Recherche appliquée

Livrées à l'animalerie à l'âge de 23 mois, 75 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 91 administrations du composé testé, subit 27 pesées, deux prélèvements sanguins en boîte de contention et trois tests d'endurance de trente à quarante-cinq minutes sur tapis roulant. Le RNT ne précise pas comment les souris sont amenées à courir jusqu'au bout de ces tests. Le porteur écrit que l'étude in vivo est une "étape règlementaire incontournable" pour le dossier de son client avant les premiers essais chez l'humain, et espère une mise sur le marché contre la perte musculaire liée à l'âge.

Objectifs

Le composé testé a été initialement développé comme un médicament visant les fibres musculaires dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire liée à l'âge. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment ses effets sur la masse et la force musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris âgées.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter la faiblesse musculaire liée à l'âge chez l'humain. Bien que de nombreux traitements aient été testés au cours des vingt dernières années, il n’existe toujours pas de médicament capable de guérir la sarcopénie. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la perte musculaire. .

Procédures

Au cours de l'étude, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (27 mesures ; durée de la mesure : 1 minute) ; 2) Administration du candidat médicament (91 administrations ; durée : 1 minute) ; 3) Analyse non invasive de la composition corporelle (3 mesures ; durée de la mesure : 2 minutes) ; 4) Prélèvements sanguins (2 prélèvements ; durée du prélèvement : 5 minutes) ; 5) Analyse des échanges respiratoires sur un tapis roulant (1 mesure ; durée : max. 48 minutes); 6) Test d'endurance sur un tapis roulant (3 mesures ; durée moyenne : 30-45 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel, ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boîte de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les administrations de traitements, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de courte durée. Les tests réalisés sur tapis roulant constitueront une nuisance d'isolement sur les animaux qui garderont toutefois un contact visuel avec leurs congénères. L’anesthésie peut également générer un stress de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus près euthanasie pour analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles musculaires. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel et la prise alimentaire) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les animaux seront hébergés en cages collectives et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les traitements seront réalisés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Par ailleurs, une phase d'habituation sera prévue afin de réduire le stress pouvant être généré par la procédure. Avant la mesure de la composition corporelle, les animaux seront habitués à être installés dans l'appareil de mesure permettant de réduire le stress des animaux au cours de la mesure. Les animaux seront habitués par deux fois aux systèmes de contention pour les prélèvements sanguins avant de pratiquer ces procédures et seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs. Avant chaque test sur tapis roulant, les animaux seront également habitués à être sur un tapis roulant à une faible vitesse. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. A la réception, les 75 animaux seront âgés de 23 mois. Le stade de développement de ces animaux correspond ainsi à la population cible du composé développé.

Proposés à l'adoption par une association après six mois d'utilisation, dix lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fois par semaine, chacun est attaché pendant que plusieurs centaines de poux de corps humains d'élevage se nourrissent de son sang, la séance pouvant durer environ deux heures pour les cinq stades du parasite. Le porteur décrit une irritation passagère et un inconfort lié à la contention, et prévoit une mise à mort seulement en cas de maladie grave ou d'impossibilité de placement. Il affirme que le lapin est la seule espèce sur laquelle ces poux, sélectionnés il y a plusieurs décennies, peuvent survivre, et que ce nourrissage reste "nécessaire" le temps de mettre au point une alternative in vitro.

