Cancers

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales du foie, par chirurgie dans l'organe ou par injection sous la peau, puis des traitements par voie intrapéritonéale ou par plasma froid et un suivi par imagerie sous anesthésie, pour évaluer de nouvelles thérapies des cancers hépatiques. Le porteur indique que la contrainte principale tient au développement tumoral et prévoit des points limites. Il affirme qu'il n'est "pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de vaccination puis une greffe de cellules tumorales sous la peau, pour tester si une vaccination prévient l'apparition de tumeurs des voies aérodigestives. Le porteur indique que des tumeurs sont attendues, au moins dans les groupes témoins, et prévoit des points limites de taille et d'aspect. Il affirme que le recours à des souris immunocompétentes est "indispensable" et invoque le même fond génétique de l'"organisme entier" pour éviter le rejet de greffe.

Objectifs

Les carcinomes épidermoïdes de la tête et du cou (CETC) définissent un groupe hétérogène de tumeurs malignes qui se développent au dépend de l'épithélium des voies aérodigestives supérieures (cavité orale, pharynx et larynx). Les CETC sont le 6ème cancer le plus fréquent dans le monde, avec plus de 600 000 cas diagnostiqués chaque année. Leur incidence est particulièrement élevée en Europe de l'Ouest, et dans le Nord et le Nord-Est de la France (23 cas/100.000 habitants). Les CETC diagnostiqués à un stade précoce sont traités par radiothérapie ou chirurgie, et le pronostic est bon avec une survie globale à 5 ans d'environ 90%. Cependant, la majorité des CETS sont diagnostiqués à un stade localement avancé. La prise en charge de ces tumeurs de haut grade est multimodale et repose sur la combinaison de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie à base de platine. Malgré des modalités de traitement agressives, le pronostic des CETC ne s'est que marginalement amélioré au cours des trois dernières décennies, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 45-50 %. Ces traitements sont agressifs, avec de nombreux effets secondaires qui impactent très négativement la qualité de vie des patients, et malgré cela, le pronostic de ces tumeurs reste sombre, avec une survie globale à 5 ans inférieure à 50%. Très récemment, les immunothérapies (qui visent à mobiliser le système immunitaire du patient contre la tumeur) ont été développées pour la prise en charge des patients avec une tumeur ORL. Ces alternatives thérapeutiques peuvent provoquer des réponses tumorales complètes et de longue durée, mais ce uniquement chez environ 20% des patients. Nous souhaitons évaluer l’hypothese qu’un traitement de ces cancers avec des thérapies ciblées deja utilisees dans la pratique clinique puisse provoquer une mort cellulaire particuliere qui stimule le systeme immunitaire. Cette mort cellulaire, dite immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter leur efficacité. L’enjeu de ce projet est donc la réalisation d’une expérience d’immunisation (vaccination) sur de modèles murins de cancer et l’évaluation de la capacité de cette vaccination à prévenir l’apparition ou la progression tumorale de manière prophylactique.

Bénéfices attendus

Cette approche nous permettra d’établir si les protocoles de vaccination que nous avons mis au point sont capables de mobiliser le système immunitaire. Si une action anti-tumorale prophylactique est démontrée, cela permettra d’établir un rationnel solide sur l'induction d'une MCI. Cette mort cellulaire immunogène, pourrait à son tour stimuler la réponse aux immunothérapies et en augmenter l’efficacité pour des stratégies thérapeutiques futures.

Procédures

Chaque souris engagée dans ce projet sera d'abord injectée en sous-cutanée avec une suspension cellulaire pour la phase de vaccination. Une semaine plus tard, une deuxième injection sous-cutanée de suspension de cellules tumorales sera réalisée pour induire une tumeur.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 2 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle. Ce geste ne devrait pas engendrer de douleur ou de souffrance particulière. La deuxième injection a pour but d'effectuer une greffe tumorale. Nous nous attendons donc à observer l'appartition de tumeurs, au moins pour les groupes témoins si la vaccination devait être un succès. Les souris seront surveillées tous les jours afin d'observer leur état général (état du pelage, comportement...). Des points limites sont définis (aspect et taille de la tumeur par exemple) pour pouvoir soustraire un animal avant qu'une souffrance ou une douleur ne s'installe.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet. En effet, il est nécessaire de pouvoir continuer l'étude en réalisant des analyses au laboratoire à partir des tissus prélevés sur ces animaux.

