Cancers

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

1 610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeurs bronchiques humaines, des gavages quotidiens jusqu'à deux fois par jour cinq jours sur sept et des scanners, pour étudier la résistance aux thérapies ciblées du cancer du poumon. Le porteur indique des difficultés respiratoires liées à la tumeur et des inconforts liés aux gavages répétés. Il affirme que la croissance tumorale ne peut s'étudier que sur un modèle vivant et que les données précliniques chez la souris sont une étape "nécessaire".

Objectifs

L’objectif du projet est de comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des résistances aux thérapies ciblées dans les cancers bronchiques, principalement les inhibiteurs tyrosine kinase de l’EGFR (ou EGFR-TKi) dans le but d’identifier des combinaisons thérapeutiques permettant de limiter ou de prévenir la rechute chez les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet servira d'une part à apporter des connaissances scientifiques sur l'origine des mécanismes de résistance aux thérapies ciblées in vivo afin d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques, et d'autre part de tester les cibles qui auront préalablement été validées in vitro en réalisant des combinaisons de traitement dans le but de prévenir l'émergence de résistances. Les bénéfices seront à moyen terme de développer des essais cliniques chez les patients.

Procédures

1) Implantation de tumeurs sous-cutanées (PDX et xénogreffes) ; 5 à 10 minutes/manipulation, 1565 souris; 2) Gavages ; une à deux fois/jour, 5 jours/semaine,

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables potentiels ainsi que les mesures prises pour réduire, éviter ou atténuer ces nuisances sont décrits dans les procédures expérimentales. Les principaux effets indésirables peuvent être : 1) Des difficultés respiratoires liées à la tumorigénèse bronchique du modèle CCSP-rTA-EGFRL858R 2) Des inconforts liés aux gavages quotidiens 3) Des effets potentiellement indésirables liés aux traitements, dont les potentiels signes de toxicité feront l’objet d’un suivi rapproché

Devenir

Procédure 1 (implantation de PDX) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 2 (Implantation de cellules tumorales bronchiques humaines) : une fois les tumeurs établies, les souris seront traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 3 (Traitement des souris par gavage) : une fois les tumeurs établies, les animaux seront traités par gavage et mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 4 (Tumorigenèse pulmonaire du modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R) : la croissance tumorale sera déterminée par CT-scan (procédure 5) et les souris seront traitées par gavage (procédure 3) puis mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2. Procédure 5 (CT-scan) : la croissance tumorale sera monitorée, les souris seront ensuite traitées par gavage (procédure 3) et les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure selon les critères fixés en 4.2.

Remplacement

L'étude des mécanismes à l'origine des résistances aux thérapies ciblées est en majeure partie réalisée in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, pour étudier la croissance tumorale, la dissémination métastatique et la réponse aux traitements qui sont des processus complexes, il faut prendre en compte plusieurs paramètres comme la présence du microenvironnement tumoral, le métabolisme in vivo, la circulation sanguine ou encore la présence du système immunitaire le cas échéant, ce qui n'est possible que via l'utilisation de modèles vivants. De plus, l’obtention de données précliniques chez la souris est une étape nécessaire pour l’établissement d’un protocole clinique chez les patients.

Réduction

Le nombre de souris utilisées fera l'objet d'une étude statistique préalable a fin de limiter au mieux le nombre d'animaux à utiliser tout en garantissant la fiabilité statistique des résultats

Raffinement

Les souris sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur. Afin de réduire au maximum le stress des animaux, ils seront manipulés avec précautions et calme durant toute la durée de l’expérience. Pour éviter le stress des animaux, le milieu environnemental et les conditions d’hébergement des souris seront optimisés (enrichissement, igloos, ajout de gels nutritifs, manipulation par personnel formé). Si besoin, nous utiliserons un agent analgésique (Buprecare, Buprénorphine) pour réduire la douleur liée notamment à l'implantation de tumeurs sous-cutanées. Quand nécessaire, les souris seront anesthésiées à l'isoflurane 3%. Les souris seront quotidiennement observées pour détecter d’éventuels signes de souffrance (difficultés à respirer, prostration, dos voûté, agitation, activité sociale anormale).