Objectifs

L'infestion de la peau et des cheveux par des poux touche des millions de personnes dans le monde et est toujours très fréquente en France, notamment chez les enfants scolarisés. Les poux représentent un problème de santé publique et un coût financier non négligeable pour les populations touchées. Afin de lutter contre ces parasites, il est important de tester l'efficacité des nouveaux produits antipoux avant leur mise sur le marché. Cependant, il est très difficile de se procurer des poux sur les humains. C'est la raison pour laquelle, des poux d’élevage sont utilisés avec l'avantage d'être disponibles en grande quantité à tout moment de l'année. Ce sont des poux de corps humains sélectionnés il y a plusieurs décennies, pour leur capacité à se nourrir du sang de lapin pour assurer leur survie. Le lapin est la seule espèce animale disponible pour l'élevage de poux. L'objectif du projet est de maintenir l'élévage de poux en les nourrissant sur des lapins puis de tester sur ces poux, l’efficacité de produits capables de tuer poux et lentes, ou de répulsifs développés par l'industrie pharmaceutique. De par cette expertise sur les poux et les antipoux, le deuxième objectif est de diffuser les connaissances nécessaires à la lutte contre la pédiculose auprès des étudiants, des services scolaires (interventions dans les écoles) et du grand public (conseils aux familles, expertise auprès des médias), confrontés à cette infestation.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet permettront d'orienter le développement de produits antipoux et répulsifs efficaces et de conseiller leurs utilisateurs.

Procédures

Les animaux subiront la piqûre de poux une fois par semaine pendant 6 mois.

Impact sur les animaux

Les lapins seront hébergés individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères et non collectivement pour éviter les conflits. La contention du lapin nécessaire pendant le nourrissage des poux peut engendrer du stress. Les lapins pèsent plusieurs kilos et il est indispensable de les attacher pour assurer leur sécurité, ce qui peut provoquer un inconfort le temps de la procédure. Les liens sont en tissu et ne provoquent pas de blessures, irritations ou dépilation. Les poux des différents stades (adultes et 4 stades larvaires) ne doivent pas être mélangés. Les poux mettent environ 15-20 minutes à prendre un repas complet, ce qui fait une durée totale d’environ 2 heures pour le nourrissage des 5 stades en prenant en compte leur dépôt et leur ramassage. Si la quantité de poux est faible, deux stades peuvent être déposés côte à côte, ce qui diminue cette durée. Le nourrissage des poux (plusieurs centaines) peut entraîner une irritation passagère qui disparaît après quelques minutes.

Devenir

A l'issue de la procédure hebdomadaire, les animaux sont hébergés à l'animalerie. Après une période de 6 mois d'utilisation, tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil par l'intermédiaire d'une association. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave indépendante de la procédure, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.

Remplacement

Le nourrissage des poux sur animal vivant est le seul moyen à ce jour de garantir la survie des poux, insectes hématophages stricts à tous les stades (adultes et larves), et le maintien du cycle (reproduction et pontes). Le lapin est le seul animal sur lequel les poux humains ont été adaptés il y a plusieurs décennies. Ces poux d’élevage meurent en cas d’ingestion de sang humain, puisqu’ils ne sont plus capables de le digérer. Le nourrissage sur lapin est nécessaire le temps de mettre en place un mode de nourrissage in vitro des poux sur sang de lapin permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations.

Réduction

Le nourrissage des poux se fait par roulement sur 4 lapins. Afin de réduire les contraintes individuelles, la durée d’utilisation de ces lapins sera limitée à 6 mois, soit 8 lapins pour la durée du projet. Deux animaux supplémentaires sont prévus pour compenser l'éventuelle sortie prématurée d’animaux du projet.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes, individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères, afin d’éviter les conflits en hébergement collectif. Le sol des box sera recouvert de copeaux de bois pour un plus grand confort et muni d'une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Des enrichissements seront ajoutés ponctuellement pour varier leur quotidien ("rabbit relaxer" par exemple). Une grille scorée basée sur l'échelle d’évaluation des expressions faciales éditée par le National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) sera utilisée pour évaluer l’état sanitaire des lapins. Les signes pris en compte seront la contraction orbitaire, l’aplatissement des joues, la position « tombante » du museau, des moustaches et des oreilles avec les scores absent (0), modéré (1) et évident (2). Une acclimatation d’une semaine est prévue à l’arrivée des lapins et une habituation à la procédure est mise en place sur plusieurs jours avant le tout premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil par l’intermédiaire d’une association.