Remplacement

Après plusieurs travaux in vitro très encourageants, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La démonstration de la mobilisation de la réponse immunitaire en réponse au traitement est impossible in vitro, et demande l’utilisation de souris immunocompétentes, chez lesquelles le déclanchement d’une réponse immunitaire anti-tumorale est réalisable par des expériences de vaccination. Ainsi, les enjeux de ce projet sont la démonstration de l’efficacité in vivo de cette modalité thérapeutique, qui pourra à terme trouver une application dans l’amélioration de la prise en charge des patients. La démonstration de capacité de notre protocole vaccinla à induire une MCI complète nécessite des éléments de preuves in vivo, chez des modèles murins immunocompétents, à travers des expériences de vaccination. Cette approche est la seule admise dans la littérature permettant de prouver la mobilisation du système immunitaire et la constitution d’une mémoire immunitaire anti-tumorale.

Réduction

Le projet nécessitera un nombre maximum de 120 souris. Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette). Les animaux sont surveillés quotidiennement comme l'exige la réglementation en vigueur. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites ont été établis (taille et aspect de la tumeur) permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris de la lignée C57BL/6. Ceci se justifie par le fait que les lignées cellulaires que nous allons utiliser sont dérivées de carcinome ORL de souris C57BL/6. Il est indispensable que les lignées cellulaires et l'organisme entier utilisé pour cette étude que faut le même fond génétique pour éviter un phénomène de rejet de greffe (les souris C57BL/6 étant immunocompétentes). Des souris de 6 à 8 semaines seront utilisées. En effet, l’âge de 6-8 semaines correspond à la période de maturation de la réponse immunitaire, et plus particulièrement de la réponse lymphocytaire.

2 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une à trois injections et une greffe de cellules tumorales pour induire un mélanome, la plupart des injections étant faites sans anesthésie, que le porteur juge plus traumatisante que l'acte lui-même. Il décrit comme principal risque l'ulcération de la tumeur, et toutes les souris sont mises à mort en fin d'étude pour des analyses post-mortem. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'existe et que ces expériences sont "indispensables" car les interactions in situ ne peuvent être modélisées in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à déterminer le rôle précis d’un récepteur de signal de danger dans les réponses immunitaires anti-tumorales dans un modèle de mélanome chez la souris. Pour cela nous utiliserons des modèles de souris conditionnellement déficientes pour ce récepteur et nous leur injecterons des cellules tumorales suivi ou non de transfert adoptif de lymphocytes T protégeant ou attaquant la tumeur et nous étudierons la pousse tumorale, le phénotype des cellules immunitaires recrutées au sein de la tumeur et des ganglions drainants. Enfin nous évaluerons l’influence de traitements immunothérapeutiques dans ces modèles de souris.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé publique majeur, et la 2ème cause de mortalité dans le monde. Récemment, des traitements développés chez la souris visant à lever les phénomènes de tolérance immunitaire contre le cancer ont prouvés leur efficacité chez l’Homme et redonnés un espoir de réduire la mortalité liée à cette maladie. Ces traitements n’ont néanmoins pas encore permis d’éradiquer la maladie. Ce projet permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer les immunothérapies visant à inhiber la tolérance immunitaire aux tumeurs et augmenter l’efficacité des vaccins contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis à des Injections sous cutanées, intra péritonéales, intraveineuses. Chaque animal recevra entre 1 et 3 injections selon la procédure: procédure 1 : 1 seule injection sous-cutanée; procédure 2: une injection sous-cutanée et une injection intraveineuse (sur animal anesthésié) 1 à 3 jours plus tard; procédure 3: 1 injection sous-cutanée et 2 injections intrapéritonéales, chacune à 7 jours d'intervalle. Sauf cas indiqué, les procédures ne justifient pas l’utilisation d’anesthésiques. Une procédure de sédation rendrait en effet l’ensemble de la procédure plus traumatisante pour l'animal que la procédure expérimentale elle-même.

