immunomodulatrice ciblée avec un profil de sécurité très encourageant pour traiter de manière efficace ce type de maladies thrombo-inflammatoires. Des études publiées sur un médicament similaire ont également montrées que le mode d’action utilisé était efficace et sûr chez les primates et chez l’Homme. En outre, ce produit similaire a démontré un excellent profil de sécurité, à la fois chez des volontaires humains sains et chez des patients souffrant d’un accident vasculaire cérébral ischémique aigu, renforçant ainsi le potentiel thérapeutique de ce type de médicament. Les bénéfices attendus du projet sont donc, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouveau traitement utilisé comme thérapie ciblée, efficace et sûre contre les maladies thrombo-inflammatoires. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront notamment de sélectionner la dose et la voie d’administration à privilégier pour de futures études précliniques et cliniques.

Procédures

6 groupes composés d’un animal chacun seront inclus dans ce projet : Groupes 1 à 3 : anticorps administré en sous-cutanée à 3 doses différentes ; Groupes 4 à 6 : anticorps administré par voie intra-veineuse à 3 doses différentes. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant plus d’un mois et ils bénéficieront d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) de plus de trois semaines avant le début du projet. Un prélèvement de sang ainsi que deux mesures du temps de saignement (temps nécessaire à l’arrêt spontané d’un saignement après réalisation d’une micro-incision de la peau) seront réalisés avant l’administration du candidat médicament. Les animaux recevront la molécule test par injection intra-veineuse lente de 15 minutes (temps de contention d’environ 25 minutes) ou par injection sous-cutanée (temps de contention d’environ 5 à 20 minutes). Ensuite, 12 prélèvements de sang et 5 mesures du temps de saignement seront réalisés à différent délais post-administration (prélèvements étalés sur plus d’un mois). Les mesures du temps de saignement impliquent une contention sur chaise à contention durant environ 15 minutes. Les prises de sang nécessitent une contention de 3 à 20 minutes (contention manuelle ou sur chaise à contention au besoin). Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 3 à 10 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Les administrations intra-veineuses peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection, des ecchymoses et/ou des hématomes. Les administrations sous-cutanées peuvent provoquer un stress léger, une douleur légère lors de l’injection et/ou des gonflements localisés. Les prélèvements sanguins et les mesures du temps de saignement pourront provoquer un stress léger, une douleur légère, un saignement local mineur et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple). Les pesées ainsi que les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie (selon avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur).

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment un nouveau candidat médicament agit dans le corps : comment il circule, combien de temps il reste actif, quels effets il produit... Ce type d'étude in vivo chez l’animal est indispensable au développement de nouvelles thérapies. Les données issues de ce projet ne pourraient être obtenues in vitro, car les modèles cellulaires utilisés en laboratoire restent trop simplifiés : ils ne reproduisent qu’une partie d’un organe isolée du reste du corps. Or, les paramètres étudiés dépendent d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant complexe (exemples : le débit sanguin, les échanges entre les tissus, le fonctionnement du foie et des reins, les barrières biologiques, …). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante, permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet. En effet, 6 groupes seront constitués (1 animal/groupe) : Groupes 1 à 3 : anticorps administré en sous-cutanée à 3 doses différentes; Groupes 4 à 6 : anticorps administré par voie intra-veineuse à 3 doses différentes. Chaque animal recevra le candidat thérapeutique à une dose et une voie d’administration différente, il est donc impossible de réduire d’avantage le nombre d’animaux utilisé par groupe. Le suivi longitudinal de chaque animal (analyses biologiques et suivi métabolique avant et après administration) permettra de recueillir un maximum de données à partir de chaque individu, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires. Cette étude étant préliminaire et non règlementaire, aucun test statistique ne sera réalisé, il n’y a donc pas besoin d’utiliser de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux, de la litière pour permettre aux primates de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine, des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs), de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Les animaux seront acclimatés à leur environnement (volières, personnel, congénères) durant minimum un mois avant le début du projet. Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile car l'anesthésie modifie les paramètres physiologiques étudiés et engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Le médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. Ce dernier a pour cible deux protéines spécifiques impliquées dans l’activité des plaquettes sanguines. Au cours d’études préliminaires in vitro (sur des cellules provenant de plusieurs espèces animal), seul le singe cynomolgus a réagit au médicament testé. Comme la souris, le rat, le lapin et le chien n’ont montré aucune réaction, ces espèces ne peuvent pas être utilisées dans ce projet. Ces résultats s’expliquent par le fait que les macaques sont très proches de l’être humain, tant sur le plan génétique que dans le fonctionnement de leur système immunitaire. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système cardiovasculaire, il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Une perte de poids de 15 % ou l'apparition de difficultés respiratoires déclenchent la mise à mort immédiate. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau, huit prises de sang à la veine submandibulaire, deux à dix administrations nasales du vaccin sans anesthésie, puis une inoculation du virus par le nez, le porteur indiquant que l'infection provoque une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort huit jours plus tard. L'enjeu déclaré est d'appuyer une demande d'essai clinique pour un candidat vaccin contre les symptômes du covid long, déjà évalué chez l'humain en prophylaxie.