Choix des espèces

Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Les adultes sont préférables pour avoir une surface de peau la plus grande possible et ainsi réduire la durée de nourrissage des poux.

Les 165 souris de ce projet sont dépourvues de système immunitaire, choisies pour qu'elles ne rejettent pas les cellules humaines qu'on leur greffe. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'hydrogel sous la peau, de vingt à trente minutes, puis des injections d'analgésique toutes les douze heures pendant vingt-quatre heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quarante-cinq d'entre elles passent cinq séances d'imagerie sous anesthésie sur quatre semaines avant d'être tuées par surdose d'anesthésique injectée dans le cœur, et 120 reçoivent une injection intracardiaque de produit de contraste. Le porteur explique qu'aucune ne peut sortir de l'animalerie du fait de son immunodéficience et du greffon humain génétiquement modifié qu'elle porte, l'enjeu étant de limiter la mort des cellules souches transplantées.

Objectifs

L’objectif du projet est de limiter la mort de différents types de cellules souches, les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (Mo-CSM), ou de tissu adipeux (ADSC) et les myoblastes cellules progénitrice musculaire — après implantation dans un contexte mimant les conditions cliniques de greffe suite à une perte tissulaire importante (musculaire, osseuse ou de tissus mou/adipeux). Actuellement, le comblement de pertes tissulaires majeures repose principalement sur l’autogreffe, qui consiste à prélever le greffon directement chez le patient. Toutefois, cette méthode présente plusieurs inconvénients : nécessité d’une seconde intervention chirurgicale, et quantité ainsi que qualité de tissu prélevé limitées. Une alternative prometteuse consiste à implanter des cellules souches dans le tissu lésé, afin de favoriser la réparation soit par différenciation directe en cellules du tissu cible, soit en stimulant la régénération par les cellules résidentes. Malgré des résultats encourageants, la régénération tissulaire à partir de cellules souches reste limitée, principalement en raison d’une importante mortalité cellulaire post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel ces cellules sont greffées est généralement peu vascularisé (environnement ischémique), pauvre en oxygène et en glucose, et caractérisé par une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose est un facteur clé de la mortalité des Mo-CSM implantées, ce qui corrobore les résultats de la littérature obtenus avec d’autres types cellulaires. La stratégie développée par le laboratoire consiste à charger les Mo-CSM dans un hydrogel leur fournissant un apport local en glucose, afin de favoriser leur survie grâce à une nutrition in situ. Cet hydrogel est composé de fibrine (matrice de soutien) et de glucose (source nutritive). La preuve de concept de cette approche a déjà été établie, aussi bien in vitro qu’in vivo, avec les Mo-CSM. Nous cherchons désormais à élargir cette stratégie à d’autres cellules souches issues du mésenchyme. L’objectif global du projet est donc de déterminer s’il est possible d’améliorer la survie et la fonctionnalité d’autres types de cellules souches mésenchymateuses (Mo-CSM, ADSC, myoblastes) grâce à cet hydrogel enrichi en glucose.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre hydrogel d’assurer la survie de nos différents types cellulaire (Mo-CSM/ ADCS / Myoblaste) transplantés dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci l’hydrogel au sein d’un défaut de taille critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, nos résultats sur 3 types cellulaires permettraient d’entrevoir une réponse plus générale dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions ischémiques. (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, AVC, les infarctus du myocarde, transplantation de CSM pour les défauts osseux de taille critique)

Procédures

Pour tous les animaux (165 souris) : Les animaux subiront une chirurgie pour l'implantation d’hydrogel sous anesthésie et antalgie (1x, durée 20-30 min) et une injection sous cutanée d'analgésique toutes les 12h pendant 24h. Pour les animaux de l’étude de survie cellulaire (45 souris) : La survie sera suivie au moyen d'une imagerie sous anesthésie. La procédure sera répétée à 5 fois pendant la période d’implantation (5x, durée, variable en moyenne 45 min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés puis seront mis a mort par surdose d’anesthésiant injecté dans le coeur (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude de la formation de vaisseaux sanguin (120 souris) : Les animaux seront mis sous antalgie et anesthésie, et subiront une injection intracadiaque d'un agent de contraste (1X, durée 30 min).