Impact sur les animaux

Les procédures de notre projet sont bien établies et réalisées par du personnel expérimenté pour leur réalisation. Les nuisances et effets indésirables possibles ont donc peu de chance de se produire. Etant donné les précautions prises dans l’exécution du projet, les risques comportent principalement l’ulcération de la tumeur chez les animaux porteurs de tumeurs et les éventuelles réactions secondaires (irritations cutanées, diarrhées, poil hirsute, perte de poids) aux traitements immunothérapeutiques. Pour éviter leur apparition, le comportement des animaux sera contrôlé régulièrement (tous les jours par le zootechnicien et 3 fois par semaine par l’expérimentateur). Nous serons vigilants aux changements de comportement et d’aspect des souris et les évalueront au moins 3 fois par semaine à l’aide d’un système de scoring détaillé. L’apparition de nuisance ou d’effet indésirables donnera lieu à une réponse graduée en fonction du score. Parmi les actions à prendre, figurent le traitement des animaux par des analgésiques ou la mise à mort des animaux qui atteidraient un point limite.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique que l’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l’étude de façon éthique par des personnes expérimentées.

Remplacement

En termes de remplacement, aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'étant disponible pour cette recherche, ces expériences chez la souris sont indispensables car les interactions complexes se déroulant in situ ne peuvent être modélisées in vitro. Mais pour les tests fonctionnels nous remplacerons chaque fois que possible l’utilisation des animaux par des tests in vitro. Il est à noter que parmi les 10 molécules les plus efficaces en cancérologie développées depuis 20 ans, toutes ont été découvertes grâce aux modèles murins. En particulier les découvertes de James Allison et de Tasuku Honjo leur ont valu le Prix Nobel en 2018, signe que l’immunothérapie est un espoir contre le cancer et que les avancées majeures passent par l’étude de modèles animaux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons établi des procédures expérimentales tenant compte de l'effectif minimal pour atteindre une puissance statistique suffisante. L’utilisation de techniques modernes de phénotypage et les tests in vitro développés par notre équipe permettra également de réduire le nombre de souris utilisées. Des études exploratoires sur un petit nombre de souris seront réalisées pour sélectionner les meilleures stratégies avant d’évaluer leur impact sur un nombre plus important d’animaux. Pour mener à bien le projet sur l'ensemble des lignées, 2860 souris seront étudiées.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, nous avons mis en place des points limites précis et un système de score afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux. Les animaux seront contrôlés régulièrement et scorés par du personnel formé et compétent afin de détecter les changements de poids d’aspect et l’apparition de comportements associés à la douleur. En cas de signes précoces d’ulcération tumorale ou de souffrance, les animaux recevront des antidouleurs, et s’ils présentent de l’hypothermie ou des difficultés à se nourrir, ils seront placés dans des cages chauffées ou en présence de nourriture humidifiée respectivement. Ils seront mis à mort si le diamètre tumoral dépasse une valeur seuil ou s’ils perdent une valeur seuil de leur poids. Les souris âgées de 7 à 15 semaines seront hébergées en groupe en accord avec la législation en vigueur avec un nombre maximum de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (lanières de papier permettant la nidification) avec un accès illimité à la nourriture et l'eau de boisson au sein d’une animalerie A2 avec surveillance informatique du respect des paramètres environnementaux (température, hygrométrie). Les animaux seront anesthésiés pour la réalisation des procédures les plus stressantes pour l'animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle valide en immunologie, en immunologie des tumeurs et particulièrement dans les études visant à mieux décrire une voie de signalisation. L’homme et la souris ont un système immunitaire proche et partagent les mêmes sous-populations de cellules immunitaires. Les modèles mimant le développement tumoral existent et sont très bien caractérisés. Nous pourrons facilement implémenter ces modèles et ainsi minimiser le nombre de souris nécessaires pour notre étude. Par ailleurs, le modèle souris offre l’avantage de pouvoir utiliser des outils immunologiques puissants permettant de suivre les cellules spécifiques d’antigène. Du fait de l’utilisation de ces modèles très spécifiques, le projet tel qu’il est ne pourrait pas être réalisé dans une autre espèce animale. Nous utiliserons des souris adultes de 7 à 15 semaines d’âge, conditions favorables permettant d’obtenir un stade de maturité immunitaire suffisant tout en limitant le temps d’hébergement total.

1 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse ou dans la veine du foie, puis l'injection de radioéléments couplés à des vecteurs et jusqu'à huit prélèvements sanguins sur cinq mois, pour évaluer de nouveaux médicaments radioactifs contre le cancer. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être étudiés in vitro et que le recours aux animaux est "indispensable". Les bénéfices annoncés, un transfert en clinique, restent formulés comme une perspective.