Objectifs

Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.

Bénéfices attendus

Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.

Procédures

Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).

Impact sur les animaux

Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. MODIFICATION : Les administrations en voie SOUS-CUTANEE pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection ET SONT MOINS NOCIVE QUE LA VOIE INTRAPERITONEALE, TOUT EN MAINTENANT UNE EFFICACITE COMPARABLE. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pour le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.

Choix des espèces

Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.

Jusqu'à vingt-sept injections dans le ventre et neuf prélèvements de sang par animal après une greffe de cœur cousue au niveau du cou: 1 226 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Près de la moitié sont utilisées comme donneuses, infectées par un cytomégalovirus, l'autre moitié recevant leur cœur sous traitement anti-rejet. Donneuses et receveuses sont génétiquement différentes pour reproduire l'incompatibilité entre un donneur d'organe et son receveur, et le porteur indique qu'amplifier le virus dans les glandes salivaires de souris vivantes reste "nécessaire", la culture cellulaire l'affaiblissant. Toutes sont tuées pour prélever poumons, foie, cœur, reins, rate et glandes salivaires.

Objectifs

Lorsqu’un patient subit une transplantation d’organe et qu’il reçoit un organe provenant d’un donneur, son système immunitaire peut alors reconnaître cet organe comme étranger et provoque son rejet. Pour l’éviter, les patients doivent prendre des traitements immnosuppresseurs (anti-rejet). Ces médicaments visent à réduire l’activité de l’ensemble du système immunitaire et protègent l’organe transplanté mais ils rendent aussi les patients plus vulnérables aux infections. L’infection virale la plus fréquente après une transplantation est celle causée par le cytomégalovirus. Ce virus est très répandu dans la population générale. Chez une personne en bonne santé qui s’infecte pour la première fois, les symptômes sont souvent légers voire absents, car le système immunitaire contrôle rapidement l’infection. Le virus reste ensuite dormant, en « latence », dans différents organes (les reins, le foie, le cœur, les poumons…). Le problème apparaît lorsqu’un patient receveur, n’ayant jamais été en contact avec ce virus, reçoit un organe provenant d’un donneur porteur du virus. Sous traitements anti-rejet, le receveur ne peut pas développer une réponse immunitaire efficace contre le virus. L’infection peut alors se réactiver et entraîner des complications graves, compromettant la santé du patient et la survie de l’organe transplanté. L’objectif de ce projet est d’étudier la manière dont le système immunitaire réagit contre le cytomégalovirus après transplantation, en particulier sous traitement anti-rejet. Nous analyserons aussi l’impact des différences génétiques entre donneur et receveur. Pour cela, nous utiliserons un modèle expérimental de transplantation cardiaque chez la souris dans lequel le cœur de souris donneuses infectées de manière latente au cytomégalovirus sera transplanté à des souris receveuses n’ayant jamais été en contact avec le virus et traitées avec différents médicaments anti-rejet. Le choix du modèle de transplantation cardiaque se justifie par la taille plus importante des vaisseaux, rendant la procédure chirurgicale plus simple que pour d’autres organes. Les souris donneuses et receveuses seront génétiquement différentes afin de reproduire ce qui se passe lorsqu’un patient reçoit un organe infecté par le cytomégalovirus provenant d’un donneur génétiquement différent. La réactivation et la propagation du virus seront analysés dans les différents organes des souris receveuses, ainsi que la réponse immunitaire développée par ces souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cytomégalovirus est transmis au receveur lors d’une transplantation d’organe, ainsi que le rôle des principales cellules immunitaires impliquées dans le contrôle et la résolution de cette infection chez les patients transplantés. Les résultats obtenus permettront de également de préciser l’impact des traitements anti-rejet sur la réactivation et la dissémination du cytomégalovirus et de savoir comment moduler la réponse immunitaire du receveur afin de la rendre efficace contre le cytomégalovirus tout en limitant le risque de rejet, avec pour objectif de réduire la morbi-mortalité liée à ce virus et de prolonger la durée de vie des greffons.