Choix des espèces

Les souris NSG sont classiquement utilisées en oncologie car elles favorisent l’implantation et le suivi des tumeurs d’origine humaines (PDX), et les souris nudes sont classiquement utilisées dans le cadre de l’implantation et le suivi de lignées cellulaires telle que les lignées PC9, HCC4006 ou H3122. Il existe de plus de nombreuses données bibliographiques sur ces modèles, ce qui permet d’une part d’optimiser les séquences techniques (protocoles d’implantation) et d’autre part d’ajuster les traitements en fonction des données publiées. Le modèle CCSP-rtTA-EGFRL858R a déjà été utilisé dans de nombreuses études et notamment au laboratoire, car il présente le double avantage d’avoir des caractéristiques histopathologies très similaires aux adénomes et adénocarcinomes humains (Politi et al. Genes Dev. 2006) et de reproduire l’évolution clinique observée chez les patients sous traitement aux EGFR-TKi (Politi et al, Dis Model Mech. 2010 ; Starrett et al., Cancer Res. 2020). Implantation PDX et xénogreffes réalisés sur des souris jeunes âgées de 6 et 8 semaines, ce qui permet d’une part de favoriser la prise des greffes et d’autre part de pouvoir réaliser des traitements pouvant aller jusqu’à 6 à 8 mois selon les modèles.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour développer des cancers disséminés, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, afin de mettre au point des agents de diagnostic des métastases. Le porteur décrit une perte de poids et des signes de mal-être suivis par une grille, l'animal étant tué dès un score supérieur à 6, les autres tués pour prélever les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients relèvent d'une médecine personnalisée future, l'imagerie étant présentée comme réduisant le nombre d'animaux par rapport à une étude classique.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladies systémiques par l’apparition de métastases. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est d’abord de mettre en place des modèles de cancers disséminés mimant l’envahissement systémique des métastases, puis de développer de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer la réponse aux traitements anti-cancéreux et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira au développement d’agents d’imagerie non invasifs permettant le diagnostic et le suivi des métastases issues de divers cancer. Ces agents permettront une meilleure prise en charge des patients et sera un pas de plus vers la médecine personnalisée en oncologie. De plus, ce projet permettra l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre l’apparition de métastases au cours du développement tumoral.

Procédures

Les animaux subiront des injections de cellules par voie IP ou IV. Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie IP, IV ou oral (gavage). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (PET/SPECT/fluorescence/bioluminescence).

Impact sur les animaux

Le développement de modèles animaux de cancer disséminés est susceptible d’induire chez les animaux des signes cliniques tels qu’une perte de poids ou des signes de mal être qui seront très étroitement suivis tout au long des procédures du projet afin de mettre à mort les animaux dès l’apparition de ces signes cliniques indésirables comme décrit dans le tableau 1 en annexe. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera mis à mort. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tumeurs.

Remplacement

La mise en place de ce projet s’est attachée à respecter la règle des 3R. L’étude préalable des molécules d’intérêt sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée.

Réduction

En comparaison avec une étude « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux d’autant.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles quantifiables se substituant à des méthodes de prélèvements plus traumatiques pour l’animal. La totalité des procédures impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Les murins de type souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie moléculaire eux-mêmes très proches des appareillages humains (SPECT, TEP, IRM et fluorescence), facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales puis de cellules CAR-T, avec suivi de la croissance de la tumeur par imagerie sous anesthésie et prélèvements sanguins, jusqu'à une ponction intracardiaque terminale. Le porteur reconnaît l'apparition de tumeurs et de possibles difficultés respiratoires liées à des métastases pulmonaires. Il présente ce modèle murin comme un "prérequis indispensable" avant un éventuel essai clinique, tout en reconnaissant qu'aucun modèle animal n'existe encore pour cette stratégie.

