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Évaluation à long terme, chez l’agneau en croissance, d’une matrice extracellulaire assemblée par des cellules en culture pour la réparation des valves cardiaques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Ouverture du thorax sous anesthésie générale, circulation extracorporelle de trente minutes, reconstruction de la voie de sortie pulmonaire pendant environ deux heures: cinq agneaux de trois à quatre mois vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les complications possibles, troubles du rythme cardiaque, hémorragies, infection du site opératoire, occlusion du drain thoracique, calcification de la valve et régurgitation. Le biomatériau testé, une valve assemblée par des cellules humaines en culture, viserait à corriger une malformation cardiaque fréquente chez le nouveau-né, la tétralogie de Fallot. Les cinq agneaux sont tués après cinquante-deux semaines d'implantation pour prélever ce matériau, sans que soit précisé le nombre d'examens sous anesthésie générale subis pendant cette année.
Objectifs
La tétralogie de Fallot est une malformation cardiaque très fréquente chez les nouveau-nés. Elle peut être corrigée par une réparation chirurgicale consistant à fermer la communication interventriculaire et à élargir la voie de sortie pulmonaire du ventricule droit. Cette approche entraîne inévitablement une fuite valvulaire pulmonaire, qui doit être réparée. Des patchs synthétiques ou biologiques, issus d’animaux et traités chimiquement, ont pu être utilisés pour limiter cette fuite. Néanmoins, ils se sont révélés inefficaces à court et moyen terme et peuvent être associés à des complications postopératoires sévères. Un biomatériau entièrement biologique, sans traitement chimique, produit par des cellules humaines et pouvant grandir avec le patient, a été développé par notre équipe. Afin d’envisager une application en clinique, il est nécessaire d’évaluer, à court et à moyen terme, la réponse immunitaire à l’implantation du biomatériau dans l’organisme. Ceci ne peut être réalisé qu'en utilisant un modèle animal présentant une physiologie et une anatomie proches de celles de l'Homme. Une implantation dans un modèle de gros animal est donc indispensable pour évaluer la réponse immunitaire et le remodelage in vivo à long terme des produits d’ingénierie tissulaire. Un total de 5 agneaux sera inclus dans le projet. Ainsi, l’objectif général de ce travail est d’étudier l’efficacité et le remodelage à long terme d’un biomatériau développé au laboratoire (valve et patch qui traversel'anneau de la valve biologique) dans un contexte de greffe, en vue d’une correction chirurgicale de la tétralogie de Fallot.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'une part de valider l’efficacité à long terme de notre valve, sur le phénomène de régurgitation pulmonaire (phénomène qui se produit lorsque la valvule pulmonaire ne se referme pas correctement : le ventricule droit pousse le sang dans l'artère pulmonaire vers les poumons, où il peut être oxygéné, mais lorsque la valvule pulmonaire ne se referme pas complètement, du sang peut refluer des poumons au cœur) qui peut avoir des conséquences dramatiques sur le patient et d'autre part de mettre en évidence la capacité du biomatériau à être remodelé par les cellules de l’hôte et à adapter ses dimensions à l’anatomie de l’animal durant sa croissance. Ces résultats permettront d’envisager une première étude clinique afin de proposer le biomatériau dans la prise en charge de la tétralogie de Fallot chez l'Homme.
Procédures
Au cours de la procédure, les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, avec mise en place d’une circulation extracorporelle. Une correction chirurgicale sera réalisée au niveau de la voie de sortie pulmonaire. Cette intervention durera environ 2 heures par animal avec un temps de CEC moyen de 30 minutes. Bien que le procédé d’implantation soit maîtrisé par le chirurgien, la reconstruction chirurgicale qui sera réalisée est très complexe. L'opération est réalisée selon le protocole mis en place pour une opération chez l'Homme et elle a déjà été réalisée chez des brebis adultes par l’équipe responsable du projet dans le même établissement.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels surviennent principalement lors de la réalisation de la procédure chirurgicale. Les effets indésirables lors de l'opération peuvent inclure des troubles du rythme cardiaque et des hémorragies. La pose des cathéters pour la mesure des pressions ventriculaires et artérielles est mini-invasive, et les effets indésirables associés sont les mêmes que ceux de l’opération : troubles du rythme cardiaque et hémorragies. Les suivis par échographie ou par scanner, réalisés sous anesthésie générale, sont non invasifs et indolores pour l'animal. Les effets indésirables post-opératoires peuvent inclure : infection du site opératoire, occlusion du drain, empêchant le bon drainage thoracique, hémorragie, calcification de la valve et régurgitation au niveau de la valve. Un suivi particulier sera assuré par le personnel au cours des premiers jours afin d'identifier tous les effets indésirables éventuels. Lors de la phase de suivi et d'hébergement, après la cicatrisation du site opératoire, il ne devrait pas y avoir de complications supplémentaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après 52 semaines d’implantation afin de pouvoir réaliser les analyses permettant de répondre à l'objectif scientifique de l'étude. La réponse immunitaire et le remodelage des greffes par les cellules de l’hôte seront étudiés par des analyses histologiques. Cette étape nécessitant le prélèvement du matériau préalablement implanté, la mise à mort de l’animal est inévitable.
Remplacement
Bien qu’un modèle de valve humaine puisse être largement étudié in vitro, son étude in vivo reste limitée aux modèles animaux immunodéficients ou immunosupprimés trop petits (souris ou rats), trop chers et/ou éthiquement difficiles d’accès (primates). Il n’est donc pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux. En effet, l’objectif du projet est d’évaluer la réponse immunitaire, le remodelage et l’intégration du biomatériau dans l’organisme entier, afin d’envisager, à terme, une utilisation chez les patients.
Réduction
Ces expérimentations sont conçues pour recourir à un nombre minimal d’animaux, afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique. Nous implanterons 5 agneaux, car un animal n’a qu’une seule valve pulmonaire.
Raffinement
Le raffinement sera pris en compte tout au long du projet. Le projet est mis en place dans des locaux agréés, avec du personnel dédié et expérimenté. Des mesures d’enrichissement sont mises en place pour répondre aux besoins des animaux (pierre à sel, foin, hébergement en groupes sociaux…). Un protocole précis de prémédication, d’analgésie et d’anesthésie est mis en place, et le bien-être des animaux sera suivi en continu par le personnel dédié. Finalement, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués et, si nécessaire, des actions adaptées pourront être mises en œuvre sur l'avis du vétérinaire.
Choix des espèces
Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité du biomatériau étudié. Le modèle ovin a été choisi, car il figure parmi les modèles animaux couramment utilisés dans le domaine cardiovasculaire. De plus, d’après nos études, ce modèle est le seul dont les cellules peuvent produire des feuillets cellulaires ressemblant à ceux obtenus avec des cellules humaines. Les animaux seront implantés à partir de 4 mois d’âge afin d’obtenir des agneaux en croissance. Les animaux seront implantés à partir de 3 mois d’âge avec un poids d’environ 20 à 30 kg approximativement, afin d’obtenir de jeunes agneaux en croissance.
Résolution de l’inflammation dans un modèle de lésion endovasculaire fémorale
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
88 souris vont subir une chirurgie unique de vingt minutes, ouverture de la peau, insertion puis retrait d'un guide dans l'artère de la patte gauche, suture : 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, quatre opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Le porteur chiffre à environ 10 % la mortalité liée à cette opération, et signale que l'artère peut se déchirer et provoquer une hémorragie au moment où le guide y pénètre. Le geste reproduit la lésion que laisse un cathéter ou un ressort chez les patients dont les artères se rebouchent, l'équipe voulant montrer que l'épaississement de la paroi vient en partie d'un défaut de résolution de l'inflammation. Toutes sont tuées pour prélever les artères fémorales, le porteur notant que ce prélèvement risque d'induire une mort des tissus.
Objectifs
Les lésions internes des artères causées par le débouchage des artères malades avec un ballonnet et l'implantation d'un ressort gardant les parois artérielles dilatées, contribuent souvent à l'épaississement de la paroi artérielle altérant le passage de sang. Dans ces cas, cela nécessite la ré-opération des patients par d’autres interventions plus lourdes comme les pontages. En mimant le phénomène dans des souris normales et dépourvues d'un système impliqué dans la résolution de l’inflammation, nous souhaitons montrer que l'épaississement de la paroi artérielle est dû en partie à un défaut de résolution de l'inflammation. Nous voulons également décortiquer les mécanismes mis en jeux dans le rebouchage des artères après une première intervention.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettrons de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le rebouchage des artères après intervention. Il permettront également d’utiliser le nouveau concept d’activation de la résolution de l'inflammation pour l’amélioration de la prise en charge après le débouchage des artères ou la pose d'un ressort gardant les parois artérielles ouvertes. Si ces résultats sont concluants, de nouveaux traitements pourraient être développés pour limiter l'épaissement de la paroi artérielle et favoriser la cicatrisation vasculaire lors du débouchage des artères ou la pose de ressorts. Les essais chez l'animal se font le plus souvent chez les mâles, nous proposons de compléter ces données chez la femelle pour voir si il faut adapter les traitements différemment chez l'homme et la femme.