Procédures

Toutes les souris donneuses de greffon cardiaque (soit près de la moitié du nombre total des animaux prévue pour ce projet) recevront une injection (du virus) dans le ventre sur animal vigile en début de procédure. 3 prélèvements sanguins sous anesthésie locale seront réalisés sur les souris donneuses (avant infection, une semaine après infection et quelques jours avant la chirurgie pour confirmer l’état de latence du virus). En fin de procédure, les souris donneuses recevront une injection d’anesthésiques (anesthésie générale profonde) dans le ventre et une injection d’analgésique morphinique dans le ventre avant la chirurgie. La peau sera désinfectée et incisée afin de prélever le cœur des souris donneuses. Durée de l’opération chirurgicale : 1h. Toutes les souris receveuses de greffon cardiaque (l’autre moitié des animaux de ce projet) seront anesthésiées profondément via une injection d’anesthésiques dans le ventre et recevront au total 4 injections sous la peau d’analgésique morphinique sur une période de 2 jours. Ainsi, sous anesthésie profonde générale et analgésie, la peau sera désinfectée et incisée afin de greffer le cœur de la souris donneuse au niveau du cou, puis suturée. L’opération chirurgicale durera 2h maximum. De plus, elles seront également soumises à des injections dans le ventre répétées 3 fois par semaine sur animal vigile (soit au maximum 27 injections sur 63 jours maximum), et à des prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie locale (soit jusqu’à 9 prélèvements maximum). Les injections dans le ventre et les prélèvements sanguins dureront 30 secondes (contention comprise).

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang répétés sont susceptibles d’entrainer un stress (lors de la contention) et une légère douleur lors de l’acte. La greffe de cœur correspond à une procédure bien documentée, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. L’intervention chirurgicale entrainera une gêne lors du réveil et une douleur malgré les analgésiques et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. L'infection à cytomégalovirus, aux doses utilisées ici, n'engendre pas de symptômes chez les animaux immunocompétents (c’est-à-dire non traités avec les traitements anti-rejet). Pour les souris traitées avec le traitement anti-rejet, l'infection peut causer l'apparition de signes généraux telles qu'une perte de poids ou une prostration, ou encore une hépatite (inflammation hépatique non douloureuse), ou une colite (associée à des diarrhées). L’infection durera 4 mois (pour les souris donneuses immunocompétentes) ou 2 mois (pour les souris receveuses sous traitement anti-rejet) au maximum. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux. Les points cliniques généraux (aspect du poil, comportement, pesée) seront observés selon une fréquence déterminée pour chaque procédure ou étape au sein d’une même procédure. Les points limites propres à chaque procédure ont été décrits pour éviter toute souffrance.

Devenir

Les souris seront mises à mort avec une méthode réglementaire en fin de procédure afin de récupérer différents organes (poumons, foie, coeur, reins, rate et glandes salivaires). La mise à mort des animaux est donc nécessaire pour toutes les analyses biologiques et biochimiques. Toutes les souris ayant atteint un point limite avant la fin de la procédure seront également mises à mort avec une méthode réglementaire.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe et les interactions cellulaires aboutissant à la réponse dirigée contre le cytomégalovirus font intervenir de multiples acteurs immunitaires présents dans différents tissus ou organes lymphoïdes, ce qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, le phénomène d’ischémie-reperfusion (lésions dues à l’arrêt puis retour du flux sanguin) est impossible à reproduire sur des modèles in vitro simplifiés, nous avons donc besoin de toute la complexité vasculaire et inflammatoire de l’organisme vivant pour reproduire ce phénomène observé en transplantation d’organe. Dans certains cas, la génération du stock de virus peut être réalisée par amplification sur lignées de cellules in vitro. Cependant, ceci a pour effet de dimiuner la virulence du virus, contrairement au virus amplifié in vivo et isolé à partir de glandes salivaires. Etant donné que, dans notre cas, nous devons utiliser la souche non modifiée et peu virulente afin d’étudier la réponse physiologique de certaines cellules immunitaires en particulier (ce qui n’est pas possible avec les autres souches de virus modifiées plus virulentes), et que le virus doit être suffisamment virulent afin d’infecter des hôtes immunocompétents et d’obtenir une infection latente (virus en état de dormance), une amplification initiale du virus in vivo (au niveau des glandes salivaires de la souris) est donc une étape nécessaire et non remplaçable par une amplification in vitro.