Objectifs

L’objectif principal de notre plateforme est de développer de nouveaux traitements contre le cancer. Nous disposons de différents vecteurs (Anticorps, affitines, liposomes, etc…) et de plusieurs radioéléments (Astate 211, Iode 131, zirconium, Yttrium 90 Scandium 47, cuivre 64 etc…), certains connus qui servent de références et des nouveaux, produits. La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. Il faut accrocher le radioélément à un ligand et à un vecteur afin de former un radiopharmaceutique qui doit cibler et détruire la cellule tumorale tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Nos études suivent le même protocole. Le système vecteur- ligand-radioélément est d’abord testé sur des cellules tumorales en culture. Quand l’efficacité est démontrée, les cellules tumorales sont greffées à des souris. Le système vecteur- ligand-radioélément est injecté aux animaux porteurs de tumeurs pour étudier la distribution dans un organisme vivant, la fixation du radioélément sur la tumeur et tous les organes. La radiothérapie sera appliquée sur 2 types de modèles de métastases expérimentales : injection intraveineuse dans la veine latérale de la queue qui engendre un envahissement disséminé et injection dans la veine porte hépatique qui permet un envahissement du foie. Ces 2 procédures reflètent les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de produire un radiopharmaceutique capable de détruire les cellules tumorales dans des modèles précliniques. En vue d'un futur transfert à la clinique.

Procédures

Greffe de cellules tumorale en intraportale (Procédure 2) : Cette procédure reflète les propriétés de colonisation et de domiciliation des cellules tumorales. Elle permet d’évaluer l’efficacité anti-métastatique des traitements. Injection unique. Concerne 700 souris sur souris analgésiées et anesthésiées. La procédure chirurgicale en elle même dure 15 minutes par souris. Les souris sont ensuite suivies jusqu'à 150jours. Prélèvement sanguins 50µl de sang à J-7,15,30,45,60,90,120, 150 pour évaluer toxicité hématologique (procédure 3). Lors des prises de sang, une goutte de tétracaïne 1% collyre unidose est appliquée au niveau de l’œil puis les souris sont anesthésiées sous isoflurane, et le sang est prélevé au niveau du sinus rétro orbital à l’aide d’un capillaire. Les prélèvements en eux mêmes ne durent qu'une trentaine de secondes et concernent 1750 souris.

Impact sur les animaux

Les procédures de modèles de métastases (procédure 1 et 2) sont modérées si les animaux sont bien suivis. Ils seront suivi quotidiennement selon une grille de score et de points limites (en annexe) qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. En palier 1 (un critère de la liste en annexe): AINS : Méloxicam 2.5 mg/kg/jour dans l’eau de boisson. En palier 2 (2 critères associés de la liste en annexe) : morphinique faible : Buprénorphine 0,05 mg/kg en sous-cutané matin et soir (soit 50 µL à 0,03 mg/mL pour une souris de 25 g). En palier 3 : mise à mort. La procédure de thérapie (3) pourrait entraîner des effets indésirables. Le traitement analgésique sera mis en place en accord avec le palier de douleur observé. Enfin, la procédure d'imagerie (4) n'entraine pas d'effet indésirable

Devenir

Porocédure 1 : 1050 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie. Procédure 2 : 700 souris gardées en vie pour thérapie (procédure 3) dont 1/3 seront imagées pour suivi thérapeutique (procédure 4). Toutes sont mises à mort à l'issue de la thérapie.

Remplacement

Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.

Réduction

Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism. Nous utiliserons des T-tests non paramétriques pour les analyses intergroupes, et un test Logrank pour l’analyse des courbes de survie.

Raffinement

L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées par trois ou cinq en fonction des protocoles, avec des frisotis pour pouvoir faire un nid. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé.

Choix des espèces

Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe

98 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses coliques leur sont transplantées, les animaux sont maintenus vingt-cinq jours puis tués pour prélever la tumeur, un régime riche en lipides étant testé pour son effet sur la tumorigenèse. Le porteur indique que du sang dans les fèces ou tout autre effet indésirable entraînera la mise à mort de l'animal, et précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas modifier la réponse inflammatoire. Il affirme que l'effet d'un régime alimentaire ne peut être caractérisé in vitro et que la proximité physiologique avec l'humain justifie le recours à la souris.