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut être également observée occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants en étude 3 peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait après court temps d’adaptation. Les anesthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. L’anesthésie gazeuse prolongée peut aussi entrainer une dessèchement oculaire pouvant être prévenue par une bonne préparation des animaux. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.

Devenir

A la suite de nos expérimentations tous les animaux seront mis à mort; en effet leur état immunodéficient ainsi que la présence du greffon cellulaire d'origine humaine génétiquement modifiée par la firefly luciferase et de la Green Fluorescent Protein rend impossible toute adoption hors animalerie de plus des analyses complémentaires engendrent ou nécéssitent la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible, à ce jour, de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires par exemple) et moléculaires (par l’effet paracrine d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent pas toutes les interactions étant pour le moment limité en termes de type cellulaire et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons, les alternatives non-animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une étude de leur survie post implantation et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux par procédure, l'étude de la survie cellulaire sera réalisée en imagerie sur les mêmes animaux au fil du temps (et non un animal par unité de temps). Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons sélectionner les groupes présentant une survie améliorée afin de vérifier le potentiel angiogène de nos hydrogels chargés en glucose. Pour maintenir un pouvoir statistique suffisant de nos résultats et en se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants par groupe.

Raffinement

Avant le début de l'étude, les animaux bénéficieront d'une semaine pour s'habituer à leur environnement. Ils disposeront dans leur cage de tunnels en plastique translucides permettant une manipulation en douceur. L'intervention chirugicale de greffe réalisée sous la peau pourra provoquer un inconfort temporaire, mais celui-ci sera limité grâce à l'administration d'antalgiques avant et après l'opération. Durant les trois jours suivant l'opération, une alimentation plus facile à consommer leur sera proposée pour favoriser leur rétablissement. Compte tenu de la sensibilité du modèle utilisé, les conditions d’hébergement seront adaptées : les litières seront changées dans un environnement stérile et tous les objets entrant en contact avec les animaux seront stérilisés. Après l’intervention, leur comportement, leur apparence générale et d'éventuels signes de douleur seront observés deux fois par jour pendant les trois premiers jours, puis deux fois par semaine par la suite. Si un animal présente des signes persistants de douleur ou d'inconfort malgré les soins (injection d'antalgique et suivie rapproché de l'animal), il sera retiré de l'étude/et ou mis a mort en fonction de la gravité afin d'éviter toute souffrance inutile. Une anesthésie complète et une prise en charge de la douleur seront assurées avant l'intervention. Les animaux, initialement installés ensemble, continueront à vivre dans les mêmes groupes tout au long du protocole.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris SCID (déficit immunitaire combiné sévère (Severe Combined ImmunoDeficiency)). Le modèle souris est connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes (souris SCID) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

Des cellules de cancer humain de la bouche sont injectées dans la patte arrière gauche de 70 souris, qui reçoivent ensuite une séance de radiothérapie, une à deux IRM de quarante-cinq minutes sous anesthésie, ou les deux. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue, tumeurs, ganglions, foie et poumons étant prélevés. Le porteur énumère les atteintes possibles, gêne fonctionnelle progressive, infection, ulcération, brûlures dans les 24 à 48 heures suivant l'irradiation, puis ajoute qu'il n'a "jamais observé ces nuisances à cette dose". Sur le remplacement, il écrit qu'aucun modèle informatique ni organoïde ne reproduit la réponse aux radiations et que l'animal reste "incontournable".