Procédures
les 88 animaux seront soumis à un anti-douleur pré-opératoire et post-opératoire par injection sous cutanée et une procédure chirurgicale (ouverture de la peau, insertion et enlèvement d'un guide dans l'artère de la patte gauche et suture de la peau) qui durent 20 minutes en tout.
Impact sur les animaux
L’injection d'antidouleur sous la peau induit une légère douleur de quelques secondes ; L’anesthésie pour la chirurgie, de 20 minutes; La mortalité due à la chirurgie est possible. Basée sur l’expérience, celle-ci est d’environ 10%. Au moment de l’entrée du guide dans l’artère, celle-ci peut se déchirer et provoquer une hémorragie. La zone d’intervention peut provoquer un gonflement ou une ecchymose dans les premières heures suivant l'intervention.
Devenir
A la fin de la procédure unique, tous les animaux sont mis à mort puisque les artères femorales seront prélevées. Ceci risque d'induire une mort des tissus.
Remplacement
Des études in vitro sur les cellules musculaires d’artère issues de souris dépourvues d’un système impliqué dans la résolution de l’inflammation ont montré qu’elles avaient une capacité de migration in vitro plus importante que les cellules issues de souris sauvages. Ce phénomène est observée après le débouchage d’un d’une artère par un cathéter. De plus, le rôle de ce système de résolution de l’inflammation dans les maladies qui induisent le retrécissement voir l'obstruction des artères par des plaques de gras (athérosclérose) a été montré in vitro et in vivo au laboratoire. Cependant, nous ne pouvons pas reproduire la lésion engendrée par la pose d’un ressort ou le débouchage de l’artère par un cathéter in vitro car cela nécessite une composante inflammatoire apportant d’autres types cellulaires comme les globules blancs ainsi que plusieurs couches de l’artère, non modélisable actuellement. Nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo rendant le remplacement impossible pour l’heure.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux, l'effectif du nombre d'animaux requis pour la procédure a été calculée avec un logiciel de statistique adapté sur la base d'une étude préliminaire menée par nos collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront surveillées étroitement pendant l’heure suivant l’opération. Un anti-douleur pré- et post-opératoire et une anesthésie pendant la chirurgie seront réalisées. Du gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour éviter le dessèchement lors de l’anesthésie. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étape de la procédure. Après l’étape de réveil, les souris sont replacées avec leurs congénères initiaux.
Choix des espèces
Les données préliminaires et connaissances de la biologie vasculaires ont été obtenues sur des souris. Les mécanismes moléculaires d'épaississement de la paroi artérielle après le passage d'un cathéter pour déboucher l'artère malade ou la pose d'un ressort chez la souris sont très proches de ceux observés chez l’homme. D’autre part, le modèle génétiquement modifié n’est disponible que chez la souris. Des souris adultes de 8 à 12 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet. Il s’agit de l’âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Comparaison, sur modèle porcin, de deux stratégies de protection cérébrale utilisées lors d’une circulation extracorporelle en chirurgie cardiaque. EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Trente minutes d'arrêt complet de la circulation, le corps refroidi à 18 °C ou entre 25 et 28 °C : 10 cochons vont être ouverts par sternotomie sous anesthésie profonde et tués avant tout réveil. Une circulation extracorporelle est installée en trente minutes, des capteurs sont posés dans l'œsophage et la veine jugulaire, et des prélèvements sanguins suivent des marqueurs d'atteinte cérébrale pendant toute l'opération. Le projet compare deux stratégies de protection du cerveau employées en chirurgie cardiaque humaine, dont le porteur écrit qu'elles donnent déjà des résultats similaires chez les patients pour des arrêts de 30 minutes. Il retient des cochons de 50 à 60 kg, âgés d'environ six mois, parce que la taille de leur cœur permet d'utiliser la même machine de circulation extracorporelle qu'au bloc opératoire.
Objectifs
Dans certaines opérations du cœur, notamment lorsqu’il faut intervenir sur l’aorte, les chirurgiens doivent utiliser une machine cœur-poumons qui remplace temporairement le travail du cœur et des poumons. Pendant ces interventions délicates, il est aussi essentiel de protéger le cerveau. Aujourd’hui, deux techniques principales existent pour cela : refroidir modérément le corps (25–28°C), arrêter la circulation pendant 30 minutes, et envoyer du sang vers le cerveau par une artère du cou ou du bras pour le protéger, puis réchauffer progressivement le patient ; ou refroidir profondément le corps (18°C), arrêter complètement la circulation pendant 30 minutes sans envoyer de sang au cerveau, puis réchauffer progressivement le patient. Notre projet se déroule dans 2 établissements différents (un pour l'hébergmeent et la pré-anesthésie des animaux et un deuxième pour la procédure à proprement dite)et consiste à comparer ces deux méthodes pour savoir laquelle protège le mieux le cerveau pendant l’opération. Pour cela, nous utiliserons plusieurs types de mesures : un enregistrement de l’activité électrique du cerveau, des analyses de sang pour détecter des substances qui indiquent si le cerveau a souffert, et l’étude du tissu cérébral après l’expérience pour rechercher d’éventuelles lésions. Le but principal est de déterminer les forces et les limites de chaque technique afin d’améliorer la protection du cerveau lors des opérations cardiaques. Le deuxième objectif est de voir comment les différentes mesures (enregistrement cérébral, analyses sanguines, examen des tissus) se complètent et se correspondent pour chacune des deux méthodes.
Bénéfices attendus
Il existe très peu d’études qui comparent directement ces deux techniques de protection du cerveau. Celles qui existent sont difficiles à interpréter, car elles se basent souvent uniquement sur un enregistrement de l’activité du cerveau et elles mesurent rarement des marqueurs biologiques. Surtout, elles n’étudient presque jamais le tissu cérébral lui-même. Comme les deux méthodes que nous voulons comparer semblent donner des résultats similaires chez les patients pour des arrêts de circulation de 30 minutes, il nous paraît important de regarder plus précisément leurs effets sur le fonctionnement du cerveau et sur le tissu cérébral. Cela permettra de mieux comprendre leurs avantages et leurs limites et d’aider à améliorer les techniques de protection cérébrale utilisées en chirurgie cardiaque.
Procédures
Ce projet se déroule dans 2 établissements nommés établissement 1 ou établissement 2. Les cochons auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress du à la manipulation (durée 2 minutes) à l'animalerie (établissement 2). Les expérimentations ont lieu dans l'établissement 1 : une perfusion intraveineuse sera posée (2 minutes) afin de permettre une anesthesie générale. A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde. L'assistance circulatoire sera installée (durée 30 minutes) par sternotomie. Des capteurs seront mis en place pour monitorer l'activité cérébrale, l'activité cardiaque et la température à différents endroits d'intérêt (oesophage, veine jugulaire). Des prélèvements sanguins auront lieu pour suivre des indicateurs sanguins tout au long de l'opération.
Impact sur les animaux
Les injections intra-musculaires d'anxiolytiques peuvent induire un stress léger et une courte douleur (quelques secondes). La contention de l'animal et l'installation d'une voie veineuse périphérique peut induire un stress modéré et une douleur légère. Risque inhérent à la chirurgie : une perte de sang légère peut avoir lieu lors de la pose des canules.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en vue d'une étude des tissus post mortem.
Remplacement
Pour cette étude, l’utilisation d’une circulation extra-corporelle est indispensable, car elle permet de recréer des conditions très proches de celles rencontrées lors d’opérations chez l’humain. Les modèles réalisés sur ordinateur ou en culture de cellules ne peuvent pas reproduire correctement les interactions complexes entre la circulation sanguine et le cerveau. Le choix du porc se justifie parce que son système cardiovasculaire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, et parce que sa taille permet d’utiliser une machine de circulation extra-corporelle comme en chirurgie cardiaque réelle.