Objectifs

L’enzyme Elovl5 catalyse l’élongation des acides gras et son expression est augmentée dans les tissus coliques tumoraux comparés aux tissus sains chez l’Homme. De plus, nos résultats in vitro montrent que l’inhibition de cette voie métabolique réduit la prolifération des cellules cancéreuses du côlon. Notre projet vise à démontrer l’importance de l’enzyme elovl5 dans le développement du cancer du côlon et à évaluer l’importance d’un régime riche en lipides dans ce contexte. En effet, un régime riche en lipides augmenterait la tumorigenèse colique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’importance de Elovl5 dans le développement de cancer colique dans un contexte nutritionnel riche en lipides. Nous attendons une effet protecteur de l’absence d’expression Elovl5 validant cette enzyme comme cible thérapeutique. L’utilisation des modèles CT-26 et MC-38 permet de comparer le comportement de deux lignées cancéreuses coliques murines avec des profils mutationnels différents.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection sous-cutanée pour transplantation des cellules cancéreuses.

Impact sur les animaux

Les modèles utilisés de transplantation de cellules cancéreuses en sous-cutanée et de cancer colique induit par AOM et HFD peuvent induire des nuisances concernant le stress lié à la contention de l’animal au moment des différentes injections. Dans le modèle de cancer colique, du sang dans les fèces pourrait apparaître et occasionnerait la mise à mort de l’animal. Tout autre effet indésirable conduira également à la mise à mort de la souris (nécrose tumorale, changement de comportement ou d’apparence). Les animaux seront suivis quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses, les souris seront maintenues 25 jours en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement de la tumeur.

Remplacement

L'utilisation de ces modèles murins de cancer sont nécessaires pour évaluer la progression tumorale et métastatique dépendante d’acteurs cellulaires différents (système immunitaire notamment). L’effet d’un régime alimentaire ne peut être caractérisé dans un modèle in vitro. Par ailleurs, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 178 souris mâles sur un fonds génétique C57Bl6 seront utilisées.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche C57Bl6 a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. D’un point de vue technique, le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée.Des souris mâles âgées d’au moins 6 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses. Les souris wt et Elovl5 ko seront mises sous régime spécifique également dès 6 semaines pour prise de poids rapide.

240 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein triple négatif leur sont injectées sous la peau, la tumeur est suivie au pied à coulisse et des composés sont administrés par voie orale ou intrapéritonéale plusieurs fois par semaine. Le porteur indique que la littérature ne prévoit pas d'effet secondaire notable de ces composés et que les animaux ne développant pas de tumeur seront tués huit semaines après la greffe. Il affirme qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution du composé et l'organisation d'une tumeur, et conclut à la nécessité d'un recours aux animaux.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent en France et représente la première cause de décès par cancer chez la femme. (Source : Santé publique France). Il existe plusieurs types de cancer du sein dont un appelé triple négatif. Peu de solutions efficaces sont disponibles pour le traitement du cancer du sein triple négatif, aussi le but de ce projet est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour se développer les cellules cancéreuses ont besoin de ressources importantes et notamment de protéines. Récemment, plusieurs facteurs nécessaires à la synthèse des protéines ont été identifiés, et vis-à-vis desquels les cellules cancéreuses sont dépendantes. L'inactivation de ces facteurs bloque les propriétés tumorales des cellules cancéreuses et induit leur mort. Les cellules saines ne sont pas affectées par l'inhibition de ces facteurs. Ceci a été montré in vitro pour plusieurs cancers dont la prostate, le colon ou le mélanome. Un travail préliminaire a été mené qui étend cette approche au cancer du sein de type triple négatif en utilisant une dizaine de modèles cellulaires, par des approches in vitro de culture de cellules en 2 dimensions et en 3 dimensions. En particulier in vitro deux approches ont été validées, l'une par inhibition de l'expression de ces facteurs par des outils génétiques, l'autre par inactivation de ces facteurs à l'aide de composés chimiques, qui sont des candidat médicaments en cours d'évaluation clinique dans d'autres pathologies. Il est maintenant nécessaire de vérifier si un effet anti-tumoral est obtenu lorsque les cellules sont organisées en tumeur. Le modèle de choix utilisé est la greffe de tumeurs sous-cutanée de cellules tumorales humaines chez la souris immunodéprimée. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps, puis les tumeurs seront collectées et analysées par histologie afin de déterminer l'impact des composés sur la prolifération et la mort des cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anticancer en santé humaine. En effet, altérer la synthèse des protéines des cellules cancéreuses est une nouvelle approche thérapeutique anticancer qui semble très prometteuse selon les premiers essais cliniques. Afin d'évaluer le véritable potentiel thérapeutique de cette approche, la communauté scientifique fait face à deux enjeux : premièrement, déterminer les cancers qui bénéficieraient de cette nouvelle approche ; deuxièmement, identifier de nouveaux médicaments. Ainsi les bénéfices de ce projet seront précisément de : 1- Apporter des données in vivo pour finaliser une étude in vitro en cours sur le cancer du sein de sous-type triple négatif. 2- Démontrer que les composés utilisés n'ont pas d'effets secondaires notables chez la souris. 3- Disposer de résultats obtenus dans des modèles animaux qui seront nécessaires avant d'initier des études cliniques chez l'Homme.