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe afin d’assurer la robustesse des analyses. Afin d’atteindre un effectif de 5-6 animaux par expérience, sachant que 2 types de protocoles expérimentaux incompatibles seront réalisés (soit 10-12 animaux par groupe), en prenant en compte le taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques, nous prévoyons 14 animaux par groupe. Au total, le nombre d’animaux prévus pour ce projet est de 1226 souris (mus musculus). Néanmoins, ce nombre est suceptible d’être revu à la baisse au cours du projet. L’étape de génération du stock de virus in vivo étant redondante avec un autre projet (déjà validé par le ministère), si la quantité de virus générée dans ce premier projet est également suffisante pour ce nouveau projet, nous ne réaliserons pas cette procédure. De même, le nombre d’animaux prévus pour l’entrainement technique à la greffe cardique correspond à un nombre maximal : ainsi, dès validation de la technique, nous passerons à l’étape suivante. Les différentes étapes de ce projet se feront séquentiellement afin de sélectionner au mieux les groupes les plus pertinents au fur et à mesure de l’avancée du projet, et ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le maximum d’échantillons biologiques sera extrait de chaque animal, et plusieurs expériences seront réalisées sur les mêmes échantillons, afin d’éviter d’avoir à reproduire ultérieurement l’expérience par manque de matériel biologique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque acte ont été définis afin d’assurer une prise en charge adaptée. Afin de limiter les nuisances et douleurs liées aux injections et aux prélèvements sanguins réguliers, nous alternerons régulièrement des sites d’injection et les sites de prélèvement. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Bien que la douleur lors des injections ou des prélèvements dans ce protocole sera réduite grâce à l'administration d'analgésiques/anesthésiques, des points limites ont tout de même été définis pour les différentes procédures afin d'intervenir en cas de nécessité et de limiter la souffrance de l'animal. Après chaque chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant et un suivi rapproché sera effectué. Le protocole chirurgical a été établi de façon à ce que le cœur de la souris receveuse est conservé et fonctionnel, ainsi, la perte du greffon cardiaque (issu de la souris donneuse) ne peut entrainer la mort et la souffrance de l’animal en soi. L'infection au cytomégalovirus des animaux traités sous traitement anti-rejet est susceptible de causer des symptômes spécifiques comme une inflammation du foie ou du côlon. Un suivi quotidien de leur état général sera effectué, et la survenue de diarrhées sera contrôlée. À cela s'ajoute un monitoring spécifique permettant de doser les enzymes du foie grâce aux prélèvement sanguins réalisés de façon hebdomadaire. Ces prélèvements sanguins réguliers sont donc nécessaires afin de suivre l’état de santé des animaux et de réagir plus précocément en cas de résultats insatisfaisants. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

Du fait de sa similarité avec l’Homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire anti-virale dans le contexte allogénique. Pour les expériences de transplantation, des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées afin de garantir un système immunitaire pleinement mature capable de répondre à l’infection. Pour la production virale in vivo, des souris immunocompétentes agées de 6 semaines, déjà sevrées, seront utilisées afin d’optimiser le rendement, tout en préservant leur bien-être.

Quatre-vingt-douze des souris utilisées sont dystrophiques, dépourvues de dystrophine, donc atteintes de dégénérescence musculaire, d'inflammation et de fibrose. Avec 32 souris témoins, 124 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent jusqu'à six électrocardiogrammes sur animal vigile et six échocardiographies sous anesthésie, une partie courant en outre sur tapis roulant et passant des mesures de contractilité musculaire, le porteur indiquant qu'elles peuvent ressentir des douleurs musculaires et se déplacer difficilement en fin de vie. Toutes sont tuées pour prélever plusieurs muscles et le cœur.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique à transmission récessive liée au chromosome X due à l’absence de la protéine dystrophine. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse), une inflammation, de la fibrose et une perte de masse et de force musculaire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Parmi les approches de thérapie génique, la restauration de la protéine dystrophine est la plus prometteuse. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques sont confrontées à des limites comme la dégénérescence des fibres musculaires dystrophiques et la perte du bénéfice thérapeutique. Dans cette optique, la molécule testée dans ce projet représente un bon candidat car il a déjà été prouvé que ce traitement renforce la structure musculaire, la fonctionnalité des mitochondries et réduit l'inflammation. Le but du projet est d’évaluer l’efficacité de ce traitement dans un modèle murin de dystrophie musculaire de Duchenne.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus à court terme, chez les souris dystrophiques, sont une amélioration du phénotype dystrophique lorsque les souris seront traitées avec le candidat médicament. A long terme, cette molécule pourrait être envisagée comme traitement utilisable chez le patient atteint de dystrophie musculaire de Duchenne en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une évaluation de la fonction cardiaque par électrocardiogramme sur animal vigile (3 à 5 minutes, 6 fois maximum) et à une échocardiographie sur animal anesthésié (5 à 10 minutes, 6 fois maximum). Une partie des animaux sera soumis à un régime alimentaire particulier en prise spontanée dans l'alimentation (12 semaines). Une partie des animaux sera soumis à des tests d’endurance sur tapis roulant (20 minutes, 2 fois maximum), à des mesures de contractilité musculaire sur animal anesthésié et sous analgésie (20 minutes, 1 fois) et à un prélèvement de sang sur animal anesthésié et sous analgésie (20 secondes, 1 fois).