Réduction
Une estimation statistique a été réalisée pour déterminer combien d’animaux étaient nécessaires afin de comparer correctement les deux techniques de protection du cerveau. Selon ce calcul, 10 animaux au total sont suffisants pour obtenir des résultats fiables. L’étude comparera donc deux approches : une méthode avec refroidissement modéré et apport de sang vers le cerveau, et une méthode avec refroidissement plus profond sans apport de sang. Même si le nombre d’animaux reste volontairement limité pour respecter les règles éthiques, le protocole est conçu pour fournir des résultats solides et utiles. L’analyse des données sera faite de manière rigoureuse et transparente afin d’interpréter correctement les différences entre les deux techniques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en petits groupes pour réduire leur stress et leur angoisse. Leur environnement est aménagé avec des jouets (balles, cordes) pour les stimuler et favoriser leur bien-être. Avant le début de l'expérience, ils ont une période d'acclimatation d'au moins sept jours pour s'habituer à leur nouveau cadre de vie et réduire le stress. Avant l'intervention, on leur donne des médicaments pour les détendre et pour soulager la douleur afin de les manipuler sans qu'ils aient peur ou soient soumis à des traitements douloureux. Durant l'expérience, les animaux sont sous anesthésie et analgésie profonde, et leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, respiratoire, pression artérielle) sont surveillés en continu. Si un signe de douleur apparaît, les médicaments sont ajustés immédiatement pour garantir leur confort. Leur état et leurs paramètres vitaux sont suivis de près pour détecter rapidement toute anomalie ou signe de détresse. Des points limites à chaque étape du protoc ole ont été établis.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser le porc car son organisme présente de fortes ressemblances avec celui de l’être humain, en particulier pour le cœur et la circulation sanguine. Cela en fait un modèle adapté pour étudier des techniques employées en chirurgie cardiaque. Ce modèle animal est couramment utilisé dans des travaux de recherche et a déjà montré qu’il reproduit de manière fiable les conditions rencontrées chez l’homme. Les animaux sélectionnés pèsent entre 50 et 60 kg, ce qui correspond à un âge d’environ six mois. À ce stade de développement, leur cœur et leur système circulatoire ont des proportions similaires à celles de l’être humain, ce qui permet de mener l’étude dans des conditions aussi proches que possible de la réalité clinique.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toute altération de l'état de santé déclenche une injection anti-inflammatoire, et une injection d'analgésique si la douleur dure plus de 24 heures. 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse des tumeurs, des ganglions, du foie et des poumons. Une tumeur ORL est implantée dans leur patte arrière gauche, puis viennent une ou deux IRM de 45 minutes et, pour la moitié d'entre elles, une séance de radiothérapie de cinq minutes, chaque acte sous anesthésie gazeuse. Le porteur annonce que l'irradiation peut brûler la peau 24 à 48 heures après la séance, puis ajoute n'avoir jamais observé ces nuisances à cette dose, sans indiquer sur combien d'animaux.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.
Prévoir l’efficacité de la radiothérapie dans les cancers ORL grâce à l’imagerie médicale et l’analyse biologique EU3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Déplacées entre trois établissements, l'un pour l'hébergement, l'un pour la radiothérapie, l'un pour l'imagerie, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche, puis selon les groupes une ou deux IRM de 45 minutes et une séance unique de radiothérapie de cinq minutes, sous anesthésie gazeuse chaque fois. Le porteur signale que la masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération, et que l'irradiation peut brûler la peau dans les 24 à 48 heures. Il retient 12 souris par groupe pour la puissance statistique et en prévoit 14, pour compenser environ 15 % d'échecs de pousse tumorale.
Objectifs
Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.
Bénéfices attendus
Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.
Procédures
70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.
Devenir
Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.
Remplacement
A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.
Réduction
Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.
Choix des espèces
Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.
Analyse des mécanismes moléculaires de la myopathie de Duchenne dans un modèle de poisson zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour comprendre comment l'absence de dystrophine dérègle le calcium dans le muscle, 1 794 poissons zèbres vont être utilisés sur cinq ans, dont 234 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes de 4 mois sont anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour analyse génétique, puis isolés jusqu'à 24 heures derrière un séparateur transparent. Le porteur affirme que ce prélèvement n'entraîne pas de douleur et que la nageoire se reforme en deux semaines, sans dire sur quoi il fonde l'absence de douleur. Les alevins porteurs de la mutation à l'état homozygote sont tués entre 6 et 8 jours pour prélever leurs muscles, les géniteurs à 12 mois quand leur reproduction faiblit, et les surnuméraires issus des croisements annuels le sont aussi.
Objectifs
La contraction du muscle squelettique dépend d’un signal envoyé par un neurone moteur. Ce signal provoque une hausse du calcium dans les cellules musculaires, ce qui déclenche la contraction. Dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une maladie génétique grave, il manque une protéine appelée dystrophine, essentielle au bon fonctionnement des muscles. L’absence de cette protéine perturberait la régulation du calcium, entraînant progressivement la dégradation des fibres musculaires. Des recherches menées chez différents modèles animaux ont montré que les poissons zèbres dépourvus de dystrophine présentent des atteintes musculaires proches de celles observées chez les patients atteints de DMD. Chez ces poissons, les premiers signes de dégradation apparaissent dès 3 jours de vie, et leur survie diminue après 8 jours. Notre projet utilise ce modèle pour étudier la contraction musculaire entre 6 et 8 jours de vie. L’objectif est de mieux comprendre comment l’absence de dystrophine altère la régulation du calcium dans le muscle et provoque la dégénérescence musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment l'absence de dystrophine, une protéine essentielle pour les muscles, perturbe le processus qui permet aux muscles de se contracter. Cela pourrait aider à mieux cerner les problèmes musculaires des personnes atteintes de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le poisson zèbre sapje présente des symptômes très similaires à ceux des patients atteints de DMD, et constitue ainsi un modèle fiable pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Les résultats de cette étude pourront contribuer au développement de nouveaux traitements, notamment des médicaments permettant de corriger les perturbations de l’excitation musculaire et la dégénérescence musculaire, afin de traiter cette maladie grave et incurable qui touche environ un garçon sur 3500.
Procédures
Les poissons adultes subiront une procédure pour sélectionner les poissons portant une seule copie mutée du gène de la dystrophine (hétérozygotes), grâce à une analyse de leur ADN. Pour cela, Les poissons âgés de 4 mois sont transférés dans un bac contenant de l’anesthésique qui induit leur perte de conscience en 20-40 secondes. De petits échantillons de nageoires qui serviront à l’analyse ADN sont ensuite prélevées à l'extrémité de la queue : ce prélèvement est rapide (
Impact sur les animaux
- Elevage des poissons hétérozygotes sur 5 ans : aucun effet indésirable dû à la mutation chez les poissons hétérozygotes mais présence d’un stress dû à la capture et la manipulation nécessaire pour anesthésier les poissons et faire le prélèvement d’une petite portion de nageoire - Prélèvement de petits échantillons de nageoire à l’extrémité de la queue - Isolement partiel des individus pendant une période courte (en moyenne 6 h et 24h au maximum) - Pour l'analyse moléculaire de la mutation conduisant à la myopathie: faible perte de mobilité à partir de l’âge de 3 jours et jusqu'à 8 jours (âge maximal des individus utilisé pour l'analyse)
Devenir
La lignée de poissons zèbres est maintenue à l’état hétérozygote pour la mutation du gène de la dystrophine. Les animaux âgés auront une capacité de reproduction affaiblie et peuvent également présenter une dégénérescence liée à l’âge. Ainsi ils seront mis à mort à l'âge de 12 mois. Afin de renouveler la population de géniteurs pour maintenir la lignée sur 5 ans, des accouplements et une analyse du génome des poissons produits seront réalisés tous les ans : les éventuels animaux en excédent seront également mis à mort. Les alevins issus de l’accouplement des hétérozygotes entre eux seront mis à mort entre 6 et 8 jours pour analyser leur génome et à prélever leurs muscles afin d’effectuer l’analyse moléculaire de l’excitation musculaire.
Remplacement
Les alternatives à l’utilisation de l’animal disponibles consisteraient à utiliser des cultures de cellules musculaires. Notre laboratoire a déjà expérimenté sur des cellules musculaires de souris en culture et a constaté que leurs propriétés étaient très immatures, rendant les résultats obtenus peu exploitables et difficilement transposables au muscle humain adulte. La caractérisation détaillée du processus de contraction musculaire ne peut donc se faire que sur des cellules prélevées chez l’animal qui présentent une maturité suffisante.
