Cancers

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer du foie, elles reçoivent des traitements par gavage cinq jours sur sept ou par injection pendant huit semaines, des échographies sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable" des immunomodulateurs testés, alors que les souris portent une tumeur hépatique évolutive. Il conclut qu'aucun modèle ne reproduit ces interactions et parle d'un "passage obligatoire par le modèle animal".

Objectifs

Notre projet est d’évaluer l’intérêt de l’immunomodulation dans le CHC, et pour se faire il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de CHC immunocompétent. Nous proposons d’utiliser un modèle de souris transgénique (ASVB) développant un carcinome hépatocellulaire évoluant en trois stades bien définis : dysplasie, nodulaire, et diffus (Dupuy, et al., 2003 ; Contreres, et al., 2006 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). Ce modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain) (Dupuy, et al., 2003 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). De plus, des résultats préliminaires ont montré une augmentation de l’expression de PD-1 et PD-L1 au cours du développement du CHC (Tijeras-Raballand, et al., abstract accepté ILCA 2019). Toutes ces caractéristiques en font un excellent modèle d’étude pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seul 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti- PDL1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. Ce projet tend donc à proposer des méthodes combinatoires, permettant à la fois d’augmenter l’efficacité des thérapies proposées, ainsi que d’éviter l’apparition de résistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 type d'intervention en étant vigiles: L'administration du traitement soit par gavage 5 jours sur 7 soit en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 8 semaines. Ils seront ensuite anesthésiés pour être soumis à un échodoppler qui n'est pas une précédure invasive, donc non douloureuse 3fois (à 8 12 et 16 semaines). Enfin, ils seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale où les animaus ne seront pas réveillés à 16semaines.

Impact sur les animaux

Il n'y a aucun effets indésirables attendus avec l'utilisation d'immunomodulateurs. Aussi, la dose sélectionnée de Sorafenib (traitement contrôle dont on connaît les effets) a été choisie pour ne pas induire d'effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après l’échographie de la 16ème semaine par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti-PD-L1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. A ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, tout en étant statistiquement valide, le nombre d’animaux par groupe (10) a été déterminé grâce aux expérimentateurs (personnel en charge de l’échographie, anatomo-pathologistes, pharmacologues et chercheurs) qui participent à ce projet et qui ont de l’expérience avec ce modèle. De plus, dans la mesure du possible, plusieurs groupes de traitements seront testés en parallèle afin de ne pas multiplier le groupe contrôle (ou placebo), pour un total de 360 animaux sur 36 mois. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes de monothérapie et les groupes de monothérapie avec les combinaisons.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (qui ne sera jamais pris en compte individuellement dans la mesure où l’accroissement du volume hépatique peut provoquer une légère prise de poids), le gonflement de l’abdomen (signe de développement tumoral trop important) et la survenue d’une gêne pour se déplacer (signe de douleur possible au niveau hépatique). Le comportement et l’apparence physique feront aussi l’objet d’observations. Les dispositions retenues pour stopper ou atténuer les problèmes liés à l’apparition de points limites seront prises dès constatation. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC). Ce modèle est un des rares modèles immuno-compétents de CHC, disponibles pour l’étude de nouvelles thérapies. Le modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain). Les anomalies vasculaires observées sont également les mêmes que celles observées chez l’homme et permettent d’analyser les effets anti-angiogéniques attendus des molécules, en plus de leurs effets antitumoraux. Enfin, ce modèle possède un stroma immun riche et complexe, à l’image de celui observer dans les tumeurs issues de patients. Le début de l’administration des médicaments aura lieu à l’âge de 8 semaines. En effet, dans ce modèle, 3 stades de carcinogenèse bien définis ont été mis en évidence. Une hyperplasie (8 semaines), stade nodulaire (12 semaines) et carcinome diffus (à partir de la semaine 16). En oncologie, les patients commençant à être traités une fois leur pathologie déclarée, cela explique pourquoi nous attendons également le début de la carcinogenèse dans les animaux.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas

Procédures

Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Remplacement

Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Choix des espèces

Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.