Objectifs

Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules tumorales. Après réinjection aux patients, ces cellules dites "CAR-T" sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Les CAR-T cells représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certains cancers du sang réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète au traitement par la thérapie CAR-T cell, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules CAR-T, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie CAR-T cell, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices des CAR-T pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Avant administration des cellules progénitrices CAR-ProT et évaluation de l’effet thérapeutique, il est nécessaire de valider dans un premier temps le modèle animal pour le développement de tumeur de lymphome et la régression tumorale en injectant des cellules CAR-T matures, connues pour leur capacité d’élimination de tumeur in vivo. Si cette 1ère étude est concluante, une 2è étude sera réalisée avec les cellules progénitrices CAR-ProT et fera l’objet d’une 2è demande d’autorisation de projet.

Bénéfices attendus

Si le modèle animal, tel qu’il est décrit dans ce projet, permet de démontrer une réponse antitumorale avec une dose faible de cellules CAR-T classiques, nous pourrons ensuite continuer l’étude avec des cellules progénitrices CAR-ProTcell. Cette deuxième partie du projet fera l’objet d’une deuxième demande d’autorisation. A notre connaissance aucun modèle animal n’est établi à ce jour pour répondre aux besoins de nos études avec des cellules progénitrices humaines nécessitant de poursuivre leur différenciation in vivo en cellules effectrices. Le modèle doit être adapté à l’évaluation des fonctions anti-tumorales des progéniteurs des CAR-T génétiquement modifiés. Ce modèle murin représente par conséquent un prérequis indispensable afin de tester in vivo notre stratégie thérapeutique dans des conditions proches de celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable avant l’application éventuelle de notre stratégie thérapeutique innovante dans un essai clinique. Les résultats de ce projet permettront ainsi la validation du potentiel de notre plateforme et l’acquisition de données indispensables au développement clinique d’une thérapie innovante, à fort potentiel translationnel.

Procédures

Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections par voie intraveineuse (1X à l'age de 8 semaines); - des injections par voie intrapéritonéale et des anesthésies sous isoflurane pour suivre laecroissance tumorale par imagerie (2X/semaine, sur une durée de 1 mois environ); - des prélèvements sanguins, toutes les 2 semaines (sur une durée de 1 mois environ, soit 3X maximum); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, sous anesthésie profonde, sub-léthale).

Impact sur les animaux

Les cellules CAR-T matures pourraient occasionner au long cours une réaction des lymphocytes humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules hématopoiétiques humaines. La durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet effet indésirable. Par ailleurs, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Par ailleurs, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem

Remplacement

Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations phénotypiques et moléculaires du produit final par des méthodes de type séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire et par cytométrie de masse. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les cellules T matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules souches hématopietiques avec des cellules stromales. Bien que ce modèle permette d’obtenir des cellules T exprimant des marqueurs CD3 de différentiation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénotransplantation, réceptif aux cellules hématopoïétiques humaines, permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs lymphoides dans l’environnement thymique. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.

Réduction

La première étape de ce projet consiste à utiliser des cellules CAR-T matures et à valider le modèle tumoral avec une décision de poursuivre ou non à l’issue de cette étape avec les cellules progénitrices des CAR-T. Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal de base choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, y compris pour la greffe des progéniteurs lymphoïdes. D’autre part, le rendement de la reconstitution hématopoïétique est supérieur chez les souris femelles. Nous utiliserons donc de préférence des souris femelles dans nos protocoles permettant d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental en fonction de la différence relative attendue. En utilisant des tests statistiques non paramétriques de type Kruskal Wallis, Mann Whitney ou Wilcoxon, selon le design expérimental et le paramètre mesuré, nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux si ces différences existent.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes NOD/SCID/gc- (NSG) sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire des souris NSG permet la prise de greffe de cellules hématopoïétiques humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité des cellules CAR-T. Le thymus des souris NSG, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules hématopoïétiques sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. L’étude de la thymopoïèse et de la régénération thymique humaine chez ces souris nous permettra ainsi d’évaluer les progéniteurs lymphoïdes greffés dans un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris NSG adultes de 8 semaines, permettant une bonne prise de greffe des cellules tumorales et des CAR-T matures.