Réduction
La lignée de poissons sera maintenue sous forme hétérozygote, c’est-à-dire que les animaux porteront la mutation sans être malades. Seul le nombre minimal de reproducteurs nécessaire au maintien de la lignée sera conservé, soit 30 mâles et 30 femelles. Un renouvellement annuel des géniteurs sera effectué. Pour cela, des croisements contrôlés seront réalisés et la descendance sera élevée jusqu’à l’âge de 4 mois. Le nombre total d’alevins produits chaque année est limité à 312 poissons, ce qui correspond au minimum nécessaire pour 1/garantir un équilibre entre mâles et femelles, 2/ assurer la transmission stable de la mutation, et 3/compenser la présence éventuelle de mauvais reproducteurs. À l’âge de 4 mois, un petit fragment de nageoire sera prélevé au niveau de la queue afin d’effectuer une analyse génétique. Le nombre d’animaux prélevés sera strictement limité : les prélèvements seront interrompus dès que le nombre requis de poissons porteurs aura été identifié. Pour l’étude de la fonction musculaire, des croisements entre hétérozygotes seront effectués, produisant une descendance composée de 25 % d’animaux homozygotes mutants, 25 % de type sauvage et 50 % d’hétérozygotes. Les analyses seront menées sur les cellules musculaires de poissons mutants homozygotes et sauvages issus des mêmes croisements, ce qui permet d’éviter la production de poissons contrôles supplémentaires. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude a été calculé statistiquement afin de garantir la puissance nécessaire tout en minimisant le nombre d’animaux, soit 234 poissons âgés de 6 à 8 jours. Enfin, si des résultats concluants sont obtenus avec un nombre d’animaux inférieur, la taille des élevages sera révisée à la baisse.
Raffinement
Le prélèvement de l'extrémité de nageoire des poissons zèbres adultes sera réalisé sous anesthésie générale après 12h de jeûne afin de limiter régurgitation et contamination fécale. Le prélèvement se fera rapidement et sans saignement et concernera la plus petite portion de nageoire possible. A l’issue du prélèvement, le poisson sera transféré dans un bac de « réveil » où il sera surveillé pendant 10 min. Le réveil doit survenir en quelques minutes et si l’activité des branchies ne revient pas rapidement à la normale, une pipette sera utilisée pour aider au passage de l’eau dans les branchies. Le temps de l'analyse génétique, les poissons zèbres seront maintenus isolés en les plaçant 2 par aquarium de part et d’autre d’un séparateur transparent, afin de limiter le stress de l'isolement. Ils seront maintenus ainsi pendant une durée maximale de 24 h. Concernant les alevins comportant la mutation sapje à l’état homozygote, les défauts de motricité restent très faibles avant l'âge de 8 jours. Ainsi, afin de réduire au maximum les atteintes au bien-être tout en s’assurant que les muscles squelettiques soient suffisamment matures pour permettre l’étude de l’excitation des cellules musculaires, tous les alevins seront mis à mort entre 6 et 8 jours. Les alevins seront observés à chaque nourrissage, 4 fois par jour, et tout alevin présentant des signes d’altération du bien-être sera mis à mort. Le nourrissage se fera avec de la poudre de nourrissage très fine qui sera déposée à la surface et qui, une fois dissoute dans l’eau, permettra aux alevins de se nourrir facilement.
Choix des espèces
Nous avons déjà étudié le processus moléculaire de l'excitation dans des cellules musculaires de poisson zèbre sain et celui-ci présente de nombreuses similitudes avec celui du muscle humain. Cette étude préliminaire nous a permis aussi de développer une expertise spécifique à cette espèce et aux cellules musculaires de cette espèce . Par ailleurs, le modèle poisson zèbre, en reproduisant plus fidèlement les symptômes de la dystrophie musculaire de Duchenne en l’absence de la dystrophine, c'est à dire une perte de mobilité progressive, constitue un modèle animal susceptible de fournir des données plus pertinentes que le modèle souris (souris mdx) pour élucider les conséquences de la maladie au niveau de la cellule musculaire. L’entretien de la lignée nécessite des animaux en âge de procréer (agés de 4 à 12 mois) qui seront régulièrement renouvelés grâce à des accouplements réalisées tous les ans. La caractérisation détaillée du processus d’excitation des cellules musculaires sera réalisée sur des cellules obtenues à partir des muscles de poissons de type homozygotes et de type sauvage âgés entre de 6 et 8 jours. A ce stade, les cellules musculaires sont suffisamment matures pour pouvoir étudier de façon fiable le processus de la contraction au niveau cellulaire.
Étude préclinique du potentiel thérapeutique de nanoparticules d’apolipoprotéine A1 chargées en molécules d’intérêt clinique dans la fibrose pulmonaire expérimentale chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
1 056 souris vont être utilisées, dont 704 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever les poumons. Une partie reçoit un agent chimique qui déclenche une fibrose pulmonaire, une autre un régime riche en graisse, et 528 d'entre elles passent une mesure de fonction respiratoire que le porteur classe lui-même en nuisance sévère. Chaque souris subit jusqu'à huit inhalations de nanoparticules d'environ cinq minutes, sur animal vigile. Les retombées annoncées, un traitement inhalé qui "pourrait révolutionner la prise en charge des diabétiques" et réduire les coûts hospitaliers, restent au conditionnel, quand la fibrose provoquée et les mesures respiratoires sont, elles, programmées.
Objectifs
Les nanoparticules que nous produisons sont des reconstitutions simplifiées de molécules présentes dans notre organisme dont le rôle principale est d'éliminer le cholestérol. Ces nanoparticules possèdent aussi des propriétés protectrices pour l'appareil cardio-vasculaire, tel qu'une activité anti-inflammatoire. Ainsi, plusieurs industriels pharmaceutiques ont utilisés ces nanoparticules pour tester leurs potentiels thérapeutiques dans les maladies cardiovasculaires. L'administration de ces nanoparticules était réalisée par injections intraveineuses répétées. Une autre voie d'administration, l'aérosolisation, permettrait de cibler directement les poumons. Il se trouve que les cellules pulmonaires sont capables de reconnaitre et d'utiliser ces nanoparticules. Aujourd'hui, aucune étude n'a montré la transposition du potentiel thérapeutique de ces nanoparticules dans les maladies respiratoires. Nous avons réussis à produire et enrichir ces nanoparticules avec différentes molécules thérapeutiques et montré un effet protecteur dans un modèle in vitro. Les objectifs du projet sont d'évaluer le potentiel thérapeutique de l'aérosolisation des nanoparticules enrichies dans deux modèles complémentaires de fibrose pulmonaire in vivo: (i) la fibrose pulmonaire induite par une alimentation riche en graisse et (ii) la fibrose pulmonaire induite par un agent chimique.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une preuve de concept de l’efficacité des nanoparticules A1NP enrichies à prévenir le développement de fibrose pulmonaire dans différents contextes pathologiques. Cette stratégie pourrait révolutionner la prise en charge des diabétiques en offrant un traitement ciblé et non invasif capable d’interrompre la progression de cette complication pulmonaire, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant la mortalité. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, notamment des produits chimiothérapeutiques, des vasodilatateurs, des antibiotiques, des ARNm, des siARN et des mucolytiques, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticules lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. En diminuant la fréquence et la gravité des complications pulmonaire, cette thérapie innovante pourrait réduire significativement les coûts liés aux soins à long terme, à l’hospitalisation, et à la prise en charge des incapacités. Elle répond ainsi à un besoin urgent de solutions thérapeutiques efficaces face à la charge croissante que représente les maladies respiratoires pour les systèmes de santé mondiaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à des inhalations de nanoparticules (1056 animaux au total maximum). Le geste technique d'inhalation des nanoparticules dure environ 5 minutes et se fait sur animaux vigiles. Parmi ces animaux, la moitié auront une mesure de leur fonction respiratoire (528 animaux au total maximum). Certains animaux auront reçu une dose d'un agent chimique (640) et certains auront eut un régime riche en graisse (192). L'administration de l'agent chimique dure environ 1 minute et la mesure des fonctions respiratoires dure environ 10 minutes. Ces deux interventions sont réalisées sous anesthésie générale. Dans le modèle 1 (fibrose pulmonaire induit par un régime riche en graisse), nous aurons : - Etude pilote (32) : 8 inhalations de nanoparticules par souris. - Etude (320) : chaque groupe de souris contient 32 souris (16 pour la fonction respiratoire et 16 pour l'analyse histologique), il y a 8 inhalations de nanoparticules par souris. Dans le modèle 2 (fibrose pulmonaire induit par un agent chimique), nous aurons : - Etude (352 souris avec de l'eau normale et 352 souris avec de l'eau sucrée) : chaque groupe de souris contient 32 souris (16 pour la fonction respiratoire et 16 pour l'analyse histologique), les souris reçoivent soit une dose de solution physiologique ou une dose de l'agent chimique. Puis les souris reçoivent 3 ou 6 inhalations de nanoparticules par souris.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée du régime riche en graisse. - Nuisance modérée de la mesure de glycémie. - Nuisance modérée pour les administrations pulmonaire. Cette technique est réalisé sous anesthésie générale et ne dure qu'une minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de la fibrose pulmonaire induite par l'agent chimique. - Nuisance sévère pour la mesure des fonctions respiratoires.