Objectifs

Les cancers de la tête et du cou (comme ceux de la bouche ou de la gorge) sont parmi les plus fréquents dans le monde. Chaque année, ils sont responsables de plus de 440 000 décès. L’un des traitements les plus utilisés est la radiothérapie, qui consiste à envoyer des rayons pour détruire les cellules cancéreuses. Mais ce traitement ne fonctionne pas toujours aussi bien : certaines parties de la tumeur résistent, ce qui complique la guérison. Pourquoi certaines cellules cancéreuses survivent-elles à la radiothérapie ? C’est la question à laquelle notre projet veut répondre. Pour cela, nous allons utiliser une nouvelle méthode appelée radiomique. Elle permet d’analyser très finement les images médicales (IRM) des tumeurs. Grâce à des outils informatiques, on peut extraire des informations que l’œil humain ne voit pas. Cela pourrait nous aider à repérer, à l’avance, les zones d’une tumeur qui risquent de ne pas bien réagir au traitement. Mais pour l’instant, on ne sait pas encore si ce que l’on voit sur les images correspond bien à la réalité des tissus malades. Notre étude va donc tester cette idée dans un modèle animal (des souris). Des cellules cancéreuses humaines seront implantées dans la patte des souris. Ensuite, elles recevront une radiothérapie, et passeront des examens IRM avant et après le traitement. On analysera ensuite les tumeurs pour comparer ce que montrent les images avec ce qu’on observe réellement dans les tissus. Ce projet se déroulera sur 3 EU différents : pour des fins d’hébergement, de radiothérapie et d’imagerie. Le projet se déroule en deux grandes étapes. La première servira à mettre au point les bonnes conditions expérimentales (taille des tumeurs, bons moments pour les IRM, méthode d’analyse des tissus, etc.). Dans la deuxième étape, nous comparerons deux groupes de souris (traitées ou non) pour vérifier si certaines caractéristiques visibles à l’IRM permettent de prédire la réponse à la radiothérapie. Si cette méthode fonctionne, elle sera testée ensuite chez l’humain. À long terme, l’objectif est de mieux personnaliser les traitements : si on sait à l’avance qu’une tumeur va mal réagir à la radiothérapie, on pourra adapter la stratégie, par exemple en augmentant la dose ou en ajoutant un autre traitement. Cela permettrait d’améliorer les chances de guérison tout en réduisant les effets secondaires.

Bénéfices attendus

Ce projet préclinique sur la souris sera suivi par la validation des résultats sur pièces chirurgicales de patients (biopsies), suivi d’une étude clinique de phase II de radiothérapie adaptative en fonction des résultats de ce projet.

Procédures

70 souris recevront une injection de cellules tumorales dans la patte arrière gauche. Ces 70 souris recevront différentes interventions : 14 souris recevront 2 IRM (45 minutes chaque séance) espacées d’au moins 5 jours (EU imagerie). 28 souris recevront une séance unique de radiothérapie (5 minutes) (EU radiothérapie), dont 14 seulement recevront une IRM (EU hébergement et EU imagerie). 28 souris recevront une séance d’IRM de 45 minutes (EU imagerie), dont 14 souris recevront une séance unique de radiothérapie qui dure 5 minutes (EU radiothérapie). Avant toute injection de cellules tumorales, IRM, radiothérapie : les souris sont anesthésiées par un gaz volatile anesthésiant.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales peut générer une inconfort local léger et transitoire. La masse tumorale peut entraîner une gêne fonctionnelle progressive, une infection ou une ulcération. La radiothérapie peut causer des brûlures autour du site irradié 24 à 48 heures post-irradiation. Néanmoins, nous n’avons jamais observé ces nuisances à cette dose.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour analyses histologiques de la tumeur. De plus, d’autres organes comme les ganglions, le foie et les poumons seront prélever pour des expérimentations ultérieures afin d’étudier la dissémination tumorale.