Procédures

Des cellules humaines de cancer du sein seront injectées sous la peau des souris. Pour cela l’animal est maintenu environ 15 secondes sans stress. Une seule injection de 0,1 mL est réalisée par animal. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans les 2 à 3 semaines qui suivent. Le développement tumoral sera suivi par simples mesures au pied à coulisse (3x/semaines), sur animal vigile maintenu immobile environ 20 secondes. Les composés seront administrés soit par voie orale (2x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaines ; 10 secondes).

Impact sur les animaux

Implantation des tumeurs : Les cellules seront injectées sur animal vigile, pour cela l’animal est tenu en contention sans stress. Le volume d’injection est faible (0,1 mL). Une seule injection par animal, durée 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée dans un délai de 2 à 3 semaines, sans géner la mobilité des animaux. Suivi des greffes de tumeurs : Le développement tumoral sera suivi par mesures au pied à coulisse, sur animal vigile tenu en contention. Fréquence : 3x/semaine, 20 secondes. Traitements : Les souris seront traitées par voie orale (3x/semaine ; 15 secondes) ou par injection intrapéritonéale (5x/semaine ; 10 secondes). La littérature indique que ces composés n'induisent pas d'effet secondaire chez les souris. Un des objectifs du projet étant de confirmer ces données, les animaux bénéficieront d'une vigilance toute particulière dans la détection de signes de souffrance. Un des traitement sera administré dans l’eau de boisson. Celui-ci a un goût amer, donc pour que les souris s’hydratent correctement, 3% de sucre sont ajoutés dans l’eau de boisson.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux, ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. Les animaux ont subi une injection de cellules tumorales, ils ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

L'efficacité des composés a été validée in vitro, sur des cellules en culture, par plusieurs approches complémentaires. Néanmoins, l'efficacité d'un composé médicament dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de la tumeur et de son environnement. Aujourd'hui, il n'est pas possible de reproduire in vitro la distribution et l'élimination du composé dans un organisme, ni de reproduire à l'identique l'organisation d'une tumeur (par exemple la vascularisation ou la surveillance anti-tumorale). Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux pour valider l'efficacité in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour ces expériences. Une étude préliminaire de validation sera effectuée sur un petit nombre d'animaux (40 souris) avant d'engager l'étude principale. Les protocoles utilisés permettent d'effectuer l'ensemble des analyses sur une seule tumeur pour éviter de dupliquer les expériences et donc le nombre d'animaux. La procédure prévoit la collecte post-mortem de l'ensemble des tumeurs et des organes de plusieurs animaux afin qu'ils soient stockés et disponibles pour des analyses complémentaires qui pourraient être nécessaires (par exemple lors de l'expertise externe des résultats), et ce sans l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le nombre d'animaux a été fixé à 10 par groupe, en prenant en compte les éléments suivants : - Les contraintes statistiques. - Disposer d'un nombre minimum de 8 animaux par groupe, prenant en compte que la greffe ne prendra pas chez 10% des animaux et le risque qu'un animal meurt dans chaque groupe au cours de l'expérience. - La croissance de tumeur présente une variabilité de 30% - Observer un écart d'au moins 30% de baisse de croissance entre les moyennes des deux groupes

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe de 5 individus. Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. Sur la base de données disponibles, deux des trois composés seront administrés par voie orale. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris sera suivi par pesée des animaux et par une analyse histologique de plusieurs organes sur quelques animaux traités. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est le modèle de choix pour l'analyse de greffes de tumeurs humaines en oncologie. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles immunodéprimées de 6 à 8 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus, les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes d'animaux.