Devenir
Chaque animale est euthanasié afin de pouvoir collecter les poumons pour analyses biologiques.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la fibrose pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la fibrose tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d'animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Ainsi, nous avons réduit à 8 le nombre de souris par groupe pour les analyses statistiques.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites qui ont été définis pour évaluer leur bien-être. Si l'un de ces points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur.
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles, et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins de fibrose pulmonaire sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à des agents chimiques. Ici, les souris sous régime riche en graisse ou exposées à un agent chimique en condition hyperglycémique reproduisent les caractéristiques clés de la fibrose pulmonaire humaine, en prenant en compte les perturbations métaboliques. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par la fibrose pulmonaire. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de la fibrose. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de cellules CAR-T anti-GD3 dans un modèle murin de glioblastome sous-cutané.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Immunodéficientes par construction, 84 souris NSG reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de glioblastome humain, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune est anesthésiée pour la greffe, puis deux fois pour l'injection de cellules CAR-T directement dans la tumeur. Le porteur reconnaît que le développement de la tumeur jusqu'à son point limite occasionne une gêne, et que les manipulations et les injections provoquent stress et douleur. Toutes seront tuées au titre d'études de survie, la croissance tumorale étant suivie jusqu'au terme fixé.
Objectifs
Notre projet consiste à évaluer l’efficacité de cellules immunitaires modifiées conçues pour cibler une molécule fortement exprimée à la surface de certaines cellules cancéreuses, dans un modèle animal de tumeur cérébrale (glioblastome). En laboratoire, ces cellules immunitaires modifiées ont déjà démontré leur capacité à freiner la croissance des cellules tumorales. Nous cherchons maintenant à savoir si elles peuvent, chez la souris, ralentir la croissance de la tumeur et ainsi ouvrir la voie à une nouvelle approche thérapeutique contre ce cancer du cerveau particulièrement agressif.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur du cerveau particulièrement agressive, dont le pronostic reste très défavorable. À ce jour, il n’existe aucun traitement curatif, et la survie médiane des patients dépasse rarement un an. Évaluer, in vivo, l’efficacité antitumorale de cellules CAR-T ciblant la molécule GD3, fortement exprimée à la surface de certaines cellules cancéreuses, pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques contre ce cancer du cerveau.
Procédures
Tous les animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de glioblastome (84 animaux, une seule intervention de 1 minute environ). Pour cela, ces animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) (84 animaux, une seule intervention de 5 minutes environ). Tous les animaux recevront un traitement intratumoral de cellules CAR-T (84 animaux, intervention de 2 minutes environ, 2 interventions / animal). Pour cela, ces animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) (84 animaux, une seule intervention de 5 minutes environ).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement de la tumeur sous-cutanée jusqu'à son point limite occasionne une gène pour l'animal. Les souris NSG sont immunodéficientes.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie.
Remplacement
L'efficacité de nouvelles thérapies sur la croissance tumorale du glioblastome nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique du glioblastome. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenus in vitro et ex vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 4 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les animaux seront hébergés en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). Les animaux seront anesthésiés avant les procédures de greffes sous-cutanées ou les injections intratumorales (anesthésie gazeuse). La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines. En effet, nous souhaitons réaliser l’étude sur de jeunes souris adultes. A cet âge optimal de 6 semaines, l’organisme de l’animal est parfaitement mature sur le plan métabolique, hormonal et tissulaire, ce qui assure une bonne vascularisation tumorale après la greffe ainsi qu’une croissance tumorale plus régulière et prévisible.
Développement d’une méthode utilisant les isotopes stables du carbone et de l’azote comme indicateur de l’efficacité alimentaire chez le bar et la dorade
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Autres poissons : 100
Améliorer l'efficacité alimentaire des élevages de bars et de dorades, pour abaisser le coût de l'aliment et les rejets des fermes aquacoles : 200 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Chacun subit trois prélèvements d'un bout de nageoire et d'écailles sous anesthésie, aux mois 0, 1 et 3, après avoir été identifié par une puce. Le porteur indique que les zones prélevées se régénèrent en moins de deux semaines, et qu'aucun poisson ne peut être relâché, leurs fonds génétiques restreints l'interdisant. Il affirme qu'un caractère aussi complexe que l'efficacité alimentaire mesurée individu par individu n'a "pas d'alternative" non animale disponible.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer une méthode pour mesurer l’efficacité alimentaire ( le poids de nourriture ingéré divisé par le gain de poids ) d’un poisson d’aquaculture en utilisant des marqueurs naturellement présents dans les aliments. Pour cela, le projet combine deux types de mesures : La quantité de nourriture mangée par chaque poisson, obtenue grâce à des vidéos de poissons élevés en petits groupes. La vitesse à laquelle ces marqueurs passent de l’aliment au poisson. L’analyse vidéo permettra de savoir précisément combien chaque poisson mange. En y ajoutant la mesure de sa croissance, on pourra calculer son efficacité alimentaire individuelle. Avant l’expérience, les poissons seront habitués à un aliment A. Pendant l’évaluation, ils recevront un aliment B. Ces deux aliments auront des compositions différentes (par exemple des proportions différentes d’huile ou de farine de poisson), ce qui leur donnera des signatures distinctes pour les marqueurs étudiés. Ces signatures seront ensuite mesurées dans différents tissus des poissons, comme les écailles ou les nageoires, grâce à une technique d’analyse spécialisée. Enfin, on vérifiera s’il existe un lien entre la manière dont chaque poisson absorbe ces marqueurs et sa capacité à utiliser efficacement la nourriture.
Bénéfices attendus
Cette nouvelle méthode pour évaluer l’efficacité alimentaire, basée sur l’analyse de la façon dont les poissons absorbent certains marqueurs naturels présents dans l’aliment, permettra d’estimer facilement les performances individuelles de plusieurs milliers de poissons élevés en groupe. Grâce à un simple changement d’aliment et à un prélèvement léger de tissu (comme des écailles ou une nageoire), il sera possible de mesurer l’efficacité alimentaire des bars et des dorades. Cette approche rendra plus simple et plus pratique la sélection des poissons qui utilisent le mieux leur nourriture. Ainsi, il deviendra possible de mettre en place une sélection ciblée dans une ferme pour choisir les animaux les plus performants et améliorer ce caractère sur le plan génétique. Améliorer l’efficacité alimentaire apporte à la fois des avantages économiques (réduction du coût de l’alimentation) et des bénéfices environnementaux (moins de rejets dans le milieu naturel).
Procédures
Pour réaliser ce projet, les animaux seront prélevés à trois reprises d'un bout de nageoire et d'écailles. Chacun de ces prélèvements prend moins d'une minute et sera réalisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Le projet n'implique qu'une procédure légère. Les petites blessures causées par les prélèvements d’écailles ou de fragments de nageoires guérissent rapidement. En quelques semaines, les poissons régénèrent entièrement les zones prélevées. Les prélèvements répétés sur les nageoires n’ont pas d’effet négatif sur leur façon de nager. Les prélèvements de nageoires sont réalisés avec un emporte-pièce de petite taille (3 mm de diamètre), ce qui permet une repousse complète du tissu en moins de deux semaines. Ces prélèvements auront lieu aux mois 0, 1 et 3. Enfin, chaque poisson sera identifié grâce à une petite puce d’identification, ce qui permettra de suivre ses performances individuelles tout au long de l’étude.
Devenir
Tous les poissons seront euthanasiés à l'issue de la procédure. La réutilisation et le replacement de ces individus n'est pas possible. Leurs fonds génétiques restreints ne permettent pas de les relacher dans le milieu naturel.
Remplacement
Ce type d'expérimentation, où la variation observée et recherchée est liée à l'individu, ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n'y a donc pas de remplacement possible. La mesure de l'efficacité alimentaire (ingéré/gain de poids) est un caractère complexe mettant en jeu une multitude de mécanismes comme la capacité à assimiler les nutriments, le métabolisme énergétique, l'activité de nage des poissons, la microflore intestinale. Ce caractère complexe étudié au niveau individuel n'a pas d'alternative non animale disponible du fait de ses nombreuses composantes et des variabilités individuelles qu'explore l'étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes sur le bar pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés. Les modèles linéaires qui serviront à analyser les données de corrélation entre l'efficacité alimentaire individuelle et la signature isotopique des tissus prélevés seront réalisés à partir d'un logiciel de statistique.