Remplacement

A l’heure actuelle, aucun modèle informatique, in vitro ou organoïde ne permet de reproduire fidèlement la complexité des zones résistantes et la réponse aux radiations ionisantes in vivo. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc incontournable pour garantir la pertinence des résultats avant une transposition à l’Homme.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été rigoureusement calculé afin d’obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux engagés dans l’étude. Chaque groupe expérimental comporte ainsi un effectif restreint, mais suffisant pour assurer la validité scientifique des conclusions. Selon l’expérience de l’équipe et les équipes qui travaillent en collaboration sur ce projet, 12 souris par groupe sont nécessaires afin de mener l’étude et de garantir une puissance statistique suffisante. Sur la base de l’expérience de l’équipe, un taux d’échec de pousse tumorale d’environ 15 % est observé, donc . Pour compenser ces pertes et disposer d’un nombre suffisant de données exploitables, 14 souris par groupe sont prévues.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement ont été mises en place afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux, tout en garantissant la validité scientifique des données recueillies. Une habituation à la manipulation sera réalisée progressivement. Le choix du site d’injection des cellules tumorales (patte postérieure gauche, en sous-cutanée) a été réfléchi pour limiter la gêne fonctionnelle et éviter l’exposition des organes internes sensibles lors de la radiothérapie. Ce site permet également une croissance tumorale plus homogène et plus facilement mesurable, tout en étant bien maîtrisé par l’équipe. Le suivi des animaux est rigoureux : les animaux sont observés au minimum trois fois par semaine, et quotidiennement à partir de l’apparition de la tumeur. Toute altération de leur état de santé entraînera l’administration d’antalgiques : injection en sous-cutanée d’anti-inflammatoire. Si la douleur persiste plus que 24h, une injection d’analgésique sera effectuée. Si nécessaire, l’expérimentation sera arrêtée selon les points limites mis en place. Les anesthésies nécessaires aux injections de cellules, examens IRM et à l’irradiation sont réalisées avec un apport en oxygène, pour une induction et un réveil rapide. Un tapis chauffant est utilisé pour éviter l’hypothermie, et une surveillance post-anesthésique est assurée jusqu’au retour complet à l’état de veille. Le transport des animaux entre les sites d’hébergement et d’imagerie est limité au strict nécessaire (5 minutes sur un chariot adapté) et le transport entre le site de radiothérapie et d’imagerie sera effectué dans des véhicules à température contrôlée, avec des caisses ventilées adaptées (25 minutes). Les trajets sont courts et les animaux sont replacés rapidement dans un environnement familier.

Choix des espèces

Le modèle de souris a été choisi pour sa pertinence biologique, sa robustesse et son large usage en recherche préclinique en oncologie. Son génome est entièrement connu, avec une forte similarité fonctionnelle avec celui de l’Homme. Ce modèle permet une vision intégrée de la tumeur et de son microenvironnement. Le modèle tumoral utilisé, basé sur l’injection de cellules tumorales issues de carcinomes oraux chimiquement induits, est bien documenté et reproduit les caractéristiques des cancers ORL humains. L’utilisation de souris immunocompétentes permet d’étudier les interactions entre tumeur, radiothérapie et système immunitaire. Leur petite taille les rend compatibles avec les plateformes d’IRM préclinique et d’irradiation ciblée. Ce choix favorise ainsi une cohérence entre les données d’imagerie et histologiques animales, et celles prévues chez l’Homme, renforçant la validité translationnelle du modèle. Les souris seront âgées de 7 semaines à la réception afin qu’elles aient atteint le stade adulte et un système immunitaire mature lors de la séquence thérapeutique.