Impact sur les animaux

Les souris dystrophiques présentent une atteinte des muscles squelettiques, du diaphragme et du cœur. Elles ont une importante faiblesse musculaire, de l’inflammation, de la fibrose et de l’infiltration de tissu adipeux. Ces animaux peuvent donc ressentir des douleurs musculaires et présenter des difficultés à se déplacer en fin de vie. Les animaux pourront subir un stress de courte durée, lors du transfert d’une cage à une autre et pendant les premiers jours après leur arrivée. Au cours des différentes procédures, les animaux peuvent subir un stress de courte durée au moment des manipulations et lors de l’administration de l’anesthésie gazeuse. Au cours des procédures sous anesthésie, les souris pourraient risquer l’hypothermie. Pour les mesures de performance sur tapis roulant, les animaux peuvent ressentir de la fatigue. Le traitement dans la nourriture pourrait provoquer une diminution de la consommation alimentaire et des dérèglements intestinaux tels que des diarrhées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.

Remplacement

Le but de ce projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. L’utilisation d’un modèle murin de la DMD est indispensable car les modèles in vitro ne peuvent recréer la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu et ne peuvent rendre compte de la dégénerescence progressive observée au cours de cette maladie. Le modèle utilisé dans ce projet est un modèle de choix pour l'étude de la dystrophie musculaire de Duchenne. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.

Réduction

Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité. Pour tous les groupes expérimentaux et toutes les méthodes d'analyse, 5 à 8 animaux est le nombre d'échantillons nécessaire pour une analyse statistique fiable. Néanmoins, considérant une forte hétérogénéité chez les souris dystrophiques, des groupes de 6 à 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable, pour éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable. Nous prévoyons de répéter une deuxième fois les expériences pour confirmation des résultats. De plus, plusieurs muscles ainsi que le coeur seront prélevés. Au total, nous prévoyons d'utiliser 92 souris dystrophiques et 32 souris contrôles soit un total de 124 animaux. La taille des effectifs sera été établie grâce à un calcul de puissance et nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaliers procèdent à un contrôle quotidien des cages et à un changement régulier sous hotte aspirante. Les animaux sont 5 par cage maximum et l'hébergement individuel est évité. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent en hébergement individuel (causes: seul mâle d’une portée, agression entre congénères, dernier animal dans la cage..). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage ou en bouillie dans des coupelles. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une semaine d’acclimatation sera mise en place lors de l'arrivée dans l'animalerie. Pour limiter la souffrance et l'angoisse, les procédures qui le nécessiteront seront réalisées sous anesthésie et sous analgésiques. Au cours des différentes procédures, la température des souris sera maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante à 37 degrés. Lors des mesures de performance et d'évaluation de la fonction cardiaque, une habituation sera réalisée et les mesures se feront dans un environnement calme et par un manipulateur expérimenté. Dès que les animaux émettront des signes de fatigue, les tests seront interrompus et de l'eau sera proposée aux animaux après l'effort. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Nous mettrons en place des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour la caractérisation de l’homéostasie musculaire. Cette espèce permet de combiner les études moléculaires et fonctionnelles du muscle squelettique. Le modèle de souris dystrophique utilisé dans ce projet a l’avantage de présenter un phénotype semblable aux patients. Les animaux utilisés seront âgés de 5 à 8 semaines en début de procédure et de 17 à 24 semaines en fin de procédure. L’intérêt est de traiter les animaux à un stade précoce de la maladie. Le démarrage du traitement peu de temps après le sevrage des animaux permettra d’évaluer la capacité de notre molécule à ralentir la progression de la maladie.