Raffinement
Pour limiter la souffrance et l'angoisse des animaux, toutes les mesures individuelles et tous les prélèvements seront effectués sous anesthésie profonde. Les prélèvements de nageoire et d'écailles seront réalisés à chaque fois à une localisation différente. Tout au long de l'expérimentation, les poissons seront hebergés entre congénères et seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Le bar et la dorade sont deux espèces majeures en aquaculture et pour lesquels la question de l'efficacité alimentaire se pose avec un vif intérêt. Ces élevages consomment aujourd'hui, à quantité de production égale, près de deux fois plus d'aliments qu'un élevage de truite ou de saumon. Les animaux seront au stade juvénile (entre 50 et 200g de poids moyen) pour pouvoir mesurer des croissances significatives.
Irradiation de rongeurs sur une plateforme de recherche pré-clinique
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 250
Renvoyés à leur animalerie d'origine après l'irradiation et comptés comme réutilisés dans d'autres projets, 2 250 souris et 250 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié seul sous anesthésie générale, quelques secondes avec le FLASHKNIFE ou jusqu'à vingt minutes avec le CLINAC, sans prélèvement ni chirurgie sur cette plateforme. Le porteur indique que les nuisances relevant de ce projet se limitent au stress de la préhension pour l'injection de l'anesthésique, et que les autres effets de l'irradiation "se feront sentir au retour dans l'animalerie d'origine". Cette autorisation couvre une prestation d'irradiation pour des projets autorisés ailleurs, ce qui laisse hors de son périmètre les atteintes provoquées par les rayonnements.
Objectifs
Le projet vise à utiliser un irradiateur de dernière génération pour étudier les effets de l’irradiation sur les tissus et les organes de manière très précise. Les chercheurs veulent comprendre comment la radiothérapie à très haut débit de dose (appelée « FLASH ») affecte les cellules saines et tumorales, afin de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques pour l’homme. Chaque institut ou laboratoire gestionnaire des animaux doit disposer de ses propres autorisations réglementaires pour les recherches qu’il souhaite mener. L’irradiation des animaux sur la plateforme ne peut avoir lieu que si ces demandes d’autorisation sont dûment validées et en cours de validité. La plateforme ne réalise pas d’irradiation sur des animaux dont le projet n’a pas été autorisé. Le nombre d’animaux accueillis varie selon les projets et est précisé dans chaque demande d’autorisation de projet.
Bénéfices attendus
Les connaissances acquises grâce à ce projet devraient aider à améliorer la sécurité et l’efficacité des traitements radiothérapiques pour les patients, limiter les effets secondaires sur les tissus sains, accélérer le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre certains cancers difficiles à traiter, et préparer l’utilisation future de la radiothérapie FLASH chez l’homme, après validation complète par des études précliniques.
Procédures
Tous les animaux accueillis sur la plateforme seront soumis à une irradiation ciblée à l’aide du FLASHKNIFE ou du CLINAC, réalisée sous anesthésie générale) afin de prévenir toute douleur ou stress. Chaque animal est placé individuellement dans l’irradiateur pour une courte période : quelques secondes pour le FLASHKNIFE et 10 à 20 minutes maximum pour le CLINAC. Après l’irradiation, les animaux sont remis dans leur cage d’origine et retournent dans leur animalerie par transporteur agréé pour poursuivre leurs conditions normales de vie. Aucun prélèvement invasif ni chirurgie n’est prévu dans le cadre de cette plateforme. Le transport entre l’animalerie et la plateforme se fait en cages spécifiques avec couvercle filtrant et nourriture gélifiée, les animaux étant maintenus en groupe social pendant tout le transfert.
Impact sur les animaux
Pendant la durée de la procédure concernée par ce projet plateforme dans lequel les animaux sont reçu uniquement pour irradiation, les nuisances potentielles découleront du stress de la préhension pour injection d'anesthésique général. Ce stress sera léger et de courte durée. Les autres effets de l'irridation se feront sentir au retour dans l'animalerie d'origine.
Devenir
Tous les animaux imagés retournent dans leur animalerie d’origine après la réalisation de l’imagerie pour poursuite des expérimentations
Remplacement
Aucune méthode de substitution, comme les expériences sur cellules en culture (in vitro) ou les modèles informatiques (in silico), ne permet de reproduire la complexité du corps vivant. Les interactions entre organes, la circulation sanguine, les réponses immunitaires et les réactions aux irradiations ne peuvent être évaluées que dans des animaux vivants. C’est pourquoi la plateforme utilise des modèles murins pour étudier les effets de l’irradiation FLASH.
Réduction
La plateforme accueille uniquement les animaux nécessaires aux expériences autorisées dans d'autres établissements de recherche. Le nombre d’animaux est planifié en fonction des besoins scientifiques de chaque projet et des autorisations de projet. Les expériences sont conçues pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, par exemple en suivant plusieurs paramètres sur un même animal.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues pour minimiser l’inconfort et le stress des animaux. L’irradiation FLASH ou CLINAC est réalisée sous anesthésie chimique (Zolétil/xylazine), et la durée dans l’irradiateur est très courte. Les animaux sont surveillés avant, pendant et après l’irradiation, et tous les signes d’anomalie sont immédiatement signalés au vétérinaire. Aucun prélèvement invasif ni chirurgie n’est pratiqué sur cette plateforme, et les animaux retournent toujours dans leur animalerie d’origine après la procédure.
Choix des espèces
La radiothérapie FLASH est réalisée sur des souris et des rats, des animaux très utilisés en recherche biomédicale car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain sur le plan anatomique, physiologique et génétique. Leur petite taille, leur coût modéré et leur cycle de reproduction rapide en font des modèles particulièrement adaptés pour tester de nouvelles approches thérapeutiques. Les animaux utilisés sont des souris âgées de plus de 8 semaines et des rats adultes de 300 à 450 g, correspondant à un stade de développement adulte, afin d’obtenir des résultats fiables. La radiothérapie FLASH permet d’étudier les effets de doses très élevées délivrées en très peu de temps sur des tissus ou des zones tumorales ciblées, dans le but de mieux comprendre la réponse des tissus et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Tous les animaux sont anesthésiés chimiquement pour leur confort, et ils sont remis dans leur animalerie après la procédure.
Statut parental en sélénium et tolérance au mercure chez les alevins de truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Évaluer si des coproduits de thon, chargés en méthylmercure, peuvent entrer dans l'alimentation des poissons d'élevage: l'objet du projet est la faisabilité d'une ressource pour la filière aquacole. 6 000 alevins de truite arc-en-ciel d'environ 100 milligrammes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués dans un bain de tricaïne puis prélevés. Pendant 21 jours, ils reçoivent un aliment contenant 2 milligrammes de mercure par kilo, avant une privation alimentaire de 16 heures la veille de la mise à mort. Cette dose représente quatre fois la limite légale pour les aliments aquacoles, le porteur la décrivant comme un "stress physiologique contrôlé" choisi pour provoquer un stress oxydant mesurable sans provoquer de mortalité.
Objectifs
Afin d’assurer la durabilité de l’aquaculture, il est nécessaire de réduire la dépendance aux farines et huiles de poissons. Les aliments alternatifs à base de protéines et huiles végétales peuvent limiter la croissance des poissons. Les coproduits de thon, représentant jusqu’à 65 % du poisson non commercialisé, constituent une ressource alternative intéressante et ont montré leur efficacité sur les performances des poissons. Cependant, le thon et ses coproduits peuvent contenir du mercure, souvent sous forme de méthylmercure, en quantité supérieure aux seuils réglementaires pour l’alimentation humaine et animale. Ce composé, facilement absorbé et lentement éliminé, s’accumule dans les tissus et exerce une toxicité liée à son effet pro-oxydant. Il perturbe les défenses antioxydantes, induit un stress oxydant et une réponse pro-inflammatoire, en particulier durant les stades précoces du développement. Chez les poissons, peu d’études ont examiné les conséquences d’une exposition alimentaire précoce au méthylmercure sur les mécanismes de défense antioxydante et inflammatoire. Le sélénium, élément trace essentiel présent également dans le thon, joue un rôle clé dans la régulation du stress oxydant et pourrait limiter la toxicité du méthylmercure. Il favorise la déméthylation du méthylmercure, accélère son excrétion et stimule l’expression de gènes antioxydants et de détoxication. Le statut en sélénium des géniteurs pourrait ainsi moduler la sensibilité de leur descendance à l’exposition au mercure. Mieux comprendre cette interaction est essentiel pour évaluer les risques liés à l’incorporation de coproduits de thon dans les aliments aquacoles, dans une perspective de durabilité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’acquérir des connaissances nouvelles sur les interactions entre mercure et sélénium, notamment sur les mécanismes antioxydants et les voies de détoxication impliquées. Les résultats attendus contribueront à : 1) mieux comprendre les effets d’une exposition alimentaire au méthylmercure chez les poissons pendant les stades précoces du développement ; 2) préciser le rôle du sélénium parental dans la tolérance et la protection de la descendance ; 3) évaluer la faisabilité d’utiliser des coproduits de thon dans les régimes destinés à l’aquaculture sans compromettre la sécurité sanitaire ni la performance des poissons. Au-delà des retombées pour la filière aquacole, ces travaux apporteront également des éléments utiles à l’évaluation des risques liés à l’exposition alimentaire au méthylmercure dans les populations humaines, en particulier chez les jeunes enfants. L’expérimentation proposée s’inscrit ainsi dans une démarche de durabilité intégrant à la fois la santé animale, la santé humaine et la protection de l’environnement.