Jusqu'à six IRM sous anesthésie et cinq prélèvements sanguins par animal, après une greffe de tumeur dans le cerveau puis son ablation chirurgicale : 300 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Une partie reçoit en plus une séance de radiothérapie à 10 Gy, dont le porteur indique qu'elle pourrait provoquer une nécrose du cerveau et de l'os au point d'irradiation. Le projet reproduit la prise en charge clinique du glioblastome pour y ajouter un composé local à tester, le porteur décrivant l'animal comme un "système d'essai" physiologiquement proche de l'être humain. Troubles neurologiques, convulsions, incapacité de boire ou de manger, perte de 15 % du poids : ce sont les seuils qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement à ce jour de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est, dans un modèle de glioblastome orthotopique (dans l’organe dans lequel il se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau dans ce cas) chez les rongeurs (rats) décrit dans la littérature, de reproduire la prise en charge clinique et d’y ajouter un traitement local de nouveau composé afin d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique du composé d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de glioblastome. En d’autres termes, les études couvertes par ce projet permettront, avant les essais cliniques chez l’homme, d’évaluer l’efficacité de composés destinés à traiter les tissus cancéreux résiduels de glioblastome chez l’homme. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, les modèles et site d’implantation choisis (dans l’organe dans lequel la tumeur se développe normalement, c’est-à-dire le cerveau) permettront de reproduire la prise en charge clinique actuelle chez l’homme et d’apprécier le bénéfice de nouvelle thérapies ajoutées en sus sur la survie des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La greffe tumorale intra cérébrale, ainsi que sa résection seront des procédures chirurgicales d’une trentaine de minutes environ et seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire. Les animaux vigiles pourront également recevoir un unique traitement de radiothérapie sous anesthésie dans un établissement spécialisé (trajet ne dépassant pas 40 min aller-retour et 15-30 min de traitement par animal). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Il sera réalisé un maximum de 5 prélèvements sanguins par animal, répartis sur la durée totale de l’étude. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Il sera réalisé un maximum de 6 IRM par animal.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles la greffe de la tumeur (implantation de fragment) est réalisée dans le cortex cérébral pariétal. Compte tenu de l’analgésie, la douleur opératoire et post-opératoire sera de niveau modéré. L’évolution du volume tumoral, la résection et le traitement topique pourront entrainer des troubles tels que des troubles neurologiques (diminution de la mobilité, convulsions, incapacité de boire ou manger, apathie) ou une perte de poids qui constitueront un point limite. Les animaux recevront des traitements par radiothérapie ou voie orale. Ces actes entraineront un stress léger. La séance de radiothérapie à la dose 10Gy pourrait induire de la nécrose cérébrale et de l’ostéonécrose sur le site de radiation. Le jour du démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (en poids et/ou du volume tumoral) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lors des prélèvements sanguins, la contention ou l’anesthésie entraineront un stress léger. Lors des acquisitions IRM, l’anesthésie entrainera un stress léger.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament nécessitent d’étudier leurs interactions dans un contexte global et anatomique et cela ne peut pas être transposé dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus sont à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s), à savoir le poids et le volume tumoral. Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques (ANOVA) soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 8 et 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires ne pourra pas excéder 20%. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe et la résection du fragment de tumeur seront réalisées sous anesthésie générale et locale avec administration préalable d’un analgésique opiacé et d’un alpha 2 agoniste (type xylazine, médétomidine ou équivalent). En fin de chirurgie et les 2 jours suivant (total 72h), un anti-inflammatoire non stéroïdien (type meloxicam ou équivalent) ou un corticoïde sera administré. 4h, 6 à 8h et 24h après la chirurgie, les animaux recevront un analgésique opiacé. Un anesthésique local (type lidocaïne) sera également injecté en sous-cutané avant la chirurgie. La chirurgie de greffe sera réalisée stérilement avec un cadre de stéréotaxie. Les procédures seront réalisées sous maintien de la température corporelle et surveillance post-opératoire jusqu’au réveil puis toutes les 2h (6h au total). Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les expérimentateurs sont formés pour effectuer ce type de chirurgie et évaluer spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Une perte de poids de 15% ou prolongée (entre -10 et -15% sur 3 jours consécutifs) constituera un point limite. Les autres points limites concernent l’état général de l’animal. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasive permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.

Choix des espèces

Diverses souches de rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter la greffe des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.