Procédures
Les alevins, d’un poids moyen initial d’environ 100 mg, seront exposés pendant 21 jours à un aliment expérimental contenant du méthylmercure, à une concentration de 2 mg de mercure par kg d’aliment. À l’issue de cette période, ils seront soumis à une privation alimentaire de 16 heures avant l’échantillonnage, correspondant à un dernier repas distribué à 17 h, suivi d’une nuit sans alimentation. Le lendemain matin à 9 h, les animaux seront euthanasiés dans un bain de tricaïne (150 mg/L), puis pesés et prélevés.
Impact sur les animaux
Les alevins seront exposés à un aliment supplémenté en méthylmercure à une concentration de 2 mg/kg, correspondant à quatre fois la limite légale pour les aliments aquacoles et à environ quatre fois la teneur maximale attendue pour un aliment intégrant des coproduits de thon faiblement contaminés. Cette concentration a été choisie pour provoquer un stress oxydant et inflammatoire mesurable tout en évitant la mortalité et des effets sévères sur le métabolisme. Les effets indésirables potentiels sur les poissons incluent un stress oxydant léger, une possible altération temporaire du métabolisme antioxydant et des réponses inflammatoires légères. Aucun effet grave n’est attendu, car la dose a été validée par des essais antérieurs chez la truite à différents stades de développement. La survie, la croissance et le comportement alimentaire devraient rester globalement normaux. Ainsi, les effets indésirables attendus sont jugés légers et transitoires, correspondant à un stress physiologique contrôlé permettant d’atteindre les objectifs scientifiques.
Devenir
Les 6000 poissons mis en expérimentation seront euthanisés et prélevés pour analyse afin d’évaluer le rôle protecteur du statut parental en sélénium vis-à-vis de la toxicité du méthylmercure chez les alevins de truite arc-en-ciel.
Remplacement
Le remplacement n’est pas possible, car l’étude des effets d’un régime alimentaire chez un animal ne peut pas se faire in vitro ou par des systèmes de mesures informatiques.
Réduction
Le nombre d’alevins a été calculé pour obtenir des données fiables sur la croissance, le métabolisme et la biodynamique du mercure tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. La conception expérimentale, incluant la répartition des lots parentaux et des régimes testés dans plusieurs bassins, permet de maximiser l’information obtenue par animal et de limiter le nombre total de poissons utilisés.
Raffinement
Toutes les conditions d’élevage ont été optimisées pour le bien-être des alevins : température contrôlée (17 ±1 °C), photopériode naturelle, densité conforme aux recommandations physiologiques, renouvellement continu de l’eau, et alimentation à satiété visuelle plusieurs fois par jour. Le suivi du bien-être animal sera réalisé par la mise en place d'une fiche d'évaluation et de points limites adaptés. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire et effectuées par du personnel formé. Les prélèvements pour analyses seront réalisés après euthanasie et conforme aux recommandations en vigueur, afin de limiter la souffrance. Les mesures de l’environnement et de l’aliment permettent de minimiser l’exposition au mercure et de réduire le risque de stress supplémentaire pour les poissons.
Choix des espèces
En plus d'être la principale espèce piscicole produite en France, la truite arc-en-ciel est un poisson à gros oeufs riches en sélénium. Les animaux utilisés seront des alevins de truite arc-en-ciel, qui commencent à s'alimenter, avant que les réserves vitellines endogènes ne soient totalement épuisées. Les alevins seront nourris avec les régimes expérimentaux pendant 3 semaines, jusqu’à résorption complète des réserves vitellines. Ce stade de développement a été choisi car : -Les stades précoces sont particulièrement sensibles aux effets du méthylmercure, notamment en termes de stress oxydant et de réponse inflammatoire, ce qui permet de mettre en évidence des différences liées au statut en sélénium parental. -Les réserves vitellines fournies par la mère permettent un apport initial en sélénium, ce qui est nécessaire pour étudier l’influence du statut parental sur la tolérance à l’exposition alimentaire au mercure. -L’alimentation exogène à ce stade permet un contrôle précis de l’apport en méthylmercure et en sélénium, ce qui est essentiel pour évaluer la biodynamique d’accumulation et d’élimination du mercure. Ainsi, l’utilisation des alevins à ce stade permet de répondre directement aux objectifs du projet tout en limitant l’exposition à des stades plus avancés et donc en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.
Adaptation aux variations environnementales et effets des polluants à différents niveaux biologiques (physiologie, comportement, démographie) sur une population naturelle de cincles plongeurs
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Déjà capturés et manipulés jusqu'à huit fois au cours de leur vie pour certains, les cincles plongeurs de cette population de rivière sont repris chaque année depuis une dizaine d'années. 2 300 oiseaux adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous relâchés sur leur site de capture. Pris au filet, ils attendent jusqu'à deux heures dans un pochon, puis sont bagués, mesurés, soumis à une mesure du rythme cardiaque et d'un comportement de lutte, avant une prise de sang, un prélèvement de plumes et un prélèvement de sécrétions de la glande uropygienne. Le porteur reconnaît que le cumul de ces gestes peut peser sur l'oiseau et que le stress s'accumule sur toute une vie, tout en indiquant qu'aucun effet négatif majeur n'a été mis en évidence jusqu'ici.
Objectifs
En populations naturelles, les individus sont soumis à des variations des conditions environnementales qui peuvent être d'origine naturelle ou anthropique. Parmi ces dernières, la présence de polluants de natures diverses, liée aux activités industrielles, agricoles et/ou à l'urbanisation, peut fortement impacter le fonctionnement des organismes et des populations. Les actions de restauration des milieux au travers de mesures de dépollution restent pourtant souvent d'une efficacité limitée en raison du manque d'informations sur les concentrations de multiples polluants à une échelle spatiale fine ainsi que de leur impact biologique réel sur l'écosystème concerné. Le projet a pour objectif de fournir une cartographie détaillée des concentrations de différents types de polluants (métaux lourds, polluants organiques persistants, microplastiques) et de caractériser leur impact de façon conjointe (« effets cocktail » potentiels) sur une population d'un petit passereau considéré comme un bioindicateur du milieu des rivières courantes de basse et moyenne montagne, le cincle plongeur. Les rivières sont des milieux particulièrement sensibles à la pollution du fait de la concentration des polluants dans l'environnement alentour via le ruissellement. Sur la zone d'étude, des échantillons biologiques (plumes, sang, sécrétions) sont prélevés sur les oiseaux de façon faiblement invasive et compatible avec le suivi à long terme de la population. Ils permettent de mesurer (1) d'une part les concentrations de différents types de polluants très présents dans cette zone fortement exploitée par l'homme et anthropisée depuis des siècles, et (2) d'autre part des paramètres physiologiques, mais aussi comportementaux et d'histoire de vie (reproduction, survie) des individus. L'étude des liens entre ces concentrations mesurées de polluants auxquels les individus sont effectivement exposés (et donc présents dans leur organisme) et du fonctionnement physiologique (marqueurs des processus immunitaires, hormonaux, métaboliques...) permettra de mieux comprendre l'impact biologique réel des polluants au niveau individuel, et les implications au niveau de la population. Cette cartographie et ces résultats seront donc mis à disposition des acteurs locaux de la société civile, permettant de cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion et de restauration de la biodiversité des écosystèmes rivulaires dans la zone d'étude.
Bénéfices attendus
Nos analyses permettront de comprendre de façon fondamentale l'action des polluants sur les organismes en conditions naturelles et qui sont donc soumis à différentes sources de stress en même temps ; elles permettront également de façon plus appliquée. d’établir une cartographie détaillée à l'échelle locale des niveaux d'exposition aux polluants et de leurs effets sur le fonctionnement des organismes, qui sera mise à disposition des acteurs locaux associatifs et institutionnels comme outil de sensibilisation du public et pour cibler les zones les plus impactées afin d’optimiser les actions de gestion, restauration et préservation de la qualité de l'eau des rivières et de leur biodiversité sur ce territoire. Le manque d'informations sur les variations dans l’espace et le temps des concentrations de différents polluants à une échelle spatiale fine et surtout sur leurs effets biologiques conjoints sur les individus et les populations limite en effet souvent fortement la possibilité de mettre en oeuvre des actions efficaces de ce type face à diverses sources de pollution. Dans un contexte de "santé globale", l'enjeu est à la fois environnemental mais aussi sanitaire, car les activités humaines liées à l'eau sont nombreuses dans la zone d'étude (pêche, sports d'eau , baignade...). Pour atteindre ce but, le suivi exhaustif de la population étudiée permet d'accéder à l'ensemble des paramètres biologiques d'intérêt, chez une espèce qui intègre les mesures de polluants et de leurs effets le long de la chaîne trophique. Le transfert des résultats et connaissances concernant la pollution par différentes substances, sa dynamique au cours du temps et ses conséquences sur l'écosystème des rivières vers différents partenaires de la société civile est aussi un objectif du présent projet.
Procédures
Les oiseaux sont capturés grâce à des filets spéciaux et soumis à une série de manipulations, mesures et de prélèvements une fois par an (lors de leur première capture uniquement, dans le cas où ils seraient recapturés plus tard la même année). Une fois sortis du filet, ils sont placés en attente dans des pochons dédiés, au calme, le temps de la capture de l'ensemble des individus présents sur la zone (maximum 2h). Au moment des manipulations, réalisées sur site, ils sont d'abord identifiés individuellement par baguage, puis mesurés : masse, longueur du tarse, du crâne et du bec, de l'aile, de la queue. Une série de mesures comportementales et physiologiques est ensuite réalisée : mesure du rythme respiratoire et du rythme cardiaque, comportement de lutte. Différents prélèvements sont alors réalisés : (1) prise de sang ; (2) prélèvement de plumes (plumes de couverture du corps à différents endroits et une plume de la queue) ; (3) sécrétions de la glande uropygienne. Enfin, diverses informations sont notées : le sexe et l'âge des oiseaux, l'état des plumes et la présence de mue, la présence d'une plaque incubatrice (pour les femelles reproductrices), la présence de blessures éventuelles, liées à la capture ou antérieures. L'ensemble de ces opérations de mesures et prélèvements dure environ 20 à 30 minutes. Une fois l'ensemble des manipulations effectuées, l'oiseau est relâché directement sur le site de capture (entre 30 min et 2h30 après la capture selon le temps d'attente au départ).
Impact sur les animaux
Le coeur du projet est de pouvoir explorer les liens entre concentrations de différents polluants et leurs effets biologiques sur les individus à différents niveaux, y compris physiologique. Ceci implique de disposer des mesures des polluants et des mesures physiologiques simultanément, sur les mêmes individus, et donc de récolter l'ensemble des échantillons nécessaires sur chaque oiseau. Au cours d'une capture, chaque oiseau sera donc soumis à l'ensemble des gestes d'échantillonnages : (1) prise de sang, (2) prélèvement de plumes, (3) prélèvement de sécrétions de la glande uropygiale, en plus (4) des opérations d'identification (baguage) et des mesures morphologiques. Les effets individuels de chacun de ces prélèvements ou manipulations restent limités, mais le cumul de ces effets pourrait avoir une résultante impactant l'oiseau, parce qu'ils impliquent un temps de manipulation plus long, et/ou parce qu'ils occasionnent des stress et douleurs prolongés / multiples. Le principal effet indésirable attendu est donc un niveau de stress potentielement élevé de l'oiseau durant la capure et les manipulations. Par ailleurs, afin d'étudier la dynamique éventuelle des effets des polluants au cours de la vie des individus (et en particulier les processus de vieillissement), les oiseaux seront échantillonnés et mesurés chaque année. Ainsi un oiseau sera manipulé à chaque première capture de l'année au cours de sa vie, avec un effet potentiellement cumulatif du stress engendré sur l'ensemble de la vie. Une fraction importante des oiseaux subira donc les prélèvements et manipulations plusieurs fois (entre 2 et 8 fois jusqu'ici, la durée de vie moyenne de cette espèce étant d'environ 2 à 3 ans).
Devenir
L'objectif du projet étant de comprendre les effets à long terme des polluants sur des oiseaux en conditions naturelles, les mesures et échantillonnages réalisés visent à impacter le moins possible le devenir des oiseaux (survie, comportement, reproduction futurs) et donc à être compatibles avec le suivi à long terme de la population. Une fois les manipulations effectuées sur les oiseaux, ils sont donc tous relâchés dans leur milieu naturel, au site de capture.
Remplacement
L'objectif étant de comprendre les effets des polluants sur des animaux en conditions naturelles à long terme, l'utilisation d'expériences in vitro ou in silico n'est pas envisageable et seuls les prélèvements et mesures sur oiseaux vivants en population naturelle est possible.
Réduction
Le nombre d'oiseaux impliqués dans le projet correspond à la taille de la population reproductrice suivie (environ 460 adultes maximum par an), soit 2300 oiseaux adultes manipulés au maximum durant tout le projet) ; ceci permettra d'utiliser les modèles statistiques complexes appropriés pour quantifier l'effet des polluants sur les différents paramètres biologiques tout en tenant compte de nombreux facteurs individuels (sexe, âge, histoire des oiseaux) et environnementaux (date, rivière, altitude...) susceptibles d'affecter l'action des polluants. L'exhaustivité de l'échantillonnage de la population est nécessaire pour étudier les liens avec les différents paramètres et en particulier les paramètres démographiques tels que la survie et le succès reproducteur à l'échelle de la vie, qui ne peuvent être estimés fiablement qu'avec un effort de suivi suffisamment important, mais aussi pour estimer le déterminisme génétique des traits (héritabilité) au travers du pedigree établi via les captures et le suivi de la reproduction.
Raffinement
Le suivi de la population est réalisé depuis une dizaine d'années, et les procédures utilisées lors de la capture et manipulation des oiseaux ont été ajustées au cours de cette période afin de réduire au maximum leur impact sur le devenir des oiseaux et le fonctionnement de la population. L'expérience acquise par les manipulateurs leur permet de réduire au strict minimum le temps nécessaire au démaillage et à la manipulation des oiseaux. Afin de réduire le stress des oiseaux, ceux-ci sont placés dans des pochons spécialement conçus et opaques pendant les temps d'attente, et leur tête est gardée dans le pochon tant que les manipulations le permettent ; cette procédure est reconnue comme limitant le stress des oiseaux. Les manipulations se font en évitant les gestes et buits brusques ou mouvements non nécessaires, qui occasionnent du stress chez les oiseaux. Durant toute la manipulation de l'oiseau, le manipulateur reste vigilant et observe l'oiseau sans interruption afin de détecter les signes de stress intense et peut décider de relâcher l'oiseau immédiatement avant la fin des prélèvements ou mesures si ces signes deviennent trop forts. Ces précautions permettent de réduire quasiment à zéro le risque de mortalité pendant la capture. Les effets à plus long terme du stress de la capture, plus difficiles à évaluer directement, sont régulièrement estimés au travers des données de survie, mouvement et comportement des oiseaux collectées au cours du suivi général, et font l'objet d'une évaluation régulière. Jusqu'ici, aucun effet négatif majeur évident n'a pu être mis en évidence sur la base de ces données.
Choix des espèces
Le cincle plongeur a été choisi comme espèce d'étude en raison de : (1) sa situation élevée dans la chaîne trophique des rivières (c'est un prédateur d'invertébrés aquatiques), entraînant des niveaux de bioconcentration de polluants importants, et donc la possibilité de les quantifier et de détecter leurs effets biologiques mêmes faibles; (2) une variation importante des niveaux et type de pollution entre rivières étudiées, permettant de quantifier les effets de ces polluants ; et (3) la possibilité de suivre individuellement un grand nombre d'oiseaux et leur reproduction au cours de leur vie, grâce à une forte densité locale, assurant des tailles d'échantillons importantes et donc une puissance statistique satisfaisante, en particulier par rapport aux processus populationnels (survie, dispersion). Le cincle plongeur est une espèce protégée, dont le statut de conservation actuel est "préoccupation mineure" sur la liste rouge de l'UICN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature, qui fait référence pour l'établissement du statut de conservation des espèces), reflétant une absence de vulnérabilité spécifique (effectifs stables en France). Il est considéré comme un bioindicateur des écosystèmes rivulaires. Les prélèvements seront réalisés sur les oiseaux adultes, qui sont installés sur leurs territoires au moment de la capture et ont donc pu bioconcentrer les polluants présents dans l'environnement pendant une durée suffisante pour permettre leur détection et l'exploration de leurs effets biologiques.